200927928 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明關於滅活之含佐劑流感疫苗。 流感病毒爲可感染鳥類和哺乳類之正黏济 感病毒）的RNA病毒。流感病毒具有包含8 鏈（節）之分節基因組，縮寫爲PB2、PB1 NP、NA、M和NS。這些節編碼10種基因。 碼血球凝集素蛋白質，其爲在病毒粒之蛋白f 套）中找到之抗原蛋白質。此蛋白質涉及病_ 。NA節編碼神經氨酸酶，其爲一種亦可在淸 面上找到之抗原性糖化酶。其幫助子代病毒自 胞釋出。 流感病毒有三種類型：A、B和C。 人類可被A、B和C型之流感病毒感染。 A型流感病毒根據二種主要之表面糖蛋白 (HA)和神經氨酸酶（NA)進一步分類亞型 型流感病毒並未鑑定出不同之Η和N亞型。 毒有16種已知之ΗΑ亞型和9種已知之ΝΑ3 “ Η5Ν1”病毒具有屬於亞型5之ΗΑ蛋白質2 之ΝΑ蛋白質。目前在人類世界中傳播之a塑 亞型包括H1N1、H1N2及H3N2病毒。然而， 引起發病和死亡之亞型（諸如H9N2、H7N7 i 成人類感染之報導。 雖然目前描述之B型流感病毒有二種不局 ί病毒科（流 股RNA負單 、P A、HA、 該HA節編 [外衣（病毒 t之入侵細胞 :感病毒粒表 丨受感染之細 血球凝集素 。B型和C A型流感病 型。例如： .屬於亞型1 流感病毒之 亦有由其他 :H2N2)造 之遺傳和抗 -5- 200927928 原譜系（Victoria和Yamagata)，但其並未被進一步分類 〇 流感病毒有二種類型之抗原變異，稱爲“抗原漂移（ antigenic drift) ” 和“抗原轉換（antigenic shift) ” 。 抗原漂移爲經由HA和NA基因中之突變（點突變） ' 連續產生與其原型不同之新流感菌株的一部分。該變化量 可爲細微或明顯的。 0 第二種抗原變異爲“抗原轉換”。當二種不同之流感 病毒共同感染相同宿主時交換完整之基因組節即可發生遺 傳轉換。此可能產生具新穎之基因群集，且因此具新性質 之“重新組合”病毒。當病毒亞型直接跨越物種屏障，未 在中間宿主中重新組合時亦可發生遺傳轉換。 發生抗原轉換可產生能使新流感病毒可在人體中複製 ，更重要的爲在人類間有效散佈之基因變化。當這類病毒 具有人類族群未具有其抗體之亞型時即可能發生大流行。 〇 過去一世紀中有3種流感大流行出現，其中在1918 年之西班牙流感爲最嚴重者。此次大流行使全世界約5千 萬人死亡。 目前，由於禽流感（H5N1 )正在亞洲、歐洲和非洲 家禽群中爆發流行，且亦有相當多之人類病例（3 1 7， 2007年6月29日），其中還有60%死亡，因此，全世界 對其之關注持續增加。此病毒具高度傳染性且已有超過 2 0億之馴養鳥類在感染後被剔除或死亡。目前爲止，人-對-人之傳染仍非常無效率，但該病毒可能在適應後取得 -6 - 200927928 此能力。此情況將增加大流行爆發之風險。 【先前技術】 在控制大流行中，疫苗可能扮演重要角色。若引起感 染之作用劑因非敏感性或抗性而無法以化學或藥學產物（ 如：抗生素或抗病毒劑）對抗，或無法以公衛手段對抗時 ，控制方法甚至可能完全倚賴接種疫苗。 〇 吾人熟知接種疫苗後所誘導出之抗體在對抗流感之保 護上扮演重要角色。除了體液免疫力外，由細胞傳介之免 疫力在終止感染上扮演重要之角色。 誘導由細胞傳介之免疫力很重要，因爲τ細胞可辨識 保留之抗原決定部位（其可產生對不同病毒株之廣泛保護 )° 目前滅活之流感疫苗係以三種由世界衛生組織每年根 據全球流感監測取得之資訊所推薦的流感病毒製造。這些 〇 疫苗之抗原通常係在勝化雞卵中製造。此季節性疫苗含有 15微克各病毒株之血球凝集素。