TW200927160A - Toona sinensis roem extract for suppressing the proliferation of osteoblasts - Google Patents

Description

200927160 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於香椿萃取物，且特別有關於一種抗骨 ' 肉癌之香椿萃取物。 【先前技術】 香椿幻·Roem.)為楝科（Meliaceae)多年生 落葉性喬本植物，樹皮為赭褐色，嫩葉可供食用且全年可 ❹ 採，原生中國東南，西南至華北地區，如今在全世界均有

種植（Jennifer M. Edmonds and Martin Staniforth, TOONA SINENSIS (Meliaceae)，Curtis’s Botanical magazine, 15 (3), 186-193, 1998; Xiao-Dong Luo et al., Fitoterapia, 71, 492-193, 2000; Jong-Cheol Park et al., J, Pharmacogn, 27(3)，219-223, 1996)。 香椿的嫩葉呈小矩齒狀可食，其營養豐富，經現代科 技分析含有蛋白質、脂肪、胡蘿蔔素（Carotene)及維生素B 和C等’具有消炎、解毒、殺蟲、治腸炎、痢疾、疽、疔、 疥瘡、白禿等功效。香椿不但具有抗氧化、抗發炎、止痛， 還有抑制血小板凝集、降血壓及治療青春痘和預防感冒等 功效’長期服用’也沒有副作用。近年來研究指出，香捲 可降低Alloxan誘發糖尿病鼠血糖值、增加其葡萄糖耐受 性，而不會使正常老鼠產生低血糖症狀（王珮悻2〇〇ι、又 =卜在文獻同樣指出香椿可降低她xan誘發糖尿血 糖值，促進分化中之脂肪細胞3T3-L1經由么 、也田PKC途和（被 cAMP down-regulation)調控脂肪分解作用 工、 <2003)，並增進細胞内葡萄糖之利用（γ:= 200927160 “η並可有效預防與醣類代謝相關所導致之心血管 疾病以及神經退化疾病。 #舍丨内广&刖並無任何文獻揭示香椿或香椿萃取物具有 椿其：物；：f生長的活性’而本發明基於發現香椿或香 椿卒取物可抑财肉癌細胞生長而提出。 f發明内容】 Ο 括一ίίϊ係提供一種抑制骨肉癌細胞生長之組成物，包 得。有/里之香椿萃取物，其中該香椿萃取物以水萃取而 含一另提供一種用以治療骨肉癌之醫藥組成物’包 殿减二：之上述抑制骨肉癌細胞生長之組成物，以及-面樂上可接党的載體或賦型劑。 括更J供一種抑制骨肉癌細胞生長之組成物，包 驟製得:在〜 取=香椿萃取物係以下列步 以及將該叙蓋香椿葉以得到一第一萃取液， 满液:飞以％篩目（mesh)的過濾膜過濾而取其 =燥將制液離心以獲得一上清液，以及將該上清液冷 明顯^懂^發月之上述和其他目的、特徵、和優點能更 細說明如下：文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳 【貫施方式】 括有2 ΐ供厂種抑制骨肉癌細胞生長之組成物，包 得。 香椿卒取物，其中該香椿萃取物以水萃取而 200927160 本發明之香椿萃取物可萃取自一般之香椿葉或香椿 嫩芽，較佳為香椿嫩葉。 本發明之香椿萃取物之萃取方法包括：（a)在加熱下 以水萃取香椿以得到第一萃取液，（b)將此第一萃取液過 濾而取其濾液，（c)將此濾液離心以獲得一上清液，以及 將此上清液冷凍乾燥以獲得本發明之香椿萃取物。 首先，將含有香椿葉及/或嫩芽之水煮沸至一適當 量，以獲得一粗萃取液（第一萃取液），並以紗布、棉花或 ©以30-100篩目（mesh)的篩網過濾，較佳為70篩孔之篩 網，以獲得濾液，最後將濾液在4°C下，以2000-4000 rpm 離心8-15分鐘，獲得一上清液。 在一實施例中，本發明之香椿萃取物更包括再經過一 高壓濕熱滅菌處理。本發明之高壓濕熱滅菌的條件為 100-130°C，滅菌10-20分鐘，較佳為121°C滅菌15分鐘。 在另一實施例中，本發明之香椿萃取物更包括再經由 以下步驟處理：將本發明之香椿萃取物裝入一液相層析管 柱；以醇類依序沖提該逆相層析管柱，以及收集該醇類沖 ❹提物。 在另一實施例中，本發明之香椿萃取物更包括再經由 以下步驟處理：將本發明之香椿萃取物以醇類萃取以獲得 一第二萃取液；將該第二萃取液離心以獲得一上清液，以 及將該上清液冷凍乾燥。 本發明中所述之醇類包括，但不限於，乙醇、曱醇、 丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇或其上述之組合。 本發明之香椿萃取物可有效地抑制癌細胞之增殖，較 佳為骨肉癌細胞，例如U2-OS、MG-63或Saos-2等。經 7 200927160 實驗發現，本發明之香椿萃取物可促進骨肉癌細胞之 p21、P53或P-CC1C25蛋白質的表現，並抑制cdc_2或cyciin B1蛋白貝的表現，使骨肉癌細胞停留在時期。 此外’本發明之香椿萃取物與骨肉癌細胞之細胞凋亡 有關。經實驗發現’本發明之香椿萃取物可促進骨肉癌細 胞之Bax及cyclophilin A蛋白質的表現，並抑制Bd_2蛋 白質的表現’以誘發癌細胞之細胞凋亡。

