TW200827363A - Compositions including triciribine and trastuzumab and method of use thereof - Google Patents

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200827363 九、發明說明： 本申請案主張2006年11月15日申請之美國臨時專利申 請案第60/858,923號的權利，其在此併入本案以為參考資料。 政府支持之確認 5 本發明係部份遵照由 the National Institudes of Health 授予之批准（合同）號 P30-CA 16672; IRO1-CA109570; IR01-CA119127; P01-CA099031 研究計劃 4 ;及 P50 CA11610001研究計劃與由 the Department of Defense 授予 之批准號DAMD17-02-1-0694在政府支持下完成。政府對本 10 發明有特定權利。 【發明所屬之技術領域3 發明領域 本申請案係有關於適用於治療及預防腫瘤、癌症、及 與異常細胞增生有關之其它病症的低毒性組合治療物，其 15 包括曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分 子’例如曲妥珠單抗或其鹽與組成物。 發明背景 癌為細胞之異常生長。儘管空間之限制、藉其它細胞 20而分旱之營養物或身體發出中止再生之信號，癌細胞仍快 速再生。癌細胞之形狀通常不同於健康細胞，其功用並不 正常且可擴散入身體許多部位内。組織之異常生長，稱為 腫瘤，為可未受控地生長且分裂之細胞群。腫瘤可以呈良 性（非癌性）或惡性(癌性）。良性腫瘤傾向緩慢生長且不會擴 5 200827363 散。惡性腫瘤可快速生長、可侵襲並破壞附近主常組織、 並可擴散遍及全身。 癌之分類係根據其發源之流體或組織或根據其首先被 形成之身體部位。此外，一些癌為混合型。癌可分類成5種 5概括性種類··癌瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病、及骨髓瘤， 這些種類表示該癌之組織及血液分類系統。癌瘤為在身體 組織，亦即覆蓋器官、腺或身體構造之表面或作為彼等之 襯裡的上皮組織中所發現之癌。例如胃襯裡之癌稱為癌 瘤。許多癌瘤會影響涉及分泌之器官或腺，諸如產生母乳 10之乳腺。癌瘤為所有癌病例之約80至90%的主因。肉瘤為 自結締組織，諸如軟骨、脂肪、肌肉、腱、及骨，生長之 惡性腫瘤。最常見之肉瘤，在骨上之腫瘤，通常存在於年 輕人。肉瘤之貫例包括骨肉瘤（骨)及軟骨肉瘤（軟骨）。淋巴 瘤係指起源於淋巴細胞之結或腺（其功用為產生白血球並 15淨化體流）或器官（諸如腦及乳房）的癌。淋巴瘤分成兩類： 雈吉金氏淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma)及非霍吉金氏淋巴 瘤。白血病，亦稱為血癌，為會阻止骨髓產生正常紅血球 及白血球與血小板之骨髓癌。需要白血球以抵抗感染。需 要紅血球以預防貧血。血小板可防止身體輕易地瘀傷及出 20血。白血病之實例包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白 血病、急性淋巴細胞白血病、及慢性淋巴細胞白血病。該 等名詞“骨髓性”及“淋巴細胞的，，表示所涉及的細胞類型。 最後，骨髓瘤係生長在骨髓之漿細胞内。在某些情況下， 該等骨髓瘤細胞可聚集在一骨内並形成單一腫瘤，亦即漿 200827363 細胞瘤。然而，在其它情況中，該等骨髓瘤細胞可聚集在 許多骨内，藉此形成骨腫瘤，亦稱為多發生骨髓瘤。 腫瘤誘發及演變通常為該腫瘤細胞基因組之積聚性變 化的結果。此等變化可包括細胞生長抑制基因或腫瘤抑制 5 基因之失活，以及細胞生長促進基因或致癌基因之活化。 至今在動物模式中已確認許多經活化之細胞致癌基因，然 而，僅少數之這些基因已證明與人類癌症有關（Weinberg) 等人，Oncogenes and the Molecular Origins of Cancer, 1989. Cold Spring Harbor，NY; Stanbridge J.等人，Cell，1990. 63:p 10 867-874; Godwin等人，in Gynecological oncology:principles and practice，Hoskins W.J·，Perez C.A. and Young R.C· (eds·)， 1992· pp 87-116, Lippincott，Philadelphia)。致癌基因在人類 癌症中之活化可起因於，諸如增加的基因複製數或結構變 化等之因素。這些因素可導致許多細胞作用，例如其可導 15 致基因產物之過度表現。可經由基因過度表現而活化涉及 人類癌症之幾種致癌基因。 明顯可知癌細胞所具有之連續基因異常會導致管理正 常細胞增生、分化及按程序之細胞死亡的調節信號轉導電 路之缺損（Hanahan，D. and R.A_ Weinberg，Cell, 2000· 20 1〇〇(1):ρ· 57-700)。其接著導致細胞生理學之基本缺損，這 等缺損會導致惡性腫瘤。這些缺損包括：a)生長信號之自 足（亦即生長因子受體酪胺酸激酸，諸如EGFR之過度表現 及下游信號轉導路經，諸如Ras/Raf/Mek/Erk %及 Ras/PI3K/Akt之異常活化），b)對抗生長信號之抗性（亦即 7 200827363 TGFB及其受體之低表現性），c)逃避細胞凋亡（亦即原細胞 凋亡p53之損失；原存活Bcl-2之過度表現；存活路徑，諸如 藉P13K/Akt而媒介之存活路徑之高度活化，d)持續血管生 成（亦即VEGF之高分泌量）及〇組織侵入及轉移（亦即細胞 5 外蛋白酶及原轉移性整合素）(也1^1^11，0.311(1尺.八· Weinberg，Cell，2000· 100(1):ρ· 57-700)。 受體酪胺酸激酶，諸如EGFR，ErbB2, VEGFR及似胰島 素生長因子I受體(IGF-1R)，密切地涉及許多人類癌症，其 包括結腸直腸癌、胰臟癌、乳癌及卵巢癌之形成 10 (Khaleghpour，K·，等人，Carcinogenesis，2004. 25(2):ρ· 241-8; Sekharam，Μ·，等人，Cancer Res，2003· 63(22):ρ· 7708-16)。 配位體，諸如EGF、VEGF及IGF-1，結合至彼等之受體可 促進内因性酪胺酸激酶活性之刺激作用、特異性酶胺酸在 該等受體之胞體漿結構域内之自體磷酸化作用及可引發各 15種複雜信號轉導路徑之傳訊蛋白質的募集（Olayioye，M.A.， 等人，Embo J，2000. 19(13):ρ· 3159-67, Porter，A.C· and R.R· Vaillancourt，Oncogene，1998. 17(11 Reviews):p· 1343-52)。 其接著會導致許多腫瘤存活性及致腫瘤性路徑，諸如該等

Ras/Raf/Mek/Efk %、JAK/STAT3及PI3K/Art路徑，之活性。 20雖然所有3種路徑業經涉及結腸、胰臟、乳房及卵巢之腫瘤 生成，但是藉Akt而媒介之此等路徑業經證明在惡性變性， 其包括細胞增生、抗細胞凋亡/存活、侵入及轉移與血管生 成之許多步驟中具重要性(Datta，S.R.等人Genes Dev，1999. 13(22): ρ· 2905-27) 〇 25 Akt為絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶（亦稱為ρκΒ)，其具有 200827363 3個家族成員：Aktl、Akt2及Akt3。以生長或存活因子刺激 細胞募集脂質激酶，磷酸肌醇激酶(PI3K)，其可將碟 酸肌醇-4,5-二磷酸酯（ΡΙΡ2)磷酸化以形成PI?3，其可幫細胞 膜補充Akt，於其中可藉在Thr308及Ser473(Aktl)、Thr308 5 及Ser474(Akt2)及Thr308與Ser472(Akt3)進行之攝酸化反應 而活化 Akt(Datta，S.R·等人 Genes Dev，1999，13(22):ρ· 2905-27)。因此，ΡΙ3Κ可藉將ΡΙΡ2磷酸化並轉化成ΡΙΡ3而活 化Akt。該磷酸酶，ΡΤΕΝ，可將ΡΙΡ3去磷酸化以形成ΡΙΡ2， 因此可防止Akt活化。 10 大多數人類癌症含有高度活化之Akt(Datta，S.R·等人

Genes Dev, 1999. 13(22)··ρ· 2905-27, Bellacosa，A·，等人，Int J Cancer，1995·64(4)··ρ· 280-5; Sun，M·，等人，Am J Pathol， 2001. 159(2):p. 431-7)。更詳細地，分別在57%、32%、27% 及36%之人類結腸直腸癌、胰臟癌、乳癌及卵巢癌中，Akt 15 具過度表現性及/或高度活性(Roy，Η·Κ·，等人Carcinogenesis， 2002·23(1):ρ· 201-5·，Altomare，D.A·，等人，J Cell Biochem， 2003.88(l):p. 470-6·，Sun，M·，等人，Cancer Res， 2001·61(16):ρ· 5985-91·，Stal，0·，等人Breast Cancer Res， 2003. 5(2):p· R37-44, Cheng· J· Q·，等人，Proc Natl Acad Sci 20 USA，1992· 89(19):p· 9267-71，Yuan，Z.Q·，等人，Oncogene， 2000. 19(19)φ· 2324-30)。Art之高度活化作用係起因於Akt 本身之擴增及/或過度表現以及Akt上游之基因改變，其包 括受體酪胺酸激酶及/或彼等之配位體的過度表現 (Khaleghpour，K·，等人Carcinogenesis，2004. 25(2):ρ· 241-8; 9 200827363

Sekharam，M·，等人，Cancer Res, 2003· 63(22):ρ· 7708-16, Cohen，B.D·，等人，BiochemSocSymp，1998. 63:ρ· 199-210·， Muller，W.J·等人Biochem Soc Symp，1998. 63:ρ· 149-57, Miller，W.E·，等人 J Virol，1995. 69⑺:p. 4390-8，Slamon， 5 D.J·，等人，Science，1987. 235(4785):p. 177-82, Andrulis，I丄·， 等人，J Clin Oncol，1998. 16(4):ρ·1340-9)。已藉證明 Akt之 異位表現性可誘發惡性變形並增進存在(Sun M，等人，Am J Pathol，2001. 159(2)··ρ· 431-7; Cheng J.Q·等人，Oncogene， 1997. 14(23):ρ· 2793-801)及Akt路徑之分裂可抑制細胞生 10 長並誘發細胞凋亡（Jetzt A.等人Cancer Res， 2003·63(20):ρ·6697-706)而臨床前說明Akt涉及腫瘤形成之 概念驗證。 癌及相關疾病之現行治療法的有效性有限且具有許多 嚴重的非預期副作用。儘管許多抗癌藥物已證明具臨床效 15 力’嚴重的全身性毒性通常會中止有成功希望之化療劑的 臨床研發。另外，受體酪胺酸激酶(諸如EGFR)及彼等之配 位體(諸如IGF-1)之過度表現、PTEN之Akt過度表現及/或損 失（其皆會導致Akt之高度活化)與癌患者之不良預後、對化 療之抗性及縮短之存活期有關。現行研究策略強調對具低 2〇 危險性之有效治療方法的探求。 因此，曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體 之分子，例如曲妥珠單抗的組合保證可作為用於治療腫 瘤、癌症及異常細胞增生且可協同性地降低藉目前投予之 癌化合物而導致之毒性或不良副作用的潛在性組合治療物。 200827363 【發明内容】 發明概要 本發明提供曲西立濱、曲西立濱磷酸鹽及相關化合物 與可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或 5 其鹽的組合以治療患者之腫瘤或癌症並可限制全身性毒性 之新穎治療方案。本發明係基於以下發現：可過度表現Akt 激酶之腫瘤或癌對於TCN及相關化合物之細胞毒殺性作用 與使用可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單 抗或其鹽的組合所產生之增效作用特別敏感。本發明者已 10確定成功使用曲西立濱及可調節HER2/neu(erbB2)受體之 分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，以治療腫瘤及癌之方法， 其係藉以下之一或彼等之組合：⑴對該曲西立濱化合物及 或该曲妥珠單抗或其鹽顯示增強的敏感性之患者投予曲西 立濱及調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗 15或其鹽；⑴)使用可以使該曲西立濱化合物及/或可調節 HER2/臟(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽之毒 性減至取小但仍能顯示功效的所述劑量；或(出)使用可以使 該曲西立濱化合物及/或可調節HER2/neu㈣B2)受體之分 子例如曲妥珠單抗或其鹽之毒性減至最小的所述投藥方案。 2〇 纟本發明—方面中，本發明涵蓋-組成物，其包括、： ⑴式I化合物 200827363 9% CHa

其中R2’、R3’及R5’各獨立為氫、可選擇性經取代之磷 酸鹽或膦酸鹽（其包括單-、二-或三磷酸鹽或安定化磷酸鹽 前藥）；醯基（其包括低碳醯基）；烷基（其包括低碳烷基）；醯 5 胺、續酸S旨，其包括烧基或芳烧基；項醯基，其包括甲石黃 醯基及苄基，其中該苯基可選擇性經一或多種如，例如在 文中所予之芳基的定義中所述之取代基取代；可選擇性經 取代之芳磺醯基；脂質，其包括磷脂；胺基酸；碳水化合 物；肽；或膽固醇；或活體内可得到其中r2’、r3’及r5’獨 12 200827363 立為Η或單-、二-或三-磷酸鹽之化合物的其它藥學上可接受 脫離基； 其中Rx及Ry獨立為氫、可選擇性經取代之磷酸鹽；醯 基(其包括低碳醯基）；醯胺、烷基(其包括低碳烷基）；芳香 5 族聚氧化烯烴，諸如聚乙二醇、可選擇性經取代之芳磺醯 基；脂質，其包括磷脂；胺基酸；碳水化合物；肽；或膽 固醇；或其它藥學上可接受之脫離基。在一實施例中，該 化合物係以5，-磷酸醚脂質或5，-醚脂質投予；

Ri及R2各獨立為Η、可選擇性經取代之直鏈、分支鏈或 10環系烷基(其包括低碳烷基）、烯基或炔基、CO-烷基、CO-烯基、CO-炔基、CO-芳基或雜芳基、c〇_烷氧烷基、c〇_ 芳氧烷基、CO-取代之芳基、磺醯基、烷磺醯基、芳磺醯基、 芳烷磺醯基； 15 20 ⑼可調節服2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單 抗或其鹽；及 (iii)藥學上可接受載劑。 予有效量之組成 在另-實施例中，本發明涵蓋—種治療哺乳動物之腫 瘤或癌症的方法，其包括對該哺乳動物投 物，其包括： ⑴式I化合物 13 200827363

9¾ ch3

其中r2’、r3’及r5’各獨立為氫、可選擇性經取代之磷 酸鹽或膦酸鹽（其包括單-、二-或三磷酸鹽或安定化磷酸鹽 前藥）；醯基(其包括低碳醯基）；烷基(其包括低碳烷基）；醯 5 胺、績酸自旨，其包括烧基或芳烧基；績醯基，其包括甲磺 醯基及苄基，其中該苯基可選擇性經一或多種如，例如在 文中所予之芳基的定義中所述之取代基取代；可選擇性經 取代之芳磺醯基；脂質，其包括磷脂；胺基酸；碳水化合 物；肽；或膽固醇；或活體内可得到其中R2’、R3’及R5’獨 14 200827363 立為Η或單-、二-或三_鱗酸鹽之化合物的其它藥學上可接受 脫離基； 其中Rx及Ry獨立為氫、可選擇性經取代之磷酸鹽；醯 基(其包括低碳醯基）；醯胺、炫基(其包括低碳烧基）；芳香 5族聚氧化烯烴，諸如聚乙二醇、可選擇性經取代之芳續醯 基，脂質，其包括鱗脂；胺基酸；碳水化合物；肽；或膽 固醇；或其它藥學上可接受之脫離基。在一實施例中，該 化合物係以5，-磷酸醚脂質或5，-醚脂質投予；

Ri及R2各獨立為Η、可選擇性經取代之直鏈、分支鏈或 10環系烷基(其包括低碳烷基）、烯基或炔基、c〇_烧基、c〇_ 烯基、CO-炔基、CO-芳基或雜芳基、c〇_烷氧烷基、c〇_ 芳氧燒基、CO j代之芳基、石黃酿基、院石黃酿基、芳石黃醯基、 芳垸續酿基；及 ⑻可調節腿2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單 15抗或其鹽。 /口之方法特別受TCN、TCN-P及/或 相關化合物之毒性作用的影 _ 〜響。在另一實施例中，係提供 用於治療嚼乳動物，特別 ό ^ ^ 類之腫瘤的方法’其包括⑴ 自该腫瘤獲得生物學試樣· 20

Alct^^ ^...、^ ’’（11)剩定該腫瘤是否過度表現

Akt激酶，及(111)使用如 酸鹽或相關化合物及^ 4之曲西立濱、曲西立濱碟 度表現Akt麟之轉。=崎«狀組合以治療該過 檢測該石嫌化形式之實施例中，可例如藉使用處 化Akt激酶以測定Ak a而檢定該腫瘤或癌所含有之填酸 轉表現性之程度。在另一實施例 15 200827363 中可藉檢定知自患者之腫瘤或癌細胞並與對照組織之程 度比較而敎Akt表現_程度。在肢實闕巾，與該對 照組織比較，該Akt在該癌試樣中之過度表現性為至少2、 2·5、3或5倍。在特定實施例中，該過度表現性Akt激酶可 5以疋咼度活性且磷酸化之Akt激酶。 在本發明某些方面中，曲西立濱、曲西立濱磷酸鹽或 相關化合物可增加及/或恢復對可調節HER2/n⑶(ertB2)受 體之刀子，例如曲妥珠單抗或其鹽的敏感性。在某些實施 例中，曲西立濱、曲西立濱磷酸鹽或相關化合物可補償 10 PTEN缺乏。在本發明某些實施例中，曲西立濱、曲西立濱 磷酸鹽或相關化合物與可調節HER2/neu(erbB2)受體之分 子，例如曲妥珠單抗或其鹽的組合可協同性作用。在其它 實施例中，曲西立濱、曲西立濱磷酸鹽或相關化合物與可 調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽 15的組合可誘發細胞凋亡。在其它實施例中，曲西立濱、曲 西立濱嶙酸鹽或相關化合物與可調節HER2/neu(erbB2)受 體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽的組合可降低PI3K之活化。 在本發明之另一方面中，係提供可限制TCN為相關化 合物之毒性副作用的給藥方案。在另一實施例中，此等給 20藥方案可以使毒性副作用減至最低或將其去除，該等毒性 副作用包括，但不限於：肝細胞毒害性、血小板減少症、 高血糖症、腹瀉、胃炎及/或發熱。在另一實施例中，TCN、 TCN-P或相關化合物之投藥在至少15、2〇或25%患者中可得 到至少一部份，諸如至少15、20或30%或完全之活體内反應。 16 200827363 Γ

