TW200922604A - RNAi-mediated inhibition of aquaporin 1 for treatment of IOP-related conditions - Google Patents

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200922604 九、發明說明： 【發明所肩技術領域3 本發明請求美國臨時專利申請案第60/861,671號，申請 曰2006年11月28曰之權益，該案揭示係以引用方式併入此處。 5 發明領域 本發明係關於干擾性RNA組成物用於眼内壓（ιορ)相 關症狀，諸如眼高壓及青光眼包括正常眼壓型青光眼及開 放隅角型青光眼中，抑制蛋白質水通道蛋白（aquap〇rin)1 (AQP1)表現之領域。 1〇 【先前技術】 發明背景 眼刚節由虹膜及虹膜平面劃分呈為兩個流體填充房， 亦即眼別房及眼後房’其中有連續水狀液的供應。水狀液 係經由睫狀體的處理而分泌入眼後房，通過晶狀體前方與 虹膜後方間之狹窄房空間，且流經瞳孔而流入眼前房。水 狀液由眼前房主要係經由眼小梁網狀物流入許萊姆氏小管 (ScWenim，SCanal)及流入淋巴排液系統而從眼睛排出。水狀 液流出流的最大阻力係由眼小梁網狀物所提供。 水狀液的製造係藉由其流出速率的精巧平衡來維持正 2〇 艮内壓(IOP)。需要適當眼内壓來維持眼睛的形狀，結果 讓眼睛可聚焦影像，且提供壓力梯度來允許水狀液流至無 血管的角膜和晶狀體。任_種速率的微小變化皆可能對眼 内壓造成重大影響。 月光眼毛展的主要風險因子之-為存在有眼高壓（ΙΟΡ 200922604 由 升馬）。IOP的程度也涉及正常眼壓青光眼(NTG)之病因 病人給予降低IOP藥物可獲益可證。於病人一旦對 讀數做中心角膜厚度調整，則將發現其中多個病人患有言 眼壓 目前抗青光眼的治療包括使用抑制水狀液形成之抑制 劑或促進葡萄膜鞏膜流出流之藥劑來降低I 〇 p、雷射眼小梁 塑形術或眼小梁切除術，此乃改進排水之濾出手術。利用 藥物之抗青光眼辦法有各種不期望的副作用。例如縮瞳劑 諸如毛果芸香驗可能造成視力模糊、額頭疼痛及其它視力 10的負面副作用。系統性投予碳酸脫水酶抑制劑(CAI)也可能 造成噁心、消化不良、倦怠及代謝性酸中毒。此外，多種β-阻斷劑由於對肺組織的β_2受體的作用，逐漸引發嚴重肺臟 副作用。擬交感神經作用劑造成心搏過速、心律不整及高 血壓。此等負面副作用皆可導致病人遵從性降低或甚至中 15止治療。此外，目前降低ΙΟΡ治療之功效係每曰相當短時間 即需要重複投藥，某些情況下功效可能隨著時間的經過而 降低。 水通道蛋白（A Q Ρ)屬於可形成開放性、水選擇性孔洞之 膜蛋白，AQP允許於全面性之滲透梯度方向，水快速移動 2〇通過漿骐。眼睛於睫狀體、角膜、晶狀體、網膜、虹膜、 眼小梁網狀物及脈絡膜中各自表現不同的水通道蛋白1、 3 4及5。水通道蛋白i(aqpi)及水通道蛋白4(AqP4)顯然 為睫狀體之非色素性上皮細胞所表現的唯一水通道蛋白’ 睫狀體為水狀液的主要製造來源(Patil等人Exp Eye Res， 200922604 1997;64:203-9; Han, Ζ·等人J Biol Chem, 1998, 273:6001-4) 。無AQP1小鼠及/或無AQP4小鼠報告比較野生型小鼠之 IOP降低高達1.8毫米汞柱，及水狀液的製造降低高達0·9微 升/小時(Zhang等人(2002) J. Gen Physiol 119:561-569)。 5 使用反訊息寡核苷酸抑制AQP1，據報告可減少跨培養 中之睫狀體上皮細胞之水狀液轉運(Patil及Sharif，Curr Top. Pharmacol. 9:97-106, 2005 ; Patil, R.V.等人 Am J Physiol Cell Physiol 281:C1139-C1145, 2001)。此外，對AQP1 具有選擇 性之小型干擾性RNA據報告可於大鼠肝内膽管單元中抑制 10 AQP1 mRNA的表現及蛋白質的表現（Splinter, P丄.等人J. Biol Chem 278:6268-6274, 2003)。由於AQP1 的突變發現表 現型正常的人類出現無功能的水小管（Preston等人，科學， 265:1585-1587 ’ 1994)。但未曾評估此等個體之青光眼。 AQP1之最高眼部表現係於視網膜之莫樂（Muller)細胞 15 及睫狀體上皮的非色素層（Hamann等人1998, Am. J. Physiol. 274:C1332-45; Patil等人1997同文），於該處可調節膜之水滲 透性。小鼠之AQP4的删失據稱可保護避免視網膜缺血性再 灌流傷害(Da等人Invest Ophthalmol Vis Sci 2004; 45:E-摘 要3266) ’於缺乏AQP4之小鼠據報告視網膜功能輕微受損 20 (Li等人1nvest Ophthalmol Vis Sci 2002; 43:573-579)。施用 佛爾醇肉豆蔻酸酯乙酸酯至兔眼由Mittag，TW.等人引述為 可降低眼内壓（Invest. Ophthalmol. Visual Sci· 28, 2057-2066, 1987)。Han等人(J. Biol. Chem. 273:6001-6004, 1998)研究藉佛爾醇酯來調節aqP4水小管活性，原因在於 200922604 據報告佛爾醇酯可降低IOP。透過涉及蛋白質磷酸化機轉， 蛋白質激酶C被描述為可調節AQP4之活性。

Nicchia，GP·等人使用siRNA檢驗於大鼠腦新皮質星狀 細胞中之AQP4之表現（FASEB期刊表現文章 5 10.1096/fj.02-1183fje，2003年6月 17 日線上公開）。AQP4抑 制據較告將導致細胞生長的降低，且由於膜水通透率的降 低’導致細胞收縮率的降低。報告提供AQP4擊落對小鼠、 大鼠及人星狀細胞一次培養之效應之比較(Nicchia，G.P.等 人FASEB期刊表現文章1〇 1〇96/fj 〇4_3281fje，線上公開 10 2〇仍年8月15日），形態表現型對人星狀細胞所造成的結果 據報告也類似大鼠星狀細胞的結果，小鼠星狀細胞的結果 指示只有極為輕度的形態改變。此外，刪除AQP4可提供對 胞毋性腦水腫的保護（Manley等人，2000，自然Med. 6:15-163)。 15 美國公告專利申請案No. 2004/0213782，申請人Wax， 申請日2004年1月30日報告提供治療經由眼内壓升高所介 導之眼部病症之組合治療，包括對個體投予水通道蛋白調 節劑組合水狀液調節劑。據陳述水狀液調節劑典型係藉調 節AQP以外之徑路來降低ιορ。 20 有鑑於IOP對眼高壓及青光眼的重要性，以及先前方法 之治療不足，高度期望發展出控制IOP與治療眼高壓之青光 眼之改良方法。 L發明内容3 發明概要 200922604 本發明提供讓AQPl mRNA之表現寂靜之干擾性 RNA，藉此減少水狀液的製造與提供IOP的降低。如此， AQP1 mRNA表現寂靜結果導致患有I〇p相關症狀病人之眼 内壓降低。本發明之干擾性RN A可用於治療患有丨〇 P相關症 5狀之病人，包括眼鬲壓及青光眼諸如原發性青光眼、繼發 性青光眼、正常眼壓型青光眼及原發性開放隅角型青光眼。 本發明也提供於個體衰減AQPl mRNA之表現之方 法。於一個態樣中’該方法包含對該個體投予-種組成物， 該組成物包含有效量之具有長度為19至49核苔酸之干擾性 10 RNA及藥學上可接受之制。於另-個態樣巾，投藥係投 予個體眼球用來衰減人類之八(^1>1的表現。 於個L樣中，本發明提供-種於個體眼部衰減AQP1 ’包含對個體眼部投行擾性⑽a， n亥干擾|·生RNA包含可識別與SEq ι〇 n㈤及/或① 15 NO:2之mRNA部分之_區’該等序列分別為編碼娜道異 株2及變異株lmeDNA序列，其中AQP1 mRNA之表現 因而被衰減。 此外本發明提供於有需要之個體治療相關症狀之 方法’包含對铺眼部㈣—讀似NA，料含可識別 與sEQID购及/或SEQidn〇:2之一部分相對應之 mRNA邓刀之區’其中因而衰減AqP1 mRNA之表現。 於右干L樣巾’本發明之干擾性rna設計絲定於與 SEQIDN0.1#刀相對應之—她财，其中該部分包含卿 IDN〇:1WS^59、61、62、132' 385、420、422、432、 20 200922604 507、591、598、599、655、656、722、725、756、815、 946、952、990、996、998、1045、1075、1197、1236、1405、 144卜 1442、1526、1600、16(H、1602、1627、1628、65、 67、116、16卜 176、179、196、205、218、279、282、307、 5 341 、 383 、 419 、 43卜 434 、 443 、 470 、 476 、 505 、 540 、 573、578、590、592、597、604、612、613、614、650、 653、662、664、672、673、778、798、800、812、845、 847、或848。於本發明之另一個實施例中，干擾性RNA係 設計來靶定於與SEQ ID ΝΟ:1之一部分相對應之一 10 mRNA，該部分係始於SEQ ID ΝΟ:1之核苷酸59、61、62、 132 、 385 、 420 、 422 、 432 、 507 、 591 、 598 、 599 、 655 、 656 、 722 、 725 、 756 、 815 、 946 、 952 、 990 、 996 、 998 、 1045、1075、1197、1236、1405、144卜 1442、1526、1600、 16(H、1602、1627、1628、65、67、116、16 卜 176、179、 15 196、205、218、279、282、307、34卜 383、419、43卜 434、443、470、476、505、540、573、578、590、592、 597 ' 604 、 612 、 613 、 614 、 650 、 653 、 662 、 664 、 672 、 673、778、798、800、812、845、847、或848。於特定態 樣中，「SEQ ID NO: 1之一部分」長約19核苷酸至約49核苷酸。 2〇 本發明之又一實施例提供一種干擾性RNA，其係設計 來靶定於與SEQ ID N0:2之一部分相對應之一mRNA，該部 分包含或始於核苷酸1793、2058、2059、2060、2143、2149、 2155、2157、2190、2219、2220、2228、2315、2360、2420、 2454、2460、2472、2478或2673。