由於該族群對大流行之 流感病毒株不具有抗體，因此，需要高出許多之大流行流 感疫苗劑量來誘導保護性免疫力。於誘導對抗H5N1病毒 株之保護性免疫力時顯示出需要二個90微克之血球凝集 素劑量。鑑於可利用之抗原量有限，這類高劑量並不方便 〇 使用佐劑可能克服對抗大流行之流感疫苗株的不良反 應。 -7- 200927928 疫苗之組成物（尤其是佐劑之性質）在免疫反應之動 力學中扮演重要角色。不僅是程度，免疫反應之開始和持 續期間係受免疫組成物之影響。吾人熟知，貯庫（油性） 佐劑（諸如油中水乳化液）爲強佐劑，其誘導穩定增加之 免疫反應（其可達到高水準之最大反應且長期持續）。另 一方面，水性佐劑誘導免疫力快速開始，但一般而言僅達 到低得多之最大反應且其持續時間短得多。 〇 爲了防止免疫力水準不足，通常係在明顯延長建立免 疫力所需之時間（“取得免疫之時間”）的第一次免疫注 射後之三或更多週後加強免疫化。 在大流行，而非地區性流行中，時間和產製能力爲關 鍵因子。以最低濃度之抗原在單次注射（“ 一針”）後可 很快地（一週）建立保護性免疫力之疫苗將有機會控制大 流行，此爲那些需要數週來建立或甚至需要以含高濃度抗 原進行第二次投藥之產品所無法達成者。誘導高濃度抗體 Ο 並誘導由細胞傳介之免疫力的疫苗可保護族群不僅可對抗 同源病毒株（確切之大流行株）亦可對抗異源病毒株，或 相同亞型之不完全相符的流感病毒株。此可產生對可能之 大流行爆發更及時的反應，如：使用加有佐劑之H5N2疫 苗來控制家禽中之Η 5N1爆發。這類可在第一次顯露大流 行浮現之警訊時快速且大規模（劑量數）產製之疫苗將有 利於控制流行。事實上，明顯減少介於第一次警訊（‘起 程時間’）和人類族群受到充分保護之狀況（‘抵達時間 ’）間之時間的各次及任何測量均具有正面作用。 -8- 200927928 因此，理想之大流行疫苗係在盡可能大之族群中浮現 大流行時可盡早取得且在盡可能多之個體中盡早建立足夠 程度之保護性免疫力（體液和細胞性免疫）。 【發明內容】 本發明提供可克服多種現有之滅活流感疫苗缺點之疫 苗。
〇 本發明提供滅活流感疫苗，其包含經/3丙內酯（BPL )滅活之全流感病毒並包含作爲佐劑之一或多種單糖或雙 糖衍生物，該等衍生物具有至少一個但不超過N-1個脂肪 酸酯基及選擇性地一個但不超過N-1個硫酸酯基，其中N 爲該單糖或雙糖（其爲該衍生物之衍生來源）之羥基數。 這類佐劑揭示於 WO 0 1 40240，Hilgers L.A.,and Blom A.G. Suer o se fatty acid sulphate esters as novel vaccine adjuvant. Vaccine 24 : S2-81 ( 2006 )，及 Blom A,G·， O and Hilgers L. A. Sucrose fatty acid sulphate esters as novel vaccine adjuvants : effect of the chemical composition. Vaccine 23 : 743-54 ( 2004 )中 ° 此類型之佐劑並不像油性佐劑般形成抗原庫，此可使 宿主免疫系統能夠立即利用抗原。尤其是在大流行之狀況 中免疫力快速起動是很重要的。該佐劑宜爲CoVaccine HTtm。CoVaccine HTtm包含合倂在次微米水中角鯊烷乳 化液中之蔗糖脂肪酸硫酸酯。蔗糖脂肪酸硫酸酯之劑量係 介於0.1和40毫克之間。較佳地，蔗糖脂肪酸硫酸酯之 -9- 200927928 劑量係介於0.25和1 0毫克之間。最佳地，蔗糖脂肪酸硫 酸酯之劑量係介於〇 . 5和4毫克之間。角鯊烷之劑量係介 於0.4和160毫克之間。較佳地，角鯊烷之劑量係介於1 和4 0毫克之間。最佳地，角鯊烷之劑量係介於2和1 6毫 克之間。 血球凝集素之劑量係介於0.1和60微克之間。較佳 地，血球凝集素之劑量係介於0.25和15微克之間。最佳 〇 地，該劑量係介於1和3微克之間。