在另一實施例中，係提供一種治療業經診斷患有腫瘤 之患者的方法，其係藉根據給藥計劃（其包括每週約一次投 予曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分 子，例如曲妥珠單抗或其鹽，費時約3週，繼而在一週期間 5内並未投予曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受 體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽）對該患者投予有效量之 TCN、TCN-P或相關化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體 之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽。在另一實施例中，係提 供治療患者之腫瘤或癌的方法，其係藉對該患者提供一給 10 15 20 藥方案，該給藥方案為每週一次各投予1〇毫克/米2或較少之 TCN ' TCN-P或相關化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體 之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽。在另一實施例中，可以 在短時間内，例如約5、1〇或15分鐘，以單一大量劑量投予 遠曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分 子’例如曲妥珠單抗或其鹽。在另外實施例中，係提供其 中"亥曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分 子，例如曲妥珠單抗或其鹽，藉連續輸注而投予，費時至 少 24、28 、/2、96或120小時的給藥計劃。在特定實施例中， /連貝奴藥可重複至少每週一次、每兩週一次及/或每月一 在其匕貫施例中，可以至少每3週一次投予該曲西立濱 口物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠 單抗或其_ 、执。在另外實施例中，可以至少每天一次投予該 等化合物，乾 物費時至少2、3、4或5天。 在另外實施例中，可對患者投予如文中揭示之該曲西 17 200827363 立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲 妥珠單抗或其鹽，其投予量能有效導致腫瘤消退。該曲西 立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲 妥珠單抗或其鹽之投藥可以在至少15至20%該等患者中得 5 到至少部份，諸如至少15、20或30%或完全活體反應。在 特定實施例中，可對患者投予至少2、5、10、15、20、30 或50毫克/米2之文中揭示的曲西立濱化合物及至少約2〇、 50、100、150、200、300、400、600、800或 1000毫克可調 節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽。 10 可根據文中揭示之任何治療方案而進行該曲西立濱化合物 及可調節HER2/neu(erbB2)抗體之分子，例如曲妥珠單抗或 其鹽之投藥。在特定實施例中，該給藥方案可包括投予小 於20毫克/米2之曲西立濱化合物及小於4〇〇毫克曲妥珠單抗 或其鹽。在一實施例中，可每週一次投予小於1 〇毫克/米2 15 之曲西立濱化合物及小於400毫克曲妥珠單抗或其鹽。在另 外實施例中，可對患者投予劑量小於2毫克/米2、5毫克/米2、 10¾克/米2、及/或15毫克/米2之曲西立濱化合物及小於4〇〇 宅克、300毫克、200毫克、100毫克、及/或5〇毫克可調節 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽。在 20另一實施例中，可藉連續灌注射而對患者投予小於1〇毫克/ 米2之劑量，費時至少5天。在特定實施例中，該曲西立濱 化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠 單抗或其鹽’可用於治療胰腺癌、攝護腺癌、結腸直腸癌 及/或卵巢癌。 18 200827363 在另一實施例中’該曲西立濱化合物及可調節 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，可 用於治療方案中以預防及/或治療癌瘤、肉瘤、淋巴瘤、白 血病、及/或骨髓瘤。在本發明其它實施例中，可使用該曲 5 西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如 曲妥珠單抗或其鹽，以治療固體腫瘤。在又另外實施例中， 文中所揭示之曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2) 受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，與組成物可用於治 療腫瘤或癌，諸如但不限於以下器官或組織之癌：乳房、 10攝護腺、骨、肺、結腸（其包括但不限於結腸直腸）、泌尿系 統、膀胱、非霍吉金氏淋巴瘤、黑色素瘤、腎臟、腎上腺、 胰臟、咽、甲狀腺、胃、腦、及/或卵巢。在一特定實施例 中’該曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分 子’例如曲妥珠單抗或其鹽，可用於治療胰腺癌、乳癌、 15結腸直腸癌及/或卵巢癌。在本發明另外實施例中，文中所 揭示之曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之 分子’例如曲妥珠單抗或其鹽，可用以治療血管生成相關 疾病，在特定實施例中，係提供經由連續輸注射曲西立濱 化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠 20單抗或其鹽，費時至少24、48、72或96小時而治療白血病 之方法。在其它實施例中，可重複連續輸注，例如每2、3 或4週至少一次。 在一特定實施例中，係提供用於治療宿主之腫瘤、癌、 及異常細胞增生有關之其它病症的方法，該方法包括對該 19 200827363 但主投予有效置之可選擇性併用藥學上可接受載劑的曲西 立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲 妥珠單抗或其鹽。 在本發明一方面中，該曲西立濱化合物及可調節 5 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，與 組成物可以一起投予且可形成該相同組成物之一部份，或 以適於在相同時間或不同時間下進行投藥之不同組成物形 式提供。 在其它實施例中，文中揭示之曲西立濱化合物及可調 10節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽， 可用以治療對一或多種已知抗癌藥物具抗藥性之腫瘤或 癌，其包括文中揭示之腫瘤或癌及化合物的實施例。在一 實施例中，文中揭示之曲西立濱化合物及可調節 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽的投 15予量能有效治療患有抗藥性腫瘤或癌之患者，該抗藥性腫 瘤或癌為，例如多藥抗藥性腫瘤或癌，其包括，但不限於： 僅抗紫杉齡、抗雷帕黴素、抗泰莫西芬(tamoxifen)、抗順 鉬、及/或抗吉非替尼（gefitinib)(iressa)之腫瘤或癌。 在特定實施例中，係提供一種方法，其包括對需要治 20 療之宿主投予有效量之文中揭示的曲西立濱化合物及可調 節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽， 或包括其含能量能有效治療治療宿主之腫瘤、癌、及異常 細胞增生相關之其它病症的曲西立濱化合物及曲妥珠單抗 或其鹽之藥學組成物。 20 200827363 在另一實施例中，係提供一種用於治療腫瘤或癌之方 法一包括對品要治療之個體投予有效量之文中揭示的化 口物或其鹽、異構物、前藥或酯、及可調節HER2/_(^bB2) 受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，其中該癌為，例如 5癌瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。該化合物或其鹽、 異構物、前藥或酯可選擇性以包含合適載劑(諸如水)之藥學 上可接受組成物提供，該組成物經調製適於以所欲投藥方 式對需要其治療之個體投予。該化合物可選擇性與至少一 另外治療劑一起或輪流投予以治療腫瘤或癌。 10 本發明之範圍亦包括可選擇性在藥學上可接受載劑中 之文中揭示的化合物或其鹽、前藥或酯在治療腫瘤或癌之 用途；及可選擇性在藥學上可接受載劑中之文中揭示的曲 西立》負化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如 曲妥珠單抗或其鹽，或其鹽、前藥或酯在製備用於治療癌 15 或腫瘤之藥物的用途。 圖式簡單說明 第1圖係說明API-2(曲西立濱）作為得自NCI多樣化分 子庫(Diversity Set)之Akt抑制劑的適合物之鑑定。第1A圖 係闡明API-2(曲西立濱）之化學結構。第1B圖係說明API-2 2〇 抑制AKT2在經AKT2轉形之NIH3T3細胞中的磷酸化程 序。以ΑΡΙ·2(1μΜ)處理經野生型AKT2轉形之NIH3T3細 胞，費時指定時間，並使用抗磷酸化Akt-T308及-S473抗體 (最上面的一組及中間組）進行免疫墨點分析。最下面的一組 顯示總AKT2之表現性。在第1C圖中，顯示API-2可抑制Akt 21 200827363 之3種變異體。使HEK293細胞經HA-Aktl、-AKT2及-AKT3 轉移感染並在EGF刺激前經ΑΡΙ-2(1 μΜ)或渥曼青黴素 (wortmannin)(15pM)處理，使該等細胞經溶解並經抗ha抗 體免疫沈澱。使免疫沈澱物進行活體外激酶檢定（上)並使用 5抗磷酸化Akt-T308(下）抗體進行免疫墨點分析。中間的一組 顯示經轉移感染之Aktl，AKT2及AKT3的表現性。第1D圖 係闡明API-2並不能活體外抑制Akt。進行原構性活性AKT2 重組型蛋白質在含ΙμΜ API-2(第3道)之激酶緩衝劑中的活 體外激酶檢定。 10 第2圖係說明API-2並不能抑制pi3K、PDK1及緊密相關 之AGC激酶族成員。第2A圖係說明活體外ρΐ3Κ激酶檢定。 使HEK293細胞之血清不足並在EGF刺激前經ΑΡΙ-2(1μΜ) 或渥曼青黴素（15μΜ)處理，費時30分鐘。細胞被溶解且以 抗-ΡΙΙΟα抗體進行免疫沈澱。使用n-4-P作為基質使該等 15免疫沈殿物進行活體外激酶檢定。第2Β圖係闡明αρι_2對活 體外PDK1活化作用（最上面的一組)之影響，實心圓表示藉 ΑΡΙ-2而進行之抑制作用。空心圓表示藉正對照物星形孢菌 素(staurosporine)，其係為有效的PDK1 抑制劑（IC5〇=5nM)， 而進行之抑制作用。最下面的一組為經MyC_pDK4轉移感染 20並在EGF刺激前經渥曼青黴素或API-2處理之HEK293細胞 的免疫墨點分析。以指定抗體檢測該等免疫墨點法。第2C 圖係闡明在經API-2或非選擇性PKC抑制劑Ro31 _822〇處理 後使用抗構酸化PKCaT638(上）及總成PKCa (下）抗體進 行PKCa之磷酸化程度的免疫墨點分析。第2D圖表示活體 22 200827363 外SGK激酶檢定。使HEK293細胞經ΗΑ-SGK轉移感染並在 EGF刺激前經API-2或渥曼青黴素處理。使用MBP作為基質 (上）以ΗΑ-SGK免疫沈澱物進行活體外激酶檢定。最下面的 一組表示經轉移感染之ΗΑ-SGK的表現性。第2E圖係闡明 5 PKA激酶檢定之結果。在含指定抑制劑(API-2或AKAI)及基 質，肯普肽(Kemptide)之ADB緩衝劑（Upstate Biotechnology Inc)中培育經免疫純化之PKA。將該激酶活性定量。第2F 圖係表示西方墨點法。以API-2處理OVCAR3細胞，費時指 定時間。以指定之抗磷酸抗體（第1至4組)及抗肌動蛋白抗體 10 (下）進行細胞溶解物之免疫墨點。 第3圖係說明API-2可抑制Akt活性及細胞生長且可誘 發具有高Akt之人類癌細胞的細胞凋亡。第3A圖為西方墨點 法，在經API-2處理後，在指定之人類癌細胞株内以抗磷酸 化Akt-T308抗體檢測Akt之磷酸化程度。再以抗-總Akt抗體 15 (最下面的一組)探測該等墨點法。第3B圖係表示細胞增生 檢定。以不同劑量之API-2處理圖中所示之細胞株，費時24 時及48小時，然後經CellTiter 96細胞增生檢定套組 (Promega)分析。第3C圖提供細胞凋亡分析。以API-2處理 細胞並經膜聯蛋白（annexin)V及Π染色，然後經FACScan分析。 20 第4圖表示API-2可抑制Akt之下游目標並在小鼠異種 移殖物中之具高Akt之癌細胞株内顯示抗腫瘤活體。第4A 圖係說明API-2可抑制馬铃著球蛋白（tuberin)、Bad、AFX及 GSK-3万iAkt石粦酸化反應。在經ΑΠ_2處理後，溶解OVAR3 細胞並經指定之抗體免疫墨點。第4Β圖表示ΑΡΙ-2可抑制腫 23 200827363 瘤生長。將腫瘤細胞皮下注射入左側具低Akt細胞含量而右 側具高Akt細胞含量之裸鼠體内。當腫瘤達約1〇〇至15〇毫米 3之平均大小時，以媒劑或1毫克/公斤/天之API-2處理這些 動物。各測定值代表1〇個腫瘤之平均值。第4C圖係闡明經 5 ΑΡΙ-2或媒劑（對照物）處理之具OVCAR3(右）及OVCAR5(左） 異種移殖物的小鼠之圖解。第4D圖表示於實驗結束時之腫 瘤大小（下）及重量（上）。在第4E圖中，在經處理(丁3及T4)及 未經處理（T1及T2)之OVCAR-3-衍生之腫瘤内使用抗磷酸 化Akt-S473(上）及抗AKT2(下）抗體進行腫瘤溶解產物的免 10 疫墨點分析。 第5圖表示API-2(曲西立濱）可抑制活體外激酶活性。在 含磷脂醯肌醇-3,4,5-P3(PIP3)、API-2及組織蛋白作為基質 之激酶緩衝劑中以PDK1及Akt之重組型進行活體外激酶檢 定。30分鐘培育後，藉SDS_PAGE而分離該等分應物並曝露 15 在薄膜中。 弟6a至c圖提供人類Akt 1之mRNA及胺基酸序列，亦言己 錄限制酶位置。 第7a至d圖提供人類Akt2之及mRNA胺基酸序列，亦言己 錄限制酶位置。 20 第8a至c圖提供人類Akt3之mRNA及胺基酸序列，亦記 錄限制酶位置。 第9圖表示藉曲妥珠單抗及Akt/mTOR路徑抑制劑之、会且 成而進行之生長抑制。以該Akt/mTOR路徑抑制劑單獨或與 曲妥珠單抗一起治療PTEN反訊息或非專一性募核答酸轉 24 200827363 移之BT474.ml細胞並評估相對細胞生長。第9A圖表示 Akt/mTOR抑制劑之名單。在PTEN AS轉移感染之BT474.ml 細胞中評估生長抑制作用。其劑量為：曲西立濱 (ΤΟΝ)ΙμΜ ； RAD001 0.2nM ； QLT0267 ΙΟμΜ ； ΚΡ 372-1 5 〇.〇5μΜ ; 4ADPIB 5μΜ ;依地福新（Edelfosine)7.5pM ;及曲 妥珠單抗(Ttzm)2微克/毫升。標示生長抑制百分比之標準偏 差（SD)。所示結果為得自2至3次實驗(各次實驗内重複各處 理法3次）之合併資料。第9B圖表示TCN與曲妥珠單抗之組 合可抑制細胞生長。使BT474.ml細胞經PTEN AS募核苷酸 10 或非專一性(NS)寡核苷酸轉移感染於TCN之多劑量下經曲 妥珠單抗及TCN(單獨或一起)處理並分析生長抑制作用。曲 妥珠單抗係以單一濃度投予。第7C圖表示RAD001與曲妥珠 單抗之組合可抑制細胞生長。使BT474.ml細胞經PTEN AS 募核苷酸或非專一性(NS)寡核苷酸轉移感染，於RAD001之 15 多劑量下經曲妥珠單抗及RAD001處理（單獨及一起)並分析 生長抑制作用。就第9B及9C圖而言：*表示與單獨使用曲 妥珠單抗或TCN-TAD001比較，使用組合治療劑之生長抑制 作用有明顯差異。Ρ<0·05被視為顯著。該差長條圖描述 SEM。 20 第10圖表示對細胞之凋亡之協同效果。接種後24小 時，如所述使經PTENAS及NS轉移感染之BT474.ml細胞經 以下濃度之曲妥珠單抗(Tzm)、TCN及/或RAD001處理：曲 妥珠單抗2微克/毫升；曲西立濱2.5μΜ; RAD001 0.4nM。 進行Apo-BrdU Tunel檢定法以評估細胞凋亡。進行該實驗 25 200827363 共3次且所示數據為平均細胞滴亡數。誤差長條圖描述標準 偏差。與所有其它處理法比較，曲妥珠單抗+曲西立濱治療 物可明顯誘發細胞凋亡(p<0.01)。 第11圖表示Akt及P70S6K活性之抑制作用。為了評估這 5些藥物對Akt/mT0R路徑之影響，使BT474.ml細胞經PTEN AS及NS券核苷酸轉移感染。兩天後，使該等細胞經曲妥珠 早抗及曲西立 >負（TCN)(第11A圖）或曲妥珠單抗及 RAD001(第11B圖）處理，費時2小時。收集總細胞溶解產 物，藉SDS-PAGE而分離並如上述經免疫墨點。該曲妥珠單 10抗之濃度為2微克/毫升，曲西立濱之濃度為2·5μΜ且 RAD001之濃度為0·4ηΜ。重複該等實驗至少兩次以確保該 等結果可複製。 第12圖表示組合治療物可抑制S CID小鼠異種移種物 模式中之腫瘤生長。使SCID小鼠接受乳房脂肪墊中之 15 BT474.ml乳癌細胞異種移植物。使該等異種移植物生長3 週以產生平均大小為1〇〇至15〇毫米3之腫瘤。投予pTEN反訊 息寡核苔酸、曲妥珠單抗、曲西立濱（第12A圖）及RAD001(第 12圖）。母週使用測徑器測量該等腫瘤兩次並平均各治療組之 腫瘤大小。誤差長條圖表示該平均值之標準誤差。*表示與 20單獨使用曲女珠單抗(Ttzm)、TCN或DMSO比較，使用組合 治療物之生長抑制作用有明顯差異。Ρ<0·05被視為顯著。 【】 較佳實施例之詳細說明 與先W技藝及經驗不同，本發明者已確定成功使用曲 26 200827363 西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如 曲妥珠單抗或其鹽的組合以治療腫瘤及癌之方法，其係藉 以下之一或彼等之組合：（i)僅對根據下述診斷性試驗之曲 西立濱化合物及/或曲妥珠單抗或其鹽呈現增強敏感性的 5 患者投予曲西立濱及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分 子，例如曲妥珠單抗或其鹽；（ii)使用可以使該曲西立濱化 合物及/或該曲妥珠單抗或其鹽之毒性減至最低但仍具有 功效之所述劑量；或（iii)使用可以使該曲西立濱化合物及/ 或該曲妥珠單抗或其鹽之毒性減至最低的所述給藥方案。 10 定義 如文中使用，該名詞“本發明化合物”係指式I化合物、 式II化合物、及彼等之組合。 如文中使用，該名詞“癌”及“癌性的”係指或描述典型 上患有未經控制之細胞生長（亦即增生性病症）特性之哺乳 15 動物的生理狀況。此等增生性病症之實例包括癌，諸如癌 瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤、及白血病；以及文中所述 之其它癌。此等癌之更特定實例包括乳癌、攝護腺癌、結 腸癌、鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、 膜臟癌、子宮頸癌、印巢癌、肝癌（例如肝癌瘤）、膀脱癌、 20 結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臟癌、及甲狀腺癌。 癌之其它非限制性實例為基底細胞癌瘤；膽道癌；骨 癌；腦及CNS癌；域毛膜癌；結締組織癌；食道癌；眼癌； 頭及頸之癌；胃因性癌；上皮内贅瘤；喉癌；淋巴瘤，其 包括霍吉金氏及非霍吉金氏淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤； 27 200827363

Μ及其它癌瘤與肉瘤。 如文中使用， 如文中使用’該名詞“腫瘤，，係指所有贅生性細胞生長

。原發性腫瘤團塊 及增生（不論惡性或良性）、及所有癌前及癌性的細胞與組 織。例如一倍宗滤 係指起因於_之正常細胞的轉形之在論織内癌細胞的 生長。在大多數情況下，可藉囊腫之存在(其可經由目視或 觸#方法而發現)或藉該輯之形狀我靠、結構或重量 而鑑定該原發性腫朗塊n某些原發性腫瘤並未能 觸知且僅可經由醫學影像技術，諸如χ射線(例如乳房放射 線攝影術）’或藉針抽吸法而檢測。在早期檢測中較常使用 15這些技術。在組織内進行癌細胞之分子性及表型分析通常 可證實該癌是否為該組織之内源性癌或該病灶是否起因於 自另一部位之轉移。 除非另有指定，如文中使用，該名詞“烷基，，包括具有， 例如(^至(：24之飽和直鏈、分支鏈或環系、第一、第二或第 20三烴且更明確地，包括甲基、三氟甲基、乙基、丙基、異 丙基、環丙基、丁基、異丁基、第三-丁基、戊基、環戊基、 異戊基、新戍基、己基、異己基、環己基、環己基甲基、 3-甲基戊基、2,2-二曱基丁基、及2,3-二甲基丁基。該烷基 可選擇性經，例如一或多種以下之取代基取代：諸如鹵素 28 200827363 (F、Cn、Br 或 1)(例如 CF3、2-Br-乙基、CH2F、CH2a、CH2CF3 或cf2cf3)、羥基（例如CH2OH)、胺基（例如ch2nh2、 ch2nhch3或ch2n(ch3)2、烷胺基、芳胺基、烷氧基、芳 氧基 '硝基、疊氮基(例如ch2n3)、氰基(例如ch2cn)、磺 5 酸、硫酸根、膦酸、磷酸根或膦酸根，且若必要，如熟悉 本項技藝者所知，例如如Greene等人在Protective Groups in Organic Synthesis，1999，第 3版(John Wiley and Sons，NY) 中所教示，該等分子團可未經保護或經保護。 該名詞“烷芳基”或“烷基芳基”包括具有芳基取代基之 1〇 烷基。該名詞“芳烷基，，或“芳基烷基”包括具有烷基取代基 之芳基。 如文中使用之該名詞“鹵素’’包括氣、溴、碘、及氟。 該名詞“醯基”包括羧酸酯，其中該酯基之非羰基分子 團係選自直鏈、分支鏈或環系烷基或低碳烷基；烷氧烷基， 15 其包括甲氧曱基；芳烷基，其包括苄基；芳氧烷基，諸如 苯氧曱基；芳基，其包括可選擇性經素、口至(：4烷基或 ^^至〇4烧氧基取代之苯基；績酸酯，諸如烧基或芳烧基石黃 醯基，其包括甲磺醯基、單、二或三磷酸酯、三苯甲基或 單甲氧三苯曱基、經取代苄基、三烧基甲石夕烧基(例如二甲 2〇 基·第三·丁基曱矽烷基）或二苯基甲基甲矽烷基。該等酯内 之芳基最好包含苯基。該名詞“低碳酷基”係指其中非羰基 分子團為低碳烷基之醯基。 如文中使用’就鏡像異構性純度而^ ’實質上不含” 或“實質上缺乏，，係指包括至少85或90重量％、較佳95至98 29 200827363 又更佺99至1〇〇重量％指定鏡像異構物之組成物。 在較佳實施例中，在本發明該等方法及化合物中，該等 化口物實質上不含其它鏡像異構物。 5 10 15 20 &類似地，該名詞“經離析”係指包括至少85或90重量％、 =佳95至98重量％且又更佳99至綱重量％該化合物及含其 它化學種類或鏡像異構物之化合物組成物。 、 〃文十使用之該名詞“獨立”剌以表示該變數，其係獨 立,¼用”，隨各應用而獨立不同。因此，在—化合物（諸如 R XYR )中，其中R，，“獨立為碳或氮，，，兩R”皆可以是碳， 兩尺可以疋氮，或_R，，可以是碳而另一R”為氮。 本專利說明書從頭至尾使用之該名詞“藥學上可接受 2或則藥係、描述—旦對患者投㈣可得到化合物之該化 合物的任何藥學上可接受形式(諸如i旨、碟咖旨 '自旨或相關 基團之鹽）。藥學上可接受鹽包括衍生自藥學上可接受無機 ^有機驗及酸之鹽。合適的鹽包括衍生自以下之鹽：在藥 學技藝已為吾人所熟知之許多其它酸雜金屬，諸如鉀及 ，’驗土金屬’諸如_及鎂。藥學上可接受前藥係指可在 伯=體内代δ射’例如水解或氧化，以形成本發明化合物之 化口物。則藥之典型實例包括在該活性化合物之官能性分 :團上具有生物學不穩定保護基團之化合物。前藥包括可 氧化還原、胺化、去胺化、經基化、去經基化、水解、 去水解H去絲、㈣、去·、雜化、去碟酸 化以產生該活性化合物之化合物。 匕，，除非另有指定，如文巾使用之該名詞“藥學上可接受 酉曰包括在正常醫療判斷之範圍内適用於接觸宿主之組織 30 25 200827363 且不會有不當毒性、刺激性、過敏反應等之與合理的效益 性/危險性比相稱且能有效用於彼等之目的用途的一或多 種化合物之醋。 如文中使用之該名詞“患者”係指動物、較佳為哺乳動 5 物、最佳為人類。哺乳動物可包括非人類之哺乳動物，其 包括，但不限於：豬、山羊、綿羊、牛（牛類動物）、鹿、騾、 馬、狼；及其它非人類之靈長目動物，例如狗、I苗、大鼠、 小鼠、兔或任何其它已知或文中所揭示之動物。 本發明化合物 10 本發明提供TCN、TCN-P及相關化合物與可調節 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽的組 合適用於治療增生性病症之特殊治療方案的用途。 除非另有指定，如文中使用該名詞“曲西立濱化合物” 與“曲西立濱及相關化合物”係指具有以下結構之化合物：

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5月女、石兴酉夂酉曰，其包括烧基或芳院基；績酿基，其包括甲續 醯基及节基，其中該苯基可選擇性經一或多種如，例如在 文中所予之芳基的定義中所述之取代基取代；可選擇性經 取代之芳基，脂質，其包括石舞脂；胺基酸：碳水化合 物、，月太，或膽固醇；或活體内可得到其中R2,、R3,及R5,獨 1〇立為Η或單_、二或三-磷酸鹽之化合物的其它藥學上可接受 脫離基； -中R及Ry獨立為氫、可選擇性經取代之填酸鹽；酿 — 括低反酼基），醯胺、烷基(其包括低碳烷基）；芳香 、1化狀’諸如聚乙二醇、可選擇性經取代之芳石黃酸 1 土/日貝其包括碟脂；胺基酸；碳水化合物；肽；或膽 口醇’或其匕藥學上可接受之脫離基。在—實施例中，兮 化合物係以5，，酉_旨質或5，-嶋質投予； ^ 32 200827363

Ri及R2各獨立為Η、可選擇性經取代之直鏈、分支鏈或 %系烷基(其包括低碳烷基）、烯基或炔基、c〇_烷基、c〇-烯基、CO-炔基、CO-芳基或雜芳基、c〇_烷氧烷基、c〇_ 芳氧烷基、CO-取代之芳基、磺醯基、烷磺醯基、芳磺醯基、 5 芳烷磺醯基； 在一實施例中，R2’及R3’為氫。在另一實施例中，R2, 及R5’為氫。在又另一實施例中，r2,、R3，及R5，為氫。在 又另一實施例中，R2,、R3,、R5,、似及们為氫。 在另一實施例中，該曲西立濱化合物具有以下結構：

CHS

其中R3為Η、可選擇性經取代之直鏈、分支鍵或環系烧 基(其包括低奴烧基）、稀基或炔基、NH2、NHR4、N(R4)2、 芳基、烧氧烧基、芳氧燒基或經取代之芳基；且 各R獨立為Η，醯基，其包括低碳醯基；烷基，其包括 15低碳絲，諸如，但不限於：甲基、乙基、丙基及環丙基； 烯基；炔基；環烷基；烷氧基；烷氧烷基；羥烷基或芳基。 33 200827363 在一亞實施例中，R3為直鏈Cl至C11烷基、異丙基、第三-丁基或苯基。 在一實施例中，文中提供之曲西立濱化合物具有以下 結構： 5

ίΨΌ 戰

在另一實施例中，文中提供之曲西立濱化合物具有以 下結構：

在另一實施例中，文中提供之曲西立濱化合物具有以 10 下結構： 34 200827363

其中R6為Η、烷基(其包括低碳烷基）、烯基、炔基、烷 氧烷基、羥烷基、芳烷基、環烷基、NH2、NHR4、NR4R4、 CF3、CH2OH、CH2F、CH2Cb CH2CF3、C(Y3)3、C(Y3)2C(Y3)3、 5 C(=0)0H、C(=0)0R4、C(=0)-烷基、C(=0)·芳基、C(=0)· 烷氧烷基、C(=0)NH2、C(=0)NHR4、C(=0)N(R4)2，其中各 Y3獨立為H或鹵素；且 各R4獨立為Η ;醯基，其包括低碳醯基；烷基，其包括 低碳烷基，諸如，但不限於：甲基、乙基、丙基及環丙基； 10 烯基；炔基；環烷基；烷氧基；烷氧烷基；羥基或芳基。 在一亞實施例中，R6為乙基、CH2CH2OH或CH2-苯基。 在另一實施例中，文中提供之曲西立濱化合物具有以 下結構： 35 200827363

其中R7為Η、鹵素、烷基(其包括低碳烷基）、烯基、炔 基、烷氧基、烷氧烷基、羥烷基、環烷基、硝基、氰基、 OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R4、SH、SR4、CF3、CH2OH、 5 CH2F、CH2C1、CH2CF3、C(Y3)3、C(Y3)2C(Y3)3、C(=0)0H、 C(=0)OR4、C(O)-烷基、C(=0)-芳基、C(=0)-烷氧烷基、 C(=0)NH2、C(=0)NHR4、C(=0)N(R4)2或N3，其中各Y3獨 立為H或鹵素；且 各R4獨立為Η ;醯基，其包括低碳醯基；烷基，其包括 10 低碳烷基，諸如，但不限於：甲基、乙基、丙基及環丙基； 烯基；炔基；環烷基；烷氧基；烷氧烷基；羥烷基。 在一亞實施例中，R7為曱基、乙基、苯基、氯或ΝΗ2。 在另一實施例中，文中提供之曲西立濱化合物具有以 下結構： 36 200827363

在另一實施例中，文中提供之曲西立濱化合物具有以 下結構： 37 200827363

Η

Ν

除非另有指定，如文中使用之該名詞“可調節 HER2/neu(erbB2)受體之分子”係指可以在以細胞為主之檢 定中以高親和力選擇性結合至人類上皮細胞生長因子受體 5 2蛋白質（HER2)之細胞外結構域的重組型DNA衍生之人類 單株抗體化合物。在特定實施例中，該抗體為含有人類架 構區段之klgGi，其具有可結合至HER2之鼠抗體(4D5)之互 補決定區域。 除非另有指定，如文中使用之該名詞“曲妥珠單抗”係 10 指曲妥珠單抗或其鹽。在特定實施例中，該名詞“曲妥珠單 抗”係指具有DrugBank登錄號BTD00098及商標名稱為賀癌 平(Herceptin)之化合物，其係為針對人類上皮細胞生長因子 38 200827363 受體2(HER2)之重組型人源化單株抗體。許多腺癌瘤，特別 為乳房腺癌瘤，可過度表現HER2。曲妥珠單抗可結合至腫 瘤細胞之細胞表面上的HER2，藉此誘發能對抗可過度表現 HER2之腫瘤細胞的抗體依存性細胞媒介之細胞毒害性。 5 應瞭解文中揭示之化合物可含有對掌性中心。此等對 掌性中心可具有（R)或（S)構型或可以是彼等之混合物。因 此，文中提供之化合物可具鏡像異構純性或可以是立體異 構性或非對映異構性混合物。應瞭解文中化合物之揭示内 容涵蓋外消旋、旋光性、多晶形或立體異構性形式或彼等 10 之混合物，該化合物較佳具有文中所述之有用性質，製備 旋光性形式之方法及使用文中所述之標準試驗或使用本項 技藝中已為吾人所熟知之其它類似試驗以測定活性的方法 在本項技藝中已為吾人所熟知。可用以獲得該等化合物之 光學異構物的方法實例包括下述： 15 晶體之物理分離法··一種以手工方式分離個別鏡像異 構物之肉眼可見的晶體的技術。若個別鏡像異構物之晶體 存在’亦即該物質為晶團且該等晶體在視覺感受上不同： 同日守結晶法·僅在消旋物之溶液為呈固態之晶團時， 可分別自該溶液晶化個別鏡像異構物的技術。 10 酶催拆分法：藉使用酶進行該等鏡像異構物之反應的 不同速率而部份或完全分離消旋物之技術。 峰催不對稱合成法·该合成法之至少一步驟係使用酶 催反應以獲得所欲鏡像異構物之鏡像異構性純或富集的合 成前驅體之合成技術。 39 200827363 化學不對稱合成法：於可以在該產物内產 於可以在該產物内產生肩觀·