S 10 200922604 於若干態樣中，本發明之干擾性RNA具有長度約19核 苷酸至約49核苷酸。於其它態樣中，干擾性RNA包含一訊 息核苷酸股及一反訊息核苷酸股，其中各股具有與另一股 至少近完美連續互補之至少19核苷酸之一區，以及其中該 5 反訊息股可識別與SEQ ID ΝΟ:1及/或SEQ ID NO:2之一部 分相對應之AQP1 mRNA部分，以及具有與該部分AQP1 mRNA至少近完美連續互補之至少19核苷酸之一區。訊息 股及反訊息股可藉聯結子序列連接，允許訊息股及反訊息 股彼此雜交，藉此形成如此處所述之髮夾形迴路結構。 10 本發明進一步提供除了一第一干擾RNA之外將一第二 干擾RNA投予個體。該方法包含對個體投予長19至49核苷 酸之一第二干擾RNA，且包含一訊息核苷酸股、一反訊息 核苷酸股’其中各股具有與另一股至少近完美互補之至少 19核苷酸之一區；其中該第二干擾性RNA之反訊息股於生 15理條件下與SEQ ID ΝΟ:1及/或SEQ ID NO:2相對應之 mRNA之一第二部分雜交，以及該反訊息股具有分別與SEQ ID ΝΟ:1及/或SEQ ID NO:2相對應之mRNA之第二雜交部 分至少近完美連續互補之至少19核苷酸之一區。此外，可 以類似方式投予第三、第四或第五等干擾性RNA。於本發 2〇 明之另一個實施例中，第二干擾性RNA向下調節AQP4基因 之表現。於本發明之另一個實施例中，投予靶定於AQP1 mRNA之一干擾性RNA及AQP4 mRNA之一干擾性RNA之 一組合物。靶定於AQP4 mRNA之干擾性RNA容後詳述。 本發明之另一個實施例為一種於一個體衰減AQP1 11 200922604 mRNA之表現之方法，包含對該個體投予一種組成物，該 組成物包含有效量之長19至49核苷酸之單股干擾性RNA及 一藥學上可接受之載劑。用於衰減AQP1之表現，該單股干 擾性RNA於生理條件下’雜交至前文對反訊息股所引述之 5 序列識別子及核苷酸位置相對應之一 mRNA部分。

於又有其它態樣中，本發明之干擾&RNA包含：（a)具 有與SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:14-SEQ ID NO:112 中之任 一者相對應之一mRNA 3’端之倒數π核苷酸，至少9〇%序列 互補或至少90%序列相同度之至少13連續核苷酸之一區；（b) 10 具有與SEQIDNO:3及SEQIDNO:14-SEQIDNO:112中之 任一者相對應之一mRNA 3’端之倒數13核苷酸，至少85% 序列互補或至少85。/〇序列相同度之至少14連續核苷酸之一 區；或（c)具有與SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:14-SEQ ID NO: 112中之任一者相對應之一mRNA 3,端之倒數13核苷 15 酸，至少80%序列互補或至少80%序列相同度之至少15、 16、17、或18連續核苷酸之一區；其中因而衰減aqpi mRNA 之表現。 於又一態樣中，本發明之干擾性RNA或包含本發明之 干擾性RNA之組成物透過局部、玻璃體内、穿鞏膜、眼周、 2〇結膜、囊下、眼房内、網膜下、結膜下、眼球後、或小管 内等途徑投予個體。干擾性RNA或組成物例如可透過活體 内由干擾性RNA表現載體之表現來投予。於若干態樣中， 干擾性RNA或組成物可透過喷霧、經頰、經皮、皮内、吸 入、肌肉、鼻内、眼内、肺内、靜脈内 '腹内、經鼻、經

S 12 200922604 眼、經口、經耳、經腸道外、貼片、皮下、舌下、局部、 或經皮途徑投予。 於一個態樣中，分離本發明之干擾性RNA分子。「分離」 一詞表示干擾性RNA不含其全部天然周圍環境。 5 本發明進一步提供於有需要之個體治療IOP相關症狀 之方法，包含對該個體投予一種組成物包含可透過1^^八干 擾而向下調節AQP1基因之表現之一雙股siRNA分子，其中 該siRNA分子之一股長度分別約為19核苷酸至約27核苷 酸，以及該siRNA分子之一股包含具有與AQP1基因相對應 10之一mRNA實質上互補之一核苷酸序列，故siRNA分子可透 過RNA干擾而指導mRNA的裂解。 本發明進一步提供除了一第一干擾性RNA之外，將一 第二干擾性RNA投予一個體。該第二干擾性RNA可靶定於 與該第一干擾性RNA相同之mRNA標乾，或可把定於不同 15 基因。進一步’可以類似方式投予一第三、第四或第五等 干擾性RNA。 於一個態樣中，本發明之一實施例提供一種組成物包 含如此處所述靶定該AQP1 mRNA之該雙股siRNA分子與 透過RNA干擾而向下調節AQP4基因之表現之一雙股siRNA 20 分子之組合物。一種於有需要之個體治療一IOP相關病症之 方法包含對該個體投予如此處所述之組合組成物構成本發 明之又一實施例。因而可治療該I0P相關症狀。 使用如此處所述之任一實施例製備衰減AQP1 mRNA 之表現之藥物也構成本發明之一實施例。 13 200922604 本發明之特定較佳實施例由後文若干較佳實施例之進 一步細節說明其申請專利範圍將更為彰顯。 圖式簡單說明 第1圖提供以AQPl siRNA#l、#2、#3、及#4及非乾定 5對照組siRNA(NTC2)各自係於l〇nM、ΙηΜ及O.lnM、及—緩 衝液對照組（-siRNA)轉移感染至CH0[AQP1]細胞之AqPi 西方墨點。箭頭指示約23-kDa AQP1帶及42-kDa肌動蛋白帶 之位置。

I：實施方式]I 1〇較佳實施例之詳細說明 此處所述細節僅供舉例說明之用且僅用於本發明之較 佳實施例之說明性討論，為了提供相信為最有用且最容易 了解本發明之多個實施例之原理及構想面相之說明之理由 而提供。就此方面而言，未曾試圖比對本發明有基礎了解 所需更進一步詳細顯示本發明之結構細節。熟諳技藝人士 顯然易知對圖式及/或實例所做說明可如何具體實施本發 明之若干形式。 下列疋義及解釋表示且意圖控制於任何未來之組成結 構，除非於後文實例中明顯無疑義地經修改，或當應用該 定義時造成任何組成結構變成無意義或大致上無意義。於 该術語之組成結構造成及變成無意義或大致上無意義之情 况下將以韋氏字典第3版或熟諳技藝人士已知之任何字典 諸如牛津生物化學及分子生物學辭典（編輯 mith ’牛4大學^版社，牛津2刪年）巾之定義為準。 .··.产 14 200922604 如此處使用，除非另行陳述，否則全部百分比皆為重 量百分比。 如此處使用且除非另行陳述，否則「一」一詞用來表 示「一個」、「至少一個」或「一個或多個」。除非内文另行 5要求’否則此處使用之單數名詞將包括多數，而多數名詞 將包括單數。 本發明係有關使用干擾性RNA來抑制水通道蛋白 l(AQPl)mRNA之表現。AQP1為第一種顯示可發揮作為水 通道之功能之蛋白質。AQP1係於睫狀體之未經著色之上皮 10 (NPE)細胞中表現，睫狀體為水狀液製造之主要來源(Kim 等人J Comp Neurol 2002;452:178-91; Patil等人Exp Eye Res, 1997;64:203-9; Stamer 等人 Invest Ophthalmol Vis Sci; 2003;44:2803-8)。據報告AQP1涉及藉由協助水狀液跨越睫 狀上皮分泌來涉及眼内壓的調節（Zhang, D.L.等人J Gen 15 Physiol, 2002，119(6):561-9; Patil, R.V·等人Am J Physiol Cell Physiol，2001. 281(4):C1139-45)。 根據本發明，由外生性提供或由内生性表現之如此處 所示之干擾性RNA可特別有效用來讓AQP1 mRNA寂靜，藉 此減少水狀液的製造且提供IOP的降低用於治療與高眼壓 20 相關的眼病及青光眼。 干擾性RNA(RN Ai)係雙股RNA(dsRNA)用來讓基因表 現寂靜之一種程序。雖然不欲受理論所限，但RNAi始於藉 11价86111狀酶亦即切碎酶((1&1')，1^八丨始於將長(1810认裂解 成為小型干擾性RNA(siRNA)。siRNA為通常長約19至28核 15 200922604 苷酸’或20至25核苷酸或2i至22核苷酸之dsRNA，常含有2 核苔酸3’懸垂部及5’磷酸端及3,羥基端。siRNA之一股結合 入稱作為RNA誘導寂靜複體（RISC)之核糖核蛋白複體。 RISC使用本siRNA股來識別至少與所結合之siRNA股部分 5互補之mRNA分子’然後裂解此等目標mRNA或抑制其轉 譯。因此結合入RISC之siRNA股稱作為嚮導股或反訊息 股。siRNA股之另一股稱作為乘客股或訊息股則由siRNA中 去除，且係至少部分與標靶mRNA同源。熟諳技藝人士了 解原則上siRNA之任一股皆可結合入RISC且用作為嚮導 10股。但siRNA設計（例如於期望之嚮導股5，端之siRNA二倍體 穩定性降低）有利於期望之嚮導股結合入RISC。 siRNA之反訊息股為siRNA之活性導引劑，原因在於反 訊息股結合入RISC，然後允許RISC識別標靶mRNA，與反 訊息siRNA股至少部分互補來用於裂解或轉譯遏止。具有一 15序列至少與嚮導股部分互補之mRNA經過RISC介導之裂 解，結果導致mRNA之穩定狀態程度及由此mRNA所編碼之 相對應蛋白質之穩定狀態程度的降低。另外，RISC也透過 轉譯遏止來降低相對應之蛋白質的表現，而未裂解標乾 mRNA。 20 本發明之干擾性RNA顯然可以催化方式作用於標乾 mRNA的裂解’亦即干擾性RNA可以低於化學計算量影響 標把mRNA的抑制。比較反訊息治療，於此種裂解條件下 需要顯著較少干擾性RNA來提供療效。 於若干實施例中，本發明提供使用干擾性rNA來抑制

