TW200817015A - A method for promoting axonal re-growth and behavior recovery in spinal cord injury - Google Patents

Description

200817015 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 促進脊鑛損傷中軸突再生和行為功能恢復的藥物組合物 【先前技術】 本^明係關於一種用於促進脊鑛損傷轴突再 ai r^owth)和行為功能恢復(behavi〇r rec〇very)的方法及藥物組 合物。

在哺乳動物巾’成年人的神經組織具有有限的再生能力。 許多大腦或脊髓損傷不能自體修復或連接重建功能。許 〔複雜的原因，包括免疫調控分子和抑制因子影響成年人中框 神經糸統的再生能力。在脊鑛損傷(SCI)後，損傷部位的星形 細胞和少突膠質細胞會增加硫酸軟骨素蛋白多糖 產生，因而限制了軸突再生。 、某純告已經表明在損傷後CSPG之表現通常會增加，最 近的研究^焦在不同的損傷後各個家族成分表現的改變。 CSPGs 由葡糖胺聚糖(giyc〇samin〇glycan)(GAG)組成，苴為一 種阻斷軸突生長的關鍵性限制因素。軟骨素酶ABC (ChABc) 是一種細菌酶，其消化CSPGs的GAG側鏈。然而，由於chABc 的毒性，其很少被用於脊髓損傷病例的臨床試驗。 【發明内容】 本發明提供ChABC以低劑量治療受試者中神經損傷的 用途。 作本發明了方面提供一種用於促進患有神經損傷的受試者 軸突再士和行為功能恢復的方法，包括向受試者神經損傷的 部位給藥，包含安全有效量的軟骨素酶ABC(ChABC)的藥物 組^物，比如劑量範圍為從約0.1U/ml至約10U/m卜較^當 的約0.5U/ml至約5U/ml，更適當的量為1 U/m卜 200817015 明另—方面提供ChABC在製備用於促進受試者軸 為功能恢復的藥物組合物的用途，其中所述組合 尽有效量的ChABC，比如劑量範圍為從約0J u/ml 曰I /TT/ ml ’較適當的量約o.5u/ml至約5u/mi，更適當的 罝為1 U/ml。 忠個方面提供—種驗受試者的神經損傷的部位 二傷的受試者轴突再生和行為功能恢復的 了& ，其包含安全有效量的軟骨素酶MQChABC)， = fff為從約〇J U/ml至約10 u/ml，較適當的量約 .5 U/ml至、力5 U/ml，更適當的量為1 U/ml。 夂個目的和適#實施方法將在隨後的說明書 且所述部分根據說明書是顯而易見的。本 又/έ、人優點制是在所附之申請專利侧巾指出的部 分和組合來實現和獲得。 _要^2是，前述的—般說明及其後的_田說明僅僅作 為例不性的祝明，而不限制本發明之要求。 【實施方式】

^為功能恢復的方法，該方法包括向受 ϊ 哺乳動物，包括人類。所㈣_傷 經糸統(CNS)損傷或周圍神經系統_s)損傷，、比 本發明的—個實施方案中，發現了在ChABC 種促_神_傷物_突再生和 著 ΪΪΪ對滅触的鴨改善作帥對行為德恢復的顯 根據本發明的-個實施態樣，通過 200817015 抑m日f的—個實施態樣，所述導管可以是插入到脊 ω貝w位的硬膜外鞘内導管(epidural intrathecal eath 具有輸注到ChABC的表面化(externalized)的一端。妒而私 注ChABC的方式將不會同樣地受到限制。用 或給藥ChABC的其他方法也可包括#_ + 文试者提供無毒有效的劑量。社，輸注的c ^ 劑量為約0.5至約簡ml c副c，適當量約Q 5 ^適當量為約i u/m卜另外，在人類受試者可以 給樂一X，取決於受試者的個體需要。