非對映異構物分離法，使外消旋化合物與鏡像里構性 純試劑（該對掌性伽劑）反應以使個難料構物轉化成 非對應異構物之技術。'然後藉彼等之現在更顯著的結構差 異而利用層析法或結晶作用以分離所形成非對映異構物， 並稍後移除該對掌性輔助劑以獲得所欲鏡像異構物；

一種使得自消旋物之 10非對映異構物平衡以在得自所欲鏡像異構物之該等非對映 異構物溶液中佔多數或自所欲鏡像異構物之該非對映異構 物的優先結晶反應會擾亂該平衡以致使最後原則上所有該 物質自所欲鏡像異構物轉化成結晶狀非對映異構物。然後 自該非對映異構物釋放所欲鏡像異構物的技術。 15 動力學拆分法··本技術係指在動力學條件下藉該等鏡 像異構物與對掌性、非外消旋試劑或觸媒之獨特反應速率 而進行消旋物之部份或完全拆分或進一步拆分已部份經拆 分的化合物； 自非外消旋前驅體進行鏡像專一性合成法：自非對掌 20性起始物質獲得所欲鏡像異構物之合成技術，且在合成過 &中其立體化學元整性並未受損或受損程度極微； 對掌性液體層析法：藉鏡像異構物與靜止相之不同交 互作用而在液體流動相中分離消旋物之該等鏡像異構物的 技術。該靜止相可以由對掌性物質製成或該流動相可含有 40 200827363 能導致不同父互作用之另一對掌性物質； 對掌性氣體層法：使消旋物揮發並藉鏡像異構物在氣 態流動相中與含有固定非外消旋對掌性吸收劑相之柱的不 同交互作用而分離該等鏡像異構物之技術； 5 <吏用對掌性溶劑萃取之方》去，藉使-鏡像異構物優先 溶解在特定對掌性溶劑中而分離該等鏡像異構物之技術； 經由對掌性薄膜而運載之方法，使消旋物與薄膜障壁 接觸之技術。該障壁典型上可分離兩混溶性流體（其中之一 含有該消旋物），且驅動力，諸如濃度或壓差，可以導致經 10 由該薄膜障壁而優先運載。 在某些實施例中，係提供曲西立濱、曲西立濱磷酸鹽 (TCN-P)、曲西立濱5’“粦酸鹽（TCN_P)、或曲西立濱之DMF 加成物（TCN-DMF)。可藉熟悉本項技藝者已知之任何技 術，例如如 Tetrahedron Letters，ν〇1· 49, ρρ· 4757-4760 (1971) 15中所述之方法而合成TCN。可藉熟悉本項技藝者已知之任 何技術，例如如美國專利第4，123,524號中所述之方法，而 製備TCN-P。TCN-DMF之合成法係描述在，例如INSERM, νοΐ.81，ρρ· 37-82 (1978)中。可根據例如以下資料中所述之 TCN 相關之其它化合物·· Gudmundsson K.S. et al·， 20 Nucleosides Nucleic Acids, 2001. 20(10-ll):p. 1823-1830; Porcari A.R. et al.? J Med Chem5 2000. 43(12):p. 2457-2463; Porcari A.R. et al·，Nucleosides Nucleotides, 1999. 18(ll-12):p. 2475-2497; Porcari A.R. et al.? J Med Chem5 2000. 43(12):p. 2438-2448; Porcari A.R. et al.9 Nucleosides 41 200827363

Nucleotides Nucleic Acids, 2003. 22(12):p. 2171-2193; Porcari A.R. et al.? Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2004. 23(l-2):p. 31-39; Schweinsberg P.D. et al.? Biochem Pharmacol, 1981. 30(18):p. 2521-2526; Smith K.L. et al.5 5 Bioorg Med Chem Lett, 2004. 14(13):p. 3517-3520;

Townsend L.B. et al·，Nucleic Acids Symp Ser，1986· 1986(17):p· 41-44;及/或 Wotring L.L_ et al·，Cancer Treat Rep，1986. 70(4):p. 491-7。 藶學上可接受及前華 10 15 20 就化合物之鹼性或酸性足以形成安定非毒性酸或鹼鹽 之情況而言，該化合物最好以藥學上可接受鹽投予。藥學 上可接受鹽包括衍生自藥學上可接受無機或有機鹼及酸之 鹽。合適的鹽包括衍生自該藥學技藝中已為吾人所熟知之 許多酸的驗金屬，諸如_及鈉；級土金屬，諸如詞及錢。 更洋細地’藥學上可接受鹽之實例為使用酸所形成之有機 酸加成鹽’其可形成生理上可接受之陰離子，例如甲苯谱 酸根、甲績酸根、〔酸根、擰檬酸根、丙二酸根、酒石二 根琥贼根、本甲酸根、抗壞血酸根、心酮基戊二酸根、 及α甘柄根。亦可形成合適的無機鹽，其包括硫酸 鹽、姐鹽、錢Μ、及碳酸鹽。 可使用本項技藝中已為吾人所熟知之標準程序以择得 藥學上可接受鹽’例如使充份驗性之化合物，諸如胺X t適的酸反應以得到生理上可接受之_子。亦可製成叛 酉文之驗金屬（例如鈉、鉀或峨驗土金屬（例如約）。 42 200827363 任何文中所述之核笞酸可以以核苷酸前藥投予以增加 該核苷酸之活性、生物可利用率、安定性或改變其性質。 許多核苷酸前藥取配位體係已知。一般而言，該核苷酸之 單、二或三磷酸鹽的烷化反應、醯化反應或其它親脂性修 5 飾作用可增加該核^:酸之安定性。可取代該磷酸鹽分子團 上之一或多個氫之取代基實例為烷基、芳基、類固醇、碳 水化合物（其包括糖）、丨，2-二醯基甘油及醇。許多此等取代 基係描述在 R. Jones and N. Bischofberger，Antiviral Research，27(1995)1-17中。其中任一種可併用所揭示核苷 10 酸以獲得所欲作用。 在一實施例中，該曲西立濱或相關化合物係以5，-羥基 親脂性前藥提供。揭示可共價性併入該核苷酸内，較佳於 該核苷酸或親脂性製劑之5，-0H位置處之合適親脂性取代 基的美國專利之非限制性實例包括美國專利第5,149,794 15 號、第 5，194,654號、第 5,223,263 號、第 5,256,641號、第 5,411，947號、第 5,463,092號、第 5,543,389號、第 5,543,390 號、第5,543,391號、及第5,554,728號。該等專利全部皆併 入本案以為參考資料。 揭示可連接至本發明之曲西立濱或相關化合物的親脂 20 性取代基或親脂性製劑之外國專利申請案包括W0 89/02733、W0 90/00555、W0 91/16920、W0 91/18914、 W0 93/00910、W0 94/26273、WO/15132、EP 0 350 287、 EP 93917054.4、及W0 91/1972卜 曲西立濱或相關化合物之衍生物的另外非限制性實例 43 200827363 為含有如以下出版物中所述之取代基的衍生物。這些經衍 生之曲西立濱或相關化合物可用於本文中所述之病徵或作 為抗病毒藥劑，其包括抗HIV或抗HBV藥劑。該等出版物 如下：Ho D.H.W·，Cancer Res·，1973 33:ρ· 2816-2820; Holy 5 A. in Advances in Antiviral Drug Design. V〇L_L De Clercq(ed.)? JAI Press, pp. 179-231; Hong C.I. et al. Biochem Biophys Rs Commun5 1979. 88:p. 1223-1229; Hong C.I. et al.? J Med Chem? 1980. 28:p. 171-177; Hostetler K.Y. et al.? J Biol Chem5 1990. 266:p. 11714-11717; Hostetler K.Y. 10 et al? Antiviral Res, 1994. 24:p. 59-67; Hostetler K.Y. et al? Antimicrobial Agents Chemother, 1994. 38:p. 2792-2797; Hunston R.N. et al? J Med Chem? 1984. 27:p. 440-444; Ji Y.H. et al? J Med Chem? 1990. 33:p. 2264-2270; Jones A.S. et al.? J Chem Soc Perkin Trans, 1984. I:p. 1471-1474; Juodka B.a. 15 and Smart J·，Coll Czech Chem comm，1974. 39:p. 363-968; Kataoka S. et al, Nucleic Acids Res Sym Ser, 1989. 21 :p. 1-2; Kataoka S. et al? Heterocycles, 1991. 32:p. 1351-1356; Kinchington D. et al? Antiviral Chem Chemother, 1992. 3:p. 107-112; Kodama K. et al.? Jpn J Cancer Res, 1989. 80:p. 20 679-685; Korty M. and Engels J·，Naunyn-Schmiedeberg’s

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在另一實施例中，係提供治療患者之癌的方法，其係 藉每週一次對該患者投予1〇毫克/米2或更少2TCN

、TCN-P 20或相關化合物及小於約3〇毫克之可調節her2/腦(erbB2) X體之为子’例如曲妥珠單抗或其鹽的給藥方案。在特定 實施例中，可每週—次投予〇.5、1、丨.5、2、2.5、3、3.5、4、 4·5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或 10毫克/米2 之如文中揭不的1^、TCN_p或相關化合物。在另一特定 48 200827363 實施例中，可每週一次投予1、5、10、15、20、25、30、 35或40毫克可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥 珠單抗或其鹽。 在本發明之實施例中，可以在短時間内，例如約5、10、 5 15、20、30或60分鐘，以單一大劑量同時投予文中揭示之 化合物。在另外實施例中，係提供其中該等化合物藉連續 輸注，費時至少24、48、72、96或120小時而同時投予之給 藥計劃。在特定實施例中，可以以如下述之特定頻率重複 藉連續或大量注射而進行該曲西立濱化合物及/或可調節 10 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽的投 藥：每週至少一次、每兩週至少一次、每3週至少一次、每 月至少一次、每5週至少一次、每6週至少一次、每8週至少 一次、每10週至少一次及/或每12週至少一次。可以使用文 中揭示之任何方式合併投藥之類型及頻率以創造約藥周 15 期。可藉特定給藥周期而重複投予該曲西立濱化合物及/或 可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其 鹽，例如每兩週一次以大量注射之方式投藥，費時3週。可 投予該給藥周期，費時至少：：1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、Η、12、18或24個月。或者可對患者投予至少2、3、4、 20 5、6、7、8、9、10、11、12、15或20次給藥周期。可根據 文中揭示之任何組合而投予該曲西立濱化合物及/或可調 節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽， 例如每週一次、每3週一次投予該曲西立濱化合物及/或可 調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其 49 200827363 鹽，共3周期。 在另外實施例中，可每天一次分別投予該化合物，費 時至少2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在此投藥後，在 相同的時期内並未投予該曲西立濱化合物及/或可調節 5 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽。 可對患者投予如文中揭示之TCN、TCN_P及相關化合 物與可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗 或其鹽’其投予量能有效導致腫瘤消退。該TCN、TCN-P 或相關化合物及曲妥珠單抗或其鹽之投藥可以在至少15至 10 20%該等患者中得到至少部份，諸如至少Μ、2〇或3〇%，或 完全之活體反應。在特定實施例中，可對患者投予至少2、 5、10、15、20、30或50毫克/米2之文中揭示的曲西立濱化 合物。在特定實施例中，可對患者投予至少約0.5、;1、15、

2、2·5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、 15 9、9.5、10、12、15、17、20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、165、 175、200、250、300或350毫克/米2之文中揭示的TCN、TCN-P 或相關化合物。在特定實施例中，可對患者投予1、5、10、 15、20、25、30、35或40毫克可調節HER2/neu(erbB2)受體 2〇 之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽。 可根據文中揭示之治療方案而進行該化合物之投藥。 在特定實施例中，該給藥方案包括同時、連續或在一段時 間内投予小於約20毫克/米2之TCN及相關化合物與小於約 30毫克可調節HER2/neu(ei*bB2)受體之分子，例如曲妥珠單 50 200827363 抗或其鹽。在一實施例中，可每週一次同時投予小於2〇毫 克/米2之TCN或相關化合物及小於約3〇毫克之可調節 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽。在 另一實施例中，可每週一次投予小於2〇毫克/米2之TCN或相 5關化合物並可在下一週投予小於約30毫克可調節 、 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽。 / 在另外實施例中，可對患者投予2毫克/米2、5毫克/米2、 10¾克/米、及/或15¾克/米之TCN或相關化合物及小於約 ( 300、250、200、150或 1〇〇毫克可調節 HER2/neu(erbB2)受 10 體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽。在另一實施例中，可 經由連續輸注而對患者投予小於約3〇〇毫克可調節 • HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，費 - 時至少5天。本發明提供文中揭示之給藥類型、頻率、周期 數及劑量的任何組合。 15 患者群體之師檢 在本發明之另一方面中係提供鑑定易受曲西立濱 (. (TCN)及相關化合物之毒性作用影響的癌或腫瘤之方法。在 一實施例中’係提供治療哺乳動物之癌或腫瘤之方法，其 . 係藉⑴自該腫瘤獲得生物試樣；（ii)測定該癌或腫瘤是否過 20 度表現Akt激酶或高活化且磷酸化之Akt激酶；及⑴〇使用如 文中所述之曲西立濱或相關化合物治療該癌或腫瘤。在一 實施例中，該生物試樣可以是一種活體切片。在其它實施 例中，該生物試樣可以是得自該腫瘤或癌之流體、細胞及/ 或抽吸物。 51 200827363 可根據熟悉本項技藝者 Μ φ 〇之任何技術而獲得該生物 试樣。在一 Κ施例中，可進;^、、 、 舌體切片以獲得該生物試樣。 活體切片為自身體移除組键★、 、八或、、、田胞以進行檢驗的程序。某 些活體切片可以在醫師的診所 ^ 々内進仃，而其它活體切片需 要在醫院環境中完成。此外， ^ ^ 、 杲些活體切片需要使用麻醉 藥以麻痺該區域’而其它活鹏 匕居體切片並不需要任何鎮靜作 用。在特定實施例中，可進; 廼仃内視鏡活體切片。此種活體 切片係經由光纖内視鏡（在— 10 20 、具有最近對焦之眼鏡之適 於檢視的長、細管）通過天然體孔（亦即直腸）或小切口（亦即 關節鏡檢查）而進行。使用該内視鏡以檢視所述器官之異常 或可疑區域以獲得適於研究之少量組織。内視鏡檢查程序 係用於欲顯影及/或治療之器官或身體區域。醫師可將該内 視鏡插人月腸道(雜逼内視鏡檢查）、膀胱(膀胱鏡檢查）、 腹腔(腹腔鏡檢查）、關節腔（關節檢查）、胸之中間部位(縱腸 鏡檢查)或氣管及支氣管系統(喉鏡檢查及支氣管鏡檢查）内。 在另一實施例中，可進行骨髓活體切片。可自胸骨 (ternum)或路脊髖骨（在下背區域上之骨盆任一側上的骨 員區域)進行此種活體切片。清洗皮膚並提供局部麻醉藥以 仃痺"亥區域。將長硬針插入髓内，並抽吸細胞以進行研究； 本步驟偶爾令人不舒服。在該抽吸步驟後可進行核心活體 切片（自該髓移除小骨“碎片，，）。 在另一實施例中，可對該哺乳動物進行切除性或切開 性活體切片。當需要更寬度或較深之皮膚部位時，通常此 種活體切片。使用解剖刀（手術刀）移除全厚之皮膚以進行進 52 200827363 一步檢查，並縫合(使用手術用線縫合)傷口。當移除整個腫 瘤時，其被稱為切除性活體切片技術。若僅移除該腫瘤之 一部份時，其被稱為切開性活體切片技術。例如當疑有零 色素瘤（一種皮膚癌）時，切除性活體切片通常為經常較佳使 5 用之方法。 在又另外實施例中，可使用細針抽吸(FNA)活體切片 法。此種活體切片法包括使用細針以自腫瘤移除很小片。 有時使用局部麻醉劑以麻痺該區域，但是該試驗很少導致 不舒服且不留下疤。FNA不適用，例如可疑色素痣之診斷， 10但是可用以，例如活體檢查接近黑色素瘤之大淋巴結以瞭 解該黑色素瘤是否已轉移(擴散）。可使用電腦斷層攝影術掃 描（CT或CAT掃描）以將針導入内部器官（諸如肺或肝臟）内 之腫瘤中。 在其它實施例中，可進行鑽取、剃除及/或皮膚活體切 15片。鑽取式活體切片包括使用可移除組織之短圓柱體或“辱 果核心”之活體切片儀器取出較珠的皮膚試樣。投予局部廚 醉劑後，使該儀器在皮膚之表面上轉動，直到穿過所有展 (其包括真皮、表皮、及皮下組織（脂肪）之最表面部位）為 止。剃除式活體切片包括藉剃掉皮膚之最上層而移除該 20層。亦使用局部麻醉劑進行剃除式活體切片。皮膚活體切 片包括移除皮膚試樣以在顯微鏡下進行檢查以測定，例如 黑色素瘤是否存在。该活體切片法係在局部麻醉下進行。 在特定實施例中，係提供方法以測定該腫瘤是否過度 表現Akt激酶。Akt激酶過度表現性可表示該激酶之磷酸化 53 200827363 狀態。可根據文中所述之方法以檢測Akt之高度磷酸化反 應。在一實施例中，可以比較腫瘤活體切片及對照組織。 該對照組織可以是得自獲得該活體切片之哺乳動物的正常 組織或得自健康的哺乳動物之正常組織。可測定Akt激酶過 5 度表現性或高度碳酸化以瞭解該腫瘤活體切片之Akt激酶 之含量及/或Akt激酶磷酸化是否高於該對照組織，諸如Akt 激酶之含量比該對照組織中之Akt激酶含量高至少約1 ·5、 2、2·25、2.5、2·75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、 4.75、5、5.5、6、7、8、9或 10倍。 10 在一實施例中，本發明提供一種檢測患者或得自該患 者之生物試樣中之異常Akt激酶表現性的方法，其係藉使用 對Akt激酶或其抗原性部份具專一性之免疫相互作用性分 子接觸得自該等患者之細胞、細胞萃取物、血清或其它試 樣或生物試樣並筛檢免疫相互作用性分子-Akt激酶複合物 15 形成量，其中相對於正常細胞之該複合物的高存在量表示 可表現或過度表現Akt之異常細胞。在一實施例中，可以免 疫性師檢細胞或細胞卒取物之高Akt激酶存在量。 在另一實施例中，係藉篩檢可將Akt激酶編碼之基因的 表現程度而以基因層次檢測Akt在細胞内之異常表現性，其 20 中與正常細胞比較之轉錄表現產物（亦即mRNA)的高含量 表示異常細胞。在特定實施例中，可使用實時PCr以及其 它PCR程序以測定轉錄活性。在一實施例中，mRNA可得自 患者之細胞或得自患者之生物試樣且可選擇性產生 cDNA。然後可以使mRNA或cDNA與能夠雜交及/或擴增所 54 200827363 有或部份可將Akt激•編碼之核㈣序列或其互補核苗酸 序列之基因探針接觸，然後可檢測mRNA$cDNA之含量， 其中可，平估與正常對照組比較之高含量mRNA或eDNA的 存在。 5 本發明之又另一實施例涵蓋在定量或半定量診斷套組 中使用Akt激酶之抗體（單株或多株）以測定患者之可疑癌細 胞中的Akt激酶之相對含量，該套組可包括進行該檢定之所 需之所有試劑。在一實施例中，係提供使用進行£乙岱八檢 疋所需之試劑及材料的套組。試劑可包括，例如清洗用緩 10衝劑、抗體稀釋緩衝劑、阻斷用緩衝劑、細胞染色溶液、 顯像液、終止溶液、抗磷酸蛋白質專一性抗體、抗Pan蛋白 質專一性抗體、二次抗體、及蒸餾水。該套組亦可包括使 用說明且可選擇性自動化或半自動化或呈可以與自動化機 械或軟體相容之形式。在一實施例中，可以使用能檢測活 15 化形式之AKT(於絲胺酸474經磷酸化之Akt)的磷-絲胺酸 _473Akt抗體作為診斷套組中之抗體。見，例如Yuan等人， Oncogene，2000. 19:ρ· 2324-2330。

Akt激酶

Akt，亦稱為PKB3，代表絲胺酸/蘇胺酸激酶之亞族。 20 在本亞族中已確認3個成員，AKT1、AKT2、及AKT3。在 PI3K依存性方式中，Akt係藉細胞外的刺激物而活化(Datta, S.R·，等人Genes Dev· /3:2905-2927，1999)。Akt之完全活化 需要Thr·在該活化環中之磷酸化反應及Ser473在C末端活 化結構域中之磷酸化反應。Akt係藉PTEN腫瘤抑制劑而不 55 200827363 利地調節。在各種腫瘤内已確認PTEN内之突變，其可導致 Akt路徑之活化（Datta，S.R·，等人Genes Dev· /3:2905-2927, 1999)。此外，在許多人類惡性腫瘤内已檢測出Akt之擴增、 過度表現及/或活化(DattaS.R.等人，Genes Dev，1999. 13:ρ· 5 2905-2927); Cheng J.Q. and Nicosia S.V.? in Encyclopedic

Reference of Cancer. 2001，Schwab D. (ed·) Springer，Berlin Heidelberg and New York:pp 35-7)。Akt，特別為原構活性 Akt之異位表現性可誘發細胞存活及惡性轉形，然而Akt活 性之抑制作用可刺激一系列哺乳動物細胞之細胞凋亡 10 (Datta S.R·等人，Genes Dev，1999· 13:ρ· 2905-2927); Cheng J.Q· and Nicosia S.V·, in Encyclopedic Reference of Cancer, 2001，Schwab D. (ed.) Springer，Berlin Heidelberg and New York:pp 35-7; Sun M·等人，Am J Path，2001· 159:p· 431-437; Cheng J.Q·等人，〇nc〇gene，1997· i4:p· 2793-2801)。而且， 15 Akt之活化作用業經證明與腫瘤侵入性及化學抵抗力有關 (West Κ·Α·等人，Drug Resist Updat，2002· 5:ρ· 234-248)。 該Akt路徑之活化在惡性轉形及化學抵抗力方面扮濱 關鍵角色’其係藉誘發細胞殘活、生長、遊走、及血管生 成◦本發明提供測定Akt激酶過度表現性及/或高度活化及 20 磷酸化Akt激酶之含量的方法。 邊Akt激酶可以是任何已知Akt族激酶或其相關激酶， 其包括’但不限於Aktl、Akt2、Akt3。人類Aktl、Akt2、 Akt3之mRNA及胺基酸序列係分別闡明在第6a_c、第7a-d、 及第8a-c圖中。 56 200827363 謗斷檢定 免疫學檢定 在一實施例中，係提供一種用於檢測Akt激酶在哺乳動 物之細胞或在得自該哺乳動物之生物試樣中的異常表現性 5 之方法，其係藉使用對Akt激酶或其抗原部份具專一性之免 疫相互作用性分子接觸得自該哺乳動物之細胞、細胞萃取 物或血清或其它試樣或生物試樣，並篩檢免疫相互作用性 分子-Akt激酶複合物形成之程度，然後測定相對於正常細 胞之該複合物是否大量存在。 10 該免疫相互作用性分子可以是對Akt激酶或其抗原部 份或共其同源物或其衍生物具有專一性及結合親和力之分 子。在一實施例中’該免疫相互作用性分子可以是免疫球 蛋白分子。在其它實施例中，該等免疫球蛋白分子可以是 抗體片段、單鏈抗體、及/或去免疫化分子，其包括人源化 15 抗體及T細胞關聯性抗原結合性分子(TABM)。在一特定實 施例中，該抗體可以是單株抗體。在另一特定實施例中， 該抗體可以是多株抗體。該免疫相互作用性分子對Akt激酶 或更特定地，Akt激酶上之抗原決定體或表抗原具有專一 性。Akt激酶上之抗原決定體或表抗原包括免疫反應所引導 2〇之該分子的一部份。該抗原決定體或表抗原可以是B細胞表 抗原或右合適’其係為T細胞表抗原。在一實施例中，該抗 原為磷-絲胺酸473 Akt抗體。 本發明之一實施例提供一種用於診斷哺乳動物之癌存 在或似癌生長，其中係存在異常Akt活性的方法，其係藉使 57 200827363 用A k t激酶結合性有效量之對該A k t激酶或其上之抗原決定 體或表抗原具有專一性之抗體接觸得自該哺乳之細胞或細 胞萃取物或得自該患者之生物試樣，然後定量或定性測定 Akt激酶-抗體複合物之含量，其中係測定與正常細胞比較 5 之該高含量複合物的存在。 可藉熟悉本項技藝者已知之許多方法中任一種而製備 抗體。例如就人類Akt激酶之檢測而言，抗體通常但未必可 衍生自非人類動物，諸如靈長目動物、家畜動物（例如綿 羊、牛、豬、山羊、馬）、實驗室試驗動物(例如小鼠、大鼠、 10 天竺鼠、兔子）及/或伴侣動物（例如狗、貓）。抗體亦可以在 原核性或真核性宿主細胞内經重組性製成。一般而言，可 在細胞或組織生物切片上活體外進行以抗體為主之檢定。 然而，若抗體經合適去免疫化或就人類用途而言，經人源 化，則該抗體可經，例如核標籤標記，對患者投予並藉輻 15 射技術而測定核標記蓄積之位置。該Akt激酶抗體可以是癌 訂標劑。因此，本發明另一實施例提供適用於人類或非人 類患者體内之癌影像化的該等去免疫化形式之抗體。 就抗體產生Akt激酶而言，若該等抗體係藉重組方法而 製成，則通常必需自得自動物（其包括人體組織）或得自細胞 20 培養之生物試樣萃取該酶。可藉任何合適方法而自該生物 試樣分離Akt激酶。例如該分離方法可利用以下該Akt激酶 之性質中的任一或多種：表面電荷性質、大小、密度、生 物活性及其對另一實體（例如其所結合或締合之另一蛋白 質或化學化合物）之親和力。因此，例如可藉以下任一或多 58 200827363 種方法而自該生物流體分離Akt激酶：超離心法、離子交換 層析法(例如陰離子交換層析法、陽離子交換層析法）、電泳 法(例如聚丙烯醯胺凝膠電泳法、等電點聚焦法）、尺寸分離 法(例如凝膠過濾法、超過濾法）及親和力媒介分離法(例如 5 免疫親和力分離法，其包括，但不限於：磁珠分離法(諸如