S 16 200922604 AQP1標把mRNA之表現，藉此降低患有I〇p相關症狀病人 之AQP1濃度之方法。根據本發明，干擾性尺\八係於外生性 提供或内生性表現來執行於眼部組織之AQpi表現的寂靜化。 如此處使用「衰減mRNA之表現」一詞表示投予或表 5現定量干擾性RNA(例如MRNA)來經由mRNA的裂解或經 由直接抑制轉譯而減少標靶mRNA轉譯成蛋白質。如此處 使用「抑制」、「寂靜化」及「衰減」#詞係指比較於無本 發明之干擾性RNA存在下，標靶mRNA或相對應蛋白質之 表現，一標靶mRNA或相對應之蛋白質之表現有可量測之 1〇降低。標把mRNA或相對應蛋白質表現之降低俗稱為「擊 落」’且係以相對於投藥後之含量或非標靶對照rna(例如 非把定對照siRNA)之表現報告。此處實施例意圖涵蓋包括 其介於5〇%至1〇〇〇/。間之數量表現之擊落。但用於本發明之 目的並非必要達成此種擊落程度。 15 擊落#見係使肖定量聚合料鎖反應(qPCR)擴大來測 里mRNA程度口平估’或藉西方墨點或酶聯結免疫吸附檢定 分析(EUSA)測定蛋白質含量來評估。分析蛋白質含量可 提供mRNA裂解及轉譯㈣二叙評估。進__步測量擊落 之技術包括RNA溶液雜交、核酸酶保護、北方雜交、以微 扣陣列監視基因的表現、抗體結合、放射性免疫檢定分析、 及勞光活化細胞分析。 ‘屋由觀备IOP相關症狀之改進，諸如眼内壓改進、視野 喪失改進、或視神經頭變化改進(舉例），可於人體或其它哺 乳動物體推定藉本發明之干擾性RNA分子核AQPk表現。 17 200922604 干擾性RNA擊落於例如HeLa細胞之内生性標靶基因 的表現程度之能力可如下於試管内評估。趾故胞係於轉 移感染標準生長培養基(例如以10%胎牛血清補充之讓腹 培養基）之前24小時接種。轉移感染例如係使用達馬費 5 (Dharmafect)1 (達馬康公司（Dharmacon)，科羅拉多州拉法葉) 根據製造商指示於0. InM-l OOnM範圍之干擾性RNA濃度進 行。喜康稠（SiCONTROL)非靶定siRNA及喜康稠嗜週期素 (Cyclophilin) B siRNA(達馬康公司）分別用作為陰性對照及 陽性對照。標靶mRNA濃度及嗜週期素B mRNA(ppiB, 10 NM一000942)濃度係於轉移感染後24小時使用例如塔克曼 (TAQMAN)基因表現檢定分析較佳係重疊標乾位置(應用生 物系統公司（Applied Biosystems) ’加州福斯特城)藉qPCR評 估。當轉移感染效率為100%時，陽性對照siRNA獲得嗜週 期素B mRNA之大致上完全擊落。因此藉參照於以嗜週期素 15 B siRNA轉移感染細胞中之嗜週期素B mRNA濃度，可對轉 移感染效率校正標把mRNA之擊落。標乾蛋白質濃度例如 可於轉移感染後約72小時（實際時間係依據蛋白質之週轉 率決定)例如藉西方墨點評估。由培養後之細胞分離RNA及 /或分離蛋白質之標準技術為熟諳技藝人士眾所周知。為了 20 減少非特定偏離標靶效應之機會，使用可於標靶基因表現 中產生期望之擊落程度之最低可能的干擾性RNA濃度。人 角膜上皮細胞或其它人眼細胞系也可用來評估干擾性RNA 擊落内生性標靶基因濃度的能力。 於一個實施例中，靶定於AQP1 mRNA之一單一干擾性 18 200922604 RNA經投予來降低AQP1濃度。於其它實施例中，投予把定 於AQP1 mRNA之兩種或多種干擾性RNA來降低aqp 1濃 度。於其它實施例中，投予靶定於AQP1 mRNA之干擾性 RNA與乾定於AQP4 mRNA之干擾性RNA之組合物。把定於 5 AQP4 mRNA之干擾性RNA分子實例列舉於臨時專利申請 案USSN60/861,659，申請日2006年11月28日，名稱「用以 治療眼内壓相關症狀之干擾性RNA所介導之水通道蛋白4 的抑制作用」’申請人Jon E. Chatterton等人；及美國專利申 請案-’申請曰-’名亦為「用以治療眼内壓相關 10 症狀之干擾性RNA所介導之水通道蛋白4的抑制作用」，申 請人Jon E· Chatterton等人，各案揭示全文以引用方式併入 此處。 基因存庫（GenBank)資料庫提供AQP1(也稱作為 CHIP28)之DNA序列’存取號碼NM_〇〇〇385(變異株2)及 15 NM_198098(變異株1)，分別係於「序列表單」提供為SEQ m ΝΟ:1 及 SEQ ID NO:2。SEQ ID N〇:l 提供與 mRNA編碼 AQP1(變異株2)相對應之DNA訊息股序列（但以「T」驗其來 取代「U」鹼基）。AQP1變異株2之編碼序列係由核誓酸 58-867 。 20 SEQ ID N〇:2提供與mRNA編碼AQP1(變異株丨)相對應 之DNA訊息股序列（但以「T」鹼基來取代「u」鹼基）。AQpl 變異株1之編碼序列係由核苷酸58-867。交替剪接導致編碼 同一種蛋白質之兩個轉錄變異株。比較轉錄變異株丨，轉錄 變異株2缺於3’UTR之一節段。