本發明還提供ChABC在製備用於促進患有神經損 受試者軸突再生和行為功能恢復的組合物巾的崎，A中所 述組合物包含相對低的ChAB(>aiABC： _對^ 0.5^^ 10U/mlChABC^t*^ 〇.5U/ml^^ sG/ml ，更適當量為約lU/ml。可以加入其他不會降低cj^bc的、、Λ 療效果之活性或穩定的成分。 ^ 目前已知CSPGs經由星形細胞和少突膠f細胞的產生合 ^制轴突再生。根據本發明，向損傷部位輸注的ChABc可& 解CSPGs，因此可以促進軸突再生。 根據本發明的一個實例，經由傷口將硬膜外鞘内導管插 ^到患有神經損傷的受試者的脊髓損傷部位。然後，閉合所 ^知口，使其遠離用於輸注ChABC的表面化的硬膜外鞘内導 官的一端。在本發明中意外地發現了 ChABC對患有神經損傷 的受試者的轴突再生以及行為功能恢復的顯著作用。、 根據個體受试者的需要，可以給藥或包含ChABC 合物，比如給予所需之受者每週一次。在本發明的一個 實施方案中，用1 U/ml的ChABC每隔一天給藥於受試者(比 如大鼠)兩周(總共8次）。 本發明現在將參照具體但非限定性的實例進一步詳細地 描述0 200817015 實施例l ··在τ8完全脊髓橫切(T8 compiete spinal cord transection)後導管的插入和軟骨素酶ABC的輸注 在該試驗中使用雌性Sprague-Dawley(SD)大氣(每隻稱重 250至300 g)在用異氟烧吸入麻醉和在h〇m〇e〇thermic blanket上保持體溫為約37°C下進行所有的外科手術。將皮膚 打開約酒瓶口的大小，進行縱中切口暴露頭狀骨和α層。就 在ci層上建立硬膜外腔’將導管插入達到水準。声聂 層地閉合傷口，表面化導管用於輸注軟骨素酶ABC。曰且 、在插入導管和證實後肢運動正常後一周，這些動物接受 以T8水準的T8總的椎板切除術用於暴露脊髓和插入的導管 。在舉起兩個殘肢(stumps)的方式下進行完全脊髓棒切用於完 成脊髓橫切，兩個舰靠近在—起。也在T8邮 開導管用於輸注ChABC。在脊鑛橫切穿過硬膜外勒内導管後 的2、4和6周給予第一次劑量的ChABC。一層一層地打開 =。在外科手術後，立即將動物放置在^職曰她㈣^ bla=上’在熱燈下保持一周。經由每日插入導管兩 二直到排尿功能變成正常。為了預防尿路感染，每日一次給 樂預防性抗生素直到動物排泄出它自己的尿。 口 根據脊麵切和輸注ChABC的間隔時間將雌性SD大 分成二組。在完成脊髓橫切後，以三種不同的卜 輸注ChABC。在吸人麻醉下每隔—天給予。細上』 g兩周^共8周，每次⑽。在最後一次輪注⑽队後^ 周，切開表面化的管並移除。實驗總共分為五級 鼠接受⑴僅T8脊趙橫切(僅僅TS叫、、m 入，外娜管(㈣㈣)、嶋，僅 理鹽水i^(T8tx+生理鹽水）' (4)損傷，導管U 8周$ iTCml漏C、（5)損傷，料插人和8職注5 ^ 8 200817015 實施例2 :行為功能的評價 錄旦;Ϊϊί術後每週，所有的動物接受行為魏測定8周。 定，參與行為功能評價的兩個檢查者 ίϊ Γ價从的後肢丨⑽刪❿行為功能。2 寺Ϊ 3童。通過包括躯幹、尾部和後肢的行為 >ίΞί^ ΓΓί"，]^ 〇 ^ 21 l〇c〇m〇to^s /舌性侍分(0為沒有運動，21為正常運動）。 T8 實施例3 :穿過橫切部位的轴突的順行性標記 pint及入異氣烧下麻醉雜SD “。以™水準 ί L;慢的泵壓系統注射三個部位(在每側。.2切x 1 經頸動脈輸注4%低聚甲咖亡之所述動物 的厚度_片㈣⑽咐•沿冠ΐ=⑼ 實施例4 :免疫組織化學 ^賴，浸人4 %的低聚情在磷_緩衝液 ，者轉移到3G %的蔗糖溶液中。將脊趙的橫的或 二文’ 片(每個具有2G#m厚)放置在聚L -賴氨酸塗層的载^ f Ϊ 於免繼—的往清 200817015 ，使用對 CS-56(h500 ; Sigma，St· Louis，MO)、2B6(1:5000 ; Seikagaku Corporation)^GAP-43(!：!〇〇〇; sigma, St. Louis, MO) 的單株抗體作為一級抗體。使用適當的二級抗體加抗生物素 蛋白生物素複合物(ABC)過程用於過氧化物酶染色。陰性對照 =為不含有(omission)對 CS-56 (—種 CSPG)、2B6(CSPG 的降 解產物)和GAP-43 (—種新形成的軸突)的一級抗體來檢驗，抗 體也用於評價CSPG的降解和軸突穿過損傷部位的再生。 如在圖2所示’通過與對照組比較來觀察在chABC lU/ml組和ChABC 5U/ml組中的形態學瘢痕組織，。然而，如 圖2B所不’在ChABC 5U/ml組中接近橫切部位觀察到大的 囊腫。 如圖3所示，在脊髓損傷和chABC治療後8周，與ChABC 5 U/ml組和對照組相比，在用ChABC： 1 u/ml處理的組中， CS-56的免疫染色，其為在脊髓損傷部位上的完全創痕cspGs 結構’顯示出顯著地降低。未消化的(undigested)瘢痕組織會 表現CS-56的強免疫陽性(immun〇p〇sitive)。如圖4所示，在 1 U/ml ChABC處理後2周内檢測到最低量的cs-56，但是在 ChABC處理後4周CS-56仍增加。在ChABC lU/ml組中， CS 56免疫&色在脊趙彳貝傷後2周達到峰水準，與之相比， T8 &切組的CS-56免疫染色在6周達到峰水準並持續至多$ 周。 …、、 2B6在ChABC lU/ml組中的表達比對照組更強。在