CoVaccine HT刺激Thl和Th2二種反應（對誘導由 細胞傳介之免疫力很重要），然而，例如，氫氧化鋁僅刺 激Th2反應。CoVaccine HT不會在挑戰感染後誘導出經 增強之病變。 在根據本發明之疫苗中的流感病毒宜源自於細胞培養 。用於在細胞培養中製造流感病毒之方法爲本技藝所已知 。該病毒可生長在源自哺乳動物、鳥類或人類之細胞上， . 諸如 Madin Darby 犬腎細胞（MDCK) 、Vero' MDBK、 CLDK、EBx或PerC6細胞。MDCK細胞爲本技藝所已知 之細胞。MDCK細胞株係由S.H. Madin和N.B. Darby在 1 958年 9月自表面上正常之成年雌可卡犬（cocker spaniel )的腎臟中衍生出。原始之MDCK細胞株（NBL-2 )係存放在ATCC (編號ATCC CCL 34 )。 MDCK細胞可能附著在，例如：旋轉瓶中或微載體上 生長，宜在不含血清之培養基中生長（Merten，O.W.，et al. Production of influenza virus in cell cultures for -10- 200927928 vaccine preparation. Adv Exp Med Biol·’，397: 141-51 ( 1 9 9 6 ) ; Kalbfuss, B., et al. Harvesting and concentration of human influenza A virus produced in serum-free mammalian cell culture for the production of vaccines. Biotechnology and Bioengeneering, 97 ( 2007 ) ) o MDCK細胞亦可生長在懸浮液培養中（Nakamura, K.， et al. Method of suspension culture for MDCK cells and ❹ isolation of influenza virus in MDCK suspension cultured cells. Kansenshogaku Zasshi ； 54 : 3 06- 1 2 ( 1 9 80 ))。 用於大流行之疫苗旨在以可能大流行之高病原性（禽 )流感病毒（諸如H5N1株）來保護人類對抗感染。較佳 地，根據本發明之疫苗係以H5型（尤其是H5N1型）之 滅活流感病毒爲基礎。 測試以培養在MDCK細胞上之流感病毒株NIBRG-14 爲基礎，經BPL滅活，且加上Co Vaccine HTtm佐劑之疫 〇 苗。令人驚訝地，在雪貂（流感疫苗之動物模型）中單次 注射疫苗時可提供象徵高度保護之高病毒中和化抗體。 NIBRG-14病毒係由國家生物標準和控制學會（ National Institute for Biological Standards and Control ) (Potters Bar，英國）鑑於其作爲人類流感疫苗之用途來 進行遺傳工程處理。NIBRG-14爲一種經減毒之重新組合 病毒，其含有2個來自 A/越南/1 1 94/2004 (H5N1)之表 面基因（經修改之 HA&NA)和 6個來自蛋-高成長 A/PR/8/34 ( H1N1 )的內部基因。爲了改良此株之安全性 -11 - 200927928 ’將血球凝集素基因中之多鹼基分裂部位去除。