19 200922604 則文引述之AQPl mRNA序列之相當物為交替剪接形 式、對偶基因形式、同功酶或其同源關聯形式。同源關聯 株為得自另一種哺乳動物而係與SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID N〇:2同源之AqP1 mRNA(亦即同源基因座）。 5 於若干實施例中，有需要治療IOP相關症狀或有發展成 ZOP相關症狀之風險之一「個體」為患有AQP1之非期望之 或不當之表現或活性相關聯之IOP相關症狀或有患IOP相關 症狀風險之人類或哺乳動物。與此種病症相關之眼部結構 例如包括眼球、視網膜、脈絡膜、晶狀體、角膜、眼小梁 10網狀物、虹膜、視神經、視神經頭、鞏膜、眼前節或眼後 節、或睫狀體。一個體也可為眼部細胞、細胞培養、器官 或活體外器官或組織或細胞。 如此處使用「IOP相關症狀」包括與眼内壓（IOP)升高 相關聯之高眼壓及眼病，諸如青光眼包括正常眼壓型青光 15 眼及開放隅角型青光眼。 如此處使用「siRNA」一詞，除非另行註明，否則係 指雙股干擾性RNA。典型地，本發明之siRNA為包含二核 苷酸股之雙股核酸分子，各股具有約19核苷酸至約28核苷 酸（亦即約 19、20、2卜 22、23、24、25、26、27、或28核 20 苷酸）。「具有長度19至49核苷酸之干擾性RNA」一詞當用 來指稱一雙股干擾性RNA時，表示反訊息股及訊息股個別 具有長度約19至約49核苷酸，包括干擾性RNA分子，此處 訊息股及反訊息股係藉聯結子分子連接。 除了 siRNA分子外，其它干擾性RNA分子及rnA狀分 20 200922604 子可與RISC交互作用且讓基因表現寂靜化。可與RISC交互 作用之其它干擾性RNA分子之實例包括短髮夾 RNA(shRNA)、單股siRNA、微RNA(miRNA)及切碎酶_酶基 質27元體二倍體。可與rISC交互作用之RNA狀分子實例包 5括含有一個或多個化學改性核苷酸、一個或多個非核答 酸、一個或多個去氧核糖核苷酸、及/或一個或多個非磷酸 二酯鍵聯之siRNA、單股siRNA '微RNA、及shRNA分子。 可與RISC交互作用且參與基因表現中之Rise介導變化之 全部RISC分子及RNA狀分子於此處稱作為「干擾性RNA」 10 或「干擾性RNA分子」。因此雙股siRNA、單股siRNA ' shRNA、miRNA及切碎酶-酶基質27元體二倍體屬於「干擾 性RNA」或「干擾性RNA分子」之子集。 發現單股干擾性RNA可執行mRNA的寂靜化，儘管比 雙股RNA更無效。因此，本發明之實施例也提供投予單股 干擾性RNA’其具有與部分SEQ ID ΝΟ:1至少近完美連續互 補之一區。如前文對雙股干擾性RNA引述，單股干擾性RNA 具有長度約19至49核苷酸。單股干擾性RNA具有5’磷酸端 基或於原位或於活體内於5’位置經過磷酸化。「5’磷酸化」 一詞係用來說明例如於多核苷酸或寡核苷酸之5 ’端具有透 20 過酯鍵聯而附接至糖（例如核糖、去氧核糖、或其類似物） 之C5羥基之磷酸根。 單股干擾性RNA可以化學方式合成’或如此處參照雙 股干擾性RNA之說明，藉或活體内轉錄或由載體或表現卡 匣之内生性表現來合成。5,磷酸根可透過激酶添加，或5’ 21 200922604 磷酸根可由於RNA之核酸裂解結果。髮夾干擾性RNA為單 一分子（例如單一募核苷酸鏈），其包含呈柄-環型或髮夾型 結構（例如shRNA)之干擾性RNA之訊息股及反訊息股二 者。舉例言之，shRNA可由DNA載體表現，於該DNA載體 5 中編碼訊息干擾性RNA股之DNA寡核苷酸係藉一短間隔子 而聯結至編碼反向互補反訊息干擾性RNA股之DNA募核苗 酸。若為所選用之表現載體所需，可添加3’端之T及形成限 剪位置之核苷酸。所得RNA轉錄本自我反摺來形成柄-環結構。 此處引述之核酸序列除非另行指示，否則係於5,至3, 10方向寫出。如此處使用「核酸」一詞係指DNA或RNA或包 含存在於DNA(腺嘌呤「A」、胞嘧啶「C」、鳥嘌呤「G」、 胞嘧啶「T」）或存在於RNA(腺嘌呤「A」、胞嘧啶「C」、鳥 嘌呤「G」、尿嘧啶「u」）之嘌呤鹼基或嘧啶鹼基之其改性 形式。此處提供之干擾性RNA可包含「T」鹼基，特別於3, 15端之「T」鹼基，即使「丁」鹼基並非天然出現於RNA亦如 此。「核酸」一詞包括「募核苔酸」及「多核苷酸」，且核 酸係指單股分子或雙股分子。雙股分子係藉A與T鹼基、C 與G鹼基、及八與1;鹼基間之華森克里克鹼基配對而形成。 雙股分子之各股彼此部分互補、實質部分互補或全部互 2〇補，將形成二倍體雜交體’其鍵結強度係依據驗基序列之 互補本質及互補程度決定。 如此處使肖「DNA標序列」-詞係細來衍生本發 明之干擾性RNA之DNA序列。「RNA標靶序列」、「干擾性 RNA標乾序列」及「RNA躲」等詞如此處用來指可藉本 22 200922604 發明之干擾性RNA辨識之AQPl mRNA之一部分序列，藉此 干擾性RNA可如此處討論寂靜化AQP1基因表現。「RNA標 靶序列」、「siRNA標靶序列」及「RNA標靶」典型為與部 分DNA序列相對應之mRNA序列。於與SEQ ID ΝΟ:1或SEQ 5 ID NO:2相對應之mRNA中之標靶序列可於mRNA之5,或3, 未轉譯區以及於mRNA之編碼區。 於若干實施例中’於標靶mRNA序列内部之干擾性 RNA標靶序列（例如siRNA標靶序列）係使用可用之設計工 具選定。與AQP1標靶序列相對應之干擾性RNA隨後藉可表 10現標靶mRNA之分子之轉移感染，接著為如此處所述評估 擊落而於試管内測試。干擾性RNA進一步於活體内使用如 此處所述之動物研究模型評估。 siRNA標乾序列之選擇技術例如係由Tuschl，T.等人 「siRNA使用者指南」，2004年5月6日修訂由洛克斐勒達網 15頁可取得；技術公報#506，「siRNA設計指南」，安必昂公司 (Ambion Inc.)於安必昂網頁；及其它基於網頁之設計工具 例如英維崇貞公司（Invitr〇gen)、達馬康公司、整合Dna技 術公司（Integrated DNA Technologies)、貞司普特公司 (Genscript)或波里葛公司（Pr〇lig〇)網頁而提供。初始搜尋參 20數包括3 5 %至5 5 %間之G/C含量及19核苷酸至27核苷酸間之 slRNA長度。標靶序列可位於mRNA之編碼區或於5,未轉譯 區或3’未轉譯區。標靶序列可用來衍生干擾性RNA分子， 諸如此處所述。 表 1 列舉SEQ ID ΝΟ:1 及SEQ ID NO:2之AQPl DNA標 23 200922604 靶序列之實例，由其中可以前文陳述之方式設計本發明之 siRNA。 表1. siRNA之AQP1標靶序列 AQP1變異株2及變異株1 之共通標靶序列 參照SEQ ID NO: 1之起點 核苷酸號碼 SEQ ID NO: TG6CCAGCGAGTTCAAGAA 59 3 GC CA6C GAGT T CAAGAAGA 61 14 C CAG C GAGT T CAAGAAGAA 62 15 CTTCATCAGCATCGGTTCT 132 16 GCCATCCTCTCAGGCATCA 385 17 GAACTCGCTTGGCCGCAAT 420 18 ACTCGCTTGGCCGCAATGA 422 19 CCGCAATGACCTGGCTGAT 432 20 GCTATGCGTGCTGGCTACT 507 21 TGGACACCTCCTGGCTATT 591 22 CTCCTGGCTATTGACTACA 598 23 TCCTGGCTATTGACTACAC 599 24 GCGGTGATCACACACAACT 655 25 C GGT GAT CACACACAAC T T 656 26 TGGCTGTACTCATCTACGA 722 27 CTGTACTCATCTACGACTT 725 28 ACGCAGCAGTGACCTCACA 756 29 ATGACCTGGATGCCGACGA 815 30 GGACCAAGATTTACCAATT 1075 31 GTAGACACTCTGACAAGCT 946 32 ACTCTGACAAGCTGGCCAA 952 33 GCCAGACCTGCATGGTCAA 990 34 CCTGCATGGTCAAGCCTCT 996 35 TGCATGGTCAAGCCTCTTA 998 36 TTTCTGTTTCCTGGCCTCA 1045 37 CCAAAGTTGCTCACCGACT 1197 38 ATTCTACCGTAATTGCTTT 1236 39 CTTACTGCCTGACCTTGGA 1405 40 GCCTGAGTGACCTCCTTCT 1441 41 CCTGAGTGACCTCCTTCTG 1442 42 CCAGAAGACGTGGTCTAGA 1526 43 TGGAGTTGGAATTTCATTA 1627 47 GGAGTTGGAATTTCATTAT 1628 48 GCGAGTTCAAGAAGAAGCT 65 69 6AGTTCAAGAAGAAGCTCT 67 70 CCACGACCCTCTTTGTCTT 116 71 TCAAATACCCGGTGGGGAA 161 72 GGAACAACCAGACGGCGGT 176 73 ACAACCAGACGGCGGTCCA 179 74 CAGGACAAC GT GAAGGT GT 196 75 GTGAAGGTGTCGCTGGCCT 205 76 24 200922604 TGGCCTTCGGGCTGAGCAT 218 77 CCTCAACCCGGCTGTCACA 279 78 CAACCCGGCTGTCACACTG 282 79 CTGCTCAGCTGCCAGATCA 307 80 TCATGTACATCATCGCCCA 341 81 CCGCCATCCTCTCAGGCAT 383 82 GGAACTCGCTTGGCCGCAA 419 83 GCCGCAATGACCTGGCTGA 431 84 GCAATGACCTGGCTGATGG 434 85 TGGCTGATGGTGTGAACTC 443 86 GCCTGGGCATCGAGATCAT 470 87 GCATCGAGATCATCGGGAC 476 88 GTGCTATGCGTGCTGGCTA 505 89 CCGTGACCTTGGTGGCTCA 540 90 CGGCCTCTCTGTAGCCCTT 573 91 TCTCTGTAGCCCTTGGACA 578 92 TTGGACACCTCCTGGCTAT 590 93 GGACACCTCCTGGCTATTG 592 94 CCTCCTGGCTATTGACTAC 597 95 GCTATTGACTACACTGGCT 604 96 CTACACTGGCTGTGGGATT 612 97 TACACTGGCTGTGGGATTA 613 98 ACACTGGCTGTGGGATTAA 614 99 GCTCCGCGGTGATCACACA 650 100 CCGCGGTGATCACACACAA 653 101 TCACACACAACTTCAGCAA 662 102 ACACACAACTTCAGCAACC 664 103 CTTCAGCAACCACTGGATT 672 104 TTCAGCAACCACTGGATTT 673 105 CGCGTGAAGGTGTGGACCA 778 106 CGGCCAGGT66AGGAGTAT 798 107 GCCA66TGGAG6AGTATGA 800 108 AGTATGACCTGGATGCCGA 812 109 GGGTGGAGATGAAGCCCAA 845 110 GTGGAGATGAAGCCCAAAT 847 111 TGGAGATGAAGCCCAAATA 848 112 AQPl變異株2標靶序列 參照SEQ ID NO:l之起點 核苷酸號碼 SEQ ID NO: CCACACGCCTCTGCATATA 1600 44 CACACGCCTCTGCATATAT 1601 45 ACACGCCTCTGCATATATG 1602 46 AQPl變異株1標靶序列 參照SEQ ID NO:2之起點 核苷酸號碼 SEQ ID NO: CCATCTATCACTGCATTAT 1793 49 GGCATTTGAGCAGCTGAAT 2058 50 GCATTTGAGCAGCTGAATA 2059 51 25 200922604 CATTTGAGCAGCTGAATAA ~2ι〇6〇 52 AGGTCAGCCTTGACCTAAT 2143 53 GCCTTGACCTAATGAGGTA ~2l49 54 ACCTAATGAGGTAGCTATA 2155 55 CTAATGAGGTAGCTATA6T ~2157 56 A6TTCAGAGATCAGGATCA Τΐϊο 57 CTGGATTCTATCTACATAA 2219 58 TGGATTCTATCTACATAAG 2220 59 ATCTACATAAGTCCTTTCA 2228 60 ACAATTACGCAGGTATTTA 2315 61 TTAACTATCACCAGTGCAT 2360 62 CTAGCTCATTTAACAGATA 2420 63 ACGGTTTCAGCTAGACAAT "2454 64 T CAG C TAGACAAT GAT T T G 2460 65 — TGATTTGGCCAGGCCTAGT ~2ΛΤΖ 66 GGCCAGGCCTAGTAACCAA 247T 67 CTGTCTGCTCTGCATATAT 2673 68 如上實施例中引述’熟諳技藝人士可經由參照SEq ID ΝΟ:1或SEQ ID NO:2中之序列位置，且加或刪與seq id ΝΟ:1或SEQ ID NO:2互補或近互補之核苷酸來設計具有長 5 度比表1所提供之序列更短或更長之干擾性RNA。 例如，SEQ ID NO:3表示AQP1 mRNA之19-核苷酸DNA 標靶序列之一個實例，存在於SEQIDNO:l之核誓酸59至77。 5r- TGGCCAGCGAGTTCAAGAA ~3r SEQ ID NO.3 把定SEQ ID NO:3之相對mRNA序列且具有21核苷酸 10 股及一2核苷酸3’懸垂子之本發明之siRNA為： SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 5r- UGGCCAGCGAGUUCAAGIAANN -3 3, -NNACCGGUCGCUCAAGUUCUU -5r 各個「N」殘基可為任一種(a、C、G、U、T)或改性 核苷酸。3’端有多個「N」殘基介於卜2、3、4、5及6間（及 包括）。於任一股上的「N」殘基可為相同殘基（例如UU、 15 AA、CC、GG、或TT)’ 或可相異（例如AC、AG、AU、CA、 26 5=¾ 200922604 CG、CU、GA、GC、GU、UA、UC 或 UG)。3 ’ 懸垂子可相 同或可相異。於一個實施例中，二股具有3’UU懸垂子。 靶定SEQ ID NO:3之相對mRNA序列且具有21核苷酸 股及於各股上之3’UU懸垂子之本發明之siRNA之一個實例為： 5,- UGGCCAGCGAGUUGAAGAAUU _3, SEQ ID NO:6 5 3l- UUACCGGUCGCUCAAGUUCUU -51 SEQ ID NO：7 干擾性RNA也可具有5’核苔酸懸垂子或可具有鈍端。 靶定SEQ ID NO:3之相對mRNA序列且具有19核苷酸股及 鈍端之本發明之siRNA之一個實例為： UGGCCAGCGAGUUCAAGAA -3, SEQ ID NO 8 3,- ACCGGUCGCUCAAGUUCUU -5, SEQ ID NO*9 10 雙股干擾性RNA(例如siRNA)之各股可連接來形成髮 失結構或柄-環結構(例如shRNA)。起定SEQ ID N0.3之相對 mRNA序列且具有19 bp雙股柄區及3，UU懸垂子之本發明 之shRNA之一個實例為：

5»-UGGCCAGCGAGUUCAAGAA N SEQ ID N〇：l〇.

