TW200911230A - Compounds for the inhibition of histone deacetylase - Google Patents

Description

200911230 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於新穎化合物，其係作為預防或治療與組織蛋 白去乙醯酶（histone deacetylase，HDAC)有關疾病（尤其是 腫瘤或細胞增殖疾病）的藥劑；彼等亦可作為促進神經突 觸生長（neutrite ourgrowth)的藥劑。特別地，本發明化合 物可作為抗神經退化疾病及脊髓肌肉萎縮症（sma)的藥 劑。

【先前技術】 真核DNA係高度組織化並裝配於細胞核中。該組織化及 裝配經由形成複合物結構的蛋白質（包括核心組織蛋白 H2A、H2B、H3及H4)、染色質及〇取的加入而達成。核 心組織蛋白的修飾對染色質之構形改變最為重要。乙醯化 的程度與轉錄活性有關，且乙醯化接著誘導出一個開放染 色質構形，其使得轉錄機組接近啟動子。組織蛋白去乙酿 酶及組織蛋白乙醯基轉移酶（hist賺咖吵咖也職， HAT)為影響轉錄的酶，藉由將接近核心組織蛋白胺端的離 胺酸的ε-胺基選擇性地去乙醯化或乙醢化。hdac為⑴固 酶(同功酶)的家族，由於其涉及基因表現的控制，成為許 多疾病（包括癌症）的主調控者。HDAC的破壞與各種人類 癌症有關；HDAC酶或同功酶似乎涉及多種不同的癌症。 >HDAC抑制劑成為治療固態及血液性惡性腫瘤的新一類 k癌刎近年來’已鑑定出許多結構上歧異的抑制 劑；在細胞培養及動物模式中，彼等抑制腫瘤細胞增生並 123548.doc 200911230 誘導分化及/或凋亡。HDAC抑制引起乙醯化的核組織蛋白 蓄積於腫瘤及正常組織，在活體内，可作為HDAC抑制劑 的生物活性的替代標記。HDAC抑制劑對基因表現的效果 具高度選擇性，導致特定基因的活化（如週期素依賴性激 酶（cyclin-dependent kinase)抑制劑p21WAFl/CIPl)，但抑 制其他基因。HDAC抑制不僅導致組織蛋白的乙醯化，也 導致其他因子的轉錄，如p53、GATA-1及雌激素受體α。 非組織蛋白乙醯化的功能上重要性及HDAC抑制劑誘導腫 瘤細胞生長逮捕、分化及/或凋亡的精確機制正為大量研 究的焦點（Anticancer Drugs. 2002 Jan; 13(1):1-13)。HDAC 抑制劑在目前的臨床試驗上已顯示具有活性且代表基於新 作用機制之具有功效的一類分子標的抗腫瘤劑。 發表於Medical Research Reviews, Vol. 26，No. 4，pp. 3 97-413, 2006的評論論文指出已有四種HDAC抑制劑（短鏈 脂肪酸、烴肟酸、苯甲醯胺及環肽）被報導。以烴肟酸為 主的混雜極性化合物（hybrid polar compound，HPC)為 HDAC抑制劑，其在微莫耳濃度或較低濃度時誘導分化 (Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, NO. 15, August 2, 2000，pp. 1210-1216)。US 6，174,905、EP 0847992、JP 25 88 63/96及日本第1013 89 5 7號申請案揭示誘 導細胞分化及抑制HDAC的苄醢胺衍生物。WO 01/3 83 32 揭示作為HDAC抑制劑的其他化合物。Hum Genet, 2006, 120, pp. 101-110已報導苄醯胺M344在處理SMA患者的纖 維母細胞64小時後，向上調控SMN2蛋白質的表現達到7 123548.doc 200911230 倍。另已有報導指出丁酸納（sodium butyrate)在轉殖基因 鼠中，可減輕脊髓及延髓性肌萎縮的表型表現（Human Molecular Genetics, 2004, Vol. 13, No. 11, pp. 1183-1192)。Trichostatin A，一種HDAC抑制劑，被發現可誘導 MCF-7乳癌細胞中泛素依賴細胞週期素Dl(ubiquitin-dependent cyclin D1)的降解（Molecular Cancer 2006，5:8;該 文獻可 下載自 ： http://www.molecular-cancer.com/content/5/1/8)。US 7,1 69,801 揭示用於抑制 HDAC 之具有式 Z-Q-L-M 或 Z-L-M 的化合物。US 6,888,027 包含一群磺醯胺的HDAC抑制劑，包括PXD101。EP 1 301 184包含作為HDAC抑制劑以治療固態腫瘤的丙戊酸 (valproic Acid)及其衍生物。 然而，仍需要發展新類型的HDAC抑制劑以預防或治療 癌症。 【發明内容】 本發明之目的係提供一種如下式（I)之化合物：

及其醫藥上可接受之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥 及溶劑化物。該等化合物可作為增強神經突觸生長及預防 或治療與HDAC有關疾病（尤其是腫瘤或細胞增殖疾病）的 123548.doc 200911230 n ’彼等亦可作為促進神經生長 Γ合物可…神及㈣：:症:: 【實施方式】 本發明係關於衍生自絡膝^ 神經突觸… 合物’其係作為增強 或細胞增殖疾病）的荜劑1、別地1:疾病（尤其是廬瘤 抗神缚… 本發明化合物可作為 抗耗退化疾病及㈣肌肉萎縮症的藥劑。 本發明之化合物 據此，本發明關於一種如下式⑴之化合物··

Ri (I) 其中 心及1各自獨立為〇H、OC(=〇)烷基、〇_烷基、s烷 基、N-院基、〇_烯基、s_烯基、N_稀基、〇快基、快 基、N-炔基、〇_c3.8環烷基、S_C3 8環烷基、n_Cw環烷 基、〇-不飽和5-至10員單環或雙環、s_不飽和5_至1〇員單 環或雙環、N·不飽和5-至1〇員單環或雙環、燒基、稀 基、炔基、C3-8環烷基、不飽和5_至1〇員單環或雙環、或 飽和或不飽和之包括至少一選自N、〇及8之群組之雜原子 之5-至10員雜環；或 123548.doc -10- 200911230 心及尺]一起形成二氧戊環（dioxlane);

R3及R4各自獨立為OH、0C(=0)烷基、〇-烷基、S-烷 基、N-烷基、0-烯基、S-烯基、N-烯基、Ο-炔基、S-炔 基、N-炔基、0-C 3-8環烧基、S-C3-8環烧基、N-C3-8環燒 基、0-不飽和5-至10員單環或雙環、S-不飽和5-至10員單 環或雙環、N-不飽和5-至10員單環或雙環、或飽和或不飽 和之包括至少一選自Ν、Ο及S之群組之雜原子之5-至10員 雜環； R5為C — i6烷基或C4_i6烯基，其中烷基或烯基為未經取代 或經一或多個Ci_6燒基、OH、鹵素、CN、NO、N3、 NH2、CHO、OR9、SR9、NR9 或 coor9取代； R·6為Cm烧基或Cm稀基，其中烧基或稀基為未經取代 或經一或多個Ci-6统基、0H、鹵素、CN、NO、、 NH2、CHO、0R9、SR9或 NR9 ;或

Rs及Re為之一為氫、函素或OH，另一為c4.16烷基或c4.16 烯基，未經取代或經一或多個C】·6烧基、〇H、NH2、鹵 素、CN、NO或N3取代； R7及各自獨立為氫、鹵素、OH、NH2、COOH、 CHO、CN、NO、Cw烷基（未經取代或經oh、NH2、 COOH、鹵素、CN、NO或CHO取代）、=〇、〇_烧基、s烧 基、N-院基、烯基、S-稀基、N-稀基、〇·炔基、8_炔 基、N-炔基、或I及Rs—起形成一雙鍵、CM烷基、或包 括至少一選自N、Ο及S之群組之雜原子之5_至1〇員雜環； r9為苯基、C(=0)R1()、C(=〇)〇R10或苄基；及 123548.doc -11 - 200911230 R10為OH、ΝΗΟΗ、NH2、Cw烧基、苯基或节基；