在孵化卵 ，雞和雪貂中確認此疫苗株之非致病性（Wood，J.M.，et al. From lethal virus to life saving vaccine ： developing inactivated vaccines for pandemic influenza. Nature Reviews in Microbiology 2, 842-847 ( 2004))。 (合倂）使用細胞培養（取代卵）來製造病毒，全病 毒（取代分體或次單位）、BPL (取代交聯劑）、水性（ 〇 取代油性）、非-貯庫型（取代貯庫）佐劑及/或單純加入 (取代乳化）抗原和佐劑可提供重要之利益。 首先，該疫苗可使免疫力快速開始，此在面對大流之 威脅時很重要。 再者，根據本發明之疫苗較容易製造出較高產量（劑 量數）。 由於根據本發明之疫苗僅需單次注射，所需之抗原量 將減少。 Ο 由於該疫苗可誘導高抗體及由細胞傳介之反應，其不 僅可取得對抗同源株之保護亦可取得對抗異源株之保護。 本發明進一步藉由下列實例示範。提出之實驗顯示出 根據本發明之疫苗可在單次免疫化後取得出人意料之高 HI抗體效價。那些僅所選擇之佐劑不同的與其相當之疫 苗（以氫氧化鋁取代之CoVaccine HTtm)並無法取得這 些高效價。 【實施方式】 -12- 200927928 實例1 :疫苗之產生方法 令流感病毒NIBRG14 ( H5N1 )生長在MDCK細胞上 。在發酵3-5天後收成病毒懸浮液並在以BPL ( 0.025 %重 量/體積）滅活前使之澄清。滅活後，經由超濾作用將經 滅活之病毒濃縮並進一步純化。經由單輻射免疫擴散（ SRID )分析測定抗原濃度。經由將病毒抗原與需要量之 佐劑及/或磷酸鹽緩衝之生理食鹽水（PBS )混合來配製疫 φ 苗（表 1 )。佐劑 CoVaccine HTtm 係由 CoVaccine BV 慷 慨提供（Utrecht，荷蘭）。 實例2 :以添加CoVaccine HTtm佐劑之源自細胞培 養的滅活全病毒疫苗在老鼠中進行疫苗接種/挑戰實驗 實驗設計 將6-8週大之雌瑞士老鼠任意分成5組（n = 5 )。經 〇 由肌肉內（IM )注射在後腿中投服爲0.1毫升之疫苗。疫 苗調合物指示於表1中。 將0.2毫升病毒接種在9-1 1天大之孵化的SPF卵中 以製造挑戰病毒（A/波多黎各/8/34) (H1N1)。在34°C- 3 7 °C培育3天後收成尿囊液並在MDCK細胞上滴定。 爲了評估抗體之誘導，在接種疫苗後24天採取血液 樣本。藉由血球凝集素抑制分析來測定抗體效價數。藉由 酶聯結免疫分析（ELISA)測量抗原特異性IgGl和IgG2a 抗體效價。 -13- 200927928 在接種疫苗後4週以在老鼠中適應之病毒（A/波多黎 各/8/3 4 ; Η 1 N 1 )對所有動物進行挑戰實驗。每天測量體 重以評估對臨床症狀之保護作用。挑戰1 2天後殺死所有 動物。 表1 :疫苗調合物 組別 抗原（滅活之全病毒） 佐劑 1 PBS 2 A/Pr/8/34 70 奈克 HA/劑量 - 3 A/Pr/8/34 70 奈克 HA/齊遣 氧氧化銘（0.2%) ( Brenntag Biosector，丹麥） 4 A/Pr/8/34 70 奈克 HA7劑量 CoVaccine HT (2 毫克/劑量）（CoVaccine BV， 荷蘭） 5 A/Pr/8/34 70 奈克 HA/齊！(量 CoVaccine HT ( 0.5 毫克/劑量）（CoVaccine BV ) 結果= 爲了評估佐劑CoVaccine ΗΤ改良源自細胞培養之滅 活全病毒流感疫苗之致免疫力的能力，以不同疫苗調合物 ◎ 爲老鼠接種疫苗。 