3 *-UUACCGGUCGCUCAAGUUCUU N 15 N為核苷酸A、T、C、G、U或熟諳技藝人士已知之改 性形式。環中之核苷酸N之數目為3至23、或5至15、或7至 13、或4至9、或9至11(含)之數目，或核苷酸數目]^為9。環 中之若干核苔酸可涉及驗基對與環中其它核答酸之交互作 用。可用來形成環之募核苔酸序列之實例包括 20 5’-UUCAAGAGA-3’(Brummelkamp, T.R.等人（2〇〇2)科學 27 200922604 296:550)及5 -UUUGUGUAG-3，(Castanotto, D.等人(2002) RNA 8:1454)。熟諳技藝人士須了解所得單鏈寡核苷酸形成 可與RNAi小機器交互作用之包含一雙股區之柄_環結構或 髮夾結構。 5 前文識別之siRNA標乾序列可於3,端延長來協助切碎 酶-酶基質27元體二倍體之設計。例如，於aqpi DNA序列

(SEQ ID ΝΟ_1)中識別之19核苗酸DNA標把序列（SEQ ID NO:3)由6核苷酸延長，獲得存在於SEq ID n〇:i之核苷酸59 至83之25核苷酸DNA標靶序列： 10 TGGCCAGCGAGTTCAAGAAGAAGCT -3/ SEQ ID NO:11. 用來靶定一 SEQ ID从):11之相對應„11^八序列之本發 明之切碎酶-酶基質27元體二倍體之實例為： 5f- UGGCCAGCGAGUUCAAGAAGAAGCU -3/ SEQ ID NO 12 -UUACCGGUCGCUCAAGUUCUUCUUCGA -5^ SEQ ID N〇!l3. 於訊息股3’端之兩個核笞酸（亦即SEQ ID NO:12之CU 15核誓酸)可為用於促進處理之去氧核苔酸。由19-21核苔酸標 乾序列設計切碎酶-酶基質27元體二倍體，諸如此處所提 供，進一步討論於整合DNA技術公司（IDT)網頁及Kim, D.-H·等人(2005年2月）自然生物技術23:2; 222-226。 由siRNA及其它形式干擾性RNA所指導之標靶RNA裂 20 解反應具有高度序列特異性。例如大致上，siRNA分子含有 序列上與部分標靶mRNA相同之一訊息核苷酸股，及恰與 部分標靶互補之一反訊息核苷酸股來抑制mRNA之表現。 但實施本發明並不要求反訊息siRNA股與標靶mRNA間或 28 200922604 反訊息siRNA股與訊息siRNA間之100%序列互補，只要干 擾性RNA可識別AQP1基因之標靶mRNA及寂靜表現即 可。如此，例如，本發明允許反訊息股與標靶mRNA間之 序列變化’及反訊息股與訊息股間之序列變化，包括不影 5響干擾性RNA分子之活性之核普酸取代，及由於基因突 變、應變多形性或演化分集而可預期之變化，其中該變化 並不排除辨識反訊息股為標靶mRNA。 於本發明之一個實施例中，本發明之干擾性RNA具有 一訊息股及一反訊息股’訊息股及反訊息股包含至少19核 10苷酸之至少近完美連續互補之一區。於本發明之另一個實 施例中，本發明之干擾性RNA有一訊息股及一反訊息股， 該反訊息股包含與AQP1 mRNA之一標乾序列至少近完美 連續性互補之至少19核菩酸之一區，及該訊息股包含與 AQP1 mRNA之一標靶序列至少近完美連續性互補之至少 15 19核苷酸之一區。於本發明之又一實施例中，干擾性rna 包含具有與mRNA内部之相對應標靶序列之3,端之倒數 13、14、15、16、17或18核苷酸具有序列互補百分比或具 有序列相同性百分比之至少13、14、15、16、17或18連、續 核苷酸之一區。該干擾性RNA之各股長約19核苷酸至約49 20 核苷酸，且可包含長度約19、20、21、22、23、24、、 26、27、28、29、30、3卜 32、33、34、35、36、37、38、 39、40、4卜 42、43、44、45、46、47、48、或49核誓酸。 於若干實施例中，本發明之干擾性RNA之反訊息股具 有與標靶mRNA至少19核苷酸至少近完美連續互補。如此 29 200922604 處使用「近完美」表示siRNA之反訊息股為「實質上互補於」 標靶mRNA之至少一部分，及siRNA之訊息股為「實質上相 同於」該標靶mRNA之至少一部分。如熟諳技藝人士已知 「相同度」為藉匹配二順序間之核苔酸順序及相同度所測 5 得之核苷酸序列間之序列相關性程度。於一個實施例中， ' 具有與標靶mRNA序列80%及80%至100%互補，例如85%、 • 90%或95%互補之siRNA之反訊息股可視為近完美互補且 可用於本發明。「完美」連續互補為標準華森克里克之兩相 鄰鹼基對間之鹼基配對。「至少近完美」連續互補包括如此

10處使用之「完美」互補。測定相同度或互補性之電腦方法 經設計來識別核苷酸之最大匹配程度例如BLASTN (Altschul，S.F.等人（1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)。 「相同度百分比」一詞說明於第二核苷酸分子中具有 相等長度之連續核苷酸集合中相同的第一核誓酸分子中之 15 連續核苷酸百分比。「互補性百分比」一詞說明於第一核酸 • 分子中之連續核苷酸其具有華森克里克之定義可與第二核 酸分子中之連續核苔酸集合驗基配對之百分比。 一標靶mRNA與一 SiRNA之一股（訊息股）間之關係為 相同度關係。siRNA之訊息股若存在時也稱作為乘客股。一 20標靶之另一股(反訊息股）間之關係為互補關 係。siRNA之反訊息股也稱作為嚮導股。 siRNA反訊息股可有一區或多區係與SEq m N〇j或 SEQ ID NO:2之一部分非互補。非互補區可位於一互補區之 3’端、5’端或兩端或介於二互補區中間。一區可有—個驗& 30 200922604 或多個驗基。 於一干擾性RNA分子中之訊息股及反訊息股也包含與 另一股不會形成驗基對之核誓酸。例如，一股或二股可包 含額外核苷酸或包含不會與另一股之該位置上的核苷酸配 5對之核苷酸，讓股線雜交時形成突起或不匹配。如此本發 明之干擾性RNA分子包含具有不匹配' G_u擺動或突起之 讯息股及反訊息股。不匹配、G_u擺動、及突起也出現於反 讯息股與其標靶間（例如參考Saxena等人2〇〇3, J. Biol.