Dynabead(商標）分離法、免疫層析法、免疫沈澱法）。自該 生物流體分離A k t激酶之方法可維持存在於該激酶上之構 型表抗原且，因此，最好避免使用可導致該酶之變性的技 術。在另一實施例中，可使用親和力分離法、凝膠過濾法 10 及/或超過遽法中之任一或多種自該生物流體分離激酶。 可使用本項技藝中已知之標準程序，例如藉Kohler及 Milstein(Kohler and Milstein, Nature 256: 495-499，1975; Kohler and Milstein，Eur· J· Immunol. 6(7):511-519, 1976)、 Coligan等人(“Current Protocols in Immunology，John Wiley 15 & Sons, Inc” 1991-1997)或 Toyama 等人（Monoclonal

Antibody，Experiment Manual，，，published by Kodansha Scientific，1987)所述之程序，進行免疫化反應及後續單株 抗體之製備。基本上，動物係藉標準方法而經含Akt激酶之 生物流體或其部份或重組型之Akt激酶免疫化以產生能製 20 造抗體之細胞，特別為能製造抗體之體細胞（例如B淋巴細 胞）。然後可以自該經免疫化之動物移除這些細胞以使細胞 永生。在特定實施例中，可使用Akt激酶之片段以產生抗 體。該片段可以與載體締合。該載體可以是非-或低免疫原 物質（例如半抗原）所天然或人工方式連接以增強其免疫原 59 200827363 性之典型上具高分子量的任何物質。 可使用本項技藝中已為吾人所熟知之方法進行能產生 抗體之細胞的永生反應。例如可藉轉形方法使用 Epstein-Barr病毒(EB V)進行該細胞永生反應（K〇zb〇r等人， 5 Methods in Enzymology 121:140, 1986)。在另一實施例中， 係使用廣泛用於製造單株抗體之細胞融合方法（描述在上 文Coligan等人，1991-1997中）以使產生抗體之細胞永生。 在本方法中’具有可產生抗體之潛力的產生抗體之體細 胞，特別為B細胞，係經骨髓瘤細胞株融合。這些體細胞可 10 衍生自已接觸抗原之動物，較佳為嚅齒動物（諸如小鼠及大 氣）的淋巴結、脾臟及周邊血液。在一特定實施例中，可使 用小鼠脾臟細胞。在其它實施例中，亦可使用大鼠、免子、 綿羊或山羊細胞。已自適用於產生雜交瘤之融合程序 (Kohler and Milstein，1976, supra; Shulman等人，Nature 276: 15 269-270, 1978; Volk等人，J. Virol· 42(1): 220-227, 1982)之 淋巴細胞腫瘤研製專一性骨髓瘤細胞株。許多骨髓瘤細胞 株亦可用於製造融合細胞雜化物，其包括，例如P3乘以 63-Ag8、P3 乘以 63-AG8.653、P3/NSl-Ag4-l(CN-l)、 Sp2/0_Agl4 及 S194/5.XXO.Bu.l 。業經 Kohler 及 20 Milstein(1976，上述）、Shulman等人（1978，上述)描述之該 等P3乘以63-Ag8及NS-1細胞株可形成該Sp2/0-Agl4骨髓瘤 細胞株。該S194/5.XXO.Bu.l細胞株係經由Trowbridge報告 (J. Exp. Med· 148(1):313_323，1978)。用於產生能產生抗體 之脾臟或淋巴結細胞與骨髓瘤細胞之雜化物的方法通常包 60 200827363 括在可促進細胞膜融合之一藥劑或藥劑群(化學、病毒或電 性）存在下’分別以1 〇 : 1比例（雖然該比例可以自約: 1 至約1 : 1不等）混合體細胞及骨髓瘤細胞。融合方法業經描 it (Kohler and Milstein, 1975, supra; Kohler and Milstein, 5 1976，supra，Gefter專人，Somatic Cell Genet 3· 231 _236 1977; Volk等人，1982, supra)。彼等研究者使用之融合促進 劑為Sendai病毒及聚乙二醇(PEG)。在特定實施例中，係提 供自其餘未經融合細胞，特別為未經融合之骨髓瘤細胞， 選擇經融合之細胞雜化物的方法。一般而言，可藉在能維 10持雜種瘤生長但可防止該等未經融合之骨髓瘤細胞（其通 常可無限地持續分裂）生長的培養基内培養該等細胞而進 行經融合細胞雜化物的選擇。在活體外培養物中用於融合 之該等體細胞並不能維持長期生存力。需要數週才能選擇 性培養該等經融合之細胞雜化物。在該期間之初期，需要 15鑑定可產生所欲抗體之此等雜化物，藉此該等雜化物可接 著經選殖並增殖。一般而言，約10%所獲得之雜化物可產 生所欲抗體，但是自約1至約30%之範圍並不罕見。可藉幾 種標準檢定方法中任一種而檢測能產生抗體之雜化物，該 等方法包括如，例如Kennet等人在（Monoclonal Antibodies 20 and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, pp 376-384, Plenum Press，New Yark, 1980)中所述之酶聯免 疫檢定及放射免疫檢定技術及藉FACS分析（O’Reilly等 人，Biotechniques 25:824-830，1998)。 一旦所欲經融合細胞雜化物業經選擇並在個別能產生 61 200827363 抗體之細胞株内選殖時，各細胞株可經兩種標準方法中之 任一種增殖。可將該等雜種瘤細胞之懸浮液注射入組織相 容性的動物内。然後經注射之動物可形成能分泌藉該融合 細胞雜化物而產生之專一性單株抗體的腫瘤。可放出該動 5 物之體液，諸如血清或腹水流體，以提供高濃度之單株抗 體。或者，各該細胞株可在實驗室培養容器内進行活體外 增殖。可藉傾析、過濾或遠心法而採集含高濃度單一專一 性單株抗體，並接著純化。 然後可错任何合適免疫檢測方法而測試該等細胞株之 10檢測相關Akt激酶的專一性。例如可將細胞株分成數等份裝 入許多井内並進行培育，然後藉酶聯免疫吸附檢定 (ELISA)、間接榮光抗體技術等而分析得自各井之上澄清 液。可鑑定產生能辨識目標LIM激酶但是不能辨識非目標 表抗原之單株抗體的該細胞株(群），然後直接活體外培養或 15注射入組織相容性動物體内以形成腫瘤並產生、採集且純 化必要之抗體。 因此，本發明提供一種在試樣内檢測Akt激酶或其片 段、變異體或衍生物之方法，其包括以抗體或其片段或衍 生物接觸該試樣並與正常對照組（其中高含量之Akt激酶經 2〇測定）比較，檢測含該抗體及他激酶或其片段、變異體或 何生物之複合物含量，可使用任何能測定該複合物形成之 方法。例如具有相關之報告基團之分子的本發明抗體可用 於免疫檢疋法中。此等免疫檢定法包括，但不限於：放射 免疫檢定法(RIA)、酶聯免疫吸附檢定法(ELISA)、免疫層 62 200827363 析技術(ICT)，且西方墨點法為熟悉本項技藝者所孰知。免 疫檢定法亦可包㈣爭性檢H本發料蓋定性及定量 免疫檢定法。 合適的免疫檢定技術係推述在，例如美國專利第 4,016,043號、第4,424,297號、及第中。這㈣ 定技術兼包括錢爭_狀單雜及雙部位蚊以及傳 統競爭結合性較。這錄0包域記㈣結合性分子 直接結合至目標抗原。

本發明進-步提供用於定量得自動物，諸如人類癌症 10病患或疑有癌之個體的細胞或組織試樣中的鳩蛋白質表 現性或活化程度之方法。在—實施例中，本發明提供使用 影像H歧3：性Sl：Akt蛋自質纽性或活化程度之方 法。可使用該影像化系統以接收、增強 '及處理業經Akt 蛋白質專-性染色劑染色之細胞或組織試樣的影像以測定 15在得自此種動物之細胞或組織試樣中表現的AKT蛋白質含 量或活化程度。在本發明該等方法之實施例中，可產生至 少兩種表現不同AKT蛋白質含量之細胞株的AKT1及AKT2 蛋白質表現性的校準曲線。然後可使用該校準曲線以定量 性測定表現在細胞或組織試樣内之AKT蛋白質含量。可使 20用對該等活化特性具專一性之試劑製成適於活化AKT蛋白 質之類似校準曲線。其亦可用以測定臨床性癌治療前及後 之AKT含量及活化狀態的變化。 在本發明該等方法之一特定實施例中，可使用酶聯免 疫吸附檢定法（ELISA)定量細胞或組織試樣内之AKT蛋白 25質表現性以測定AKT蛋白質在試樣内之含量。此等方法描 63 200827363 述在’例如美國專利公開案2002/0015974號中。 在其匕實施例中’可使用酶免疫檢定法以檢測該Akt 激酶。在此等檢定中，通常藉戊二醛或過碘酸鹽而使酶結 合至第二抗體。通常選擇一旦藉對應酶而水解時可產生能 5 ^欢’則之顏色變化的可併用該等專一性酶之基質。亦可使用 能產生螢光之基質，其可產生螢光產物而不是色原基質。 可添加該酶標記之抗體至第一抗體_抗原複合物，使其黏 合’然後洗掉過量試劑。然後可添加含該合適基質之溶液 至該抗體-抗原-抗體複合物。該基質可以與連接至該第二抗 10體之酶反應以產生定性可見信號，其通常可進一步經光譜 測定法定量以表示存在於該試樣内之抗原含量。或者，螢 光化合物’諸如螢光素、玫瑰紅(rhodamine)及鑭系元素(銪 (EU))，可化學性偶合至抗體，且不會改變彼等之結合能 力。當藉特定波長之光照明而活化時，該經螢光染料標記 15之抗體可吸收光能量，在該分子内誘發可激發性狀態，繼 而以可經光學顯微鏡目視檢測之特徵顏色發光。使該經螢 光標記之抗體結合至第一抗體-抗原複合物。將未結合試劑 洗掉後，接著使剩下的三級複合物曝露於合適波長之光線 下。所觀測之螢光表示相關抗原之存在。免疫螢光測定檢 2〇 定法(IFMA)在本項技藝中係已被充份確認且特別適用於本 方法。然而，亦可使用其它報告基團分子，諸如放射性同 位素、化學發光或生物發光分子。 在特定實施例中，亦可使用Akt激酶之抗體以進行血清 或其它循環流體中之Akt激酶的ELISA媒介檢測法。其進行 64 200827363 步驟為使抗Akt激酶抗體固定至固體載體並經生物萃取 物，諸如血清、血液、淋巴或其它體液、細胞萃取物或細 胞切片接觸。然後可使用經標記之抗A k t激酶抗體以檢測固 定之Akt激酶。本檢定法可許多方式中不同且所有變異皆涵 5蓋於本發明内並為熟悉本項技藝者所知。本方法可使用， 例如以血清為主之檢定以快速檢測並定量Akt激酶含量。 在一實施例中，Akt Elisa檢定套組可用於本發明。例 如得自 SuperArray Bioscience 之用於 Akt S473 的 Cellular

Activation of Signaling ELISA可用於本發明。在一實施例 10中’該抗體可以是能辨識Akt S473之抗pan抗體。Elisa檢定 套組含有抗Akt抗體及額外試劑，其包括，但不限於：清洗 緩衝劑、抗體稀釋緩衝劑、阻斷緩衝劑、細胞染色液、顯 像液、中止液、第二抗體、及蒸餾水。 核苷酸檢測 15 在另一實施例中，係提供一種藉檢測可將Akt激酶編碼 之多核苷酸在細胞中之表現性程度而檢測Akt激酶的方 法。可使用熟悉本項技藝者已知之任何合適技術以測定該 多核苷酸之表現性。在一實施例中，可使用可將Akt激酶編 碼之經標記多核苗酸作為得自該細胞之RNA萃取物之北方 20墨點中的探測物。在其它實施例中，在核酸擴增反應(諸如 RTPCR)中，得自動物之核酸萃取物可併用相對於將該激酶 編碼之多核苔酸的訊息及反訊息序列或其側接序列的寡核 苷酸引子。熟悉本項技藝者可使用各種自動化固相檢測技 術，例如如Fodor等人（Science 251:767-777，1991)及Kazal 65 200827363 等人(Nature Medicine 2:753-759，1996)所述之檢測技術。 在其它實施例中，係提供檢測能將RNA轉錄本編碼 Akt激酶的方法。可自疑有Akt激酶RNA之細胞試驗離析 RNA，例如自人類癌組織離析總RNA。可藉本項技藝中已 5 知之方法，例如使用TRIZOL試劑（GIBCO-BRL/Life Technologies, Gaithersburg，Md)，而離析 RNA。可使用 Oligo-dT或無規序列寡核苷酸以及序列專一性募核苷酸作 為逆轉錄酶反應中之引子以自該經離析RNA製備第一股 cDNAs。然後在PCR反應中所形成第一股cDNAs可經序列專 10 一性寡核苔酸酸擴增以產生經擴增產物。 聚合酶連鎖反應或“PCR”係指一種程序或技術，其中大 量預選定之核酸、RNA及/或DNA片段如，例如美國專利第 4,683，195號所述經擴增。一般而言，係使用得自相關區域 之末端或其外之序列訊息以設計募核苷酸引子。這些引子 15 之序列與欲擴增之模板的反向股相同或類似。可使用PCR 以擴增自總細胞RNA轉錄之專一性RNA序列及cDNA。一般 而言，見Mullis等人（Quant· Biol. 51:263, 1987; Erlich，eds·， PCR Technology，Stockton Press，NY，1989)。因此，藉PCR 而進行之專一性核酸序列之擴增係依賴具有保留性核苷酸 20 序列之寡核苷酸或“引子”，其中該等保留性序列係追溯自 相關基因或蛋白質序列之排列，例如哺乳動物之Akt激酶基 因的序列比較。例如製備經預計可黏接至該反訊息股之引 子並製備經預計可黏接至可將Akt激酶編碼之cDNA分子的 訊息股之另一引子。為了檢測經擴增之產物，典型上使該 66 200827363 反應混合物進行瓊脂糖(a g a r 0 s e)凝膠電泳或其它合適分雜 技術並檢測該Akt之激酶專一性擴增之dna的相對存在。例 如可使用專一性寡核苷酸探針進行南方雜化反應或比較其 電泳遷移率與已知分子量之DNA標準遷移率而檢測Akt激酶 5擴增之DNA。該經擴增Akt激酶DNA之離析、純化及特性分 析的進行步驟為自凝膠切除或溶析片段（例如見參考文 獻，Lawn等人，Nucleic Acids Res· 2:6103, 1981; Goeddel 等人，Nucleic Acids Res· 8:4057-1980)，在合適載體，諸如 pCRII載體(Invitrogen)之選殖部位内選殖該經擴增產物，進 10 行該經選殖插入物之序列分析並比較該D N A序列與LIΜ激 酶之已知序列。接著可測定LIM激酶mRNA及cDNA之相對 含量。 在一實施例中，可使用費時PCR以測定Akt核苷酸之轉 錄程序。轉錄活性之測定亦包括測定以可獲得mRNA轉錄 15 本為主之潛在轉錄活性。實時P C R以及其它p c R程序使用可 用於檢測PCR產物之許多化學方法，其包括DNA結合性螢 光團（5’核酸内切酶）、鄰近襯裡及髮夾式募核苷酸探針與自 發螢光之擴增子的組合。這些化學方法及實時PCR通時在 以下資料文獻中有討論：例如Mackay等人，Nucleic Acids 20 Res 30(6): 1292-1305, 2002; Walker, J. Biochem. Mol. Toxicology 15(3): 121-127，2001; Lewis等人，J. Pathol. 195:66-71，2001。 在另一實施例中，Akt之異常表現性的鑑定步驟為以具 有可互補選自第6a-c、7a-d或8a-c圖之核苷酸序列或彼等之 67 200827363 離析之核[ 自生物試樣所 …、'後糟雜化用於該序列之探針而檢測 10 15 序列並雜絲料正常試樣。可藉使則均可檢測華 劑標記該探針而檢_於該生物試樣之探針的雜化作^ =探針可以經，例如放射性同位素、生物素、螢光染料、 :子致密劑、酶、半抗原或可利用抗體之蛋白質標記。可 藉4何所4人方式’其包括光譜測定法、光化學法、生化法、 纽化學法、放㈣同位纽或化學方法，㈣估可檢測 私度。’料使用下述技術以檢職探針：諸如募聚物限制 技術、點墨檢定法、逆點墨檢定法、多聽針檢定法、及5, 核酸酶檢定法。或者可使縣-㈣泛適狀DNA陣列技 術，其包括巨陣列、微陣列及DNA微晶片技術，以檢測該 棟針。該募核苔酸探針典型上包括可以對選自第以<、 7a-d、及8a-c圖之核苷酸或彼等之片段雜交之約至少14、 15 ' 16 ' 18 ' 20、25或28個核^:酸。通常較佳不使用長度 大於約25或28個核苷酸之探針。該募核苷酸探針係用來鑑 定Akt核苷酸序列。 激酶檢定 可使用本項技藝已知之任何合適激酶檢定法以測定該 20 等Akt激酶之活性。例如可使用Hogg等人（Oncogene 1994 9:98-96)、Mills等人(J. Biol. Chem. 1992 267:16000-006)及

Tomizawa等人2001(FEBS Lett· 2001 492:221-7)、Schmandt 等人(J. Immunol· 1994，152:96-105)中所述之方法，但不限 於此。此外，絲胺酸、蘇胺酸及酪胺酸激酶檢定法係描述 200827363 在 Ausubel 等人（Short Protocols in Molecular Biology，1999, unit 17_6)中。

Akt激酶檢定法通常可使用Akt多肽、經標記供體基 質、及對Akt具專一性或非專一性之受體基質。在此等測定 5 法中，Akt可自該供體基質將經標記分子團轉移至受體基 質，且藉自該供體基質轉移至受體基質的經標記分子團之 數量而測定激酶活性。可使用各種表現系統以製成Akt多 肽’其可自細胞純化，可以呈經分裂或未經分裂之重組型 融合蛋白質之形式及/或可具有非Akt多肽序列，例如於其 10 N-或C-末具有His標記或/5 -半乳糖苔酶。若癌性細胞株 作為欲檢定之Akt來源，則可在該等癌性細胞株内檢定Akt 活性。適於Akt檢定之供體基質包括容易藉Akt而進行去磷 酸化反應之任何分子，諸如τ -標記之ATP及ATP類似物， 其中該標記為33P、32P、35S或任何其它放射性同位素或合適 15螢光標記。適於Akt檢定之受體基質包括容易藉Akt而進行 石粦酸化反應之任何多肽或其它分子。受體基質可衍生自Akt 之活體内標乾的片段。受體基質片段之長度可以是8至5〇個 胺基酸、通常為10至30個胺基酸且較佳具有約、12、15、 18、20及25個胺基酸。可根據經驗而使用一系列不同之多 2〇 肤或其匕为子以測定另外受體基質。一旦反應業經進行 時，適於TTK之受體基質的標靶可自該反應之其它組份純 化。通常藉分子相互作用而完成該純化反應，其中該受體 基質係經生物素化反應並藉其與鏈黴菌卵蛋白⑼reptavidin) 或可用以專-性辨識該等受體基質之專一性抗體的相互作 69 200827363 用而純化。可以在各種條件下，諸如在固體載體上、在凝 膠中、在溶液内或在活細胞内，進行該反應◦檢測方法之 選擇取決於用於該供體分子之標記類型且可包括，例如藉 放射自顯影術、閃燦、掃描或螢光X射線照相術而進行已併 5 入輻射或螢光的測定。 治療方法 文中提供之該等化合物及藥學組成物可用以治療病 症，其包括腫瘤、癌、及與異常細胞增生有關之其它病症。 在一實施例中，本發明該等化合物可用以治療癌瘤、肉瘤、 10 淋巴、白色病、及/或骨髓瘤。在本發明之其它實施例中， 文中揭示之該等化合物可用以治療固體腫瘤。 本發明該等化合物可用於治療癌，諸如但不限於以下 器官或組織之癌：乳房、攝護腺、肺、支氣管、結腸、泌 尿系統、膀胱、非霍吉金氏淋巴瘤、黑色素瘤、腎瘤、腎 15 臟系統、胰臟、咽、甲狀腺、胃、腦、多發性骨髓瘤、食 道、肝、肝内膽道、頸、喉、急性鏞性白血病、慢性淋巴 白血病、軟組織(諸如心臟）、霍吉金氏淋巴瘤、睪丸、小腸、 慢性髓性白血病、急性淋巴性白血病、肛門、肛管、肛門 與直腸的系統、甲狀腺、女陰、膽囊、胸膜、眼、鼻、鼻 20 腔、中耳、鼻咽、輸尿管、腹膜、網膜、腸繫膜、及胃腸 道、高程度神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、結腸、直腸、 胰腺、胃癌、肝細胞癌瘤；頭及頸癌、癌瘤；腎細胞癌瘤； 腺癌；肉瘤；血管内皮瘤；淋巴瘤；白血病、簟狀肉芽腫。 在另外實施例中，本發明該等化合物可用以治療皮膚病， 70 200827363 其ο括但不限於 a > M下惡性疾病：血管肉瘤、血管内皮瘤、 基底細胞癌瘤、紗 ^ ^ ^ ’狀細胞癌瘤、惡性黑色素瘤及卡波西 氏肉瘤；及非牮 t / 〜疾病或病症，諸如牛皮癣、淋巴管增 生、兒童血管瘤、 土 4 A — 史德可-早伯（Sturge-Weber)症候群、 哥兩疣、纖維神細广 找、, Τ、、、工瘤病、結節狀硬化、膿性肉芽腫、隱性 言養不良性大洵从 、 『生表皮鬆懈、靜脈潰瘍、痤瘡、酒糟鼻、 濕療、傳染性教亦 、 ^ ϋ、皮脂漏性角化病、及光化性角化病。 括本發明该等化合物之組成物以治療自該癌 10 毛見至晚期的任何階段之這些癌及其它癌。此外，包括 本發明化合物之έ 、、、成物可用以治療原發性癌及其轉移。 在本發明其它實施例中，文中所述之該等化合物可用 於/°療癌’其包括但不限於下表1中所揭示之癌。 1—1 1 · >ΤαΓ ikir -«-7» ' -------- LJ 丄·你采貝少 □成人急性淋巴母細胞 白血病 兒童急性淋巴母細胞 白血病 成人急性髓性白血病 兒童急性髓性白血病 腎上腺皮質癌 兒童腎上腺皮質癌 AIDS關聯性癌 AIDS關聯性淋巴癌 肛門癌 ' 兒童小腦性星形細胞瘤 兒童大腦性星形細胞瘤 □基底細胞癌 肝外的膽道癌 膀胱癌 兒童膀胱癌 □毛細胞白血病 頭及頸癌 成人肝細胞(肝臟)癌(原發性） 兒童肝細胞(肝臟)癌(原發性） 成人霍吉金氏淋巴瘤 兒童霍吉金氏淋巴瘤 懷孕期之霍吉金氏淋巴瘤 下咽癌 兒童下丘腦及視覺神經束 神經膠質瘤 □眼内黑色素瘤 胰島細胞癌（内分泌胰腺） □卡波西氏肉瘤(Kaposi’s Sarcoma) 腎臟（腎細胞)癌 &童腎臟癌 □喉癌 候癌 71 200827363 骨癌 骨肉瘤/惡性纖維狀 組織細胞瘤 兒童腦幹神經膠質瘤 成人腦腫瘤 兒童腦腫瘤，腦幹 神經膠質瘤 小腦性腦腫瘤 兒童星形細胞瘤 大腦性腦腫瘤 兒童星形細胞瘤/惡性 神經膠質瘤 兒童腦腫瘤，室管 膜瘤 兒童腦腫瘤，神經管 胚細胞瘤 幕上的腦腫瘤 兒童原始型神經外胚層的腫瘤 兒童腦腫瘤，視覺神經束及 下丘腦的神經膠質瘤 兒童腦腫瘤 乳癌 兒童乳癌 男性乳癌 兒童支氣管腺瘤/ 類癌 伯基特氏淋巴瘤 (Burkitfs Lymphoma) □兒童類癌瘤 胃腸類癌瘤 未知型原發性中樞神 經系統之癌瘤 兒童小腦性星形細胞瘤 兒童大腦性星形細胞瘤/ 惡性神經膠質瘤 兒童神經膠質瘤 子宮頸癌 兒童癌症 慢性淋巴細胞的白血病 成人急性淋巴母細胞 白血病 急性淋巴母細胞白血病 兒童原發性淋巴瘤 成人急性骨髓性白血病 兒童急性骨髓性白血病 慢性淋巴細胞性白血病 慢性髓性白血病 B細胞白血病 唇及口腔癌 成人肝癌（原發性） 兒童肝癌（原發性） 非小細胞肺癌 小細胞肺癌 aids關聯性淋巴瘤 伯基特氏淋巴瘤 皮膚T細胞淋巴瘤，見 蕈狀肉芽腫及西澤萊 (S0zary)症候群 成人霍吉金氏淋巴瘤 兒童霍吉金氏淋巴瘤 懷孕期之霍吉金氏淋巴瘤 成人非霍吉金氏淋巴瘤 兒童非霍吉金氏淋巴瘤 懷孕期之非霍吉金氏 淋巴瘤 原發性中樞神經系統 淋巴瘤 □大球蛋白企症，骨之華登特倫氏 〇Valdenstr0m’s)惡性纖維性組織 細胞瘤/骨肉瘤 兒童神經管胚細胞瘤 黑色素瘤 ，内（眼)黑色素瘤 ^飢(Merkel)細胞癌瘤 成人惡性間皮瘤 兒童間皮瘤