由於本發明之藥學組合物具有高度的安全性，不合對 正常人類成骨細胞造成影響，因此本發明之香椿萃取^可 作為抗骨肉癌之輔助食品或保健食品。 本發明另提供-種抑制骨肉癌細胞生長之 ^劑包括本發明之香椿萃取物及醫藥上可接受的載體或賦 本發明所述 罙学上可接受之載體或賦型劑 Ϊ制但不於’水、生理食鹽水、有機溶劑、安定劑、螯 二防腐劑、乳化劑、懸浮劑、稀釋劑、凝膝劑、』 本發明藥學組成物的給予方式包括口服 吸入式、肛Η塞劑、陰道塞劑、經皮吸 ，含傳統無毒性之藥學上可接受的载體、=载:樂: 2予則包括使用經皮吸收之給予方式，例如 或離子電滲透元件等。非腸胃式給予 月、片 脈注射、肌肉注射或胸骨注射，或“ 注射、靜 在一實施例令，本發明之藥學組成 品’其令包括賦型劑、黏合劑、崩解齊狀製 调味劑。所形成之混合物可藉由f知技術^ 200927160 末、膠囊等類似物。添加劑可包括，乳糖、氣化鋼、 =糖:粉、碳酸約、高嶺土、微晶纖維素切酸。黏 二水、乙醇、丙醇、嚴糖溶液、葡萄糖溶液、澱 鈉、瓊脂、破劑包括乾凝粉、藻酸 廿必^ Λ 風鈉、碳酸鈣、硫酸月桂脂鈉、硬脂酸單 甘油知與乳糖。潤滑劑可包括、、典π 缺& 聚乙二醇。h則了0括/月石、硬脂酸鹽類、事少與 Ο ❹ f口在例中’本發明之藥學組成物為-口服液體 ^ 中包括調味劑、緩衝劑、安 劑可為檸檬酸鈉。安定劑可頰似物。緩衝 膠或明膠。女疋^ 了為汽著膠(twth)，阿拉伯 在另—實_巾，本發明之解組成 包括pH值調控劑、迳i為丨.^ m σσ 所形成之注in劑、衫劑、雜_類似物。 控劑:緩衝二ί靜脈注射品。PH值調 為焦亞硫酸鈉、乙':二巧：或硫酸鈉。安定劑可 性劑可為氣化納或酸'乙猶酸或硫代硫酸。參 方式本ΐ:月二性的含量可依照不同個體及給予的 •^曰'成知可5併其他载體以形成一單一添;j詈。士 劑1可依照不同的參數做適當的調整。 ^此 不限於，個體的種類 >數匕括，但 明之、、舌#心w彳 的大小、疾病的嚴重性。本發 ”刀可-次給予，24小時内多次給予或二 予。當注射的方式為i車痒仏工。士 人、口宁次運續給 式，包括，但不限於，靜可選用適合的習知方 植式注射幫浦或局部給^脈注射點滴、靜脈注射幫浦、埋 本發明之藥學組成物可單獨給藥，或是合併其他骨肉 9 200927160 癌之治療方法或治療藥物。例如，放射線治療或化學治療。 【實施例】 1.香椿之萃取方法 本發明所使用之香椿由台灣香椿生技股份有限公司 提供。將香椿葉（化⑽治leaf; TSL)加水經煮沸 後’以70 mesh濾網過濾，將濾液以冷凍乾燥法得到粉末， 此為香椿葉水萃物（TSL-CE )。