及其醫藥上可接受之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前 藥及溶劑化物。 本文中，用語「燒基」代表直或分支烴鏈；烧基較佳為 Cw烷基。烷基之實例包括甲基（_CH3)、乙基（_CH2cH3)、 丙基（-CI^CI^CH3)、異丙基（(Ch3)2CH)及丁基 «Η》。 本文中’用語「烯基」代表直或支鏈之不飽和烴基，其 中不飽和為雙鍵。根據本發明，烯基包括一或多個雙鍵。 烯基較佳為C2.!6烯基。烯基之實例包括乙烯基（_CH=CH2)、 丙烯基（-ch=chch3或-CH2CH=CH2)、丁烯基（_CH2CH=CHCH3 或-CH=CHCH2CH3 或-CH2CH2CH=CH2)、-CH2CH=C(CH3) ch3、-CH2-CH=CH-CH2-CH2-CH=CH-CH3 及-CH2-CH= C(CH3)-CH2-CH2-CH=C(CH3)-CH3。 本文中’用語「炔基」代表直或支鏈之不飽和烴基，其 中不飽和為三鍵。炔基之實例包括丙炔基（即_CH2C三 CH)。 本文中，用S吾「環烷基」代表脂肪族環（飽和碳環）。環 烷基之實例包括環丙基、環丁基、環戊基及環己基。 123548.doc -12- 200911230 基及萘基 本文中’用語「不飽和5_至Η)員單環或雙環」代表不飽 和員單環或雙環（稠合或其他）系統，其實例包括苯 本文中，用語「飽和或不飽和之包括至少—選自Ν、〇 及S之群組之雜原子之5·至1〇員雜環」代表飽和或不飽和 之5-至1〇員雜環系統，其包括至少_個選自ν、嶋之雜

原子，每-基團可視需要經至少—個選自下列群組之取代 基取代：石肖基、經基、氧代、函素、C“6炫基、Cl_6烧氧 基:Cw烷硫基、Ci_6烷羰基，Ci 0烷氧羰基及苯基。上述 雜環之實例包括吡1、哌嗪、嘧啶、吡咯、吡唑、咪唑、 嘍唑、哼唑、異嘮唑、嘧二唑、噚二唑、噻吩、呋喃、喹 啉、異喹啉及彼等之類似物。 本文中，用語「鹵素」代表氟、氯、溴及碘。 本文中，用言吾「醫藥上可接受鹽」包括彼等與有機或無 機酸或驗所形成者。醫藥上可接受酸加成鹽包括彼等與礦 物(如氫氣I、氫溴酸、硫酸及磷酸）或有機酸（如檸檬 酸、酒石酸、乳酸、丙嗣酸、乙酸、三氟乙酸、琥㈣、 草酸、甲酸、反丁烯二酸、蘋果酸、草醋酸、甲烷磺酸、 乙烷磺酸、p-甲苯磺酸、苯磺酸及羥乙基磺酸）形成者。醫 藥上可接受鹼鹽包括銨鹽、鹼金屬鹽（如彼等之鈉及鉀 鹽）、鹼土金屬鹽（如彼等之鈣及鎂鹽）及有基鹼鹽（包括一 級、二級及三級胺）。 本文中’用語「前藥」代表一化合物在身體内轉變（例 如在血液中水解）成其具有醫療效果的活性形式。 123548.doc 200911230 本文中’用語「溶齡物」代表包括本發明化合物及溶 劑的複合物’其中他們反應或他們自其沉澱或結晶。 本文十，用語「立體異構物」為異構物分子，其分子速 接相同但分子的空間排列不同。 本文中，用語「鏡像異構物」代表彼此僅具有鏡像結構 關係但無法令其互相重疊一致的立體異構物，如一個人的 左手及右手是相同但相反的。 根據本發明式⑴化合物之一具體實施例，較佳地，心及 R2各自獨立為oh、OCb6烷基、〇c(=〇)Ci6烷基、〇_苯恭 或〇-苄基；或1^及112—起形成二氧戊環。更佳地，Ri&R2 各自獨立為 OH、och3、〇ch2ch3、〇ch2ch2ch3、 〇c(=〇)ch3、O-苯基或o-苄基。 根據本發明式⑴化合物之一具體實施例，較佳地，尺3及 R4各自獨立為ΟΗ、OCw烷基、〇c(=o)c丨.6烷基、〇_苯暴 或〇-苄基。較佳地，R3及r4各自獨立為OH、〇ch3、 〇CH2CH3、〇CH2CH2CH3、oc(=o)ch3、0-苯基或 〇_f 基。 根據本發明式⑴化合物之一具體實施例，較佳地，為

123548.doc -14- 200911230

HO

〇 HO、 HO' 、N^° H 〆 或 根據本發明式⑴化合物之一具體實施例，較佳地，R6為

根據本發明，本發明之較佳的式（I)化合物係選自下列群 123548.doc -15- 200911230

123548.doc •16- 200911230

123548.doc •17- 200911230

123548.doc • 18- 200911230

123548.doc -19- 200911230 CH, CH·, OCH,

CH, CH, OCH,

?Ha ?h3 〇ch3

.wU

HO CH3 OH 〇

CH3 ch3 och3 HO H3C

OCH3 Ηπ〇γ^γ-0、

H3C ch3 oh o 123548.doc -20- 200911230 本發明係亦關於根據本發明式（i)化合物之立體異構物， 及係如下列式（II)所示：

其中、R2、R3、R4、R5、R6、R7及R8係如上式（I)中戶斤定

義0 根據本發明之一較佳具體實施例，式（I)化合物為具下列 式（III)、（IV)、（V)或（VI)者：

(III)

h3c ch3 ch3 och3 ch3 och3 123548.doc -21 · (IV) 200911230

(V)

(VI) 根據本發明，本發明式（I)化合物可抑制HDAC並因此可 用於預防或治療與HDAC有關的疾病。此外，本發明化合 物顯著抑制多種癌症細胞株的生長，包括鼠C6神經膠質瘤 (C6 glioma)、人類膠狀母細胞瘤（glioblastoma)、人類乳癌 I.細胞、人類血癌細胞及人類黑色素細胞瘤細胞。抑制癌症 細胞生長的機制可經由分化途徑，特別是經由誘導分化及 調控細胞週期調節子基因表現，包括彼等p2 1及細胞週期 素B 1。此外，本發明式（I)化合物可中介神經幹細胞的神經 元分化，且因此可作為抗神經退化疾病的藥劑。 根據本發明化合物的治療用途，投藥劑量將依所使用的 化合物、投藥模式、所欲治療及病症而定。式（I)化合物的 每曰劑量範圍為自1 mg/kg至40 mg/kg。本發明提供在一個 123548.doc -22- 200911230 體抑制HDAC、治療腫瘤或細胞增殖疾病及增加神經突腐 生長的方法，包括分別投藥治療上有效量的本發明化舍物 至該個體。 本發明式（I)化合物的一般合成 本發明化合物可藉—般方法製備。合成此等化合物的適 合方法係提供於實例。一般而言 式（I)化合物可根據下述 合成圖解之一合成： 圖解1

123548.doc • 23- 200911230 圖解2

1： Ri=R2=H 2: Rj=R2二Me 3: R!=R2=Ac A: R1=Me, R2=H 5: R1=R2=Bn 6a: R1=R2=H 6b; Ri=R2=Me 5c: Rff^Ac 6d: R^M©, R2=H 6e: R1=R2=8n

Phi(OAc)2, MeCN △

1: =r2=h 7a: RpF^H 2: Ri=R2=Me 7b： R!=R2=Me 3： R-i=R2=Ac 7c: R1=R2=Ac 4: R^Me, R2=H 7d: R,=Me, R2=H 5: R1=R2=Bn 7e: R1=R2=Bn 123548.doc 24- 200911230 圖解3

ch3 ORi h3c〜 R!。 Γτ0τ ^ TsOH, CH2CI2 H3〇^〇 ch3 W or2 oh rt 1： Ri=R2=H 2: R-,=R2=Me 3: R1=R2=Ac 4: Ri=Me, R2=H 5: R1=R2=Bn 8a: Ri=R2=H 8b: R1=R2=Me 8c: R1=R2=Ac 8d: Rt=Me, R2=H 8e: Ri=R2=Bn