Ri性原發性轉移性鱗 狀頸癌 72 200827363

慢性脊髓增生 病症 大腸癌 兒童結腸直腸癌 皮膚τ細胞淋巴瘤，見 蕈狀肉芽腫及西澤萊症候群 □子宮内膜癌 兒童室管膜瘤 食道癌 兒童食道癌 尤恩氏家族(Ewing’s family)腫瘤 兒童性腺外胚細胞腫瘤 性腺外胚細胞腫瘤 肝外的膽道癌 眼癌，眼内黑色素瘤 眼癌，視網膜母細胞瘤 □膽囊癌 胃癌 兒童胃癌 胃腸類癌瘤 顧外胚細胞腫瘤 兒童性腺外胚細胞 腫瘤 卵巢胚細胞腫瘤 姓娠滋養細胞腫瘤 成人神經膠質瘤 兒童腦幹神經膠質瘤 兒童大腦性神經膠質瘤 星形細胞瘤 兒童視覺神經束及下丘腦的 神經膠質瘤 □皮膚癌（黑色素瘤） 莫克細胞皮膚癌瘤 小細胞肺癌 小腸癌 成人軟組織肉瘤 兒童軟組織肉瘤 鱗狀細胞癌瘤，見皮膚癌 (非黑色素瘤） 兒童多發性内分泌贅瘤形成 症候群 多發性骨髓瘤/漿細胞贅瘤 蕈狀肉芽腫 骨髓增生異常症候群 骨髓增生異常性/骨髓增生性 疾病 慢性髓性白血病 成人急性骨髓性白血病 兒童急性骨髓性白血病 多發性骨髓瘤 慢性骨髏增生病症 □鼻腔及副鼻竇癌 鼻咽癌 兒童鼻咽癌 神經母細胞瘤 成人非霍吉金氏淋巴瘤 兒童非霍吉金氏淋巴瘤 懷孕期之非霍吉金氏 淋巴瘤 非小細胞肺癌 □兒童口癌 口腔癌，唇及口咽癌 骨肉瘤/骨之惡性纖維性組織 細胞瘤 兒童卵巢癌 卵巢上皮癌 卵巢胚細胞腫瘤 卵巢低惡性潛在腫瘤 □胰臟癌 兒童胰臟癌 胰島細胞胰臟癌 副鼻竇及鼻腔癌 甲狀旁腺癌 陰莖癌 嗜鉻細胞瘤 兒童松果腺胚細胞瘤及幕上 原始型神經外胚層腫瘤 垂體腫瘤 73 200827363 穩性原發 頸癌 胃癌 兒童厚癌 兒童幕上原始型 神經外胚層腫瘤 1口丁細胞淋巴瘤，見 蕈狀肉芽腫及西澤萊 症候群 睪丸癌 兒童胸腺瘤 胸腺瘤及胸腺癌瘤 甲狀腺癌 兒童甲狀腺癌 ，，及輸尿管之移行細胞癌 |姓振的滋養層腫瘤 □成i之未知型原發丨生部位的癌瘤 5气之未知型原發性部位的癌瘤 兒里輸尿管及腎盂 之不尋常癌 移行細胞癌 尿道癌 子宮内膜的子宮癌 子宮肉瘤 |□陰道癌 兒童視覺神經束及下丘腦的 神經膠質瘤 | 陰癌 □華登特倫氏/大球蛋白血症 1 Tumor) 胸膝與肺的胚細胞瘤 懷孕期乳癌 ^期霍吉金氏淋巴瘤 Ιίίί霍吉金氏淋巴瘤 原表性_栖神經系統 淋巴瘤 i 攝5蒦腺癌 腎細胞（腎臟)癌 兒童腎細胞（腎臟)癌 腎盂及輸尿管移行細胞癌 視網膜母細胞瘤 兒童 橫紋肌肉瘤 唾液腺癌 兒童唾液腺癌 肉瘤，尤思氏家族型腫瘤 内瘤， 卡波西氏肉瘤 成人柔軟組織肉瘤 子宮肉瘤 西澤萊症候群 皮膚癌（非黑色素瘤） 兒童皮膚癌 在本發明另外實施例中，文中揭示之該等化合物可用 以治療血管生成關聯性疾病。 血管生成性小分子包括沙利竇邁(thalidomide)、其係部 份藉抑制NFkB而作用；2-甲氧基雌二醇，其可影響微管活 74 200827363 化作用及缺氧誘發因子（HIFla)活化作用；環-氧合酶 2(COX2)抑制劑；及低劑量之習知化療劑，其包括環磷醯 胺、紫杉烷（taxane)、及長春花生物鹼（長春花新鹼 (vincristine)、長春花驗(vinblastine))(D’Amato，R.J.等人， 5 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1994. 91 :p. 3964-3968; D’Amato R.J.等人，Proc· Natl· Acad. Sci. U.S.A·，1994. 91 :ρ· 4082-4085)。此外，特定酪胺酸激酶抑制劑可藉降低由腫瘤 及基質細胞所產生之VEGF及其它前血管生成因子而間接 減少血管生成。這些藥物包括賀癌平、依瑪替尼 10 (imatinib)(Glivec)、及艾瑞莎（iressa)(Bergers G.等人，J Clin Invest，2003· 111:ρ· 1287-1295; Ciardiello F.等人，Clin Cancer Res，2001· 7:ρ· 1459-1465; Plum S.M.等人，Clin Cancer Res，2003. 9:p. 4619-1626)。 最近’血管生成抑制劑已自動物模式發展至人類患 15者。血管生成抑制劑代表有希望成功之用於各種癌的治療 法。最近，阿伐司汀，其係為抗血管内皮生長因子(VEGF)， 業經證明可在晚期腎細胞癌瘤中作為單一藥劑以延長生命 並在晚期結腸癌中併用化療以延長生命(Yang，J.C.等人 (2003) New England Journal 〇f Medicine 349, 427-434? 2〇 KabbhiaVat，F•等人（2003) J〇Urnal of Clinical 0ncology 21， 60_65)。 血官生成關聯性疾病包括，但不限於：炎症、自體免 疫病、及感染病；血管生成依存性癌包括，例如固體腫瘤、 血行1*生腫瘤（諸如白血病）、及腫瘤轉移·，良好腫瘤，例如血 75 200827363 管瘤、、賴經瘤、神經纖維瘤、砂眼如 類風濕性關節炎；牛虔應·、、晶六 η 午皮腐，濕療，眼血管生成性疾病，例 糖尿病性視_病變、早產之視網膜病變、黃斑變性、 10 角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶狀體後纖維組織增 生、發紅’奥斯勒_韋伯（0sler_webber)症候群；心肌也管生 成；斑塊新血管生成；微血管擴張；血友病性關節；血管 纖維瘤；及傷口肉芽形成。此外，本發明組成物可用以治 療疾病，諸如但不限於··腸黏連、動脈粥瘤硬化、疣、及 肥大性瘢痕（亦即瘢瘤）。本發明之組成物亦可用以治療由於 病原結果而具有血管生成之疾病，諸如貓抓病（Rochele minalia quintosa)、潰瘍(Hdobacter pylori)、結核病、及痲瘋。 抗藥性腫瘤或癌之沦+ 本發明提供可用以治療抗藥性癌之化合物，其包括癌 與曲西立濱化合物及/或可調節HER2/neu(erbB2)受體之分 15子，例如曲妥珠單抗或其鹽的實施例。 多藥抗藥性(MDR)發生在人類癌症中且可以是化療成 功之重大障礙。多藥抗藥性為一種現象，其中業經接觸細 胞毒殺性藥劑之腫瘤細胞對一系列結構性及官能性不相關 的化合物形成交叉抗藥性。此外，]V1DR可内源性發生在先 20 前未接觸化療劑之某些癌中。因此，在一實施例中，本發 明提供用於治療患有抗藥性癌，例如多藥抗藥性癌之患者 的方法，其係藉投予TCN、TCN-P或相關化合物及可調節 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽。在 特定實施例中，TCN、TCN-P及相關化合物與可調節 76 200827363 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，可 用以治療僅對紫杉盼(Taxol)、對雷帕黴素(rapamycin)、泰 莫西芬、順鉑(cisplatin)、及/或吉非替尼（艾瑞莎）具抗性之癌。 在一實施例中，TCN、TCN-P或相關化合物及可調節 5 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，可 用於治療以下之抗藥性癌：結腸、骨、腎臟、腎上腺、 臟、肝臟，及/或本項技藝中已知或文中所述之任何其它穴 組合治療物 在一實施例中，本發明該等曲西立濱化合物及可巧> 10 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，口 以與其它細胞毒殺性藥劑一起投予。在另一實施例中，^ 々 ，讀 等曲西立濱化合物與可調節HER2/neu(erbB2)受體之 i分 子，例如曲妥珠單抗或其鹽，及彼等之組成物，當用於％ 療固體腫瘤時，可以在使用輻射之情況下投予。 15 在本發明之另一實施例中，文中揭示之該等曲西夂凟 化合物與可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥殊 單抗或其鹽，及組成物可併用至少一另外化療劑。該等另 外藥劑可以與文中揭示之化合物一起或輪流投予。該等藥 物可形成相同組成物之一部份或可以以適於在相同時間 20不同時間投予之個別組成物提供。 ， 在一實施例中，文中揭示之該等曲西立濱化合物及可 調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其 鹽，可併用抗血管生成藥劑以增強彼等之效力，或可併用 其它抗血管生成藥劑並與其它細胞毒殺性藥劑一起投予。 77 200827363 在其它實施例中，當用以治療固體腫瘤時，該等曲西立濱 化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠 單抗或其鹽，可以與選自以下之藥劑一起投予，該等藥劑 不限於：IL-12、視黃酸類(retinoids)、干擾素、血管司他汀 5 (angiostatin)、内皮抑制素(endostatin)、沙利竇邁、血小板 反應素（thrombospondin)-l、血小板反應素-2、卡托普利 (captopryl)、抗贅瘤劑(諸如α干擾素）、COMP(環碟醯胺、 長春花新驗、阿美蘇喋呤（methotrexate)及潑尼松 (prednisone))、鬼臼乙叉式（etoposide)、mBACOD(阿美蘇口祟 10 呤、布里歐黴素(bleomycin)、小紅莓、環磷醯胺、長春花 新驗及地塞米松(dexamethasone)、PRO-MACE/MOPP(潑尼 松、阿美蘇嗓鈴(w/爾可福(leucovin)搶救劑）、小紅莓、環 石粦醯胺、鬼臼乙叉武/美加明（mechlorethamine)、長春花新 鹼、丙卡巴肼）、長春花新鹼、長春花鹼、血管抑制素 15 (angioinhibins)、TNP-470、聚戊 St (pentosan)、多硫酸鹽、 血小板因子4、血管司他汀、LM-609、SU-101、CM-101、 特可能(Techgalan)、沙利竇邁、SP-PG及輻射。在另外實施 例中，文中揭示之該等化合物及組成物可以與以下藥物一 起或輪流投予：例如具抗有絲分裂作用之藥物，諸如可將 20 細胞骨架的元素定標之藥物，其包括鬼臼素(podophylotoxin) 或長春花生物鹼(長春花新鹼、長春花鹼）；抗代謝產物藥物 (諸如5-氣尿，咬、阿糖胞苷（Cytarabine)、傑西塔賓 (gemcitabine)、嘌呤類似物，諸如喷司他汀(pentostatin)、 阿美蘇喋呤）；烷化劑或氮芥(諸如亞硝基脲、環磷醯胺或艾 78 200827363 福醯胺（lfosphamide);可將DNA訂標之藥物，諸如該等复 環素藥物’艾黴素（adriamycin)、小紅莓、泛艾黴素 (pharaumibicin)或表柔比辛；可將拓樸異構酶訂標之藥物， 諸如鬼臼乙冬甙；激素及激素促效劑或拮抗劑，諸如雌激 5素、抗雌激素(泰莫西芬及相關化合物）及雄激素、氟他醯胺 (flutamide)、柳培林(leupr〇relin)、戈舍瑞林(g〇serelin)、塞 普川（cyprotrone)或奥曲肽(沉的加此）；可將腫瘤細胞内之 信號傳導訂標的藥物，其包括抗體衍生物，諸如霍塞挺； 烧化蕖物，諸如翻藥物（順翻、卡翻（carb〇platin)、奥沙利鈾 10 (oxallPlatln)、佳鉑帝（paraplatin)或亞硝基脲；可潛在性影 響腫瘤轉移之藥物，諸如基質金屬蛋白酶抑制劑；基因治 療劑及反訊息藥劑；抗體治療藥劑；海洋來源之其它生物 活〖生化a物，尤其滴澄寧（didemnin)，諸如阿波里唆 (apluime);類固醇類似物，特別為地塞米松；抗催吐藥， 15其包括5HT-3抑制劑（諸如袼倫西穿㈣__⑴或翁登西 川、與類固醇及彼等之衍生物，特別為地塞米 松。在又另外實施例中，鱗化合物及組成物可以與下表2 中所揭示之化療劑一起或輪流使用。 表2 ·化療劑 •13-順式-視黃酸 _2_胺基-6-巯基嘌呤 -2-CdA -2-氣去氧腺苷 _5_氟尿嘧啶 -5-FU -6 - TG _6_硫島嘌吟 -環鱗醯胺(Neosar) -紐拉塔(Neulasta) -紐密伽(Neumega) -紐波傑(Neupogen) -尼南尊(Nilandron) -尼魯醯胺(Nilutamide) -氟芥 79 200827363

-6-魏基嘌呤 -6-MP -阿庫坦（Accutane) -放射菌素-D -艾黴素 -阿卓西(Adrucil) -安閣靈(Agrylin) -阿拉可（Ala-Cort) -阿留浮(Aldesleukin) -阿能朱麻(Alemtuzumab) -川頁式視黃酸(Alitretinoin) -阿卡班(Alkaban)-AQ -威克瘤(Alkeran) -全反式視黃酸 -α干擾素 -六甲蜜胺（Altretamine) -甲胺嗓呤(Amethopterin) -胺磷、;丁（Amifostine) -胺基麩乙基醯亞胺 (Aminoglutethimide) -阿那格雷（Anagrelide) -阿南鑽(Anandron) 阿那斯唾(Anastrozole) -阿糖胞苔（Avabinosylcytosine) -阿拉(Ara)-C •阿倫斯波(Aranesp) -雷狄亞(Aredia) •阿里米德(Arimidex) "諾曼素(Aromasin) "三氧化石申 -天冬醯胺酶 -ATRA -癌思停（Avastin) -BCG _bcnu -貝戈西朱麻(Bevacizumad) -貝莎羅亭(Bexarotene) -必卡他胺(Bicalutamide) -BiCNU -諾瓦得士(Novaldex) -小藍莓（Novantrone) -奥曲肽 -奥曲肽乙酸鹽 -腫瘤死（Oncospar) -腫瘤平（Ontak) -腫瘤塌（Onxal) 歐普貝淨(Oprevelkin) -歐拉普霍(Orapred) -歐拉松（Orasone) -奥沙利鉑 -太平洋紫杉醇 -帕平膦酸鹽(Pamidronate) -盤雪 '汀（Panretin) -佳鉑帝 •佩帝普(Pediapred) -PEG干擾素 -培門冬酶(Pegaspargase) -培非司亭(Pegfilgrastin) _PEG插進子（Intron) -PEG-L-天冬醯胺酶 -苯基丙胺酸芥子 -川貝氣胺翻（Platinol) -順氯胺鉑-AQ -腎上腺皮質酮(Prednisolone) -潑尼松 -潑隆(Prelone) -丙卡巴肼 -普克萊特(PROCRIT) •普留淨(Proleukin) -具有卡莫司汀植入物之普非斯本 (Prolifeprospan)20 -口票呤素（Purinethol) -雷洛西芬(Raloxifene) -甲胺嗓吟(Rheumatrex) -雷度珊(Rinuxan) -雷突西麻(Rituximab) -羅貝南(Roveron)-A (a -2a干擾素） 200827363 -布雷生（Blenoxane) -布里歐黴素(Bleomycin) -侧替佳密（Bortezomib) -白消胺(Busulfan) -白消非（Busulfex) -C225 -爾可福|弓(Calcium Leucovorin) -坎伯斯（Campath) -抗癌妥（Camptosar) -坎普特赛辛(Camptothecin)-11 -截瘤達(Capecitabine) -卡拉克(Carac) -卡翻（Carboplatin) -卡莫司汀(Carmustine) -卡莫司汀晶片 -可蘇多（Casodex) -CCNU -CDDP _CeeNU -色比 ^(Cerubidine) -塞突西麻（Cetuximab) -笨丁 酸氮芥（Chlorambucil) -川頁翻(Cisplatin) -嗜橙菌（Citrovorum)因子 -克拉屈濱（Cladribine) "可體松（Cortisone) -可美淨(Cosmegen) _CPT-11 環磷酿胺 -西他尊(Cytadren) ，阿糖胞苷（Cytarabine) -阿糖胞苷微脂體 -賽德莎(Cytosar)-U -賽德勝(Cytoxan) "達卡巴仁(Daccarbazine) -放線菌素(Dactinomycin) -α 達貝汀(Darbepoetin alfa) "道諾黴素（Daunomy cin) 諾比辛（Daunorubicin) -魯貝斯(Rubex) -紅比黴素(Rubidomy cin)鹽酸鹽 -善得定(Sandostatin) •善得定LAR -沙格司亭（Sargramostim) -舒汝固體膚（Solu-Cortef) •舒汝美卓佑(Solu-Medrol) -STI-571 -鏈尿黴素（Streptozocin) -泰莫西芬(Tamoxifen) -塔格雷汀(Targretin) -紫杉酚(Taxol) -勉癌易（Taxotere) -替莫達(Temodar) -帝盟多（Temozolomide) •替尼泊成（Teniposide) •TESPA -沙利竇邁(Thalidomide) -沙利度胺(Thalomid) -泰拉西斯(TheraCys) -硫鳥嗓呤（Thioguanine) -硫鳥嘌呤藥片 -硫磷醯胺 -塞普雷斯(Thioplex) -塞替派(Thiotepa) -TICE -拓樸莎(Toposar) 拓樸替康（Topotecan) -托瑞米芬(Toremifene) -曲妥朱單抗 -維生素 AS复(Tretinoin) -摧索（Trexall) -三氧化二珅（Trisenox) -TSAP -VCR -貝班（Velban) -貝卡德(Velcade) -滅必治（VePesid) -凡善能(Vesanoid) 81 200827363 -道諾比辛 鹽酸鹽 •道諾比辛微脂體 -唐索（DaunoXome) -立可樂（Decadron) δ -固體層（Delta-Cortef) -德培松(Deltasone) -地尼白介素(Denileukin difitox) -地波賽特(DepoCyt) -地賽米松(Dexamethasone) -地賽米松乙酸鹽 -地賽米松構酸納 -得舒瑞(Dexasone) -右雷佐生（Dexrazoxane) -DHAD - DIC •敵德斯(Diodex) -多西紫杉醇(Docetaxel) -多西爾（Doxil) 小紅莓（Doxorubicin) -小紅莓微脂體 -卓賽(Droxia) -DTIC -DTIC-半球形物 -杜拉隆（Duralone) -依夫德斯(Efudex) -依利格(Eligard) -依能斯(Ellence) -益樂鈾（Eloxatin) -愛施巴（Elspar) -依立適通(Emcyt) -表柔比辛（Epinubicin) -α 依優丁(Epoetin alfa) -爾必得舒(Erbitux) -伊歐文氏桿菌（Erwinia)L -天冬醯胺酶 -雌莫司、汀(Estramustine) -乙西醇（Ethyo 1) -拜德（Viadur) •長春化絵^ -長春花驗硫贐鹽 -文卡莎（Vincasar)Pfs -長香新驗 -溫諾平（Vinorelbine) -溫諾平酒石酸鹽 -VLB -VP-16 -威猛(Vumon) -截瘤達(Xeloda) -忍諾莎（Zanosar) -澤伐靈(Zevalin) -吉卡(Zinecard) -佐拉德(Zoladex) -°坐來麟酸(Zoledronic acid) -卓骨她(Zometa) -格來德晶片（Gliadel wafer) -基立克(Glivec) -CM-CSF 戈舍瑞林 -粒性細胞-菌落刺激因子 -粒性細胞巨噬細胞菌落刺激因子 -氟甲睪酮(Halotestin) -賀癌平 -六卓隆丁 (Hexadrol) -克瘤靈(Hexalen) -六甲蜜胺 -HMM -癌康定(Hycamtin) -愛治(Hydrea) -海卓可(Hydrocort)乙酸鹽 -氫皮質酮(Hydrocortisone) -氫皮質酮磷酸鈉 -氫皮質酮琥珀酸鈉 _氫皮質酮磷酸鹽 _羥基脲 -替伊莫(Ibritumomab) -替伊莫單抗(Ibritumomab 82 200827363

-依托波松(Etopophos) -鬼臼乙叉甙 -鬼臼乙叉甙磷酸鹽 -優里辛(Eulexin) -舞穩(Evista) -依西美坦（Exemestane) -弗瑞斯(Fareston) -氟維司群(Faslodex) -弗隆(Femara) -惠爾血添(Filgrastin) -版尿苷（Floxuridine) -福達樂(Fludara) -福達樂濱（Fludarabine) •氟普雷斯(Fluoroplex) •氟癌星（Fhiorouracil) -氟癌星(乳劑） -氟美特隆(Fluoxymesterone) -氟他醯胺

-四氫葉酸(Folinic Acid) -FUDR -法洛德（Fulvestrant) -G-CSF -吉非替尼 -傑西塔濱 -傑朱麻歐札辛 (Gemtuzumab ozogamicin) -健擇（Gemzar) -基立克(Gleevec) -陸普隆(Lupron) •陸普隆迪波特(Lupron Depot) -曱苯肼(Matlane) -目滴舒(Maxidex) -美加明（Mechlorethamine) 美加明鹽酸鹽 -美卓隆(Medralone) -美卓佑(Medrol) -麥格斯(Megace) 甲地孕酮(Megestrol) ••甲地孕酮乙酸鹽_