此外，濾液在冷凍乾燥前，將濾液經4°C，3000 rpm 離心12分鐘以獲得一上清液，將此上清液冷)東乾燥取得 之粉末稱為TSL-hTSL-1經HPLC分離可得到TSL-1-5-7 之產物。將TSL-1經乙醇卒取離心後’將上清液冷;東乾燥 取付之粉末產物為TSL-2。將TSL-2以不同濃产 (99.5%·>50% + 25%+12.5%)之乙醇萃取離心，再將其: 清液冷凍乾燥取得粉末產物分別為TSL-3、TSL-4及 TSL-5。將TSL-2以水萃取離心’再將其上清液冷來乾 取得粉末產物分別為TSL-6及TSL-7。上述步驟;參‘二 華民國專利第1235664號。 > 号中 200927160 值分別為 64.7 pg/ml、98.2 pg/ml)。 將癌細胞培養於經高壓溼熱滅菌處理之TSL-1中，與 未經高壓溼熱滅菌處理之TSL-1做比較，處理時間為72 小時。第2a圖顯示U2-OS細胞之測試結果，第2b圖顯 示Saos-2細胞之測試結果。參照第2a-2b圖，將TSL-1 先經高壓溼熱滅菌後再將癌細胞培養於其中，對U2-OS 及Saos-2兩株人類骨肉癌細胞之抑癌效果比未經高壓溼 熱滅菌之TSL-1更為顯著（經高壓溼熱滅菌處理之IC50值. _ 分別為46.3 gg/ml、39 pg/ml ;未經高壓渔熱滅菌處理之 IC50 值分別為 59.8 pg/ml、59 pg/ml)。 3. 本發明之香椿萃取物不影響人類正常成骨細胞之生長 以香椿幼嫩葉水萃取物之TSL-；L、TSL-2、TSL-1-5-7 來分析對人類成骨細胞（osteoblasts)之影響，處理時間為 72小時。參照第3圖，TSL-1及TSL-2皆不會對人類成 骨細胞造成顯著之抑制生長作用，其中TSL-1不僅能有效 抑制骨癌之增殖，且對正常細胞並無毒殺之不良作用。..