9b: R-j=R2=Me 9c: R1=R2=Ac 9d: R^Me, R2=H 9e: R1=R2=Bn 10a: Ri=R2=H 10b; R1=R2=Me 10c: R1=R2=Ac 10d: R^Me, R2=H 10e: R1=R2=Bn MCPBA, CH2CI2

ch3 ch3 OR, h3c^^ tVRi 1)RNH2l ch2ci2 Ri〇 iPT〇T 2> H2S04-THF, rt ch3 or2 nhr ΌΗ

11a: R1=R2=H 11b: R!=R2=Me 11c: Rt=R2=Ac 11d: Rt=Me, R2=H 11e: R-j=R2=Bn 12a: R1=R2=H 12b: R1=R2=Me 12c. R^—R2~Ac 12d: R-i=IVle, Rs=H 12e: R-j=R2=Bn 123548.doc -25- 200911230 圖解4

NaBH4, MeOH rt DEAD, Ph3P hn3

123548.doc 26- 200911230 圖解5

OMe

18a: R=CH3 18b: R=CH3CH2 18c: R=Bn 18d: R=(CH3)2CH

19a: R=CH3 19b: R=CH3CH2 19c: R=Bn 19d: R=(CH3)2CH

123548.doc -27- 200911230 圖解6

123548.doc -28- 200911230 圖解7

24b R=i-propyl 24c R=Bn 24d R=Bz 24e R=Ac 25c R=Bn 25d R=Bz 25e R=Ac Ω

26a R=Me 26b R=i-propyl 26c R=Bn 26d R=Bz 26e R=Ac 27a R=Me 27b R=i-propyl 27c R=Bn 27d R=Bz 27e R=Ac 123548.doc O NH2〇H, EtOH, KOH △

28a R=Me 28b R=i-propyI 28c R=Bn 28d R=Bz 28e R=Ac -29· 200911230 圖解8

式（I)化合物中R!、R2、R3及R4的甲基化可藉由下列程序 達成：混合反應物、K2C03及丙酮與Me2S04，並加熱及攪 拌該溶液；在控制的氣體（例如，N2)中迴流所得溶液一段 期間；去除有機溶劑，將殘餘物溶解於特定有機溶液並以 123548.doc -30- 200911230 x仴’先，在減壓下藉蒸發乾燥有機層並藉矽膠管柱 (EtOAc:n-己烷=1:4)純化產物。 中添加OH至雙鍵可藉下列程序完成：將反應物 於而之溶液添加至冰浴中之H2S〇4;添加後，攪拌該溶 液一段_並接著以水稀釋；以適合的有機溶液（例如 ch2ci2)萃取該混合物；在減壓下藉蒸發乾燥合併的有機 層以得到殘餘物，並藉矽膠管柱純化產物。 化合物6a-e及7a_e的製備係示於圖解。蜂膠素 G(Pr〇P〇丨in G)，其為已知的蜂膠衍生物，以對應的反應條 件被曱基化、乙醯化、rigio_seleetively甲基化及节基化產 生化合物2至5並接著藉1-5的酸水合分別提供標的二氫黃 酮6a-e。亞碘醯苯二乙酸鹽（i〇d〇s〇benzene diacetate)氧化 接著1-5的酸水合而得到對應的黃酮7a_e。 化合物10a-e及12a-e之製備如圖解3所示。硼氫化鈉 (sodium borohydride)還原並接著^的去水合而得到對應 的化合物9a-e。9a-e的酸水合分別產生標的化合物1〇a_e ^ 9a-e的MCPBA環氧化（epoxidati〇n)提供環氧化物Ua_e，及 接著以對應|iC(如甲基胺’乙基胺及enZylarnine)分別進行 親核性反應得到標的化合物12a-e。 化合物14-17之合成如圖解4所示。l〇b的Mitsunobu反應 得到所欲的疊氮化物（azide)13，及接著鈉反應轉變疊氮化 物為二級胺14。將1 〇b以三溴化磷進行溴化反應，以紛硫 醇（phenol thiol)進行硫化反應及以亞硫醯氣（thi〇nyl chloride)進行氣化反應分別提供溴化物15，硫醇醚17及氯 I23548.doc -31 - 200911230 化物16。 如圖解5所述製備化合物1 8a-d及19a-d。以對應的醯基氣 (如乙醯基、丙醯基、苄醯基及異丁醯基）乙醯化化合物l〇b 而分別得到化合物1 8a-d。以對應的烷基碘（如甲基碘、乙 基碘、苄基碘及異丙基碘）烷基化化合物l〇b而分別得到化 合物19a-d。 如圖解6所示合成化合物22。化合物6b的三級醇與漠乙 酸乙酯在氫化鈉存在下反應得到化合物20。化合物2〇的驗 性水解形成化合物21並接著與羥基胺反應產生羥胺酸22。 如圖解7所述製備羥胺酸28a_e。化合物i與原甲酸三甲 酉曰在酸性條件下反應得到縮丙酮23(acetonide 23)並接著與 院基碘（如曱基、異丙基及苄基）烷基化，或與苄醯基氣及 醋酸肝醯基化分別形成化合物24aw化合物24a_e的兩個 終端烯烴的酸性水合而得到化合物25a_e，並接下來與演 乙酸乙S曰反應得到化合物26a-e。化合物26a-e的驗性水解 形成化合物27a-e，並接下來與羥基胺反應分別產生羥胺 酸 28a-e。 本發明之醫藥組合物 式⑴化合物及其醫藥可接受鹽、立體異構物、對映異構 物、Θ藥及溶劑合物可以其本身使用；但一般以醫藥組合 物形式投藥，其中式（I)化合物/鹽/溶劑合物（活性成份）與 醫藥可接受賦形劑、稀釋劑或載劑結合。視投藥模式而 定’醫藥組合物較佳包含1〇至3〇重量❶/。，更佳為3〇至5〇重 量％ ’另更佳為50至70重量％，及甚至更佳為70至1〇〇重量 123548.doc -32- 200911230 % ’的活性成份；所有重量百分比係基於總組合物。此 外，本發明醫藥組合物可另包含其他預防或治療#hdac 相關的疾病。 本發明醫藥組合物可被全身投藥，如以錠劑、膠囊、糖 t、粉末或顆粒形式藉由口服投藥；或以溶液或懸浮液形 <藉由非經腸口服投藥；或藉由皮下投藥；或以栓劑形式 藉由直腸投藥；或透皮給藥。 本發明化合物及醫藥組合物為HDAC抑制劑，且可在細 胞長時間保留並連續地誘導組織蛋白H4的乙醯化。他們為 誘導細胞及神經幹細胞分化的HDAC抑制劑。此外，本發 明化合物顯著抑制HDAC活性。本發明化合物以劑量依賴 性方式顯著降低細胞的8及G2/M相並改變癌細胞的形態。 因此’本發明化合物可治療腫瘤或細胞增生性疾病。此 外，本發明化合物可增加神經突觸生長並治療神經退化疾 病及人類骨髓肌肉萎縮症。 實施例 下列實施例說明合成及使用本發明化合物的較佳方法： 實例 1 3，，4，，5，，7，-四甲基蜂膠素 G (3，，4，，5，，7，_tetramethyN propolin G) (2) 添加 Me2S〇4(15.76 mL，126 mmol)於蜂膠素 G(1.5g， 10.16 mmol)、K2C03(16.27 g，117.89 mmol)及丙酮（280 mL)的混合物並在氮氣下加熱迴流24小時。去除有機溶劑 後，將殘餘物溶解於CH2C12 (80 mL)並以水（40 mLx3)清 洗。以NaeCU乾燥CHzC!2層並在減壓下蒸發。所得殘餘物 123548.doc -33- 200911230 以石夕膠管柱（EtOAc :正己烧=1:6)純化得到化合物2 (4·00 g » 70%) : ^-NMR (400 MHz, CDC13) 7.26 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.86 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.27 (1H, s), 5.50 (1H, dd, J=2.5, 13.5 Hz), 5.14-5.11 (1H, m), 5.11-5.10 (1H, m), 5.02-4.99 (1H, m), 3.87 (3H, s), 3.83 (3H, s), 3.79 (6H, s)5 3.50 (1H, dd, J=6.6, 15.2 Hz), 3.43 (1H, dd, J=5.8, 15.2 Hz), 3.00 (1H, dd, J=13.5, 16.7 Hz) , 2.68 (1H, dd, J=2.6, 16.7 Hz), 2.00-1.92 (2H, m), 1.75 (3H, s), 1.70 (3H, s), 1.65 (3H, s), 1.60 (3H, s), 1.52 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDC13) 189.4 (s), 164.0 (s), 163.3 (s), 159.6 (s), 153.0 (s), 147.2 (s), 135.6 (s), 134.2 (s), 131.5 (s), 131.3 (s), 129.8 (s), 124.1 (d), 122.8 (d), 122.7 (d), 122.1 (d), 118.2 (s), 110.3 (d), 108.7 (s), 95.6 (d), 75.9 (d), 61.8 (q), 60.7 (q), 55.7 (q), 55.7 (q), 45.1 (t), 39.6 (t), 26.6 (t), 25.7 (q), 25.6 (q), 24.9 (t), 22.0 (t), 17.7 (q), 17.6 (q), 16.3 (q); HREIMS Calcd for C34H44〇6 (M) 548.3142, Found 548.3140 ° 實例2 6-(2-經基-2-甲基丁基）-2-(7-經基-3,7-二甲基辛-2-稀基）-3’，4’，5,7-四甲氧基黃酮（61)) 49% H2SO4(140 mL)在冰浴中加入化合物2(7 g，12.77 mmol)於THF (170 mL)的溶液。完全添加後，在室溫下擾 拌反應混合物8小時，並接著以h2〇稀釋。以CH2C12 (100 mLx3)萃取反應混合物。合併的有機層經Na2S〇4乾燥並在 減壓下蒸發而得到殘餘物，該殘餘物以矽膠管柱（正己 123548.doc -34 - 200911230 烧：EtOAc=l: 1 〜1:3)純化而得到純油 6b(2.30 g ’ 34¾). ^-NMR (400 MHz, CDC13) 7.27 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.87 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.28 (1H, d, J=2.6 Hz), 5.49 (1H, dd, J=2.4, 13.6 Hz), 5.05 (1H, t, J=6.0 Hz), 3.87 (3H, s), 3.84 (3H, s), 3.79 (6H, s), 3.52 (1H, dd, J=5.5, 15.2 Hz), 3.43 (1H, dd, J=7.6, 15.2 Hz), 2.97 (1H, dd, J=8.0, 16.7 Hz), 2.70-2.59 (3H, m), 1.93 92H, t, J=6.4 Hz), 1.65 (3H, s), 1.64-1.60 (2H, m), 1.41-1.32 (4H, m), 1.25 (6H, s), 1.15 (3H，s)，1_14 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDC13) 189.4 (s) , 164.0 (s), 163.3 (s), 159.6 (s), 153.0 (s), 147.2 (s), 135.6 (s)5 134.2 (s), 131.5 (s), 131.3 (s), 129.8 (s), 124.1 (d), 122.8 (d), 122.7 (d), 122.1 (d), 118.2 (s), 110.3 (d), 108.7 (s), 95.6 (d), 75.9 (d), 61.8 (q), 60.7 (q), 55.7 (q), 55.7 (q), 45.1 (t), 39.6 (t), 26.6 (t), 25.7 (q), 25.6 (q), 24.9 (t) 5 22.0 (t), 17.7 (q), 17.6 (q), 16.3 (q); HREIMS Calcd for C34H4808 (M) 584.3338，Found: 584.3344 o 實例3 6-香葉基-3，，4，，5,7-四甲氧基黃酮（6-〇6以1^1· 3’，4’，S，7-tetramethoxyflavanone) (30)的製備 將Me2S〇4(0.25 mL，2.48 mmol)加入化合物29(蜂膠素 C，128 mg，0.31 mmol)、K2C03(431 mg，3.1 mmol)及丙 綱（15 mL)的混合物，並將所得溶液在氮氣下加熱迴流24 小時。去除有機溶劑後，將殘餘物溶解於CH2Cl2(5〇 mI〇 並以H2〇(5 0 mLx3)清洗。有機層以]^32；5〇4乾燥並在減壓下 蒸發。所得殘餘物以石夕膠管柱（Et〇Ac :正己烧=1:4)純化 123548.doc •35· 200911230 而得到化合物 33(107 mg，72%) : h-NMR (400 MHz, CDC13) 6.99-6.97 (2H, m)5 6.88 (1H, d, /=8.8 Hz), 6.31 (1H, s), 5.33 (1H, dd, J=2.8, 13.3 Hz), 5.11 (1H, td, J=l, 6.9 Hz), 5.04(1H, td, J=1.3, 5.5 Hz), 3.90 (3H, s, OMe), 3.88 (3H, s, OMe), 3.81 (3H, s, OMe), 3.80 (3H, s, OMe), 3.34 (1H, dd, J=7.2, 14.1 Hz), 3.26 (1H, dd, /=7.2, 14.1Hz), 3.02 (1H, dd, J=13.3, 16.7 Hz), 2.74 (1H, dd, J=2.8, 16.7 Hz), 2.04-2.00 (2H, m), 1.96-1.92 (2H, m), 1.74 (3H, s), 1.62 (3H, s), 1.55 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDC13) .189.1 (s), 164.1 (s), 163.0 (s), 159.4 (s), 149.5 (s), 149.4 (s), 131.3, 131.2 (s), 124.4 (d), 122.9 (d), 118.9 (d), 109.5 (d), 108.9 (s) 5 95.7 (d), 79.2 (q), 61.9 (q), 56.1 (q), 56.0 (q), 55.9 (q), 45.6 (t) , 39.8 (t), 26.7 (t), 25.7 (s), 22.0 (t), 17.7 (q), 16.1 (q)； HREIMS Calcd for C29H3606 (M) 480.2510, Found 480.25 U。 實例4 6-(2,6-二羥基-2,6-二甲基-辛基）-3，，4’，5,7-四甲氧基 黃酮（31)的製備 49% H2S〇4(4 mL)在冰浴中加入化合物30(80 mg，〇. 17 mmol)於THF (6 mL)的溶液。完全添加後，在室溫下攪拌 反應混合物8小時，並接著以H20稀釋。以CH2C12 (50 mLx 3)萃取反應混合物。合併的有機層經Na2S04乾燥並在減壓 下蒸發而得到殘餘物，該殘餘物以石夕膠管柱（0-3%