Ti^xetan) :乏達黴素(Idamycin) 〆乏達比辛(Idarubicin) •伊飛斯(Ifex)

-a -IFN •炎斯達好克癌（Ifosfamide) -IL-2

-IL_U -依瑪替尼(Imatinib)甲磺酸鹽 咪唑羧醯胺 干擾素 _ a jb干擾素(peg綴合物） '•介百素-2 -介百素-11 -插入子(Introm)A( a -2b干擾素) -爾可福 •瘤克寧(Leukeran) -瘤克因（Leukine) _柳培林 長春新驗(Leurocristine) -祿斯得停(Leustatin) -微脂體(Liposomal) Ara-C -液體普雷(Liquid Pred) '洛莫司汀（Lomustine) -l-dam 沙可來斯（Sarcolysin) -美可添（Meticorten) 絲裂黴素 -絲裂徽素-C -米托蒽靦 普尼松(Prednisol)

-MTC

-MTX -氮芥(Mustargen) -芥斯丁 (Mustine) -木他黴素(Mutamycin) -邁樂寧(Myleran) -艾瑞莎 -愛萊諾迪肯(Irinotecan) 83 200827363 -美發能(Melphalan) -異維 A酸(Isotretinoin) -魏基嗓呤 -吉道酶(Kidrolase) -美司納(Mesna) -拉那可特 •美司内克斯(Mesnex) -L-天冬醯胺酶 -阿美蘇喋呤 -LCR -阿美蘇喋呤鈉 -甲基腎上腺皮質酮 -麥洛西（Mylocel) -雷托唾（Letrozole) 在特定實施例中，干擾素(IFN)可以與本發明該等化合 物一起使用。合適的干擾素包括：α-2a干擾素、a-2b干擾 素、聚乙二醇化α-干擾素(其包括a-2a干擾素及a_2b干擾 5素）、石干擾素、T干擾素、τ干擾素、ω干擾素、InterMune 製造之因弗傑（INFERGEN)(alphacon-l干擾素）、Viragen製 造之歐尼弗隆(OMNIFERON)(天然干擾素）、Human Genome Science製造之俄佈弗隆(ALBUFERON)、Ares-Serono製造 之雷比夫(REBIF)(^ - la干擾素）、BioMedicine製造之ω干擾 10 素、AmariU〇 Biosciences製造之口服 α 干擾素、及InterMune 製造之r干擾素、τ干擾素、及/或γ _1 /3干擾素。 在一實施例中，如文中揭示之TCN、TCN-P或相關化 合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單 抗或其鹽，可以與另外化療劑，諸如文中或表2内所描述之 15化療劑，一起或輪流體使用以治療抗藥性癌，例如多藥抗 藥性癌。抗藥性癌可包括結腸癌、骨癌、腎臟癌、腎上腺 癌、胰臟癌、肝癌及/或本項技藝中已知或文中所述之任何 其它癌。在一實施例中，該另外化療劑可以是ρ_·蛋白質 抑制劑。在特定非限制性實施例中，該ρ_醣蛋白質抑制劑 84 200827363 可選自以下藥物：維拉帕米（verapamil)、環孢黴素（諸如環 孢黴素A)、泰莫西芬、弼調蛋白激酶(calmodulin)拮抗劑、 德斯維拉帕米（dexverapamil)、德斯尼地品 (dexniguldipine)、貝斯波達（valspodar)(PSC 833)、比可達 5 〇^士〇(131〇(¥乂-710)、搭吉達咖1^1^(131〇(乂119576)、佐斯吉 達(zosuquidar)(LY335979)、能吉達(laniquidar)(R101933)、 及/或 ONT-093。 藥學組成物 該等包括曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2) 10受體之分子，例如曲妥珠單抗及其鹽的組成物可選擇性與 藥學載劑或賦形劑一起投予。適於文中提供之化合物的投 藥之藥學載劑包括熟悉本項技藝者已知適於特定投藥模式 之任何此等載劑。該等曲西立濱化合物及可調節 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，可 15 一起經調製成該組成物内之唯一藥學活性成份或可併用。 包括該等曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2) 文體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽的組成物可適於口 服、直腸投藥、鼻投藥、局部投藥（其包括頻及舌下投藥）、 陰道投藥或非經腸(其包括皮下、肌内、皮下、靜脈内、皮 20内、眼内、氣管内、腦池内、腹膜内、及硬膜外)投藥。該 等組成物較佳經靜脈注射。 該等組成物最好可以呈單位劑型且可藉習知藥學技術 而製成it匕等技術包括使一或多種本發明組成物與一或多 種藥學載劑或賦形劑締合。 85 200827363 可將該等曲西立濱化合物與可調節HER2/neu(erbB2) 受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，調製成適於口服之 藥學製劑，諸如溶液、懸浮液、錠劑、可分散錠劑、丸劑、 膠囊、散劑、持續釋放配方或酏劑，或調製成適於非經腸 5 投藥之無翻溶液或懸浮液、以及經皮貼劑與乾粉末吸入 劑。在一實施例中，係使用本項技藝已熟悉之技術及程序 將上述曲西立濱化合物調製成藥學組成物（見，例如Ansel

Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第 4 版， 1985,126)。 10 15 20 在該等組成物中，可以使有效濃度之一或多種化合物 或其藥學上可接受衍生物與一或多種合適藥學載劑混合。 在調製前可以將本發明等化合物衍化成龍、鹽、8旨、烯醇 醚或酯、縮醛、縮酮、原酯、半縮醛、半縮酮、酸、鹼、 溶劑化物、水合物或前藥。一旦投藥時，組成物内之該等 化合物濃度能有效遞送可治療、預防或改善該餘疾病或 病症之-或多種症狀的數量。在—實施例中，該等組成物 經調製成適科—劑量投藥。為了調製Μ成物，使該重量 分散之化合物溶解、懸浮、分散或混合在特定載劑中，其 濃度能有效缓解、騎所治療之病症或可改善_或多種症狀。 適於口服之組成物可以以下述形式提供：各別單元， 諸如但不限於各含預定數量之__❹種料組成物的疑 劑、囊片、丸劑或糖衣藥丸、膠囊或扁囊劑；散劑或顆粒； 在水性祕=錢液㈣之缝錢料；或水包油液 體乳液或油包水乳液、或團狀物等。 86 200827363 可，例如藉在載劑，諸如水、鹽液、水性右旋糖、甘 油、乙二醇、乙醇等，内溶解、分散或混合曲西立濱及視 需要選用之藥學佐劑以形成溶液或懸浮液而製成液態藥學 上可投予組成物。若必要，欲投予之該藥學組成物亦可含 5有少|非毋性輔助物質，諸如潤濕劑、乳化劑、增溶劑、 pH緩衝劑、防腐劑、調味劑、及諸如此類，例如乙酸鹽、 擰檬酸鈉、環糊精衍生物、山梨糖醇酐單月桂酸酯、三乙 醇胺乙酸鈉、三乙醇胺油酸酯、及其它此等藥劑。製備此 等劑型之方法係已知或為熟悉本項技藝者所知；例如見 10 Remington^ Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing

Company，Easton，Pa·，第 15版，1975 〇 適於口内局部投藥之本發明組成物包括，例如具有以 調味為基礎之成份，通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃箸膠的含 片，具有本發明之一或多種曲西立濱化合物及可調節 15 HER2/n如(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，在 惰性成份，諸如明膠及甘油、或蔗糖及阿拉伯膠中之錠劑； 及具有以合適液體載劑投予之一或多種本發明該等組成物 的漱口液。 该等錠劑、丸劑、膠囊、口含錠等可含有一或多種以 20下成份或類似性質之化合物：結合劑、潤滑劑、稀釋劑、 助滑劑、分解劑、著色劑、甜化劑、調味劑、潤滑劑、催 吐包衣、及薄膜包衣。結合劑之實例包括微結晶狀纖維素、 貝蓍膠、葡萄糖溶液、阿拉伯膠黏液、明膠溶液、糖蜜、 聚乙烯"比咯啶'聚乙烯吡咯酮(povidone)、交聯之聚乙烯吡 87 200827363 洛酮：蔗糖及殿粉糊狀物。潤滑劑包括滑石、粉、硬脂 酸鎮或硬脂酸約、石松子(lyC〇p〇(Jium)及硬脂峻。 碲釋劑包 括，例如乳糖、蔗糖、澱粉、高嶺土、鹽、甘露醇及磷酽 二鈣。助滑劑包括，但不限於：膠態二氧化矽。 分解劑包 括交聯之羧甲基纖維素鈉、澱粉乙醇酸鈉、海对 部峻、玉米 殿粉、馬鈴薯澱粉、膨潤土、甲基纖維素、瑄 Λ I知及#甲其 纖維素。著色劑包括，例如任何已許可合格的水 土 及C染料、彼等之混合物；及懸浮在二氧化鋁水人I’合性1"13 不可溶性FD及C染料。甜化劑包括蔗糖、乳糖、命 10 15 人造甜化劑，諸如糖精，及任何數量之噴露乾燁及 調味劑包括萃取自植物(諸如水果)之天然調味:二：生 愉快感覺之合成化合物摻合物，諸如但不限於：薄行及柳 酸甲醋。潤義包括丙二醇單硬脂_、㈣糖醇肝翠油 酸酯、二乙二醇單月酸酯及聚氧化乙烯月桂醚。催吐包衣 包括脂肪酸、脂肪、躐、蟲膠、氨化蟲膠及乙酸纖維素狄 酸醋。薄膜包衣包括經乙基纖維素、”基纖維素納、聚 乙一醇4000及乙酸纖維素酞酸酯。 —適於對皮膚局部投予之組成物可以以具有一或多種以 ^學上可接受載劑投予之組成物的軟膏、乳劑 糊狀物提供。 適於直腸投藥之組成物可以以具有合適基劑其包括 例如可可脂或柳酸酯之栓劑提供。 當該載劑為固體時，適於鼻投藥之組成物包括以可用 鼻吸入之方式投予⑷卩藉自緊《近鼻子的含該散劑之 20 200827363 容器而經由鼻道快速吸入）的粗散劑，其粒度在，例如20至 500微米之範圍内，一或多種該等組成物可在水性或油性溶 液内摻合並吸入或噴入該鼻道内。 適於陰道投樂之組成物可以以含有一或多種該等組成 5物及合適載劑之陰道藥栓、填塞物、乳劑、凝膠、糊狀物、 泡沫或喷劑配提供。 適於非經腸投藥之組成物包括可含有抗氧化劑、緩衝 劑、制菌劑、及使該配方與預定受體之血液具等滲性的溶 質之水性及非水性無菌注射液；及可包括懸浮劑及增稠劑 10 之水性及非水性無菌懸浮液。該等組成物可以以單位劑量 或夕劑1容器（例如密封安瓶及小玻瓶）提供且可貯存在僅 需要於使用前不久添加液體載劑，例如注射用水之冷凍乾 二（;東乾)條件下。可自先前所述之無菌散劑、顆粒及旋劑種 類製成隨時可用的注射液及懸浮液。 可使用適於經腸或非經腸投藥之藥學有機或無機固體 或=體載劑介質以製備該等組成物。明膠、乳糖、殿粉、 _月曰s夂鎂滑石、疏菜及動物脂肪與油、樹膠、聚伸烧基 二醇'水或其它已知_全部皆適於作為載體介質。 15 包括曲西立濱化合物及可調節HER2/_(erbB2)受體 2子’例如曲妥珠單抗或其鹽的组成物可以併用 一或多 之 ，樂學上可接受載劑介質及/錢形劑。如文中使用，“藥學 =接受載劑介質”包括任何及所有適於所欲特定劑型 =、溶劑、稀釋«其它液體媒劑、分散或懸浮佐劑、 、面活性劑、等滲劑、增_或乳化劑、防腐劑、固體結 20 200827363 合劑、潤滑劑、佐劑、媒劑、遞送系統、分解劑、吸收劑、 表面活化劑、著色劑、調味劑或甜化劑等。 另外’該等包括曲西立濱化合物及可調節 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽的組 5成物可併用藥學上可接受賦形劑及視需要選用之持續釋放 基貝，諸如可生物降解聚合物，以形成治療性組成物。“藥 學上可接受賦形劑”包括非毒性固體、半固體或液體填料、 稀釋劑、包膠材料或任何類型之配方佐劑。 然而，應瞭解該等組成物之總每日使用量係由負責醫 10生根據合理的醫學判斷而決定。就任何特定宿主而言，特 疋冶療上有效劑ϊ可取決於各種因素，其包括，例如欲治 療之病症及該病症之嚴重程度；所使用特定組成物之活 性，患者所使用之特定組成物、年齡、體重、一般健康狀 況、性別及日常飲食；投藥的時間；投藥方式；所使用特 15定化合物之排泄速率；治療的持續時間；與所使用特定組 成物一起或同時使用之該曲西立濱化合物及/或該等蔥環 素類似物；及醫學技藝中已為吾人所熟知之類似因素。例 如在本項技藝之技術範圍内最好先投予其劑量低於獲得所 欲療效所需之劑量的該組成物，然後逐漸增加劑量，直到 2〇 獲得所欲療效為止。 為了方便投藥及劑量之均勻性，較佳以劑量單位形式 調製包括曲西立濱及可調節HER2/neu(erbB2)受體之分 子，例如曲女珠單抗或其鹽的組成物。如文中使用，“劑量 單位形式”係指適於欲治療之宿主的該組成物之實際上各 90 200827363 別單位。各劑量應該含有本身或與特定藥學載劑介質締合 經預計可產生所欲療效之數量的組成物。 較佳單位劑量配方為此等含有每曰劑量或單位、每日 亞劑量或其合適分數之經投予成份。例如每天約1至50毫克 5 文中揭示之化合物可降低小鼠體内之固體腫瘤的體積。 該劑量可取決於宿主因素，諸如體重、年齡、表面積、 新陳代謝作用、組織分佈、吸收速率及排泄速率。在一實 例中，每天玎對人類投予約〇·5至7克之文中揭示的曲西立 濱化合物。每天可選擇性地對人類投予約1至4克該化合 10 物。在特定實施例中，每天對人類投予0.001至5毫克該化 合物。治療上有效劑量可取決於許多如上述之因素。此外， 在本項技藝之範圍内最好先使用相當低劑量之該組成物， 然後增加劑，直到獲得所欲療效為止。 包括曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(ertB2)受體 15 之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽的組成物可以併用持續釋 放基質’該基質可以由通常為聚合物之材料製成，且其可 藉峰催或以酸為主之水解作用或藉溶解作用而降解。一旦 進入體内時，該基質係藉酶及體液而作用。例如持續釋放 基質係選自生物可相容物質，諸如脂質體、聚乳交酯（聚乳 20酸）、聚乙交酯（乙醇酸之聚合物）、聚乳交酯共-乙交酯（乳酸 及乙醇酸之共聚物）、聚酸酐、聚(原）酯、多肽、透明質酸、 膠原、碟酸軟骨素、魏酸、脂肪酸、填脂、多醣、核酸、 聚胺基酸、胺基酸(諸如苯基丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸）、 聚核答酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯啶酮及聚矽氧。較 200827363 生物可降解基質為聚乳交酯、聚乙交醋或聚乳交醋共. 乙交醋(乳酸及乙醇酸之共聚物)中之任一 種的基質。 °亥等曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體 ^刀子’例如曲妥珠單抗或其鹽，亦可以以微脂體之形式 如本項技藝中所知，微脂體通常衍生自磷脂或其它 月曰貝Μ政脂體係藉分散在水性介質内之單一或多層狀水合 液體結晶而形成。可使用能形成微脂體之任何非毒性、生 理上可接受且可代謝之脂質。除了本發明之一或多種組成 ι〇 =外，該微脂體可含有安定劑、防腐齊J、賦形劑等。脂質 、j為天然及合成之嶙脂與鱗脂酸膽驗（彡卩鱗脂）。形成微 脂體之方法在本項技藝中係已知。 4等曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體 之刀子，例如曲妥珠單抗或其鹽，可經調製成適於藉，諸 1如吸入而投藥之氣溶膠。適於對呼吸道投予之這些配方可 15以呈氣溶膠形式或適用於霧化器之溶液形式或呈適於灌氣 法之微細緻粉末形式，且可單獨或併用惰性載劑，諸如乳 糖。在此種情況下，在-實施例中，該配方之顆粒具有小 於50微米之直徑，在另-實施例中，其顆粒直徑小於職米。 包括該等曲西立濱化合物及可調節舰2/狀咖繼） ^受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽的的組成物可以與其 它組成物及/或程序-起使用以治療上述病症。例如最好使 用手術、輕射或化療及本發明之—或多種組成物以治療腫 瘤，然後可對該患者投予本發明之一或多種組成物以延長 微轉移之不活動狀態並安定化、抑制或降低任何殘留原發 92 200827363 性腫瘤之生長。 另外實施例 可根據用於製備藥學上有用組成物之已知方法以調製 。亥專I括曲西立肩化合物及可調節HER2/neu(erbB2)受體 5之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽的藥學組成物。配方係描 述在許多已為吾人所熟知且容易由熟悉本項技藝者取得之 來源。例如 Remington，s Pharmacemical (Martin EW[1995] Easton Pennsylvania, Mack Publishing, Company，第19版)描述可以與本發明一起使用之配方。適 10於投藥之配方包括，例如可含有抗氧化劑、緩衝劑、制菌 劑、及使該配方與預計受體之血液具等滲性的溶質之水性 無菌/主射液，及可包括懸浮劑及增稠劑之水性及非水性無 菌懸浮液。戎等配方可以以單位劑量或多劑量容器（例如密 封安瓶及小玻瓶）提供且可貯存在僅需於使用前添加無菌 15液體載劑，例如注射用水之冷凍乾燥（凍乾)條件下。可自無 菌散劑、顆粒、錠劑等製備可隨時使用之注射液及懸浮液。 應瞭解除了上文特別揭示之成份外，本發明該等配方可包 括已考慮到所述配方類型之本項技藝中習知之其它藥劑。 例如就抑制癌性細胞之生長而言，本發明該等方法最 2〇好可併用至少一另外治療法，其包括但不限於：化療、放 射療法、可選擇性抑制Ras致癌性傳訊之治療法或熟悉癌之 治療及管理的技藝者已知之任何其它治療法，諸如抗癌劑 之投藥。 可進行API-2(曲西立濱）鹽之投藥。藥學上可接受鹽之 93 200827363 實例為使用可形成生理上可接受陰離子之酸所形成之有機 酸加成鹽，例如甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸 鹽、丙一酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血 酸鹽、α -酮基戊二酸鹽、及α _甘油磷酸鹽。亦可形成合適 5 的無機鹽，其包括鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽、 及碳酸鹽。 可使用本項技藝中已為吾人所熟知之標準程序獲得藥 學上可接受鹽’例如藉使充份驗性之化合物，諸如胺，與 可產生生理上可接受陰離子之合適酸反應。亦可製成羧酸 10之鹼金屬（例如鈉、鉀或鋰）或鹼土金屬（例如鈣）鹽。 可將該等曲西立濱化合物及可調節HER2/neu(erbB2) 受體，例如曲妥珠單抗或其鹽，調製成適於所選用之投藥 方式，亦即口服或非經腸方式之靜脈内、肌内、局部或皮 下投藥方式之各種形式的藥學組成物，並對患者(諸如人類 15 或獸醫的患者)投予。 因此’本發明該等曲西立濱化合物及可調節 HER2/neii(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，可 以與藥學上可接受媒劑（亦即載劑），諸如惰性稀釋劑或可吸 收的食用載劑，-起系統性投予，例如口服。其可包封在 硬或軟殼明膠膠囊内，可壓擠入錠劑内或可直接與患者之 飲食併用。就治療性口服而言，該等化合物可併用_或多 種賦形劑且以下述形式使用··可攝食之旋劑、頰旋劑、口 3旋、膠囊、醜劑、懸浮液、糖聚、薄片等。此等組成物 及製劑應該含有至少〇1%活性劑。該等組成物及製劑之百 94 200827363 分比當然可不同且最好可介 約60%之間。此笙、二汰 心早诅片】％重置之約2至 量可獲得有續I療料絲料合场之含 5 10 15 5活疋、丸劑、膠囊等亦可含 結合劑，諸如黃著# 下、讀·· 劑，諸如鱗酸-句.八二 玉瓣或明膠;賦形 文一鈣，分解劑，諸如玉米澱粉' 海藻酸等；潤滑南、、、、々薯澱粉、 J诸如硬脂酸鎂；及甜化劑， 果糖、乳糖或阿斯巴甜h 堵如庶糖、 薄荷、冬m tame)，可添加調味劍，諸如 U S’ ’ 3櫻桃調味料。當該單位咖為膠 =:τ料外，其可含有液_，諸如蔬菜油 體單以以包衣存在或，該固 ^ 物料式。例如錠劑、丸劑或膠囊可經_、 蠟虫虫膠或糖等覆膜。糖漿或酏劑可含有本發明該等化夕八 物、作為甜化劑之U或果糖、作為防腐劑之對絲笨 酸曱醋及《絲甲酸丙自旨、染料及調味料，諸如樓桃 柑橘調味料。當然，用於製備任何單位劑型之任何材料3、 含量應該具藥學上可接受性且實質上無毒性。此外，本Ζ 明該等化合物可併入持續釋放製劑及裝置内。 " 亦可藉輸注或注射而進行該等曲西立濱化合物及可= 2〇郎HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其骑。 靜脈或腹膜内投藥。可在水中，選擇性地與非毒性表面、、舌 化劑混合以製成該等活化劑或彼等之鹽的溶液。亦可在甘 油、液體聚乙二醇、三醋精(triacetin)、及彼等之混合物中 及在油中製備分散液。在貯存及使用之正常條件下，這此 95 200827363 製劑含有可防止微生物生長之防腐劑。 適於注射或輸注之該等藥學劑型可包括含有適於隨日士 製備無菌可注射或可輸注溶液或懸浮液且可選擇性包2 微脂體内之活性成份的無_水性溶㈣分餘或’ 5劑。就-切情況而言，於製造及貯存之條件下，該最终^ 型必需是無菌、流體且具安定性。該液體載劑或媒劑可二 是溶劑或液體分散液介質，其包括，例如水、乙醇H 醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等）、蔬菜油、非2 甘油醋、及彼等之合適混合物。可藉以下方式而維持人適 1〇流動性，例如藉形成微脂體、藉維持所欲粒度(就分散液而 言）或藉使用表面活化劑。可藉各種抗細菌劑及抗真菌劑， 例如對經基苯甲酸醋、氣丁醇、齡、山梨酸、乙果硫柳酸 鈉(thimerosal)等，而防止微生物作用。就許多情況而言， 較佳可包括等滲劑，例如糖、緩衝劑或氣化納。可藉在該 15等組成物内使用能延緩吸收作用之藥劑，例如單硬脂酸銘 及明膠，而延長該等可注射組成物之吸收作用。 藉將必要數量之本發明化合物及各種上述其它成份併 入&適浴A! Θ且若必要’繼而進行過渡滅菌而製成無菌 注射液。就用於製備無菌注射液之無菌散劑而言，較佳之 2〇製法為真空乾燥及冷;東乾燥技術，其可產生具有該活性成 份及存在於先前經過濾滅菌之溶液内的任何另外所欲成份 之散劑。 就局部投藥而言，該等曲西立濱化合物及可調節 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，可 96 200827363 以以純形式（亦即液體)施用。然而，彼等適量較佳以和皮膚 上可接受之載劑（其可以是固體或液體）組合之組成物或配 方對皮膚投予。 有用的固體載劑包括微細緻固體，諸如滑石、黏土、 5微晶狀纖維素、二氧化矽、二氧化鋁等。有用的液體載劑 包括水、醇或乙二醇或水_醇/乙二醇摻合物，其中可選擇性 借助於非毒性表面活化劑使本發明等化合物以有效量溶解 或分散。可添加佐劑，諸如香料及另外抗微生物劑，以使 特定用途之性質最佳化。可使用自吸水墊施用之所形成液 1〇體組成物以浸潰繃帶及其它包敷料或使用泵型或氣溶劑喷 霧器將其噴在經感染區域上。 亦可連同液體載劑使用增稠劑，諸如合成聚合物、脂 肪酸、脂肪酸鹽及酯、脂肪醇、經改質纖維素或經改質礦 物質’以形成可直接施用至使用者之皮膚上的可塗開糊狀 15物、凝膠、軟膏、肥皂等。可用以遞送本發明該等化合物 至皮膚上之有用的皮膚用組成物揭示在以下資料中： Jacquet等人（美國專利第4,6〇8,392號）、Geria(美國專利第 4,992,478號）、Smith等人（美國專利第4,559，157號）及