Chem. 278:44312-9)。 1〇 雙股干擾性RNA之各股中之一股或二股具有含1至6個 核苷酸之3’懸垂部，懸垂部可為核糖核苷酸或去氧核糖核 甘酸或其混合物。懸垂部之核苷酸並未鹼基配對。於本發 明之一實施例中，干擾性RNa包含丁丁或1111之3，懸垂部。於 本發明之另一個實施例中，干擾性RNA包含至少一個鈍 15蠕。終端通常有5’磷酸基或3,羥基。於其它實施例中，反訊 息股有5’磷酸基，而訊息股有5，羥基。又有其它實施例中， 終端進一步藉共價加成其它分子或其它官能基而修改。 雙股siRNA之訊息股及反訊息股可呈如前文說明之兩 個爭股之二倍體形式，或可為單股分子，此處互補區為驗 20基對，當各區彼此雜交時，藉聯結子分子共價鍵聯來形成 髮失環。相仏該髮夾於分子内係藉蛋白質切碎酶裂解來 形成兩個個別鹼基對RN A分子之干擾性R N A。聯結子分子 也设計來包含一限剪位置，該限剪位置於活體内或於試管 内可藉特定核酸酶裂解。 31 200922604 於一個實施例中，本發明提供一干擾性尺]^八分子，包 含具有與一DNA標靶相對應之一mRNA 3,端之倒數13核苷 酸，至少90°/。序列互補或至少90%序列相同度之至少13連續 核苷酸之一區，該DNA標靶允許於該區内部之一個核苷酸 5取代。本句中並未包括二核苷酸取代（亦即11/13 = 85%相同 性/互補性）。於另一個實施例中’本發明提供一干擾性RNa 分子，包含具有與一DNA標靶相對應之一mRNA 3,端之倒 數14核苷酸，至少85%序列互補或至少85%序列相同度之至 少14連續核苷酸之一區。二核苷酸取代（亦即12/14 = 86%相 10同性/互補性)含括於本句。又一個實施例中，本發明提供— 干擾性RNA分子，包含具有與— DNA標靶相對應之— mRNA 3端之倒數14核苷酸’至少8〇%序列互補或至少8〇〇/〇 序列相同度之至少15、16、17或18連續核苷酸之一區。三 個核誓酸取代含括於本句。 15 以5至3’方向寫成之核酸序列中之倒數第二驗基係在 最末一個鹼基旁，亦即3,鹼基旁。於5，至3,方向寫成之核酸 序列之倒數13鹼基為3,鹼基旁之最末13個鹼基序列但不包 括3’驗基。同理’於5,至3,方向寫成之核酸序列之倒數14、 15、16、17或18驗基為3’驗基旁之最末14、15、16、17或 2〇 18個鹼基序列但不包括3’鹼基。 干擾性RNA可藉化學合成而外生性產生’或藉試管内 轉錄，或使用切碎酶或另一種適當有類似活性之核酸酶裂 解較長的雙股RNA而外生合成。使用習知DNA/RNA合成器 由經保護之核糖核答酸磷酸醯胺酸鹽製造之化學合成之干 32 200922604 擾性RNA可得自商業供應商諸如安必昂公司（德州澳斯 、’丁）、英維崇貞公司（加州卡斯拜德）、或達馬康公司（科羅拉 多州拉法葉）。干擾性RNA可以溶劑或樹脂、沈澱、電泳、 層析或其組合萃取純化。另外，干擾性尺^^人可極少（若有） 5任何純化以免因樣本處理造成的損耗。 當干擾性RNA係藉化學合成製造時，於一股或二股（當 存在時）之5,端之核苷酸之5,位置之磷酸化可提升siRNA功 效及提高結合的RISC複體特異性，但因可於胞内進行磷酸 化故非必要。 10 干擾性RNA也可由質體或病毒表現載體或由最低表現 卡E於内生表現，最低表現卡匣例如為包含一個或多個啟 動基因及干擾性RNA之一適當樣板或多個樣板之pcr產生 的片段。市售shRNA之基於質體之表現載體實例包括皮赛 蘭索（pSilencer)系列成員（安必昂公司，德州澳斯汀）及 15 pCpG-siRNA(英維佛貞公司（InvivoGen)，加州聖地牙哥）。 表現干擾性RNA之病毒載體可衍生自多種病毒，包括腺病 毒、腺體相關病毒、豆狀病毒(例如HIV、FIV及EIAV)、及 疱疹病毒。市售shRNA表現用之病毒載體之實例包括皮賽 蘭索腺（adeno)(安必昂公司，德州澳斯汀）及 2〇 pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST(英維崇貞公司，加州卡斯拜 德）。病毒載體之選擇、由載體表現干擾性RNA之方法、及 傳遞病毒載體之方法為熟諳技藝人士之技巧範圍。藉PCR 產生之shRNA表現卡匣之製造套件組實例包括賽蘭索伊沛 司（Silencer Express)(安必昂公司，德州澳斯汀）及希沛司 3 33 200922604 (siXpress)(麥洛斯公司（Minis) ’威斯康辛州馬迪森）。 於若干實施例中’ 一第一干擾性RNA可透過活體内表 現而由可表現第一干擾性^^八之一第一表現載體投予及一 第二干擾性RNA可透過活體内表現而由可表現第二干擾性 5 RNA之一第二表現載體投予；或二干擾性RNA可透過活體 内表現而由可表現兩種干擾性RNA之一單一表現載體投 予。額外干擾性RNA可以類似方式（亦即透過分開表現載體 或透過可表現多個干擾性RNA之單一表現載體）而投予。 干擾性RNA可由多個熟諳技藝人士已知之真核啟動基 10因表現，包括pol III啟動基因諸如U6或H1啟動基因或p〇l II 啟動基因諸如細胞巨病毒啟動基因。熟諳技藝人士了解此 等啟動基因也適合允許干擾性RNA之可誘導性表現。 於本發明之若干實施例中，干擾性RNA之一反訊息股 於活體内與mRNA雜交成為RISC複體之一部分。 15 「雜交」係指其中單股核酸與互補鹼基序列或近互補 鹼基序列交互作用來形成為氫鍵複體’稱作為「雜交體」 之程序。雜交反應敏感且具有選擇性。於試管試驗中，雜 交特異性（亦即苛刻性）係由預雜交溶液及雜交溶液中之鹽 或甲1胺之濃度控制（舉例）以及由雜交溫度控制；此項程序 20為技农界眾所周知。特別，經由降低鹽漠度，提高甲酿胺 濃度，或提升雜交溫度，可增加苛刻程度。 。牛例S之，咼度苛刻條件出現於約50%甲醯胺於37°C 至42 C。較低苛刻條件出現於約35%至25%甲醯胺於30。(：至 ^雜X之苛刻度條件實例提供於Sambrook，J.，1989， ....£= 34 200922604

分子轉殖：實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，紐約州冷 泉港。苛刻雜交條件之額外實例包括400mM NaC1, 4〇mM PIPES pH 6.4，ImM EDTA，5(TC 或 7(TC 歷 12-16小時，接 著洗務；或於7(T(^1XSSC或於5〇t^lxssc，5〇%甲醯胺 5雜交，接著於7〇。〇於0.3XSSC洗滌；或於7(rCK4XSSC或於 5(TC於4XSSC，50%甲醯胺雜交，接著於67X：k1xssc洗 滌。雜交溫度比雜交體熔點（Tm)低約5_1〇t，此處Tm係使用 如下計算式對長19鹼基對至49鹼基對之雜交體測定：丁/〇 = 81.5+16.6(l〇g10[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N)，此處N為雜 10交體中之鹼基數目及[Na+]為於雜交緩衝液中之鈉離子濃度。 前述試管内雜交檢定分析提供預測一候選者8丨^^八與 一寺示把間之結合是否將具有特異性之預測方法。但於Rise 複體之内文中，一標靶之特異性裂解也可能出現於反訊息 股，反訊息股於試管試驗並未對雜交驗證高度嚴苛度。 15 干擾性!^^人係藉加成、刪失、取代或修改一個或多個 核苷酸而與天然RNA不同。非核苷酸材料可於5,端、3，端戋 於内部結合至干擾性RNA。此種修改常見設計用來增加干 擾性RNA之核酸酶抗性，改良細胞吸收，促進細胞靶定， 協助追蹤干擾性RNA，進一步改良安定性，或降低干擾素 20徑路活化的可能。例如，干擾性RNA可於懸垂部末端包含 一個嘌呤核苷酸。膽固醇利用吡咯啶聯結子軛合至siRNA 分子之訊息股之3’端，也對siRNA提供安定性。 進一步修改包括3’端生物素分子、已知具有細胞穿透 性質之胜肽、奈米顆粒、擬肽化合物、螢光染料、或樹狀 35 200922604 物(舉例）。 核苷酸可於鹼基部分、糖部分或分子之磷酸鹽部分修 改而於本發明之實施例發揮功能。修改包括以燒基、烧 氧基胺基、去叶基、南基、經基、疏基、或其組合取代(舉 5例）肖甘酸可以有較高安定性之類似物取代諸如以去氧核 糖核甘酉夂置換-個核糖核答酸或有糖修改，諸如2,〇11基 由2月女基、2,0-甲基、2,甲氧基基、或2,_〇、4,_c亞甲基橋 所置換(舉例）。核普酸之„票吟類似物或嘴咬類似物之實例包 括η不7、_人黃嘌呤、吖嘌呤、甲基硫腺嘌呤、去吖-腺 10核苔及0-改性核誓酸及Ν_改性核誓酸。核苔酸之鱗酸基可 以氮或以硫（硫代碟酸根）取代磷酸基中之一個或多個氧來 改I·生。改性例如可用來提升功能、改良安定性或渗透性， 或直接定位或乾定。 於若干實施例中，本發明之干擾性分子包括如前文說 15 明之修改中之至少—者。 於若干實_中，本發明提供包含本發明之干擾性 RNA分子之藥學組成物(於此處也稱作為「組成物」）。藥學 組成物為包含高達9 9 %重量比之本發明之干擾性麗或其 鹽混合生理上可接受之載劑介質之配方，載劑介質包括後 20文所述諸如水、緩衝液、食鹽水、甘胺酸、玻尿酸、甘露 糖醇等。本發明之干擾性RNA係呈溶液、懸浮液或乳液投 予。以下為可用於本發明方法之藥學組成物配方實例。