MeOH/CH2Cl2)純化而得到純油 31(44mg，50%) : h-NMR (400 MHz, CDC13) 6.99-6.97 (2H, m), 6.88 (1H, d, J=8.8 Hz), 6.31 (1H, s), 5.33 (1H, dd, J=2.8, 13.3 Hz), 3.90 (3H, s, OMe), 3.88 (3H, s, OMe), 3.84 (3H, s, OMe), 3.82 (3H, s 123548.doc • 36- 200911230 OMe)，3.02 (1H，dd，J=13.3，16 Hz)，2.75 (1H，dd，*/=2.8, 16Hz), 2.62-2.58 (2H, m), 1.63-1.59 (7H, m)5 1.49-1.48 (2H，m), 1.23 (3H，s), 1.22 (3H，s)，1.21 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz，CDC13) 189.1 (s)，164.1 (s), 163·0 (s)，159.4 (s)， 149.5 (s)，149.4 (s)，131.2 (s)，ii9 〇 ⑷，118 9 ⑷，U1 3 (d)，109.5 (d)，108.9 (s)，95_8 ⑷，72.9 (s)，71·1 (s)，62.1 (q)，56.0 (q)，55.9 (q)，45.5 ⑴，44 5 ⑴，42 3 ⑴，42」⑴， 41.5 ⑴，29.4 (q)，29.3 (q)，26.9 (q)，26.8 (q)，18.8 ⑴，17.5 (t); HREIMS Calcd for (M-18) 498.2602, Found 498.2610 〇 實例5蜂膠素A (33)的製備 490/〇 H2S04(4 mL)在冰浴中加入蜂膠素D(化合物32，ι〇〇 mg，0.24 mmol)於THF (6 mL)的溶液。完全添加後，在室 溫下攪拌反應混合物8小時，並接著以h2〇稀釋。以CH2C12 (50 mLx3)萃取反應混合物。合併的有機層經Na2S04乾燥 並在減壓下蒸發而得到殘餘物，該殘餘物以矽膠管柱（〇_ 30/〇 MeOH/CH2Cl2)純化而得到純油〗〗^:!!^，^%):1!!- NMR (400 MHz, MeOD) 6.87 (1H, d, J=8.4 Hz), 6.71 (1H, d, J=8.4 Hz), 5.88 (2H, dd, J=1.9, 3.3 Hz), 5.47 (1H, dd, J=2.6, 13 Hz), 5.12 (1H, dd, J=5.7, 6.7 Hz), 3.47 (2H, d, J=6.6 Hz), 3.10 (1H, dd, J=13.4, 17 Hz) , 2.60 (1H, dd, J=2.7, 17.1 Hz), 1.94 (1H, dd, J=6.6, 13.4 Hz), 1.64 (1H, d, J=0.5 Hz), 1.43-1.41 (2H, m), 1.37-1.34 (2H, m), 1.13 (3H, s), 1.12 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDC13). 198.2 (s), 123548.doc -37- 200911230 168.5 (s), 168.4 (s)，165.5 (s)，165.4 (s)，165.2 (s)，146.5 (s) ，144.5 (s)，135.8 (s)，129.7 (s)，128.2 (s)，124.7 (d)， 118.7 (d), 113.6 (d), 103.2 (s), 97.1 (d), 96.2 (d),77.8 (d), 71.5 (s), 44.3 (t), 43.7 (t), 41.2 (t), 29.2 (q), 29.1 (q), 25.4 (t) ，23.7 (t)，16.2 (t) 〇 實例6 3，，4，，5,7-四乙醯基蜂膠素〇(34)的製備 將醋酸肝（2 mL)加入蜂膠素D(化合物32，124mg，0.29 mmol)於嘧啶的溶液並在室溫下搜拌反應混合物6小時。將 EtOAc (25 mL)加入反應混合物並以〇_in HCl(10mLx3)清 洗混合物。以NajO4乾燥有機層並在減壓下蒸發而得到殘 餘物。該殘餘物以矽膠管柱（Ci^Ch)純化而得到純油34 (139mg » 80%) ： !H-NMR (400 MHz, CDC13) 7.49 (1H, d, J=8.6 Hz), 7.18 (1H，d，J=8.6 Hz)，6.72 (1H，d，J=2.2 Hz), 6.53 (1H, d, J=2.2 Hz), 5.60 (1H, dd, J=2.5, 13.8 Hz), 5.01 (1H, td, J = 5.3, 4.6 Hz), 4.94 (1H, td, J=1.0, 5.8 Hz), 3.35 (1H, dd, J=7.1, 15.7 Hz), 3.26 (1H, dd, J=5.3, 15.5 Hz) 2.98 (1H, dd, J=13.8, 16.8 Hz), 2.36 (3H, s), 2.27 (6H, s), 2.26 (s, 3H), 2.02-1.91 (5H, m), 1.64 (3H, s), 1.62 (3H, s), 1.55 (3H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDC13). 188.8 (s), 169.2 (s), 168.1 (s), 168.0 (s), 167.9 (s), 163.2 (s), 155.9 (s), 151.3 (s), 142.8 (s), 140.9 (s), 137.0 (s), 135.2 (s), 133.5 (s)，131.6 (s)，124.5 (d)，123.9 (d)，121.6 ⑷，120.7 ⑷， 111.6 (s), 110.7 (d), 109.0 (d), 76.1 (d), 44.8 (t), 39.4 (t), 26.5 (t), 25.6 (t), 25.5 (q), 21.1 (q), 21.0 (q), 20.7 (q), 20.3 123548.doc 38· 200911230 (q)，17.7 (q)，16.3 (q)。 實例7 3’，4’，5,7-四甲基蜂膠素1)(35)的製備 將 Me2SO4(0.25 mL，2.48 mmol)加入化合物 32(128 mg， 0.31 mmol)、K2C03(431 mg，3.1 mmol)及丙晒（15 mL)的 混合物’並將所得溶液在氮氣下加熱迴流24小時。去除有 機溶劑後’將殘餘物溶解於CH2C12(50 mL)並以H2O(50 mL X3)清洗。有機層以Na2S04乾燥並在減壓下蒸發。所得殘 餘物以石夕膠管柱（EtOAc :正己烧=1:4)純化而得到化合物 35(107 mg > 72%) ： 'H-NMR (400 MHz, CDC13) 7.26 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.85 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.10 (1H, d, J=2.3 Hz), 6.07 (1H, d, J=2.3 Hz), 5.34 (1H, dd, J=2.6, 13.5 Hz), 5.04 (1H, td, J=5.3, 4.6 Hz), 4.99 (1H, td, J=1.0, 5.8 Hz), 3.88 (3H, s), 3.86 (3H, s) , 3.80 (3H, s), 3.74 (3H, s), 3.46 (1H, dd, J=6.6, 15.2 Hz), 3.44 (1H, dd, J=5.8, 15.2 Hz), 3.02 (1H, dd, J=13.5, 16.5 Hz), 2.69 (1H, dd, J=2.6, 16.5 Hz), 2.00-1.97 (2H, m), 1.94-1.92 (2H, m), 1.65 (3H, s), 1.60 (3H，s)，1.52 (3H，s)。 實例8 3’,4，，7-0-三甲基蜂膠素G(4)的製備