接種疫苗後三週測量在取自接種疫苗組和對照組動物 之血清中的HI抗體效價。如表2所示，CoVaccine HTtm 不會強有力地增強對抗A/Pr/8/34之HI效價。HI效價甚 至低於由含有氫氧化鋁之疫苗所誘導之效價。 -14- 200927928 表2 : 在接種疫苗後24天所採取之血清中之對抗A/Pr/8/34 的HI效價 組別 抗原 佐劑 HI效價 (2Log) 1 PBS - <3.3 2 A/Pr/8/34 70奈克/劑量 - 5.1±1.1 3 A/Pr/8/34 70奈克/劑量 氫氧化鋁（〇_2%) 7.3±1_3 4 A/Pr/8/34 70奈克/劑量 CoVaccine HT ( 2 毫克/劑量） 5.1±1.3 5 A/Pr/8/34 70奈克/劑量 CoVaccine HT (0.5 毫克/劑量） 6.1±1.6 Q 分析IgG同型以測定CoVaccine HT是否對誘導之免 疫力類型具有影響。如表3中所示，共同投遞氫氧化鋁可 誘導高效價之IgGl和IgG2a。共同投遞CoVaccine ΗΤ明 顯地誘導IgG同型之變動，因爲IgGl/IgG2a比大爲降低 。由於老鼠中之低IgGl/IgG2a比與有效地誘導由細胞傳 介之免疫力（Thl反應）有關，IgGl/IgG2a比向下變動可 能很重要，但高比例與由細胞傳介之免疫力（Th2反應） 的誘導不足有關。 ❹ 表3 :血清中之抗A/Pr/8/34IgG同型 組別 佐劑 IgGl IgG2a IgG/IgG2a 比 2 0.024±0.031 1.48611.101 NC* 3 氫氧化鋁（0.2%) 2.964±0.359 1.790±1.066 1.656 4 CoVaccine HT ( 2毫克/齊丨遣） 0.13110.099 2.133±1.165 0.061 5 CoVaccine HT ( 0.5 毫克/劑量） 0.253±0.189 2.583±1.252 0.097 ΦΝΟ未計算，因爲平均IgGl效價少於背景之二倍。 將血清預先稀釋200倍並在以抗原塗覆之96槽ELISA盤中進行系列之2 倍稀釋。 在接種疫苗後27天以在老鼠中適應之同源A/Pr/8/3 4 -15- 200927928 對所有老鼠進行挑戰實驗。每天測量體重。PBS對照組中 所有動物之體重減輕且在8天內死亡。直到挑戰後第6天 ，第2組（僅抗原）中之動物顯示出明顯之平均體重減輕 ，然後，體重增加至正常水準。第3_5組中之動物受到較 佳保護，因這些動物在挑戰後未損失體重。 雖然Co Vaccine HT誘導之HI效價並未高於由氫氫化 鋁所誘導者，其對反應之Thl/Th2比有利。 ❹ 實例3 :添加佐劑CoVaecine HT之源自細胞培養之 滅活全病毒流感疫苗（A/Pr/8/34株）在雪貂中之致免疫 力（試驗I )。（接種疫苗/挑戰）： 亦在雪貂中評估CoVaccine HT對源自細胞培養之滅 活全病毒流感疫苗之致免疫力的影響。 實驗設計= 〇 在實驗中使用四組經割除睾九之雄雪貂（n = 7)。在 接種疫苗前一週令雪貂經由皮下途徑接受轉發器（ Biomedic Data Systems IPTT-200)以測量體溫並用於鑑 定。經由肌肉內途徑注射0.5毫升之不同調合物爲所有動 物接種一次疫苗。 在接種疫苗後21天和49天測定血液樣本中之HI效 價。在接種疫苗後8週以感染性A/波多黎各/8/34 ( Η 1N1 )挑戰雪貂。 將0.2毫升病毒接種在9-1 1天大之孵化的SPF卵中 -16- 200927928 以製造挑戰病毒（A/波多黎各/8/34 ) ( HI N1 )。在34 °C -3 7°C培育3天後收成尿囊液並在MDCK細胞上滴定。 