干擾性RNA 數量，重量％ Ά1：21ΐ_〇Λ-99 ； 0.1-50 ; 36 200922604 0.5-10.0 羥丙基曱基纖維素 0.5 氯化鈉 0.8 氯化嶋烧号 0.01 EDTA 0.01 NaOH/HCl 適量加至pH 7.4 純水（不含RNase) 適量加至100毫升 數量，重量％ 干擾性RNA 至多 99 ; 0.1-99 ; 0.1-50 ; 0.5-10.0 磷酸鹽緩衝食鹽水 1.0 氯化嶋烷号 0.01 波利索貝（Polysorbate) 80 0.5 純水（不含RNase) 適量加至100% 干擾性RNA 數量，重量％ 至多 99 ; 0.1-99 ; 0.1-50 ; 0.5-10.0 一驗基破酸鈉 0.05 二驗基填酸納（無水） 0.15 氣化鈉 0.75 EDTA 二鈉 0.05 奎莫佛(Cremophor) EL 0.1 氯化嶋烷号 0.01 HC1及 / 或 NaOH pH 7.3-7.4 純水（不含RNase) 適量加至100% 數量，重量％ 干擾性RNA 至多 99 ; 0.1-99 ; 0.1-50 ; 0.5-10.0 1.0 磷酸鹽緩衝食鹽水 4.0 經丙基-β-壤糊精 適量加至100% 純水（不含RNase) 如此處使用，「有效量」一詞係指干擾性RNA或包含干 37 200922604 擾性RNA之藥學組成物經測定可於哺乳動物產生治療反應 之數量。此種治療有效量易由熟諳技藝人士使用此處所述 方法測定。 大致上，有效量之本發明之干擾性RNA導致於標靶細 5 胞表面之胞外濃度係由至ΙΟΟΟηΜ，或由InM至 400nM，或由5nM至約1〇〇ηΜ ’或約1〇ηΜ。達成此種局部 濃度所要求的劑量將隨多項因素決定，包括遞送方法、遞 送位置、遞送位置與標靶細胞或標靶組織間之細胞層數、 遞送為局部或為系統性等因素決定。於遞送位置之濃度顯 10 著高於標把細胞或標把組織表面之濃度。局部組成物可根 據熟諳技藝之臨床醫師之例行裁決而遞送至標靶器官表面 諸如眼表面，每曰1至4次或以延長之遞送計畫諸如每曰、 每週、每雙週、每月、或更長時間遞送。配方之pH約為pJ1 4.0至約pH 9.0、或約 pH 4.5至約pH 7.4。 15 有效量配方依據多項因素而定，該等因素諸如個體之 年齡、種族及性別、標靶基因之轉錄速率/蛋白質週轉率、 干擾性RNA之強度及干擾性RNA之安定性（舉例）。於一個 實施例中，干擾性RNA係局部遞送至一標靶器官，且以治 療劑量到達含AQP1 mRNA之組織，諸如眼小梁網狀物、視 20 網膜或視神經頭，藉此改善AQP1相關疾病過程。 使用針對AQP1 mRNA之干擾性RNA對病人做治療性 處理相信由於提高作用時間可比較小分子處理有利，因而 允許較低頻率投藥，較高病人順從性，提高標靶特異性， 藉此來降低副作用。 38 200922604 如此處使用「可接受性載劑」係指至多造成微小或無 眼部刺激’若有所需提供適當保藏，且以均勻劑量遞送一 種或多種本發明之干擾性RNA之該等載劑。投予本發明之 實施例之干擾性RNA之一可接受性載劑包括基於陽離子性 5脂質之轉移感染劑TransIT-TKO(麥洛斯公司，威斯康辛州 馬迪森）、里波非廷（LIp〇FECTIN)、里波非他命 (Lipofectamine)、毆里葛非他命(〇lig〇FECTAMInE)(英維 崇貞公司’加州卡斯拜德）或達馬費（達馬康公司，科羅拉多 州拉法葉），聚陽離子類諸如聚伸乙基亞胺；陽離子性胜肽 10諸如泰特(Tat)、聚精胺酸 '或沛尼徹廷(Penetratin)(安提普 (Antp)胜肽）’奈米顆粒；或微脂粒。微脂粒係由標準囊形 成脂質及固醇諸如膽固醇所形成，微脂粒可包括一標無分 子，諸如對細胞表面抗原具有結合親和力之單株抗體（舉 例）。此外，微脂粒可為PEG化微脂粒。 15 +擾性題八可於溶液、於懸浮液、或於生物可溶敍遞 送裝置或非生物可溶姓遞送裝置中遞送。干擾性^^人可單 獨遞达或呈經界定之共價軛合物之成分遞送。干擾性尺^^八 也可與陽離子性脂質、陽離子性胜肽或陽離子性聚合物複 合；與蛋白質、融合蛋白質、或有核酸結合性質之蛋白質 2〇領域(例如精胺)複合；或囊封於奈米顆粒或微脂粒中。組織 特異性遞运或細胞特異性遞送可藉含括適當標靶部分諸如 抗體或抗體片段來達成。 干擾性RNA可透過嘴霧、經頻、經皮、皮内、吸入、 肌肉、鼻内、眼内、肺内、靜脈内、腹内、經鼻、經眼、 39 200922604 經口、經耳、經腸道外、貼片 '皮下、舌下、局部、或經 皮投予(舉例）遞送。 於若干實施例中’眼部疾病以干擾性RNA分子治療可 藉將干擾性RNA分子直接投予眼部來達成。局部投予眼部 5由於多項理由故優異，包括：劑量可小於系統性遞送劑量， 於眼部以外組織分子造成基因標靶寂靜化的機率較低。 多項研究顯示於活體内可成功有效地遞送干擾性rNa 分子至眼部。舉例言之，Kim等人驗證結膜下注射及系統性 遞送siRNA靶定VEGF徑路基因，抑制於小鼠眼部的血管新 10 生（Kim等人，2004，Am_ J. Pathol. 165:2177-2185)。此外， 研究顯示遞送至玻璃體腔之siRNA可擴散遍布眼球，於注射 後5日仍可檢測得（Campochiaro，2006,基因治療 13:559-562)。 干擾性RNA可藉眼部組織注射而直接遞送至眼部，諸 15如眼周、結膜、囊下、眼房内、玻璃體内、眼球内、網膜 下、結膜下、眼球後、或小管内注射；使用套管或其它置 放裝置直接施用至眼部，置放裝置諸如為視網膜丸粒、眼 内嵌體、栓劑或包含多孔、無孔或含凝膠材料之質體；藉 局部眼用滴劑或眼用軟膏劑投予；或於卡迪赛(cui_de_sac) 20中之緩慢釋放裝置或植入相鄰於鞏膜（穿鞏膜）或植入鞏膜 内（鞏膜内）或眼内投予。眼房内注射可經角膜注射入眼房， 俾允許藥劑達到眼小梁網狀物。小管内注射可注入許萊姆 小管（Schlemm’s canal)排水之靜脈收集通道或注射入許萊 姆小管内。 40 200922604 用於眼部遞送，干擾性RNA可與眼用可接受之保藏 劑、助洛劑、界面活性劑、黏度提升劑、滲透提升劑'、緩 衝劑、氯化鈉或水組合來形成水性、無菌、眼用懸浮液戈 溶液。經由將干擾性RNA溶解於生理上可接受之等張水眭 5緩衝液，可製備溶液配方。進一步，溶液可包括可接受之 界面活性劑來協助溶解干擾性RN A。黏度累積劑諸如羥甲 基纖維素、羥乙基纖維素、曱基纖維素、聚乙烯基吡咯啶 酮專可添加至本發明組成物來改進化合物之保持性。 為了製備無菌眼用軟膏配方，干擾性rNA與保藏劑於 10適當媒劑諸如礦油、液體羊毛脂或白軟石蠟中組合。無菌 眼用凝膠配方可根據已知方法經由將干擾性RN A懸浮於由 例如卡玻波（CARBOPOL)-940(BF古立其公司（BF Goodrich)，北卡羅萊納州夏洛特）等之組合製備。例如維斯 科特（VISCOAT)(愛爾康實驗室公司（Alcon Laboratories， 15 Inc.)，德州佛特沃司）可用於眼内注射。其它本發明組成物 含有滲透提升劑諸如奎莫佛及吞恩（TWEEN)80(聚氧伸乙 基山梨聚糖一月桂酸酯，希格瑪亞利須公司（Sigma Aldrich)，密蘇里州聖路易），用於干擾性RNA於眼部滲透 度較低的情況。 20 於若干實施例中，本發明也提供包括衰減如所述之 mRNA於細胞中表現之反應劑之一種套件組。該套件組含 有siRNA表現載體或shRNA表現載體。用於siRNA及非病毒 性shRNA表現載體，套件組也含有轉移感染劑或其它適當 遞送媒劑。用於病毒性shRNA表現載體，套件組可含有病

S 41 200922604 毒載體及/或病毒載體製造所需成分(例如封裝細胞系及包 含病毒載體樣板及額外用於封裝之助手載體之一載體）。該 套件組也含有陽性對照及陰性對照siRNA或shRNA表現載 體（例如非靶定對照siRNA，或靶定於不相關之mRNA之 5 s 1RNA)。套件組也含有評估期望之標靶基因擊落之試劑（例 如定量PCR用之引子及探針，來檢測於西方墨點檢定分析 中對相對應蛋白質之標靶mRNA及/或抗體）c;另外，套件組 包含siRNA序列或shRNA序列，以及藉試管内轉錄產生 siRNA或組成shRNA表現載體所需之指示及資料。 10 進一步提供呈套件組形式之藥學組成物，其係以封裝 形式來提供適合容納一容器裝置與其緊密約束之一載劑裝 置，其包括一干擾性RNA組成物及一可接受之載劑之一第 一谷器裝置。若有所需，此種套件組進一步包括多種習知 藥學套件組組件中之一者或多者，諸如含有一種或多種藥 15學上可接受之載劑之容器、額外容器等，如熟諳技藝人士 顯然易知。印刷指示也可包括於該套件組，印刷指示可呈 仿早形式或標籤形式，指示各成分之投藥量、投藥指南及/ 或各成分之混合指南。 鑑於本揭示内容，熟諳技藝人士了解可未悻離本發明 之精趙及範圍而做出此處所述實施例之顯然易知之修改。 此處揭示之全部實施例皆可鐘於本揭示内容無需經由不必 要之實驗而做出其執行。本發明之完整範圍陳述於揭示部 /刀及其相當實施例。說明書不可視為不當地縮窄本發明所 擁有之完整保護範圍。 42 200922604 =已_示及說明本發明之特定實㈣，但熟諸技 明 性 就择錢化例及其它實施例。如此，可未悖 二之精髓及主要特性，以其它特定形式來實施本發 實施例就各方面而言僅供舉例說明之用 而非限制 本翻之1〖11係由隨附之中請專利範圍指示而 j文說月限制。洛入巾請專㈣圍之定義及相當範圍 内部之申請專利範圍之全部變化皆涵蓋於其範圍。此外， 此地斤述王4公開文件、專利案及申請案係以引用方式併 入此處彷彿全文呈現般。 10 實例 下列實例包括所進行之實驗及所達成之結果僅供舉例 說明之用而非視為限制本發明。 實例1 ^igHQfAQPll細靜化AQp】用之千擾性rna 15 本研究檢驗於培養的CH0[AQP1]細胞中，AQP1干擾性 RNA擊落AQP1蛋白質表現程度之能力。CH〇[AQpl]細胞係 經由使用熟諳技藝人士眾所周知之技術以rat AqP1之表現 載體，藉CHO細胞之穩定轉移感染而產生。 CH0[AQP1]細胞之轉移感染係使用標準試管試驗濃 20 度（〇.MOnM)之大鼠 AQP1 siRNA 及 siCONTROL 非靶定 siRNA#2(NTC2)及達馬費#丨轉移感染試劑（達馬康公司，科 羅拉多州拉法葉）來達成。全部siRNA皆係溶解於lXsiRNA 缓衝液、20mM Κα、6mM HEPES(pH 7.5)、0.2mM MgCl2 水溶液。對照樣本包括緩衝液對照組，其中定量siRNA係以 43 200922604 等量lXsiRNA緩衝液(-siRNA)置換。進行使用anti-AQPl抗 體(Alfred Van Hoek之贈品）之西方墨點檢定分析經進行來 評估AQP1蛋白質表現。AQP1 siRNA為對下列標靶具有特 異性之雙股干擾性RNA : siAQPl#l標碼序列 5 GAACUCACUUGGCCGAAAU，SEQ ID NO:113(衍生自 GAACTCACTTGGCCGAAAT，SEQ ID NO:114，始於二大 鼠AQP1 之nt 423，SEQ ID NO:115) ; siAQPl#2標碼序列 GAUCAACCCUGCCCGGUCA，SEQIDNO:11601^g GATCAACCCTGCCCGGTCA，SEQ ID NO:117，始於SEQ 10 ID NO:115 之 nt 630) ； siAQPl#3 標碼序列 GAGCAUCGGUUCUGCCCUA，SEQIDNO:118nMI CAGCATCGGTTCTGCCCTA，SEQ ID NO:119,始於SEQ ID NO: 115 之 nt 141) ； siAQPl#4 標碼序列 CCACGCAGCAGCGACUUUA，SEQ ID NO:120(衍生自 15 CCACGCAGCAGCGACTTTA，SEQ ID NO:m，始於SEQ ID NO:115之nt 757)。如第 1圖資料所示，siAQPl#3 siRNA 於ΙΟηΜ濃度及InM濃度相較於對照組可顯著降低AQPl蛋 白質之表現，但於O.lnM呈現功效顯著降低。 須了解如文揭不強調本發明之若干特定實施例，全部 20 修改或相當替代例皆屬於如隨附之申請專利範圍所列舉之 本發明之精髓及範圍。 C圖式簡單說明；j 第1圖提供以AQPl siRNA#l、#2、#3、及#4及非乾定 對照組siRNA(NTC2)各自係於l〇nM、InM及O.lnM、及一緩 44 200922604 衝液對照組（-siRNA)轉移感染至CHO[AQP1 ]細胞之AQP1 西方墨點。箭頭指示約23-kDa AQP1帶及42-kDa肌動蛋白帶 之位置。 【主要元件符號說明】 (無） 45