123548.doc •39- 200911230 將 Me2S04(2.17 mL，17.35 mm〇l)加入蜂膠素 G(2.30g， 2.75 mmol)、K2C〇3(i.94g，1399 mmol)及丙酮（80 niL)的 混合物’並將所得溶液在室溫下攪拌0.5小時，並接著在 氮氣下加熱迴流6小時。去除有機溶劑後’將殘餘物溶解 於 CH2C12(40 mL)並以 H2O(40 mLx3)清洗。CH2CI2 層以

NajO4乾燥並在減壓下蒸發，所得殘餘物以石夕膠管柱 (EtOAc :正己烷=1:8)純化而得到化合物4(954 mg， 65%) ： 'H-NMR (400 MHz, CDC13) 12.〇6 (1Hj s), 7.26 (1H, d, J=8.4 Hz), 6.86 (1H, d, J=8.4 Hz), 6<03 (1Hj s), 5.50 (1H，dd, J=2.4, 13.4 Hz)，5.17-5.14 (1H, m)，5 〇4·5 〇〇 (2H，m)，3·87 (3H，s)，3.79 (3H，s)，3.79 (6H，s)，3 46_3 45 (2H，m)，3.25-3.23 (2H，m)，3.05 (1H，dd，j=i3.5，16.7

Hz)，2.70 (1H，dd，J=2.6, 16.7 Hz)，2.024.94 (7H, m)，175 (3H，s)，ι·67 (3H，s)，1.66 (3H，s)，1.61 (3H, s)，158 (3H， s)。 實例9 6-(2-羥基-2-甲基丁基）-2-(7-羥基_3,7_二甲基辛_2_ 烯基）5-羥基-3’，4，，7·三甲氧基黃鲷（6d)的製備

〇CHs (NBM-HD3) 123548.doc • 40- 200911230 49% H2S〇4(1〇 mL)在冰浴中加入化合物4(530 mg，〇 99 mmol)於THF (15 mL)的溶液。完全添加後，在室溫下授拌 反應混合物8小時’並接著以1120稀釋。以CH2C12 (30 mLx 3)萃取反應混合物。合併的有機層經Na2S04乾燥並在減壓 下蒸發而得到殘餘物’該殘餘物以矽膠管柱（正己烷： EtOAc=l:l)純化而得到純油 6d (191mg，34%) : iH-NMR (400 MHz, CDC13) 12.06 (1H，brs)，7.27 (1H, d，J=8.6 Hz), 6.86 (1H, d, J=8.6 Hz), 6.05 (1H, s), 5.50 (1H, dd, J=2.6, 13.6 Hz), 5.03 (1H, t, J=6.2 Hz), 3.87 (3H, s), 3.80 (6H, s), 3.48 (1H, dd, J=5.5, 15.2 Hz), 3.42 (1H, dd, J=6.1, 15.2 Hz), 3.06 (1H, dd, J=13.6, 17.1 Hz), 2.70(1H, dd, J=2.7, 17.1 Hz), 2.65-2.61 (2H, m), 1.95-1,92(2H, m), 1.65 (3H, s), 1.41-1.35 (5H, m), 1.26 (6H, s), 1.15 (3H, s), 1.14 (3H，s) 〇 實例10其他化合物 下列二個化合物係根據上述方法製備。