挑戰前經常測量體重和體溫以建立正常基線値。挑戰 後，測量體重並每日監測體溫二次。在挑戰感染後第4天 ，藉心臟採血爲動物放血，然後進行肉眼病理檢查。 調合物顯示於表4中。 表4 :在雪貂試驗I中之疫苗調合物 組別 抗原（滅活全病毒） 佐劑 1 PBS _ 2 A/Pr/8/34 10-15 微克 HA/劑量 - 3 A/Pr/8/34 10-15 微克 HA/劑量 氫氧化銘（0.2%) (Brenntag Biosector ’ 丹麥） 4 A/Pr/8/34 10-15 微克 HA/劑量 CoVaccine HT ( 4 毫克/劑量）（CoVaccine BV )
結果= 如表 5中所示，與以氫氧化鋁免疫化相比較，以 CoVaccine HT免疫化可產生高6至7倍之HI效價。 -17- 200927928 表5 :在接種疫苗後21天和48天採取之血清中之對抗A/Pr/8/34的HI 效價 組別 抗原 (滅活之全病毒） 佐劑 HI 效價（2Log) 第21天 HI 效價（2Log) 第48天 1 PBS _ <3.3 <3.3 2 A/Pr/8/34 10-15 微克 HA/劑量 - 6.8±0.5 6.45±0.6 3 A/Pr/8/34 10-15 微克 HA/劑量 氫氧化銘 (0.2%) 7.9±1.0 7.3±1.1 4 A/Pr/8/34 10-15 微克 HA/齊！I量 CoVaccine HT (4毫克/劑量） 10.7±0.8 9.9±0.6 在接種疫苗後8週以同源感染性病毒挑戰雪貂。在挑 戰感染後第4天殺死雪貂並採取肺組織進行組織學檢查。 未接種疫苗之第1組動物的肺中顯示出最嚴重之病理 損傷。接種疫苗組（第2-4組）之動物顯示出僅細支氣管 /支氣管和肺泡有輕微發炎。挑戰後，淋巴樣刺激隨著小 血管之血管周圍淋巴細胞浸潤（最高分在第3組中）和瀰 漫性間質單核細胞浸潤（最高分在第2和3組中，但對照 組中最嚴重）出現。不同接種疫苗組間之差異並不巨大也 無明確區別。 總結之，CoVaccine HT在雪貂中明顯較氫氧化鋁可 誘導出較高之HI抗體效價，但在老鼠中則不。 實例4 :添加佐劑CoVaccine HT之源自細胞培養之 滅活全病毒疫苗（NIBRG-14株）在雪貂中之致免疫力（ 試驗Π )。 -18- 200927928 爲了評估佐劑CoVaccine HT是否亦改良H5N1株之 致免疫力，進行新穎之疫苗接種實驗。使用在GMP條件 下製造之滅活全病毒抗原來製造疫苗。 實驗設計： 使用7組雄雪貂（η = 7 )進行實驗。 在接種疫苗前1週令雪貂經由皮下途徑接受轉發器（ Biomedic Data Systems ΙΡΤΤ-200)以測量體溫並用於鑑 定。將0.5毫升之不同調合物注射在動物之左股二頭肌處 爲所有動物接種疫苗二次。爲了製造疫苗，使用滅活之全 病毒抗原（NIBRG-14株（H5N1)，在GMP條件下製造 )。表6中顯示不同之疫苗調合物。在不同時點採取血液 樣本。 表6 :雪貂試驗Π中之疫苗調合物 組別 抗原 (滅活之全病毒） 佐劑 1 7.5微克HA/劑量 - 2 7.5微克HA/劑量 氫氧化錫（0.2%) ( Brenntag Biosector ) 3 15微克HA/劑量 一 4 15微克HA/劑量 氫氧化銘（0.2%) ( Brenntag Biosector ) 5 7.5微克HA/劑量 CoVaccine HT ( 4 毫克/劑量）（CoVaccine BV ) 6 7.5微克HA/劑量 CoVaccine HT ( 1 毫克/劑量）（CoVaccine BV ) 7 7.5微克HA/劑量 CoVaccine HT ( 0,25 毫克/齊!J量）（CoVaccine BV ) 所有動物接受二次疫苗接種，其間間隔三週。 