Claims (1)

1. 200922604 十、申請專利範圍： 1. 種於一病人之一眼衰減aqpi mRNA之表現之方法， 匕3對β亥病人之該眼投予可透過RNA干擾而向下調節 AQPI mRNA之表現之—干擾性RNA分子。 5 10 15 20 2. 如申请專利範圍第1項之方法，其中該干擾性RNA分子 為雙股’各股長度分別約為19核苷酸至約27核苷酸。 3_如申s青專利範圍第2項之方法，其中各股長度分別約為 19核苷酸至約25核苷酸。 4·如申清專利範圍第2項之方法，其中各股長度分別約為 19核苷酸至約21核脊酸。 5·如申請專利範圍第2項之方法，其中該干擾性RNA分子 具有純端。 6·如申請專利範圍第2項之方法，其中該干擾性RNA分子 之至少一股包含一3’懸垂部。 7·如申請專利範圍第6項之方法，其中該3,懸垂部包含約1 個至約6個核笞酸。 8·如申請專利範圍第7項之方法，其中該3,懸垂部包含2個 核苷酸。 9·如申請專利範圍第2項之方法，其中該干擾性RNA分子 識別與SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:14-SEQ ID NO:112中 之任一者相對應之AQPI mRNA之一部分。 10.如申請專利範圍第2項之方法，其中該干擾性RNA分子 識別AQPI mRNA之一部分，其中該部分包含： a)SEQ ID ΝΟ:1 之核苷酸59、61、62、132、385、 46 200922604 420、422、432、507、591、598、599、655、656、722、 725、756、815、946、952、990、996、998、1045、1075、 1197 、 1236 、 1405 、 1441 、 1442 、 1526 、 1600 、 1601 、 1602、1627、1628、65、67、116、16卜 176、179、196、 5 205、218、279、282、307、34卜 383、419、43卜 434、 443、470、476、505、540、573、578、590、592、597、 604、612、613、614、650、653、662、664、672、673、 778、798、800、812、845、847、或 848 ;或 b)SEQ ID NO:2之核苷酸 1793、2058、2059、2060、 10 2143 、 2149 、 2155 、 2157 、 2190 、 2219 、 2220 、 2228 、 2315、2360、2420、2454、2460、2472、2478或2673。 11·如申請專利範圍第2項之方法，其中該干擾性RNA分子 包含至少一項修改。 12_如申請專利範圍第2項之方法，其中該干擾性尺]^八分子 15 為 shRNA、siRNA 或 miRNA。 13. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該病人有發展出I〇p 相關症狀之風險。 14. 如申請專利範圍第丨3項之方法，其中該1〇?相關症狀為 青光眼。 20 I5· 一種具有長度約19核苷酸至約49核苷酸之干擾性RNA 分子，該干擾性RNA分子包含 ⑷具有與SEq ID N〇:3及SEq m n〇:14 SEq m N〇:112中之任一者相對應之一 mRNA 3,端之倒數13核 %酉文，至少90%序列互補或至少9〇〇/0序列相同度之至少 47 200922604 13連續核苷酸之—區； (b) 具有與SEQ 出 NO:3及SEQ ID NO:14-SEQ ID N〇.112中之任一者相對應之一 mRNA 3,端之倒數13核 甘酸’至少85%序列互補或至少85%序列相同度之至少 5 14連續核苷酸之一區；或 (c) 具有與SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:14-SEQ ID N0:112中之任一者相對應之一mRNA 3,端之倒數13核 苔酸’至少80%序列互補或至少8〇%序列相同度之至少 15、16、17、或18連續核苷酸之一區。 10 16.如申請專利範圍第15項之干擾性RNA分子，其中該干擾 性RNA分子識別與SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:14-SEQ IDNO:112中之任一者相對應之AQP1 mRNA之一部分。 17_如申請專利範圍第15項之干擾性RNA分子，其中該干擾 性RNA分子識別AQP1 mRNA之一部分，其中該部分包含： 15 (a)SEQ ID ΝΟ:1 之核苷酸59、6卜 62、132、385、 420、422、432、507、591、598、599、655、656、722、 725、756、815、946、952、990、996、998、1045、1075、 1197、1236、1405、144卜 1442、1526、1600、16(Π、 1602、1627、1628、65、67、116、16卜 176、179、196、 2〇 205、218、279、282、307、34卜 383、419、43卜 434、 443、470、476、505、540、573、578、590、592、597、 604、612、613、614、650、653、662、664、672、673、 778 、 798 、 800 、 812 、 845 、 847 、或848 ;或 (b)SEQ ID ΝΟ:2之核苷酸 1793、2058、2059、2060、 48 200922604 2143、2149、2155、2157、2190、2219、2220、2228、 2315、2360、2420、2454、2460、2472、2478 或2673。 18.如申請專利範圍第15項之干擾性RNA分子，其中該干擾 性RNA分子為shRNA、siRNA或miRNA。 5 19.如申請專利範圍第15項之干擾性RNA分子，其中該干擾 性RNA分子包含至少一項修改。 20_如申請專利範圍第15項之干擾性RNA分子，其中該干擾 性RNA分子為雙股，以及其中該干擾性RNA分子之至少 一股包含一 3’懸垂部。 10 21.如申請專利範圍第20項之干擾性RNA分子，其中該3,懸 垂部包含約1個至約6個核苷酸。 22. 如申請專利範圍第21項之干擾性RNA分子，其中該3,懸 垂部包含2個核苷酸。 23. 如申請專利範圍第15項之干擾性RNA分子，其中該干擾 15 性RNA分子為雙股，及該干擾性RNA分子具有鈍端。 24. —種組成物，其包含下列之組合物：透過RNA干擾而向 下調節AQP4 mRNA之表現之一干擾性RNA分子，及透 過RNA干擾而向下調節AQP1 mRNA之表現之一干擾性 RNA分子。 20 25·—種於有需要之個體治療IOP相關症狀之方法，包含對 該個體投予一種組成物，其包含下列之組合物：透過 RNA干擾而向下調節AQP4 mRNA之表現之一干擾性 RNA分子，及透過RNA干擾而向下調節AQP1 mRNA之 表現之一干擾性RNA分子，其中該IOP相關症狀藉此獲 得治療。 49 25 200922604 七、指定代表圖： (一） 本案指定代表圖為：第（1 )圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無） 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 200922604 發明專利說明書

   (本說明書格式、順序及粗體字，請勿任意更動，※記號部分請勿填寫） ※【卩匚分類： ※申請案號：％|4作作 ※申請曰期： 一、 發明名稱：（中文/英文） 用以治療眼内壓Π0Ρ)-相關症狀之干擾性RNA(RNAi)-所介導之水通道蛋白1的抑制 作用 RNAi-MEDIATED INHIBITION OF AQUAPORIN 1 FOR TREATMENT OF IOP-RELATED CONDITIONS 二、 申請人：（共1人） 姓名或名稱：（中文/英文） 愛爾康研究有限公司/ ALCON RESEARCH，LTD. 代表人：（中文/英文） 小巴斯特拉納雅曼多/ PASTRANA, JR., ARMANDO 住居所或營業所地址：（中文/英文） 美國德州福特渥斯•南自由道6201號 6201 South Freeway, Fort Worth, TX 76134, U. S. A. 國籍：（中文/英文） 美國 / U.S.A. 三、 發明人：（共5人） 姓名：（中文/英文） 1. 夏特登瓊 E. / CHATTERT0N, JON E. 2. 派堤萊庫瑪 V. / PATIL, RAJKUMAR V. 3. 莎里夫奈詹 A. / SHARIF, NAJAM A. 4. 克拉克艾保特 F. / CLARK.，ABBOT F. 5. 瓦克斯馬丁 B. / WAX，MARTIN B. 國籍：（中文/英文） 3.-5.美國 /U.S.A. 2. 印度 / INDIA 1 200922604 四、聲明事項： □主張專利法第二十二條第二項□第一款或□第二款規定之事實，其 事實發生日期為：。 0申請前已向下列國家（地區）申請專利： 【格式請依：受理國家（地區）、申請日、申請案號順序註記】 □有主張專利法第二十七條第一項國際優先權： 0無主張專利法第二十七條第一項國際優先權： 1.美國、 2006/11/28、 60/861,671 □主張專利法第二十九條第一項國内優先權： 【格式請依：申請曰、申請案號順序註記】 ]主張專利法第三十條生物材料： □須寄存生物材料者： 國内生物材料【格式請依··寄存機構、日期、號碼順序註記】 國外生物材料【格式請依：寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】 □不須寄存生物材料者： 所屬技術領域中具有通常知識者易於獲得時，不須寄存。 2