123548.doc • 41 - 0200911230 ch3 ch3 och3

ch3

OH O (NBM-HD-2) 實例11本發明化合物（NBM-HD-1)對癌細胞生長的抑制

(NBM-HD-1) 將癌細胞株，鼠C6神經膠質瘤細胞（rat C6 glioma cells)，在37°C、5%C02及95%相對溼度下，培養於補充有 盤尼西林G、硫酸鏈黴素、0.5 mM L-麵_胺醯胺及10%胎牛 血清（FBS ; Gibco)的 Dulbecco’s modified Eagle’s 培養基 (DMEM ; Gibco)。在所有實驗中，細胞以每孔3xl05的密 度接種於6孔盤。24小時後，以不同濃度的化合物NBM-HD-1 (即，本文中所示之式III化合物）處理細胞。48小時 123548.doc -42- 200911230 後，觀察並計數細胞。根據圖1所示的結果，NBM-HD-l可 抑制鼠C6神經膠質瘤細胞的生長。以2.5 yg/mL(圖1(A)-b)、5 yg/mL(圖 l(A)-c)及 10 yg/mL(圖 l(A)-d)的 NBM-HD-1 培養鼠C6神經膠質瘤細胞48小時，相較於控制組（圖1 (A)-a)，細胞密度大幅減少》由細胞計數所得結果顯示相同的 趨勢（圖1(B))。上述結果指出NBM-HD-1以劑量依賴性方 式抑制鼠C6神經膠質瘤細胞的生長。 以各種濃度（0 Yg/mL、2.5 //g/mL、5 yg/mL及 10 Yg/mL) 的NBM-HD-1處理鼠C6神經膠質瘤細胞72小時。經處理細 胞被胰蛋白酶水解並收集。將細胞再懸浮於200 PBS中 並接著加入800 yL的冷100%乙醇固定細胞。所得細胞在-20°C固定過夜。藉離心收集細胞團塊，再懸浮於lmL的低 張緩衝液（0.5% Triton X-100 於 PBS 及 1 gg/mL RNase A)， 並於37 °C下培養30分鐘。接著，將1 mL的PI溶液（50 pg/mL)添加於所得細胞團塊《將混合物置於4 °C下30分 鐘。以FACScan Cytometry(Becton Dickinson)分析細胞的 DNA量（圖2)。圖2的結果顯示NBM-HD-1藉由調節抑制 G0/G1相的細胞週期，以劑量依賴性方式顯著抑制鼠C6神 經膠質瘤細胞的生長。 實例12本發明化合物（NBM-HD-1)對細胞生長的抑制及癌 細胞分化的誘導 針對鼠C6神經膠質瘤細胞，藉RT-PCR檢測與mRNA表現 有關的細胞週期。根據製造者的指示，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)自經處理的C6細胞分離總RNA。使用 123548.doc •43- 200911230

ReverTra-Plus-TM (TOYOBO)自 500 ng 的總 RNA 產生 cDNA。藉PCR及引子放大RT產物（1 //1)，龙使用GAPDHf 為内部控制以分析細胞週期的數個基因，結果示於圖3 ° 根據圖3的結果，NBM-HD- 1可調節一些細胞週期調節子的 表現。結果顯示NBM-HD-1係以劑量依賴性方式降低細胞 週期素D1及細胞週期素B 1的表現。相反地，P2 1的表現增 加。 以10 Yg/mL的NBM-HD-1培養C6神經膠質瘤細胞24小時 後，它們被固定並藉典型免疫螢光染色法分析°膠質細胞 染色的進行係使用膠質細胞專一性的GFAP抗體（SIGMA)作 為初級抗體及螢光標記的兔免疫球蛋白（SIGMA)作為二級 抗體與初級抗體結合。GFAP-正的細胞藉特定光源激發以 發散螢光。以DAPI染色細胞核。染色結果如圖4(A)所示。 根據圖4(A)，NBM-HD-1可誘導C6神經膠質瘤細胞的GFAP 表現。相對於控制組，以10 yg/mL的NBM-HD-1處理的細 胞被檢測出較多的GFAP蛋白質。圖4中間列顯示經DAPI染 色的細胞的照片。 GFAP RNA的表現係藉RT-PCR檢測。圖4(B)的結果顯示 GFAP的表現以劑量依賴性方式增加。根據GFAP表現的增 加，此等結果指出NBM-HD- 1可誘導C6神經膠質瘤細胞的 分化。 實例13以本發明化合物（NBM-HD-1)處理的癌細胞中高乙 酿化組織蛋白（hyperacetylated histone)的蓄積的 增加 123548.doc -44- 200911230 高乙醯化組織胺酸H4的蓄積係以細胞溶裂物，使用西方 墨點分析（western blotting)及抗高乙醯化的組織胺酸H4抗 體（Upstate)進行分析。C6神經膠質瘤細胞以每10公分培養 mlxlO6的密度接種。24小時後，以10 Ag/mL的NBM-HD-1 或4mM 丁酸鈉處理數小時。使用變性SDS樣品緩衝液製備 全細胞溶裂物，並接著於15% SDS-聚丙烯醯胺膠上分離。 如圖5所示，丁酸鈉及NBM-HD-1可增加高乙醯化組織胺酸 H4的蓄積。未處理的C6神經膠質瘤細胞難以檢測到高乙 醯化組織胺酸H4的量。經4mM 丁酸鈉處理的細胞中的高乙 醯化組織胺酸H4量增加。接著自培養基中將丁酸鈉去除。 6小時後，高乙醯化組織胺酸H4的量降低。高乙醯化組織 胺酸H4的蓄積在以NBM-HD-1處理2小時的細胞中增加。 去除NBM-HD-1後，高乙醯化組織胺酸H4的量隨時間減 少。最高的組織胺酸乙醯化出現於化合物去除後6小時。 此等結果指出，類似於丁酸鈉，NBM-HD· 1是一種HDAC 抑制劑。由於NBM-HD-1較丁酸鈉具疏水性，相較於丁酸 鈉，NBM-HD-1可保留於細胞中較長時間且可連續誘導組 織胺酸H4的乙醯化。 實例I4本發明化合物（NBM-HD-1)對HDAC活性的抑制 以不同劑量的NBM-HD-1及丁酸鈉（SB)處理C6神經膠質 瘤細胞。24小時後，收取細胞並依製造者說明書使用 白質萃取套組（Novagen)萃取核蛋白。接者使 用HDAC活性分析套組（Calbiochem)分析此等萃取物的 HDAC抑制活性。HDAC螢光基質，其包含乙醢化的離胺 123548.doc -45- 200911230 酸側鏈，首先與萃取的核蛋白一起培養。基質的乙醯化使 基質敏感化，使得在以離胺酸擴展劑（lysine developer)處 理的第2步驟中產生螢光團。使用螢光分析儀（fluorescent plate reader)可容易分析螢光團。如圖6所示，NBM-HD-1 可抑制C6神經膠質瘤細胞中的HDAC活性。HDAC的抑制 建議誘導癌細胞的分化。在本實驗中，HDAC抑制的已知 化合物，丁酸鈉，係用於作為正控制組。在實驗組中，較 低的榮光单位顯不較尚的HDAC抑制活性。此結果出 NBM-1HD-1顯著抑制HDAC活性。 實例15本發明化合物（NBM-HD-1)對HDAC活性的抑制及 癌細胞型態的改變