Q 4. TSL-1對於骨肉癌細胞MG-63細胞週期分佈之影響 以0.05 mg/ml之TSL-1處理骨肉癌細胞株MG-63， 處理時間為24、48及72小時，與未添加TSL-1之對照組 比較。參照第4圖，以TSL-1處理的MG-63細胞停滯在 G2/M時期（G2期的細胞量：TSL-1處理24小時為14.9%， TSL-1處理48小時為29.5%，TSL-1處理72小時為 37.3%)。 11 200927160 5.TSL-1對於骨肉癌細胞MG-63在細胞週期調控基因：週 期素 B1、週期素 A、cdc2、p-cdc25C、p21、p53 以及 p27 RNA表現之影響 以反轉錄聚合酶連鎖反應法偵測細胞週期調控基因 cdc-2、cyclin Bl、cyclin A、p27、p21、p53、p-cdc25C RNA 之表現，一樣以與未添加TSL-1之對照組比較。參照第 5a-5b圖，細胞週期調控基因p21、p53、p-cdc25C RNA 之表現隨著TSL-1處理的時間增加而增加；而細胞週期調 ❹ 控基因cdc-2及cyclin Bl RNA之表現則隨著TSL-1處理 的時間增加而減少；但細胞週期調控基因p27及cyclin A RNA之表現則不因TSL-1處理的時間之增加而有所改 變。故骨肉癌細胞MG-63經TSL-1處理後會使細胞生長 停滯於細胞週期中的G2/M期，並影響細胞週期調控基因 cdc-2、cyclin Bl、p21、p53、p-cdc25C RNA 之表現。 6.SL-1對於骨肉癌細胞MG-63在細胞週期調控蛋白質： 週期素Bl、cdc2、p-cdc25C、p21以及p53蛋白質表現 © 之影響 以西方墨點法偵測細胞週期調控基因cdc-2、cyclin Bl、p2卜p53、p-cdc25C蛋白質之表現，與未添加TSL-1 之對照組比較。參照第6a-6b圖，細胞週期調控基因p21、 p53、p-cdc25C蛋白質之表現隨著TSL-1處理的時間增加 而增加；而細胞週期調控基因cdc-2及cyclin B1蛋白質 之表現則皆隨著TSL-1處理的時間增加而減少。故骨肉癌 細胞MG-63經TSL-1處理後會使細胞生長停滯於細胞週 期中的G2/M期，並影響細胞週期調控因子cdc-2、cyclin 12 200927160 B1、p21、P53、p-cdc25C 蛋白質之表現。 7. TSL-1會對骨肉癌細胞株MG-63造成死亡 以乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH)釋出量之 比例來評估TSL-1對骨肉癌細胞MG-63之影響，與未泰 加TSL-1之對照組比較。參照第7圖，在投予0.05mg/ml 之TSL-1分別處理24、48、72小時後，會造成乳酸脫氣 酶的釋出，其釋出量有時間依賴性增加之情況。 8. TSL-1會促使骨肉癌細胞株MG-63走向細胞凋亡 以TUNEL染色，在顯微鏡下呈現紅色螢光為發生細 胞凋亡之細胞，呈現藍色螢光為DAPI染劑染核之現象； 而黑色無螢光的細胞為未發生細胞凋亡之的細胞，與未漆 加TSL-1之對照組比較。參照第8圖，MG-63細皰在以 〇.〇5mg/ml之TSL-1處理24、48及72小時後，可發現其 隨著TSL-1處理之時間愈長，呈現紅色螢光之凋亡細胞數 愈增加。 9.SL-1對於骨肉癌細胞MG-63之細胞凋亡基因Bax及 Bcl-2基因RNA及蛋白質表現的影響 骨肉癌細胞MG-63經0.05mg/ml濃度TSL-1分別處 理24、48及72小時後，以反轉錄聚合無連鎖反應法彳貞測 細胞凋亡基因Bax及Bcl-2之RNA表現量，以及以西方 墨點法偵測Bax及Bcl-2之蛋白質表現量，與未添加TSL-1 之對照組比較。第9a圖顯示RNA電泳結果’第9b圖顯 示Bcl-2 RNA之相對表現量，第9c圖顯示Bax RNA之相 13 200927160 對表現量。參照第9A-9C圖，隨著TSL-1處理MG-63細 胞之時間愈長，凋亡基因Bcl-2之RNA表現量愈下降（24 小時時減少29%、48小時時減少42%、72小時時別減少 75%);而凋亡基因Bax之RNA表現量愈上升（24小時時 增加10%、48小時時增加23%、72小時時增加46%)。 第10a圖顯示蛋白質電泳結果，第10b圖顯示Bax 蛋白質之相對表現量，第l〇c圖顯示Bcl-2蛋白質之相對 表現量。參照第10a-10c圖，隨著TSL-1處理MG-63之 〇 時間愈長，Bcl-2之蛋白質表現量愈下降（24小時時減少 25%、48小時時減少46%、72小時時減少75%);:而Bax 之蛋白質表現量愈上升(24小時時增加9.5%、48小時時 增加23%、72小時時增加55%)。結果顯示，香椿促使 MG-63走向細胞凋亡時，會促使Bcl-2蛋白表現量下降； Bax蛋白表現量上升。 10. TSL-1會造成骨肉癌細胞MG-63走向細胞调亡 我們以西方墨點法測得骨肉癌細胞株MG-63分別經 ❿ TSL-1處理24、48及72小時後，分析多聚ADP-核糖聚 合酶(PARP)的裂解情況，與未添加TSL-1之對照組比較。 參照第11圖，PARP會自116 kDa被裂解為85 kDa，而 且隨著處理TSL-1之時間增加，PARP裂解為85 kDa之 情況亦愈明顯。由此顯示TSL-1可誘導骨肉癌細胞株 MG-63走向細胞调亡。 11. TSL-1 對於骨肉癌細胞 U2-OS、Saos-2 及 MG-63 Cyclophilin A表現量之影響 14 200927160 骨肉癌細胞 U2-OS、Saos-2、以及 MG_63 經 0.05mg/ml 濃度TSL-1分別處理24、48及72小時後，以西方墨點法 债測cyclophilin A之蛋白質表現量，與未添加TSL-1之 對照組比較。參照第12a-12b圖，經香椿處理後之三株骨 肉癌細胞株之cyclophilin A之蛋白質表現量皆呈現上升 之現象，其中尤以U2-OS之表現量較其他二株顯著。 (U2-0S : 24小時組別增加75%、48小時組別增加100%、 72小時組別增加122.5%; Saos-2: 24小時組別增加33%、 _ 48小時組別增加41%、72小時組別增加50% ; MG-63 : 24小時組別.增加55%、48小時組別增加70%、72小時組 別增加78%)。 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以 限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神 和範圍内，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護 範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。 ❹ 15 200927160 【圖式簡單說明】 第1 a-1 b圖顯示本發