Woltzman(美國專利第4 82〇 5〇8號）。 20 可藉在動物模式内比較本發明該等藥學組成物之活體 外活性及活體内活性而測定彼等之有用劑量。在小鼠、及 其它動物至人類中之有效劑量的外推法在本項技藝中係已 知，例如見美國專利第4,938,949號。 在一非限制性實施例中，活性劑在液體組成物（諸如乳 97 200827363 劑)中之濃度可以自約。.㈣重量％或自約〇 5至難量 =中一之實7 ’其在半固體或嶋蝴諸如凝膠或 U)中之/辰度可以是約〇.m5重量％、較佳約〇5至2 5重旦 5 10 15 施=中’就成人而言，適於注射、輪注或攝食 之早-―通常在⑴姻毫克之間不等且每天可投 3次以產生約(U至5()毫克/公斤之劑量。在合適地判斷個發 之-下，本㈣—雜舰^服劑量相是每天介-至45毫克之間。 、·5 因此’本發明包括含曲西立濱化合物 〜 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽/ 彼等之藥學上可接受鹽及藥學上可接受载劑的藥學叙： 物。包括-數量之曲西立濱化合物及 戍 脈2/職(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽，^ 彼等之藥學上可接受鹽的適於口服、局部或非經腸投藥， 藥學組成物構成本發明_較佳實施例。就本發明而言、 患者，特別為人類，所投予之劑量應該在合理的時= 内足以㈣該患者之治療反應。熟悉本項技藝者瞭解兮▲ 量可取決於各種因素，其包括該動物之健康狀況，該= 之體重以及癌之嚴重程度與癌期。 合適劑量為可以使該等曲西立濱化合物及可調# HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽j芦 已知腫瘤内的濃度可影響所欲反應的劑量。該較佳二量= 可導致癌細胞生長之最大抑制作用且不會有失控的副作為 之劑量。如可藉一般技術者所決定，可連續或以不同的= 20 200827363 隔投予API-2(或其藥學上可接受鹽）。 可得利於該等用於抑制癌細胞生長之所揭示方法的哺 礼類物種包括，但不限於：靈長目動物，諸如猿、黑猩猩、 猩獲、人類、猴子，訓養動物（例如寵物），諸如狗、貓、天 5竺鼠、倉鼠、越南大肚豬、兔子、及雪貂；馴養農場動物， 諸如牛、水牛、野牛、馬、驢、豬、綿羊、及山羊；典型 上在動物園内所發現之外國來的動物，諸如熊、獅子、老 虎、豹、象、河馬、犀牛、長頸鹿、羚羊、樹懶、瞪羚、 斑馬、野蜂、草原犬鼠、無尾熊、袋鼠、負鼠、浣熊、熊 10貓、鬣狗、海豹、海獅、象海豹、水獺、鼠海豚、海豚、 及鯨魚。該等名詞“病患，，及“患者，，在文中係交互使用且有 意包括此等人類及非人類哺乳類物種。同樣，可以在此等 哺乳類物種之細胞上進行本發明之活體外方法。 可使用醫學職業者已知之標準技術鑑定需要使用本發 15 明該等方法進行治療的患者。 提供以下實例作為闡明用且不具限制性。 實例 實例1 :活體外篩檢 |g胞株及NCI多樣性分子庫：所有細胞株可購自ATCC 20 或如前述(Cheng，J· Q·，等人Oncogene，14:2793-2801，1997,

West，K.A·，等人 Drug Resist. Updat·，5:234-248，2002, Satyamoorthy，K·，等人Cancer Res. 61:7318-7324, 2001)。該 NCI結構分樣性分子庫為選自約140,000種化合物之NCI藥 物資料庫的1,992種化合物之保存所。有關這些多樣性分子 99 200827363 庫之化合物的選擇、結構、及活性之深入資料可在NCI Developmental Therapeutics Program之網址上找到。

Akt轉形之細胞生長的抑制作用之篩檢：將AKT2轉形 之NIH3T3細胞或LXSN媒劑轉移感染之NIH3T3對照細胞 5 (Cheng，J.Q·，等人Oncogene，14:2793-2801，1997)接種入96 井組織培養平皿内。經5μΜ之NCI多樣性分子庫化合物處理 後，可使用 CellTier 96 One Solution Cell Proliferation套組 (Promega)檢測細胞生長。可抑制AKT2轉形細胞而非LXSN 轉移感染之NIH3T3細胞的化合物被視為Akt抑制劑之適合 10 物並使其進行進一步分析。 活體外蛋白質激酶、細胞存活及細胞凋亡檢定:如前 述進行活體外激酶檢定（見，例如Jiang，K·，Coppola，等人 Mol· Cell· Biol·，20:139-148, 2000)。細胞存活係經 MTS(Promega)檢定。細胞凋亡係經膜聯蛋白V檢測，其進 15 行方法如前述（Jiang，K·，Coppola,等人 Mol· Cell· Biol.， 20:139-148，2000)。重組型 Akt 及 PDK1 係購自 Upstate Biotechnology Inc 〇 結論

Akt傳訊路徑，API-2之小分子抑制劑的鑑定 20 Akt在人類癌内之經常變化業經檢測且Akt路徑之破壞 可誘發細胞〉周亡並抑制腫瘤生長(Jetzt，A·，等人Cancer Res·， 63:697_706, 2003)。因此，Akt被視為用於研發新穎癌治療 法之有吸引力的分子標靶。為了鑑定Akt之小分子抑制劑 (群），評估得自該NCI(NCI多樣性分子庫）之1，992種化合物 100 200827363 的化學資料庫之適於能抑制AKT2轉形細胞生長而非排空 媒劑LXSN轉移感染之NIH3T3細胞的藥劑。重複的實驗證 明32種化合物僅可抑制akT-2轉形細胞之生長。其中最有 效的化合物，API-2(NCI識別號：NSC 154020)，可以於50nM 5 之濃度下抑制細胞生長。第1A圖表示API-2，其亦稱為曲西 立濱之化學結構（Schweinsberg，P· D·，等人Biochem Pharmacol” 30:2521-2526, 1981)，API-2可選擇性優先抑制 AKT-2轉形細胞而非未轉形親代細胞之事實有助於我們決 定API_2是否為AKT2激酶之抑制劑。據此，使用得自經 10 API-2處理後之AKT-2轉形NIH3T3細胞的抗AKT2抗體免疫 沈澱AKT2。使AKT2免疫沈澱物經抗磷號酸化Akt抗體免疫 墨點。如第1B圖所示，API-2可明顯地抑制AKT-2之完全活 化所需之蘇胺酸-309及絲胺酸_474的AKT2磷酸化反應 (Datta，S.R·，等人Genes Dev. 13:2905-2927, 1999)。由於Akt 15 之3種變異體共同具有高同源性及類似結構，所以可評估 API-2對彼等之激酶活性的影響。HEK293細胞係經 HA_Akt卜HA-AKT2及HA-AKT3轉移感染，使血清飢餓一 夜並在EGF(50毫微克/毫升)刺激前經ΑΠ-2處理，費時60分 鐘。3次重複實驗顯示API-2可抑制經EGF誘發之激酶活性 20 及Aktl、AKT2及AKT3之磷酸化反應（第1C圖）。然而，在 活體外激酶反應中，重組型原構原性AKT2(Myr-AKT2)之激 酶活性並未經API-2抑制（第1D圖），其表示API_2並未直接 抑制活體外之Akt且表示API-2既不能作為ATP競爭物，也不 能作為可結合至Akt之活性部位的基質競爭物。 101 200827363 API-2不能抑制Akt之已知上游活化_丨:已清楚地用文 件證明可經由P13K依存性方式，藉細胞外刺激物及細胞内 信號分子，諸如活性Ras及Src，而活化Akt。因此，Akt之 API-2抑制作用可起因於將Akt之上游分子（群）定標。由於 5 PI3K及PDK1為Akt之直接上游調節劑（Datta，S.R·，等人 Genes Dev. 13:2905-2927，1999)，所以可檢查ΑΠ-2是否可 抑制PI3K及/或PDIU。使HEK293細胞之血清飢餓，然後在 EGF刺激前可經API-2或PI3K抑制劑，渥曼青黴素處理，費 時30分鐘。使PI3K經抗ρΙΙΟα抗體免疫沈澱。使用Π-4-Ρ 10 作為基質，使該等免疫沈澱物進行活體外ΡΙ3Κ激酶檢定。 如第2Α圖所示，該經EGF誘發之ΡΙ3Κ活性係藉渥曼青黴素 而抑制，並非藉ΑΡΙ-2而抑制。為了評估ΑΠ-2對PDK1之影 響，在含磷脂醯肌醇之脂質體存在下使用其中重組型PDK1 可促進ΑΚΤ2之蘇胺酸-309磷酸化反應的檢定法。如第2Β圖 15 所示，該檢定係受對照物PDK1抑制劑，星形孢菌素(IC50 二5ηΜ)，強勢地抑制。反之，於所測試之最高濃度(5.1 μΜ) 下，API-2顯示該檢定之僅21%抑制作用。為了進一步評估 API-2對PDK1活化作用之影響，在以ΑΡΙ·2處理HEK293細 胞後，檢查PDK1於絲胺酸-241，其係為本身經磷酸化且對 20 其活性具重要性之殘基的自體磷酸化含量(Datta，S.R·，等人 Genes Dev. 13:2905-2927, 1999)。三次重複的實驗證明 PDK1之麟酸化含量並未受API-2抑制（第2B圖）。然而，PI3K 抑制劑，渥曼青黴素，可抑制經EGF刺激之PDK1(第2B圖）。 API-2對Akt—尤選摆性比對PKC、PKA、SGK、STAT、 102 200827363 JNK、P38、及ERK傳訊路徑之選擇性高很多:Akt屬於 AGC(PKA/PKG/PKC)激酶族，其亦包括PKA、PKC、血清-及腎上腺促糖皮質激素-可誘發之激酶(SGK)、p90核糖體S6 激酶、p70S6K、有絲分裂因子(mitogen)-及應激性-活化蛋白 5 質激酶及PKC-相關激酶。在AGC激酶族中，PKA、PKC及 SGK之蛋白質結構比較接近Akt激酶而非其它成員。因此， 接下來檢視API-2對這3種激酶之酶催活性的影響。使 HEK393細胞經HA-標記之PKA、PKCa或SGK轉移感染。 活體外激酶檢定及免疫墨點分析證明P K A及P K C α之激酶 10活性係分別經ΡΚΑΙ及R〇 31 -8220(其係為PKC抑制劑）抑 制，然而API-2顯示對彼等之活性並無影響（第2C及沈圖）。 而且，血清誘發之SGK激酶活性係藉渥曼青黴素而減弱而 非藉API-2而減弱（第2D圖）。此外，已確知api_2是否對其 它致癌性存活路徑有影響。使用市售抗磷酸化抗體進行之 15西方墨點分析顯示Stat3、JNK、p38及Erkl/2之填酸化含量 並未受API-2治療法之影響（第丌圖。這些資料表示Api_2可 特定地抑制Akt傳訊路徑。 API_j_可抑制細胞生長並讀發Akt過麼表現性/活化人類 癌細胞掩土-之細数週.亡：API-2可選擇性抑制該Akt路徑之 20能力表示其應該可抑制增生及/或優先誘發Akt之異常表現 性/活化作用的此等腫瘤細胞中的細胞凋亡。由於Akt在通 常起因於Akt之過度表現性或PTEN突變的人類惡性腫瘤中 之活性’所以可使用API-2以治療以下細胞：能表現由AKT2 之過度表現性所產生之原構活性Akt的細胞（〇vCAR3、 103 200827363 OVCAR8、PNNC1 及AKT2-轉形之NIH3T3)或由PTEN基因 之突變所產生之原構活性Akt的細胞（PC-3、LNCaP、 MDA-MB-468)、及對IGF-1之生長刺激無反應之細胞 (OVCAR5、DU-145、T47D、C0L0357及LXSN-NIH3T3) 5 以及藉用以活化Akt之IGF-1而活化但對IGF-1之生長刺激 無反應之黑色素瘤細胞（Satyamoorthy, K·，等人Cancer Res. 61:7318-7324, 2001)。免疫墨點分析顯示Akt之磷酸化含量 僅在能表現升高的Akt或對IGF-1刺激有反應之細胞内才會 受到API-2抑制（弟3 A圖）。因此’與具低Akt含量之細胞比 10 較，在Akt表現性/活化細胞内，API-2可很大程度地抑制細 胞生長。如第3B圖所示，在Akt表現性/活化細胞株， LNCaP、PC-3、OVCAR3、OVCA8、PANC卜 MDA-MB-468 及WM35中API-2治療法可抑制約50至60%之細胞增生，然 而在顯示Akt之含量低或對IGF-1之生長刺激並無反應的 15 DU145、OVCAR5、C0L0357、T47D及WM852細胞中僅抑 制約10至20%。而且，API-2分別可誘發8倍、6倍、6倍、及 3倍之以下細胞株的細胞凋亡：OVCAR3、OVCAR8、 PANC1、及 AKT2-NIH3T3。OVCAR5、C0L0357 及 LXSN-NIH3T3細胞之API-2與媒劑(DMSO)處理並未發現細 20 胞凋亡有明顯的差異。因此，API-2可抑制細胞生長並可優 先誘發能表現異常Akt之細胞的細胞凋亡。 API-2可抑制Akt之下游標靶：業經證明經由許多蛋白質之 石舞酸化反應，Akt可發揮其細胞作用（Datta，S.R·，等人Genes Dev· 13:2905_2927, 1999)。超過20種蛋白質業經確認為Akt 104 200827363 基質，其包括Forkhead蛋白質族之成員（FKHR、AFX及 FKHRL1)、馬鈴薯球蛋白（tuberlin)/TSC2、p7〇s6K、GSK-3 冷、？21爾1/(^、P27kipl、MDM2、Bad、ASK1 及ΙΚΚα 等。 接下來檢視API-2是否可抑制Akt之下游標靶。由於抗磷酸 5化-馬鈴薯球蛋白、_Bad、AFX、及-GSK-3a//3抗體係市售， 因此’可測定API_2對彼等經Akt而誘發之磷酸化反應的影 響。在經ΑΡΙ-2(1μΜ)處理後，使〇VAR3細胞溶解並經各別 抗磷酸化抗體免疫墨點。第4Α圖表示ΑΡΙ-2可大程度地抑制 馬鈐薯球蛋白之磷酸化反應程度，因而可導致馬鈴薯球蛋 10白之安定性及上調（Dan，H.C·，等人J. Biol. Chem·， 277:35364-35370, 2002)。Bad、GSK-3 々、及AFX之磷酸化 程度藉API-2而部份減弱。這些資料表示API-2可誘發細胞 死亡並藉抑制其下游標靶之磷酸化反應而控制細胞生長。 Akt下游標靶之不同程度的API-2抑制作用可能起因於這些 15 標乾之填酸化反應部位亦受其它激酶(群)控制的事實，例如 除了 Akt外 ’ ΡΑΚΙ 亦可將Bad絲胺酸-136>£^t^b(Schurmann， A.，等人Mol· Cell. Biol·，20:453-461，2000)。 實例2 :裸鼠腫瘤異種移植物模式之抗腫瘤活性 如先前所報告，採取腫瘤細胞，使其懸浮在PBS中， 20 並皮下注射入8週大之雌裸鼠的右脇腹及左脇腹(2xl〇6個細 胞/脑腹）内（Sun，J等人Cancer Res·，59:4919-4926, 1999)。當 腫瘤達約100至150毫米3時，將動物隨機取樣並每日以腹膜 内注射方式投予〇·2毫升該曲西立濱化合物及/或可調節 HER2/neu(erbB2)受體之分子，例如曲妥珠單抗或其鹽的媒 105 200827363 劑。使對照動物接受DMSO(20%)媒劑，然而經治療之動物 可注射ΑΡΙ-2( 1毫克/公斤/天)在20%DMSO中之溶液。 API-2可抑制能過度表現Akt之裸鼠的腫瘤生長。已說 明AKT1及AKT2在人類卵巢及胰腺癌中之經常過度表現性 5 /活化作用 / 或擴增作用（Cheng J.Q. and Nicosia S.V.，in

Encyclopedic Reference of Cancer, 2001, Schwab D? Ed. Springer，Berlin Heidelberg and New York，p. 35-7)。藉 PI3K、HSP70、Src及法呢基轉移酶(farnesyltransferase)之抑 制劑而抑制Akt路徑可控制細胞生長並誘發細胞凋亡（Soltit 10 D.B·等人，Cancer Res，2003· 63:ρ· 2139-2144; Xu，W·，等人 Cancer Res，2003· 63:ρ· 7777-7784)。最近研究顯示亦可藉 顯性負A k t之腎上腺病毒的瘤内注射而顯著地抑制具高a k t 之異種移植物的腫瘤生長（Jetzt，A.，等人Cancer Res.， 63:697_706, 2003)。由於API-2僅在具高Akt含量之癌細胞内 15 才可抑制Akt傳訊並誘發細胞凋亡及細胞生長控制，所以在 裸鼠中具高Akt含量之腫瘤生長比具低Akt含量之腫瘤生長 對ΑΠ-2更具敏感性。據此，係將皮下注射之Akt過度表現 性細胞(OVCAR3、OVCAR8及PANC-1)皮下植入小鼠之右 脇腹内並將此等表現低Akt含量之細胞株（OVCAR5及 20 C0L0357)植入左脇腹内。當腫瘤平均大小達約1〇〇至150毫米3 時’將該等動物隨機取樣並經媒劑或API_2(1毫克/公斤/天） 進行腹膜内治療。如第4B圖所闡明，在腫瘤植入後49天， 經媒劑治療之OVCAR-5及C0L0357腫瘤可生長至約 800-1，000毫米3。在腫瘤植入後49天，經媒劑對照物治療之 106 200827363 OVCAR3、OVCAR8及PANC1腫瘤可生長至約7GG-9GG毫米3。 API-2分別可抑制 90%之OVCAR3、88%之OVCAR8及80% 之PANC1的腫瘤生長。反之，API-2對裸鼠中之OVCAR5及 C0L0357細胞的生長之影響極微（第4B至4D圖且並未顯示 5 資料）。於1耄克/千克/天之劑量下，API-2對小鼠之血液葡 萄糖含量、體重、活動性及食物攝取並無影響。在經治療 之腫瘤試樣中，Akt活性係藉API-2而抑制且不會改變總Akt 含量（第4E圖）。總之，這些結果表示API_2可選擇性抑制具 高Akt含量之腫瘤的生長。 10 實例3 :TCN可直接抑制野生型Akt激酶活性 API-2(TCN)可直接抑制藉活體外PDK1而誘發之野生 型Akt激酶活性（第1圖）。本結果證實API-2為直接Akt抑制劑 且證實該基本機制可以是ΑΠ-2結合至Akt之PH結構域及/ 或蘇胺酸-308。使用PDK1及Akt在含有鱗脂醯肌醇 15 -3,4,5-P3(PIP3)、API-2及作為基質之組織蛋白的激酶緩衝 劑中之重組體進行活體外激酶檢定。培育30分鐘後，藉 SDS-PAGE而分離該等反應物並曝露在薄膜内。 實施例4: T C N能有效地有利於癌之抗藥性細胞 在順鉑、太平洋紫杉醇、及泰莫西芬抗藥性A270CP、 20 C_13、OVCAR433及MCF7/TAM細胞中測試TCN(API-2)之 效用。API-2可克服這些細胞之順鉑、太平洋紫杉醇、及泰 莫西芬抗藥性。 實例5 : TCN可藉曲妥珠單抗而增強生長抑制作用並誘發細 胞凋亡 107 200827363 材料及方法 細胞株及細胞培養物。在杜比克氏改良之依格耳氏培 養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium):具有 8至 10% ?68之黑姆氏17-12培養基(1^111’8卩-12 1116(1丨11111)(1:1)中維持 5 致腫瘤性BT474.ml亞株。 抗體及試劑。曲妥珠單抗為得自Genentech(San Francisco，CA)之贈品。RAD001 (艾波利莫斯（everolimus)) 為得自 Novartis(East Hanover，NJ)之贈品。QLT0267 及 KP372-1為得自QLT Inc.(Vancouver, BC)之贈品。曲西立濱 10 (6-胺基4_甲基-8_((3_D-酶喃核糖基）-4Η，8Η·吡咯并 [4,3,2-de]嘧啶并[4,5-c]噠畊）係購自 Berry & Associates, Inc_(Ann Arbor，MI)。依地福新係購自 Calbiochem(San Diego, CA)。合成選擇性Akt抑制劑，4ADPIB(4-胺基-2(3,4_二氯-苯基)-N-(lH_u弓卜坐-5-基)-丁醯胺）（美國專利第6,919,340)。 15 PTEN 抗體係得自 Santa Cruz，Biotechnology(Santa Cruz， CA)。3-肌動蛋白抗體係得自Sigma(St. Louis，MO)。所有其 它抗體係購自（Cell Signaling Technology(Danvers，ΜΑ)。 ΡΤΕΝ反訊息及非專一性募核苷酸暫時性轉移感染。根 據NagataY.等人，Cancer Cell，2004· 6(2):ρ· 117-27採用適於 2〇 ΡΤΕΝ之反息(AS)养核苷酸、對照物非專一性(ns)募核誓 酸及適於轉移感染之程序。 細胞增生檢定。將經PTEN AS/NS轉移感染之BT474.ml 細胞接種在2500個細胞/〇·32厘米2井内。使細胞經 Akt/mTOR路徑之抑制劑單獨或與如所述之曲妥珠單抗_ 108 200827363 起處理，費時5天，並根據製造者之規定(Promega，Madison， WI)使用CellTiter 96 AQ非放射性細胞增生檢定套組藉MTS 檢定法而測定活細胞數。比較經處理之細胞及經對照物 DMSO處理之BT474.ml細胞以計算生長抑制百分比。 5 APO_BRDU TUNEL檢定。將經PTEN AS及NS轉移感染 之BT474.ml細胞接種在6井平皿(4至6xl05個細胞/井）内。接 種後24小時，如所述使該等細胞經曲妥珠單抗TCN及/或 RAD001處理，費時72小時。根據製造者之規定收集漂浮及 粘連之細胞，標記並使用APO-BRDU™ TUNEL檢定套組 10 (Phoenix Flow Systems，San Diego, CA)進行染色。收集資料 並使用？八08〇311流動式細胞測定計及〇611(^11681?1*〇4.02軟 體(Becton Dickinson, Franklin lakes，NJ)進行分析。檢視至 少10,000次事件。 SDS-PAGE及免疫墨點分析。如所述，處理經pten 15 AS/NS募核苷酸轉移感染之細胞。如Nagata Y·等人在Cancer Cell，2004· 6(2)φ· 117-27中所述，進行免疫墨點。 結果 曲西立濱及RAD001可藉曲妥珠抗而在ΡΤΕΝ缺乏性細 胞中增強生長抑制作用。為了找出克服曲妥珠單抗抗藥性 20 (特別為由ΡΤΕΝ損失導致之抗藥性)之方法，測試6種不同的 小分子抑制劑，這些抑制劑可直接或間接將 PI3K/Akt/mTOR信號傳導路徑（其係為藉ErbB2之過度表現 性及PTEN損失而活化之主要路徑）定標。該目標為鑑定可 以與曲妥珠單抗（其較佳於低劑量下，以使毒性減至最低) 109 200827363 具增效作用之化合物。所選擇之藥物可將Akt、mTOR及整 合素連接激酶(ILK)定標（第9A圖）。BT474.ml細胞為BT474 乳癌細胞株之致腫瘤性亞株且可表現高ErbB2含量。當 PTEN含量經PTEN反訊息寡核苷酸(PTEN AS)轉移感染而 5 降低時，BT474.ml乳癌細胞對曲妥珠單抗之抗增生性作用 的抗藥性高於正常PTEN含量之細胞並可提供其中曲妥珠 單抗之抗藥性係藉PTEN損失而導致之乳癌的良好實驗模