如表7中所示，與添加氫氧化鋁佐劑之疫苗相較下， -19- 200927928 共同投遞1毫克/劑量之Co Vaccine HTtm可使HI效價增 加4.9倍。共同投遞4毫克/劑量之CoVaccine HTtm甚至 可使HI效價增加8.5倍。加強劑進一步增加HI效價。具 有CoVaccine HTtm之調合物可在第35天產生最高之HI 效價，但其與添加氫氧化鋁佐劑之疫苗的差異在第21天 較小。 〇 表7 :在第21天（第一次接種疫苗後21天）和第35天（在加強接種後 14天）採取之血清中之對抗NIBRG-14的HI效價 組別 抗原 (滅活之全病毒） 佐劑 HI 效價（2Log) 第21天 HI 效價（2Log) 第35天 1 7.5微克HA/劑量 3.5±1.8 8.4±1.6 2 7.5微克HA/劑量 氫氧化銘 5·1±1·3 10.810.5 3 15微克心劑量 4.7±1.1 8.310.7 4 15微克HA/劑量 氣氧化銘 6.210.2 11.2±1.0 5 7.5微克HA/劑量 CoVaccine HT (4毫克/劑量） 8.2±0.2 12.2±0.8 6 7.5微克HA/劑量 CoVaccine HT (1毫克/劑量） 7.4±0.3 12.411.1 7 7.5微克HA/劑量 CoVaccine HT (0.25毫克/劑量） 5.6±0.2 10.8+0.5 從前述實驗中可歸結出以添加佐劑CoVaccine HT之 滅活全病毒流感疫苗進行單次疫苗接種後可取彳寻保護个生 HI效價（HI效價>5.3被認爲在人體中具保護性）° 與共同投遞氫氧化鋁相較下，將 H5N1株與 CoVaccine HT共同投遞可使HI效價增加8.5倍（4毫克/ 劑量）或增加4.9倍（1毫克/劑量）。 -20- 200927928 在單次疫苗接種後，由7·5微克HA/劑量+CoVaccine HT所誘導之HI效價較由15微克HA/劑量+氫氧化鋁所誘 導之HI效價高出4倍。 實例6:在非人類之靈長類中比較添加佐劑CoVaccine HT和氫氧化鋁之流感疫苗 藉由在非人類靈長類中進行之疫苗接種硏究來進一步 © 說明本發明。爲此，將添加佐劑CoVaccine HTtm和氫氧 化鋁之H5N1疫苗注射入約3歲大之雌長尾彌猴（Macaca /ascicwZarii)體內（Hartelust BV，Tilburg，荷蘭）並在 一次和二次注射後測量抗體反應。 將動物以6隻一組養在正常籠子內，使用鋸木屑作爲 床。動物設施條件爲日/夜光周期（1 2小時/ 1 2小時）、 溫度爲21 °C±2t和相對濕度40-60%。動物有隨意供應之 自來水和食物（小九和水果）。每日檢查其明顯之疾病徵 ❿ 兆。 根據荷蘭之動物實驗法律進行動物實驗且符合“實驗 室動物之照顧和使用指南（Guide for the care and use of laboratory animals) ，ILAR 建議和 AAALAC 標準。 由動物設施技術員每日觀察動物二次。處理時，以卡 門（ketamin) (25毫克/公斤；i.m.)(其可使動物深度 鎭靜約20-40分鐘，此爲標準程序）使動物鎭靜。 第〇天，將左後腿（LH)股骨肌肉之皮膚剃毛並進 行免疫化。在硏究第21天，將右後腿（RH)股骨肌肉之 -21 - 200927928 皮膚剃毛並給予疫苗。在各次免疫化之前和之後4及24 小時檢查注射部位。 抗原劑量爲7.5微克HA (滅活NIBRG-14 )。使用濃 度爲0.2% (重量/體積）之氫氧化鋁。Co Vaccine HT之劑 量爲2毫克SFASE。 