Saos-2人類骨肉癌細胞^香捲萃取物可抑制m-〇S及 第2a-2b圖顯示先婉古p _ 未經高壓絲滅菌之香㈣熱滅g之香椿萃取物中比 細胞之增殖。 卒取物更能有效抑制人類骨肉癌 弟3圖顯不本發明 造成影響。 #萃取物不會對人類成骨細胞

時期 第圖，，，、貝示本發明之香椿萃取物使癌細胞停滞在G2/]Vi 上發明之香椿萃取物可促進p21、p53、 p-cdc25C RNA 之表現，而 t λ pD0 表現。 而抑制cdc-2及cyclin B1 RNA之 nr心ώ析士 "月之香椿卒取物可促進P2l、p53、 Ρ ^ 蛋白貝之表現’而抑制cdc-2及cyclin Β1蛋白質

釋出 凋亡 第7圖顯不本發明之香料取物會造成癌細胞LDH的 〇 第8圖顯示本發明之香掩萃取物會促進癌細胞之細胞 第9a-9C圖顯示本發明之香椿萃取物可抑制Bd_2疆 之表現’而促進Bax RNA之表現。 第10a-10c圖顯示本發明之香椿可抑制Bcl_2蛋白質之 表現；而促進Bax蛋白質之表現。 、 第11圖顯tf本發明之香;^可促使pARp蛋自質之分子 量自116kDa被裂解為85kDa。 200927160 第12a-12b圖顯示本發明之香椿可促進骨肉癌細胞株 之cyclophilin A蛋白質之表現。 【主要元件符號說明】 無0 ❹

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Claims (1)

1. 200927160 、由 4&1Ϊ 益 RH · 椿乂:=肉4細胞生長之香格萃取物’其中該香 在加”、':以水卒取香椿以得到—第一 將該粗萃取液以30-100籂曰r 取其射Ρ 3ϋ⑽師目（崎h)的過淚膜過遽而 3.如申請專利範圍第2項所述之 之香椿萃取物，其中_液進_ P…肉癌，，、田胞生長 膝兮味v你 a退步由以下步驟處理： 將該濾液離心以獲得一上清液，以及 爽 清液冷凍乾燥以獲得該香椿萃取物。 •如申请專利範圍第3項所述之抑 之香椿萃取物，其中該香椿萃卩^肉癌細胞生長 菌處理。 勿更包括以一高壓濕熱滅 5.如申請專利範圍第3項所 之香椿萃取物，其中該香椿萃：m肉癌細胞生長 理. 更匕括由以下步驟處 ❹ 將該香椿萃取物裝入一液相 以一醇類依序沖提該逆相層析往: 收集該醇類沖提物。 ’以及 之 理 6.如申凊專利範圍第3項所 香椿萃取物，其中該香椿萃取 卩制骨肉癌細胞生長 : 巧更包括由以下步驟處 將該香椿萃取物以一醇類萃取 將該第二萃取液離心以獲得一羧传—第二萃取液； 將該上清液冷凍乾燥。 上凊液，以及 7.如申請專利範圍第1項所述之抑· 18 G

   200927160 之香椿萃取物，其中該香椿萃取物 椿嫩芽。 自香椿幼椒葉或香 8.如申請專利範圍第5或6瑁所、α 異丙醇、正丁醇、異丁醇或其上述之^甲醇、丙醇、 之香椿卒取物，其中該香椿萃 包生長 叫、P53、P-cdc25及Bax蛋白質的物^見進/肉癌細胞之 長之1 香範圍第1項所述之抑制骨肉癌細胞生 =之香椿T取物’其中該香椿萃取物抑制骨肉癌 cdc-2、cyclmB1及Bcl_2蛋白質的表現。 11.如中請專利範圍第丨項所述之抑制骨肉癌細胞生 ^之香椿卒取物，其中該香椿萃取物促使㈣癌細 L· 。 θ 12.—種用以治療骨肉癌之醫藥組成物，包含一有效 量的申請專利範圍第1項之香椿萃取物，以及一藥學上可 接受之载體或賦型劑。 ^ 13.—種抑制骨肉癌細胞生長之組成物，包括： 一有效量之香椿萃取物，以及 ^ 一藥學上可接受的載體或賦型劑’其中該香椿萃取物 係以下列步驟製得： 在加熱下以水萃取香椿葉以得到一第一萃取液，以及 將該粗萃取液以30-100篩目（mesh)的過濾膜過濾而 取其濾液； 將該濾液離心以獲得一上清液，以及 將該上清液冷凍乾燥。 19