將人類膠質母細胞瘤DBTRG-05MG癌細胞在37°C、 5%(：02及95%相度溼度下，培養於補充盤尼西林G、硫酸 鏈黴素、0.5 mM的L-麩胺醯胺及10%胎牛血清（FBS ; Gibco)、100 mM/L 丙嗣酸鈉及 l%NEAA(Gibco)之 RPMI 培 養基164〇(Gibco)。針對此等實驗，將細胞以每孔3χ1〇5的 密度於6-孔盤。24小時後，以不同濃度的NBM-HD-1及4 mM的丁酸鈉處理細胞。72小時後，觀察並計數細胞。如 圖7所示，NBM-HD-1顯著抑制05MG癌細胞的生長並改變 細胞的形態。在05MG細胞（圖7(A))，以2.5 Ag/mL(圖7(A)-b)、5 yg/mL(圖 7(A)-c)及 10 //g/mL(圖 7(A)-d)的 NBM_HEM 培養72小時’相較於控制組（圖7(A)_a)，細胞密度大幅減 少。實驗組中的05MG細胞改變成為較控制組細胞長的形 態。細胞δ十數的結果（圖7(B))指出丁酸納可抑制〇5MG癌細 123548.doc -46· 200911230 胞的增殖，且ΝΒΜ-HD-l亦可。此等結果指出NBM-HD-l 以劑量依賴性方式抑制05MG細胞的生長並改變05MG癌細 胞的形態。 將乳癌細胞在37°C、5%C02及95%相度溼度下，培養於 補充盤尼西林G、硫酸鏈黴素、0.5 mM的L-麩胺醯胺及 10%胎牛血清（FBS ; Gibco)之Dulbecco's modified Eagles's 培養基（DMEM ; Gibco)。將細胞以每孔3xl05的密度接種 於6-孔盤。24小時後，以不同濃度的化合物ΝΒΜ-HD-l及 作為正控制組的4 mM的丁酸鈉處理細胞。48小時後觀察 細胞並於96小時後計數。如圖8所示，ΝΒΜ-HD-l顯著抑制 MCF-7癌細胞的生長並改變細胞的型態。在圖8(A)，以2.5 yg/mL(圖 8(A)-b)、5 yWg/mL(圖 8(A)-c)及 1 0 eg/mL(圖 8(A)-d)的NBM-HD-l培養48小時，相較於控制組（圖8(A)-a)， MCF-7細胞大幅減少。相較於控制組細胞，實驗組中的 MCF-7細胞的型態改變。圖8(B)顯示4 mM丁酸鈉可抑制 MCF-7細胞的生長。細胞計數的結果（圖8(B))指出，類似 於丁酸鈉，NBM-HD-l抑制細胞生長。此等結果指出NBM-HD-1以劑量依賴性方式抑制MCF-7癌細胞的生長並改變彼 等的形態。 將100公釐培養皿中的MCF-7癌細胞（lxlO6)以各種濃度 的 NBM-HD-1(0、2.5、5及 10 pg/mL)和 4 mM丁酸納處理 72 小時。樣品之製備如[0063]所述的步驟所述》細胞的DNA 接著藉 FACScan 細胞儀（FACScan cytometry)(Becton Dickinson)分析。如圖9所示，NBM-HD-1經由調節細胞週 123548.doc -47· 200911230 期、以劑量依賴性方式抑制G0/G丨相，明顯地抑制MCF-7 細胞生長。G0/G1相的百分比以劑量依賴性方式自74·46增 加至92.55。亦發現NBM_Hd-1以劑量依賴性方式顯著減少 S及G2/M兩相的細胞。 與細胞週期有關的p21 mRNA表現係藉RT-PCR檢測。總 RNA係分離自經處理的MCF_7細胞並用於RT反應。 cDNA(l yl)作為模板藉pCR放大p2i基因。GAPDH係作為 内部控制。如圖10所示，NBM-HD-1可增加P21 mRNA在 MCF-7癌細胞中的表現。在該實驗中，MCF-7細胞以不同劑 量的NBM-HD-1處理24小時。結果指出NBM-HD-1以劑量依 賴性方式誘導p21的表現。使用西方墨點分析及結合高乙醯 化組織胺酸H4的抗體（Upstate)分析細胞溶裂物的高乙醯化 組織胺酸H4的蓄積。以每10公分培養皿ΙχΙΟ6的密度接種 MCF-7癌細胞。24小時後，以10 pg/mL的NBM-HD-1或4 mM丁酸鈉處理細胞數小時。以針對高乙醯化組織胺酸H4的 特定抗體分析組織胺酸乙醯化的程度以試驗NBM-HD-1對 HDAC的抑制。丁酸鈉係用於作為正控制組。如圖11所示， MCF-7細胞的結果與C6神經膠質瘤細胞的結果類似。 實例16本發明化合物（NBM-HD-1)增加神經突觸的生長 神經幹細胞（NSC)及皮質神經元的生長培養基的製備係 添加盤尼西林G、鏈黴素及0.5 mM的L-麩胺醯胺至B-27補 充的神經基質培養基（Gibco)。未出生的胎係取自懷孕17天 的麻醉中Wistar大鼠腹腔中的胎囊。將胎的腦組織取出並 以0.1 %胰蛋白酶溶液在25°C下處理3分鐘。以PBS溶液清 123548.doc -48- 200911230 洗3次後，細胞藉上下混合而分離。所得溶液通過7〇 倫（nylon)細胞過滤器（strainer)(Falcon)以得到含有腦細胞 的過濾、物。過滤物在1000 rpm離心10分鐘並吸去上清液。 所得團塊再懸浮於如上述所製備的生長培養基◊所得懸浮 液含有NSC。 得自懸浮液的細胞培養於塗覆有30 yg/mL的聚-D-離胺 酸（Sigma)的6-孔盤至75細胞/平方公分的密度。細胞培養 於37°C、5%C〇2及95%的相對溼度。生長培養基含有〇.63 pg/mL的NBM-HD-1，並使用含1 "L DMSO的生長培養基 作為控制組。培養後的分化細胞被分類稱為皮質神經元。 培養6天後，藉顯微鏡觀察活細胞。測定並平均神經元 的突觸在6個區域的長度。如圖12所示，NBM-HD-1可促進 神經突觸生長。在圖12中，實驗組的突觸長度（圖12(A)-b) 較控制組長（圖12(A)-a)。測定突觸長度後，結果指出實驗 組突觸的平均長度大於控制組（圖12(B))。 實例17本發明化合物（NBM-HD-2)對癌細胞生長的抑制 將MCF-7癌細胞以每孔3x1 05的密度接種於6-孔盤。24小 時後，以不同濃度的化合物NBM-HD-2及作為正控制組的4 mM的丁酸鈉處理細胞。72小時後，觀察並計數細胞。如 圖13所示，NBM-HD-2顯著抑制MCF-7癌細胞的生長並改 變細胞的形態。在圖13(A)，以2.5 //g/mL(圖13(A)-c)、5 ；wg/mL(圖 13(A)-d)、7.5 //g/mL(圖 13(A)-e)及 10 //g/mL(圖 7(A)-f)的NBM-HD-2培養72小時，相較於控制組（圖13(A)-a) ’ MCF-7細胞密度大幅減少》相較於控制組，實驗組中 123548.doc -49· 200911230 的MCF-7細胞的形態改變。圖13(A)顯示4 mM丁酸鈉可抑 制MCF-7細胞的生長。細胞計數的結果（圖13(B))指出，類 似於丁酸鈉，NBM-HD-2意志細胞生長。此等結果指出 NBM-HD-2以劑量依賴性方式抑制MCF_7癌細胞的生長並 改變它們的形態。 實例18本發明化合物（NBM-HD-3)對癌細胞生長的抑制 將MCF-7癌細胞以每孔3χ1〇5的密度接種於6_孔盤。24小 時後，以不同濃度的化合物NBM-HD-3及4 mM的丁酸鈉 (其作為正控制組）處理細胞。72小時後，觀察並計數細 胞。如圖14所示’ NBM-HD-3顯著抑制MCF-7癌細胞的生 長並改變細胞的形態。在圖14(A)，以2·5 //g/mL(圖14(A)-c)、5 yg/mL(圖 14(A)-d)、7.5 Ag/mL(圖 14(A)-e)及 10 Yg/mL(圖14(A)-f)的NBM-HD-3培養72小時，相較於控制組 (圖14(A)-a)，MCF-7細胞密度大幅減少。相較於控制組， 實驗組中的MCF-7細胞的形態改變。圖14(A)顯示4 mM丁 酸鈉可抑制MCF-7細胞的生長。細胞計數的結果（圖14(B)) 指出，類似於丁酸鈉，NBM-HD-3抑制細胞生長。此等結 果指出NBM-HD-3以劑量依賴性方式抑制MCF-7癌細胞的 生長並改變它們的形態。 【圖式簡單說明】 圖1顯示經不同濃度的NBM-HD-1處理的鼠神經膠質瘤 C6細胞的顯微鏡照片* 圖2顯示藉FACScan細胞儀分析的鼠神經膠質瘤C6細胞 的DNA含量。 I23548.doc -50- 200911230 圖3顯示經不同劑量的NBM-HD-1處理的鼠神經膠質瘤 C6細胞的細胞週期的基因電泳圖。 圖4顯示經NBM-HD-1處理的鼠神經膠質瘤C6細胞的免 疫螢光染色照片集RT-PCR數據。 圖5顯示經NBM-HD-1及丁酸鈉處理的鼠神經膠質瘤C6 細胞的西方墨點分析圖。 圖6顯示經NBM-HD-1及丁酸鈉處理的鼠神經膠質瘤C6 細胞的HDAC相對抑制活性。 圖7顯示經不同劑量的NBM-HD-1處理的人類膠質母細 胞DBTRG-05MG癌細胞的顯微鏡照片。 圖8顯示經不同劑量的NBM-HD-1處理的乳MCF-7癌細胞 的顯微鏡照片。 圖9顯示NBM-HD-1經由調節細胞週期、以劑量依賴性 方式抑制G0/G1相，明顯地抑制MCF-7細胞生長。 圖10顯示NBM-HD-1以劑量依賴性方式顯著增佳 p21WAF1/eiP1基因的表現。 圖11顯示經NBM-HD-1處理的MCF-7細胞的西方墨點分 析圖。 圖12顯示經NBM-HD-1處理的皮質神經元的突觸生長的 照片。 圖13顯示經不同濃度的NBM-HD-2處理的人類乳癌MCF-7細胞處理的顯微鏡照片。 圖14顯示以不同濃度的NBM-HD-3處理的人類乳癌MCF- 7細胞處理的顯微鏡照片。 123548.doc -51·