結果： 〇 除了少數病例中可注意到一些局部發紅外並無局部或 系統性不良事件。 在血球凝集素抑制（HI )分析方面，將病毒懸浮液與 經系列（2倍）稀釋之預先以霍亂濾液（自霍亂弧菌培養 取得）處理的血清樣本一起培育。接著，將紅血球加入稀 釋液中，培育後，將顯示出完全抑制血球凝集素之作用劑 的最大稀釋倍數定義爲HI抗體效價。 〇 -22- 200927928 表8 :在彌猴中，以添加佐劑氫氧化鋁（第1組）和CoVaccine HT (第 2組）之全病毒Η5Ν1流感疫苗進行一次和二次免疫化後之HI抗體效價 第1組；以氫氧鋁作爲佐劑 對抗NIBRG-14之HI效價 對抗NIBRG-14之2log HI效價 第〇天 第21天 第49天 第70天 第〇天 第21天 第49天 第70天 <10 <10 40 20 <3.32 <3.32 5.32 4.32 <10 <10 80 10 <3.32 <3.32 6.32 3.32 <10 <10 200 60 <3.32 <3.32 7.64 5.91 <10 40 140 80 <3.32 5.32 7.13 6.32 <10 20 240 80 <3.32 4.32 7.91 6.32 <10 20 160 40 <3.32 4.32 7.32 5.32 GMT <3.32 <3.99 6.94 5.25 SD 0.00 0.82 0.96 1.21 逆對數 <10 16 123 38 增加因子 1.6 12.3 3.8 第2組；以CoVaccine HT作爲佐劑 對抗NIBRG-14之HI效價 對抗NIBRG-14之2log HI效價 第〇天 第21天 第49天 第7〇天 第〇天 第21天 第49天 第70天 <10 320 2560 1280 <3.32 8.32 11.32 10.32 <10 160 2560 1280 <3.32 7.32 11.32 10.32 <10 100 800 280 <3.32 6.64 9.64 8.13 <10 160 1920 640 <3.32 7.32 10.91 9.32 <10 400 4480 1920 <3.32 8.64 12.13 10.91 <10 80 640 280 <3.32 6.32 9.32 8.13 GMT <3.32 7.43 10.77 9.52 SD 0.00 0.91 1.08 1.19 逆對數 <10 172 175.1 735 增加因子 17.2 175.1 73.5 GMT爲幾何平均數效價；SD爲GMT之標準差；逆對數爲2AGMT ;增 加因子爲某日之逆對數除以第〇天之逆對數，即1〇。 HI測試系統之偵測極限爲10。 -23- 200927928 與第〇天（免疫化前）相比較，第1次以添加· 銘或CoVaccine ΗΤ佐劑之源自細胞培養之全病毒 流感病毒注射後3週HI效價分別增加至少1.6和1 ‘ 〇 與第〇天（免疫化前）相比較，第2次以添加童 錫或CoVaccine HT佐劑之源自細胞培養之全病毒 流感病毒注射後3週HI效價分別增加至少12.3和 ❿ 倍。 三個評估流感疫苗之效力的EMEA標準爲：1 ) 轉化之數目或HI效價之明顯增加應>40%，2 ) GMT 加>2.5及3 )具HI效價240之實驗對象的比例應3 70%。 令人驚訝地，根據本發明之疫苗的單一劑量在诗 抗原之動物中所產生之免疫反應可輕易地符合此標律 在傳統之添加佐劑氫氧化鋁之疫苗方面則需要二次费 ® 。此可歸結出：本發明可明顯減少得到免疫力之時間 在對抗和控制流感大流行中可提供巨大之利益。 ，氧化 H5N1 r.2倍 ，氧化 H5N 1 175.1 血清 應增 .少爲 接觸 ，而 疫化 。此 -24-