式（NagataY·等人，Cancer Cell，2004· 6(2):ρ· 117-27及第 9B 及第9C圖）。如對照物組，使非專一性募核苷酸(NS)經轉移 10 感染。經PTEN AS寡核苷酸處理能有效降低PTEN含量（第 11A及11B圖）。PTEN AS及NS對照物募核苷酸皆不能改變 該等細胞中之ErbB2含量。 使經PTEN AS及NS-轉移感染之BT474.ml細胞經6種化 合物中之各種或曲妥珠單抗單獨或一起處理，費時5天並與 15經DMSO處理之對照物比較而評估細胞增生。使用生長抑 制作用作為生物學終點，我們比較各藥物（其劑量可導致2〇 至40%生長抑制作用）與曲妥珠單抗之協同作用與其單獨投 予之作用（第9A圖）。 20 幾乎所有化合物，特別於高濃度下及在具有未受損之 PTNE的細胞内，皆具有生長抑制效用（第糊）。然而，與 曲妥珠單抗或化合物單獨比較，其中兩種化合物， 曲西立 肩及RAD0(U ’當與曲女珠單抗併用時可明顯地增強 AS細胞内之生長抑制作㈣9竭。在縣濃度範圍内， 曲西立濱（亦稱為ΑΡΙ·2)，—種可抑制Akt活化之化合物，可 110 200827363 藉曲妥珠單抗而增強生長抑制作用（第9B圖）。當RAD001以 低劑量(< 1 nM)投予時，該mTOR抑制劑RAD001 (艾波利莫斯) 可藉曲妥珠單抗而增加生長抑制作用（第9C圖）。在該等 PTEN AS及NS細胞内於類似含量下，曲西立濱及RAD001 5 明顯地可以與曲妥珠單抗合作以抑制細胞生長（第9 B及9 C 圖）。基本上，曲西立濱及RAD001可恢復曲妥珠單抗對 PTEN缺乏性細胞的敏感性。分別於大於5mM及1·5ηΜ之劑 量下，曲西立濱及RAD001在PTENAS及NS細胞内皆能有效 作為單一藥劑（第9Β及9C圖）。 10 在窄劑量範圍内（-5-15ρΜ)内，第3種化合物，該ILK抑 制劑QLT0267可藉曲妥珠單抗而增強生長抑制作用。由於 QLT0267與曲妥珠單抗具協同性作用之該劑量範圍窄，所 以並未進一步研究本化合物。於高於20pM之濃度下， QLT0267與曲妥珠單抗並未具協同性作用，但是以單一藥 15劑形式可顯著地抑制細胞生長。 在組合治療物處理後誘發細胞凋亡。為了評估生長抑 制作用是否藉細胞凋亡而完成，我們以曲西立濱、RAD〇〇1 及曲女珠單抗（單獨或一起)處理經PTEN AS及NS轉移感染 之BT474.mi細胞，並將細胞凋亡程度定量（第1〇圖）。 20 RAD〇01單獨或與曲妥珠單抗併用並未顯著誘發細胞凋 亡。雖然在經曲妥珠單抗或曲西立濱單獨處理後TUNEL_ 正性凋亡細胞數稍增加，但是此增加量並不具統計學的顯 著性。然而，與在經PTEN AS及]^3轉移感染之細胞内進行 的所有其它處理法比較，曲西立濱及曲妥珠單抗之組合可 111 200827363 顯著誘發細胞凋亡（第ι〇圖）。 實例6 : TCN可抑制Akt之活化作用及下游傳訊分子之 mTOR抑制作用。免疫墨點分析證實曲西立濱及RAD001可 阻斷Akt及mTOR，其係為藉ErbB2而活化之重要傳訊分子 5 及分別為曲西立濱及RAD001之標乾之活化作用。分析Akt 在Thr308及Ser473上之磷酸化反應以作為Akt活性之指標 且藉p70S6K(70-kDa核糖核蛋白體蛋白質S6激酶），其係為 一種mTOR標把之碟酸化反應而評估mT〇R活性。經曲西立 濱處理後，Akt在這兩部位上之磷酸化反應實質上降低（第 10 11A圖）。在PTEN缺乏性細胞中，經曲西立濱及曲妥珠單抗 組合處理後之Akt磷酸化程度與在具有未受損PTEN之細胞 中所發現之磷酸化程度類似（第11A圖、第4及8道）。因此， 曲西立濱可藉有效阻斷Akt活化作用而克服PTEN損失之不 良作用。RAD001可顯著地阻斷之P70S6K之磷酸化反應（第 15 11B圖）。然而RAD001併用曲妥珠單抗所降低之P70S6K磷 酸化程度並未超過僅使用RAD001之磷酸化程度（第11B 圖）。最近反饋環業經確認可導致經mTOR抑制劑，諸如 RAD001 ，處理後之Akt石粦酸化反應及活化反應（〇，Reilly Κ·Ε·等人，Cancer Res，2006· 66(3):ρ· 1500-8)。亦發現藉 20 RAD0(H、及曲妥珠單抗與RAD001之組合治療物而進行Akt 之反饋活化作用可藉本反饋環而去除Akt磷酸化反應（第 11B圖，第3道對第4道），其與在mTOR抑制作用後之Akt活 化作用係取決於上游受體酪胺酸激酶之見解一致(O’Reilly Κ·Ε·等人，Cancer Res，2006. 66(3):ρ· 1500-8)。總括地說， 112 200827363 這兩種1物可抑制彼等之特定標乾激_，且甚至在卩丁顺缺 乏陳、、、田胞中，與任何單_藥劑比較，組合治療物對 Akt/mTOR傳訊路徑具更大之抑制作用。 貝例7 · TCN及曲妥珠單抗可抑制pTEN缺乏性腫瘤中 5 之腫瘤生長。 材料及方法 SCID小乳中之異種移植物人類腫瘤模式。6週大重症聯 合免疫缺症（SCID)雌鼠係得自Tac〇nic Farms(Hudson， NY)。如NagataY.等人在Cancer Cell，2004· 6(2):ρ· 117-27中 10所述，進行腫瘤異種移植。當該等異種移植腫瘤達100至150 毫米之平均大小時，將該等小鼠分成6組，各組具有7隻小 鼠及平均分佈之腫瘤大小，且如下經處理。藉腫瘤内注射 而每週一次對各小鼠投予ΡΤΕΝ反訊息（30微微克(pg))募核 甘酸。PTEN AS券核苔酸投藥後一週，開始藥物治療。經 15 由多部位之腫瘤内注射而每週兩次投予劑量為〇 · 5毫克/公 斤之曲妥珠單抗在200微微升(pL)鹽液中之溶液。經由腹膜 内（I.R)注射而投予劑量為0.5毫克/公斤/天之曲西立濱在 200微微升20% DMSO鹽液中之溶液。藉灌食法每週兩次投 予劑量為1微微克/公斤之RAD001在500微微升5%葡萄糖水 20 中之溶液。經由Ι·Ρ_注射而投予20% DMSO鹽液(20微微升/ 天）。使用測徑器每週兩次測定該等腫瘤並如下計算該等腫 瘤之體積：體積=長度X寬度"2。 統計學分析，使用適用於windowsiGraPhPad Prism 3.0(Graph Pad Software，San Diego, CA)進行單程ANOVA。 113 200827363 結果 先前之生物學及分子資料很有成功的希望，然而，活 體内研究可提供用於治療功效之最嚴謹試驗。因此，在活 體内測試曲西立濱及RAD001。將BT474 ml細胞異種移植物 5注射入6週大SCID小鼠之乳房脂肪墊内。腫瘤形成後，經由 腫瘤内注射每週一次對該等小鼠投予PTEN AS。該實驗方 案能有效地塑造活體内PTEN缺乏性腫瘤模式(Nagata γ.等 人 ’ Cancer Cell 2004· 6(2):ρ· 117_27)。將該等小鼠隨機取 樣分成接受曲西立濱、RAD001、曲妥珠單抗或dmSO單獨 10或一起的治療組。治療後，經DMSO、曲妥珠單抗、RAD001 或曲西立濱單獨治療之腫瘤的生長模式類似（第12Α及12Β 圖）。該等腫瘤之生長並未受抑制且3週後由於大腫瘤負擔 使該等小鼠安樂死。反之，使用曲西立濱及曲妥珠單抗之 組合治療法可顯著並重大地抑制腫瘤生長（第12Α圖）。許多 15腫瘤之大小實際上可降低且經5週治療後，7隻小鼠當中之4 隻並不具有可觸知的腫瘤。與單獨使用RAD〇〇1或曲妥珠單 抗比較’經RAD001及曲妥珠單抗治療後，腫瘤生長相當緩 慢（第12B圖）。因此合併曲妥珠單抗及曲西立濱4RAD〇〇1 能有效抑制活體内ErbB2-過度表現性PTEN缺乏性人類乳 2〇 癌異種移植物。 本發明已參考其較佳實施例而說明。熟悉本項技藝者 自本發明之上述詳細說明文可知各種變異及修飾。本發明 之範圍有意涵蓋所有這些變異及修飾。 【困式簡單說明】 114 200827363 第1圖係說明API-2(曲西立濱）作為得自NCI多樣化分 子庫（Diversity Set)之Akt抑制劑的適合物之鑑定。第1A圖 係闡明ΑΡΙ-2(曲西立濱）之化學結構。第1B圖係說明API-2 抑制ΑΚΤ2在經ΑΚΤ2轉形之ΝΙΗ3Τ3細胞中的磷酸化程 5序。以ΑΡΙ-2(1μΜ)處理經野生型ΑΚΤ2轉形之ΝΙΗ3Τ3細 胞，費時指定時間，並使用抗磷酸化Akt-T308及-S473抗體 (最上面的一組及中間組）進行免疫墨點分析。最下面的一組 顯示總AKT2之表現性。在第1C圖中，顯示API-2可抑制Akt 之3種變異體。使HEK293細胞經HA-AkU、-AKT2及-AKT3 10 轉移感染並在EGF刺激前經ΑΡΙ-2(1μΜ)或渥曼青黴素 (wortmannin)(15pM)處理，使該等細胞經溶解並經抗ΗΑ抗 體免疫沈澱。使免疫沈澱物進行活體外激酶檢定(上)並使用 抗填酸化Akt-T308(下)抗體進行免疫墨點分析。中間的一組 顯示經轉移感染之Aktl，AKT2及AKT3的表現性。第1D圖 15係闡明API_2並不能活體外抑制Akt。進行原構性活性AKT2 重組型蛋白質在含ΙμΜ ΑΡΙ-2(第3道)之激酶緩衝劑中的活 體外激酶檢定。 第2圖係說明ΑΡΙ-2並不能抑制PI3K、PDK1及緊密相關 之AGC激酶族成員。第2A圖係說明活體外PI3K激酶檢定。 20使ΗΕΚ293細胞之血清不足並在EGF刺激前經ΑΡΙ-2( 1 μΜ) 或渥芰青黴素（15μΜ)處理，費時3〇分鐘。細胞被溶解且以 抗-ριιοα抗體進行免疫沈澱。使用ρι_4_ρ作為基質使該等 免疫沈澱物進行活體外激酶檢定。第2Β圖係闡明Αρι_2對活 體外PDK1活化作用（最上面的一組)之影響，實心圓表示藉 115 200827363 API-2而進行之抑制作用。空心圓表示藉正對照物星形抱菌 素(staurosporine)，其係為有效的pdki抑制劑^50=51^)， 而進行之抑制作用。最下面的一組為經]^%_1>1)反4轉移感染 並在EGF刺激前經渥曼青黴素或Αρι_2處理之HEK293細胞 5的免疫墨點分析。以指定抗體檢測該等免疫墨點法。第2C 圖係闡明在經API-2或非選擇性PKC抑制劑R〇31 -8220處理 後使用抗磷酸化PKCa T638(上）及總成PKCa (下）抗體進 行PKCa之磷酸化程度的免疫墨點分析。第2d圖表示活體 外SGK激酶檢定。使HEK293細胞經HA-SGK轉移感染並在 10 EGF刺激前經API-2或渥曼青黴素處理。使用MBP作為基質 (上）以HA_SGK免疫沈澱物進行活體外激酶檢定。最下面的 一組表示經轉移感染之HA-SGK的表現性。第2E圖係闡明 PKA激酶檢定之結果。在含指定抑制劑(API-2或AKAI)及基 質，肯普肽(Kemptide)之ADB緩衝劑(Upstate Biotechnology 15 Inc)中培育經免疫純化之PKA。將該激酶活性定量。第2F 圖係表示西方墨點法。以API-2處理0VCAR3細胞，費時指 定時間。以指定之抗磷酸抗體（第1至4組)及抗肌動蛋白抗體 (下）進行細胞溶解物之免疫墨點。 第3圖係說明API-2可抑制Akt活性及細胞生長且可誘 20發具有高Akt之人類癌細胞的細胞凋亡。第3A圖為西方墨點 法，在經API-2處理後，在指定之人類癌細胞株内以抗磷酸 化Akt-T308抗體檢測Akt之磷酸化程度。再以抗-總Akt抗體 (最下面的一組)探測該等墨點法。第3B圖係表示細胞增生 檢定。以不同劑量之API-2處理圖中所示之細胞株，費時24 116 200827363 時及48小時，然後經CellTiter 96細胞增生檢定套組 (Promega)分析。第3C圖提供細胞凋亡分析。以API-2處理 細胞並經膜聯蛋白（annexin)V及PI染色，然後經FACScan分析。 第4圖表示API-2可抑制Akt之下游目標並在小鼠異種 5 移殖物中之具高Akt之癌細胞株内顯示抗腫瘤活體。第4A 圖係說明API-2可抑制馬鈴薯球蛋白（tuberin)、Bad、AFX及 GSK-3召之Akt磷酸化反應。在經API-2處理後，溶解OVAR3 細胞並經指定之抗體免疫墨點。第4B圖表示API-2可抑制腫 瘤生長。將腫瘤細胞皮下注射入左侧具低Akt細胞含量而右 10 側具高Akt細胞含量之裸鼠體内。當腫瘤達約1〇〇至150毫米 3之平均大小時，以媒劑或1毫克/公斤/天之API-2處理這些 動物。各測定值代表10個腫瘤之平均值。第4C圖係闡明經 API_2或媒劑（對照物）處理之具〇VCAR3(右）及OVCAR5(左) 異種移殖物的小鼠之圖解。第4D圖表示於實驗結束時之腫 瘤大小（下）及重量（上）。在第4E圖中，在經處理(T3及T4)及 未經處理（T1及T2)之OVCAR-3-衍生之腫瘤内使用抗磷酸 化Akt-S473(上）及抗AKT2(下）抗體進行腫瘤溶解產物的免 疫墨點分析。 第5圖表示API-2(曲西立濱）可抑制活體外激酶活性。在 2〇 含磷脂醯肌醇-3,4,5-P3(PIP3)、API-2及組織蛋白作為基質 之激酶緩衝劑中以PDK1及Akt之重組型進行活體外激酶檢 定。30分鐘培育後，藉SDS-PAGE而分離該等分應物並曝露 在薄膜中。 第6a至c圖提供人類Aktl之mRNA及胺基酸序列，亦記 117 200827363 錄限制酶位置。 第7a至d圖提供人類Akt2之及mRNA胺基酸序列，亦記 錄限制酶位置。 第8a至c圖提供人類Akt3之mRNA及胺基酸序列，亦記 5 錄限制酶位置。 9圖表示藉曲妥珠單抗及Akt/mTOR路徑抑制劑之組成 而進行之生長抑制。以該Akt/mTOR路徑抑制劑單獨或與曲 妥珠單抗一起治療PTEN反訊息或非專一性寡核苷酸轉移 之BT474.ml細胞並評估相對細胞生長。第9A圖表示 10 Akt/mTOR抑制劑之名單。在PTEN AS轉移感染之BT474.ml 細胞中評估生長抑制作用。其劑量為：曲西立濱 (ΤΟΝ)ΙμΜ ； RAD001 0.2nM ； QLT0267 ΙΟμΜ ； ΚΡ 372-1 0·05μΜ ; 4ADPIB 5μΜ ;依地福新（Edelfosine)7.5pM ;及曲 妥珠單抗(Ttzm)2微克/毫升。標示生長抑制百分比之標準偏 15差（SD)。所示結果為得自2至3次實驗(各次實驗内重複各處 理法3次）之合併資料。第9B圖表示TCN與曲妥珠單抗之組 合可抑制細胞生長。使BT474.ml細胞經PTEN AS寡核苷酸 或非專一性(NS)募核苷酸轉移感染於TCN之多劑量下經曲 妥珠單抗及TCN(單獨或一起)處理並分析生長抑制作用。曲 20妥珠單抗係以單一濃度投予。第7C圖表示RAD001與曲妥珠 單抗之組合可抑制細胞生長。使BT474.ml細胞經PTEN AS 寡核苔酸或非專一性(NS)寡核苷酸轉移感染，於RAD001之 多劑量下經曲妥珠單抗及RAD〇〇1處理（單獨及一起)並分析 生長抑制作用。就第9B及9C圖而言：*表示與單獨使用曲 118 200827363 妥珠單抗或TCN-TAD001比較，使用組合治療劑之生長抑制 作用有明顯差異。Ρ<0·05被視為顯著。該差長條圖描述 SEM。 弟10圖表不對細胞之〉周亡之協同效果。接種後24小 5 時，如所述使經PTEN AS及NS轉移感染之BT474.ml細胞經 以下濃度之曲妥珠單抗(Tzm)、TCN及/或RAD001處理：曲 妥珠單抗2微克/毫升；曲西立濱2.5μΜ; RAD001 0.4nM。 進行Apo_BrdU Tunel檢定法以評估細胞凋亡。進行該實驗 共3次且所示數據為平均細胞〉周亡數。誤差長條圖描述標準 10 偏差。與所有其它處理法比較，曲妥珠單抗+曲西立濱治療 物可明顯誘發細胞凋亡(p<0.01)。 第11圖表示Akt及p70S6K活性之抑制作用。為了評估這 些藥物對Akt/mTOR路徑之影響，使BT474.ml細胞經PTEN AS及NS寡核苷酸轉移感染。兩天後，使該等細胞經曲妥珠 15單抗及曲西立濱（TCN)(第HA圖）或曲妥珠單抗及 RAD001(第11B圖）處理，費時2小時。收集總細胞溶解產 物，藉SDS_PAGE而分離並如上述經免疫墨點。該曲妥珠單 抗之浪度為2微克/毫升，曲西立濱之濃度為2·>Μ且 RAD001之濃度為G.4nM。重複該等實驗至少兩次以確保該 20 等結果可複製。 第12圖表示組合治療物可抑制冗叫、鼠異種移種物 _式中之Μ生長。使SCID小鼠接受乳房脂肪塾中之 BT474.ml乳癌細胞異種移植物。使該等異種移植物生長3 週以產生平均大小為100至150毫米3之腫瘤。投予pTEN& 119 200827363 訊息寡核苷酸、曲妥珠單抗、曲西立濱（第12A圖）及 RAD001(第12圖）。每週使用測徑器測量該等腫瘤兩次並平 均各治療組之腫瘤大小。誤差長條圖表示該平均值之標準 誤差。*表示與單獨使用曲妥珠單抗(Ttzm)、TCN或DMSO 5 比較，使用組合治療物之生長抑制作用有明顯差異。Ρ<0·05 被視為顯著。 【主要元件符號說明】 (無） 120

Claims (1)

1. 200827363 十、申請專利範圍： 1· 一種組成物，其包含：

   (0式I化合物：

   其中R2’、&’狀5’各獨立為氫、可選擇性經取代之磷酸 鹽或膦酸鹽（其包括單·、二或三餐鹽或安定化填酸鹽 前藥），基（其包括低碳醯基）；烷基（其包括低碳烷基” 醯胺、磺酸酯，其包括烷基或芳烷基；磺醯基，其包括 甲磺醯基及节基，其中該苯基可選擇性經一或多種如， 例如在文中所予之芳基的定義中所述之取代基取代；可 選擇性經取代之芳磺醯基；脂質，其包括磷脂；胺基酸； 碳水化合物；肽；或膽固醇；或活體内可得到其中R2’、 R3,及R5’獨立為Η或單_、二-或三-磷酸鹽之化合物的其 121 200827363 它藥學上可接受脫離基； /、中R及R獨立為氫、可選擇性經取代之磷酸鹽,·醯基 (其包括低碳醯基）；酿胺、院基(其包括低碳烧基）；芳 =、聚氧化稀諸如聚乙二醇、可選擇性經取代之芳 磺醯基；脂質，其包括磷脂；胺基酸；碳水化合物；肽； 或膽固醇；或其它鮮切接受之脫縣。在—實施例 中，該化合物係以5，-磷酸醚脂質或5，_赌質投予； ⑽各獨立為Η、可選擇性經取代之直鏈、分支鏈或 壤糸燒基(其包括低碳烧基）、埽基或炔基、CO-烧基、 10 15 20 CO-烯基、CO-炔基、CO-芳基痿施# 雜芳基、CO-烷氧烷基、 co_芳氧燒基、c◦•取代之芳基、伽基、Μ醯基、 芳磺醯基、芳烷磺醯基； (ii) 曲妥珠單抗或其鹽；及 (iii) 藥學上可接受鹽。 其中該式I化合物為曲 其中該式I化合物為曲 其中該式I化合物為曲 2·如申請專利範圍第丨項之組成物 西立濱。 3. 如申請專利範圍第1項之組成物 西立濱碟酸鹽。 4. 如申請專利範圍第1項之組成物 西立濱膦酸鹽。 5. 如申請專利範圍第i項之組成物，其中該式ι化合物係以 至少20毫克/米2之劑量存在。 6. 如申請專利範圍第i項之組成物，其中該式ι化合物係以 至少10毫克/米2之劑量存在。 122 200827363 7. 如申請專利範圍第1項之組成物，其適於非經腸投藥。 8. 如申請專利範圍第7項之組成物，其中該非經腸投藥為 靜脈投藥。 9. 如申請專利範圍第1項之組成物，其適於口服。 5 10.如申請專利範圍第1項之組成物，其適於局部投藥。 11. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該曲妥珠單抗或 其鹽係以自約1毫克至約1000毫克之數量存在。 12. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該曲妥珠單抗或 其鹽係以自約100毫克至約500毫克之數量存在。 10 13.如申請專利範圍第1項之組成物，其中該曲妥珠單抗或 其鹽係以自約200毫克至約450毫克之數量存在。 14. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該曲妥珠單抗或 其鹽係以約440毫克之數量存在。 15. —種治療哺乳動物之腫瘤或癌的方法，其包括對該哺乳 15 動物投予有效量之組成物，其包含： ⑴式I化合物： 200827363

   其中R2’、R3’及R5’各獨立為氫、可選擇性經取代之磷酸 鹽或膦酸鹽（其包括單-、二-或三磷酸鹽或安定化磷酸鹽 前藥）；基(其包括低碳醯基）；烧基(其包括低碳烧基）； 5 Sf胺、磺酸自旨，其包括烧基或芳烧基；磺醯基，其包括 甲磺醯基及节基，其中該苯基可選擇性經一或多種如， 例如在文中所予之芳基的定義中所述之取代基取代；可 選擇性經取代之芳磺醯基；脂質，其包括磷脂；胺基酸； 碳水化合物；肽；或膽固醇；或活體内可得到其中R2’、 10 R3’及R5’獨立為Η或單-、二-或三-磷酸鹽之化合物的其 它藥學上可接受脫離基； 其中Rx及Ry獨立為氫、可選擇性經取代之磷酸鹽；醯基 (其包括低碳醯基）；醯胺、烷基（其包括低碳烷基）；芳 124 200827363 香族承氧化烯烴’諸如聚乙二醇、可選擇性經取代之芳 磺醯基，·脂質，其包括磷脂；胺基酸；碳水化合物；肽； 或膽固醇，或其它藥學上可接受之脫離基。在〆實施例 中，该化合物係以5’-磷酸醚脂質或5，_醚脂質投予； 5 m2各獨立為11、可選擇性經取代之直鏈、分支鏈或 環系垸基(其包括低碳烧基）、稀基或块基、c〇_烧基、 CO_烯基、CO-炔基、CO-芳基或雜芳基、c〇_烷氧烷基、 CO-芳氧烷基、CO-取代之芳基、磺醯基、烷磺醯基、 芳石黃酿基、芳烷磺醯基； 10 (ii)曲妥珠單抗或其鹽。 16·如申明專利範圍第15項之方法，其中係㈤時投予式I化 合物及曲妥珠單抗或其鹽。 17.如申請專·圍第15項之方法，其中係先投予式】化合 物，繼而投予曲妥珠單抗或其鹽。 15 18.請專利範圍第15項之方法，其中係纽傾曲妥珠 單抗或其鹽，繼而投予式I化合物。 19·如申請專利範圍第15項之方法，其中係每週-次投予該 式I化合物’繼而在—週期間内並未投予該化合物。 20·如申请專利範圍第15項之方法，其中係每週一次投予該 20 曲*珠單抗或起，繼而在—週細内並未投傾化合物。 21·如申凊專利範圍第2〇項之方法，其中該給藥計劃係重複 至少兩次。 A如申請專利範圍第2G項之方法其中該給藥計劃係重複 至少4次。 125 200827363 23. 如申請專利範圍第15項之方法，其中所治療之腫瘤為乳 房、胰腺、卵巢及結腸直腸腫瘤。 24. 如申請專利範圍第15項之方法，其中係投予至少10毫克/米2 之該式I化合物。 5 25.如申請專利範圍第15項之方法，其中係投予至少100毫 克曲妥珠單抗或其鹽。 26. 如申請專利範圍第15項之方法，其中係投予至少200毫 克曲妥珠單抗或其鹽。 27. 如申請專利範圍第15項之方法，其中係投予至少400毫 10 克曲妥珠單抗或其鹽。 126 200827363 七、指定代表圖： (二）本案指定代表圖為：第（12 )圖。 (二)本代表圖之元件符號簡單說明： (無） 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：