Claims (1)

1. 200911230 十、申請專利範圍： 1 · 一種如下式（I)代表的化合物，

   其中 Ri及R2各自獨立為〇H、〇c(=〇)烷基、〇_烷基、s•烷 基、N-貌基、〇-烯基、S-烯基、N-烯基、0·炔基、S-炔 基、N-炔基、〇_c3 8環院基、S_C3 8環烧基、n_C3_8環烷 基、〇-不飽和5-至1〇員單環或雙環、s_不飽和5·至1〇員 早壤或雙環、N-不飽和5-至10員單環或雙環、烷基、 婦基、快基、C3·8環烷基、不飽和5-至10員單環或雙 %、或飽和或不飽和之包括至少一選自N、〇及§之群組 之雜原子之5-至10員雜環；或 Rl及R2 一起形成二氧戊環（dioxlane); R3及R4各自獨立為0Η、0C(=0)烷基、Ο-烷基、S-烷 基N院基、〇_稀基、s-烯基、N-稀基、0-快基、S-炔 基、N -快基、〇 _ p β “ 13-8¾烷基、3_(：3.8環烷基、N-C3_8環烷 基、〇 -不飽和5 -至畐gg β 主10員％環或雙環、S-不飽和5·至1〇員 單環或雙環、Ν-不輪4 c 不飽和5·至1〇員單環或雙環、或飽和 或不飽和之包括至少一 ^ y 選自N、0及S之群組之雜原子之 5-至10員雜環； 123548.doc 200911230 R_5為C4_i6烧基或C4·!6稀基，其中烧基或稀基為未經取 代或經一或多個Cw烧基、ΟΗ、鹵素、CN、NO、、 ΝΗ2、CHO、OR9、SR9、NR9或 COOR9取代； R6為C：2·丨2烧基或Cm浠基，其中烧基或烯基為未經取 代或經一或多個Cw烧基、OH、鹵素、CN、NO、、 NH2、CHO、OR9、SR9 或 NR9 ;或

   R5及Ra為之一為氫、鹵素或OH，另一為c4_16烧基或 C4-16烯基，未經取代或經一或多個Cu院基、oh、 NH2、鹵素、CN、NO或N3取代； R_7及Κ·8各自獨立為氫、鹵素、OH、NH2、COOH、 CHO、CN、NO、Ci-6烧基（未經取代或經OH、NH2、 COOH、鹵素、CN、NO 或 CHO 取代）、=〇、〇_ 烧基、s_ 烷基、N-烷基、〇-烯基、S-烯基、N-烯基、〇_炔基、S_ 炔基、N-快基、或R<7及Rg—起形成一雙鍵、c3_6院基、 或包括至少一選自Ν、Ο及S之群組之雜原子之5_至10員 雜環； 119為苯基、C(=0)R10、C(=0)0R1()或苄基；及 R10為OH、NHOH、NH2、Cw烷基、苯基或苄基； 限制條件為當Ri、R2、R3及R4為OH，R5不為

   123548.doc -2 - 200911230 及其醫藥上可接受之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前 藥及溶劑化物。 2. 根據請求項1之化合物，其中心及尺2係各自獨立為， 0CK6烷基，烷基，Ο-苯基或〇_苄基或Ri&R2 一起形成二氧戊環。 3. 根據請求項2之化合物，其中心及心係各自獨立為〇H， 〇CH3，OCH2cH3，0CH2CH2CH3 , 0C(=0)CH3，〇 苯基 或〇-节基。 4. 根據請求項1之化合物，其中Ri及R2 —起形成二氧戊 5·根據請求項！之化合物，其中尺3及以係各自獨立為〇H, 0<^-6院基’ 〇c(=0)Ci 6烷基，〇苯基或〇苄基。 6·根據請求項1之化合物，其中I及R4係各自獨立為OH， 〇CH3 ’ 〇CH2cH3，〇CH2CH2CH3，〇c( = 〇)CH3，〇 苯基 或〇-节基。 根據。月求項1之化合物，其中R5為：

   123548.doc 200911230 Ci-4alkyl

   Ο

   r \

   8. 根據請求項1之化合物

   123548.doc -4- 200911230

   9.根據請求項1之化合物，其係選自下列群組：

   OCHq

   123548.doc 200911230

   123548.doc 200911230

   123548.doc -7- 200911230

   OMe Ο

   123548.doc 200911230

   OCH, CH, CH, OCH

   OCH HO H3CH3C0\^v/0、.，、、'、、、、、^ 3

   HO h3c T I ^

   CH3 OH O ch3 ch3 och3 HO^I 及 CH3 OH O 123548.doc -9- 200911230 HO、 CHg ch3 och3 ch3 oh o 10.根據請求項1之化合物，其係選自下列群組： OCH, ch3 ch3 och3 ί: CH, CH, OCH,

   H3c0丫^^%τ/0丫、、、、^ ch3 OH O 123548.doc -10- 200911230

   OCH? f h3c ch3 ch3 och3

   及 ch3 och3

   och5 丫、、 ch3 OH 0 11. 一種如請求項1所定義之式（I)化合物，其如下式（II)代 表： 123548.doc -11 - 200911230

   其中Rj， (I)中者。

   12·—種抑制組織蛋白去乙醯酶(hdac)之醫藥組合物，其包含 如β求項1至9項中任一項之化合物或其醫藥上可接受之 肌立體異構物、鏡像異構物、前藥或溶劑化物，作為 活性成份及醫藥可接受載劑。 13.種如凊求項1至9項中任一項之化合物或其醫藥上可接 爻之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥或溶劑化物於 抑制HDAC之用途。 14· 一種如請求項1至9項中任一項之化合物或其醫藥上可接 又之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥或溶劑化物於 治療腫瘤或細胞增生疾病之用途。 15. 一種如請求項1至9項中任一項之化合物或其醫藥上可接 又之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥或溶劑化物於 增進神經突觸生長之用途。 “種如吻求項1至9項中任—項之化合物或其醫藥上可接 文之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥或溶劑化物於 療神居退化性疾病及人類脊髓肌肉萎縮症（SMA)之用 途0 123548.doc •12·