ChABC 處理後 8 周，在 ChABC 1 U/ml 組、ChABC 5 U/ml 組和對照組之間’在2B6 (ChABC對CSPGs的降解產物)的免 疫染色不存在差異。參照圖5，與對照組相比，在〇1^(：：處 理後2周，在lU/ml ChABC組中觀察到2B6免疫染色。处 如圖6所示，在ChABC 1 U/ml組中穿過橫切部位觀察到 小麥胚芽凝集的辣根過氧化物酶(WGA_HRp)標記的軸突了小 尺寸的瘢痕不會阻斷軸突再生。參照圖7，在橫切後8周，^ 200817015 疫陽性突^^^^^觀察到一些⑽七免 位觀察到大量軸突。如圖7 _側殘肢(rostral stump)損傷部 發現了更少和更薄的軸突。不，在瘢痕組織的中心區域， 本發明的患技術人員應當理解 。所述脊椎動物句括，、/〜、心中、、、災損傷的任一種脊椎動物 ，例如牛、豬、、旦不限於人類之市售有關的哺乳動物 括市ί有關的禽類比如小雞、鴨、鵠和火ir、兔子，也包 【圖式簡單說明】 样細古 明時’有助於闡述之前發明物概述以及 並能更清 圖H^F在根據本發明的不同處理 ^雌性SD錢的β讓、B咖⑽職 開放(知、衫)野(叩en fldd) 1〇c〇m〇t〇r，s檢驗得分。 8周:二Si在根據本發明的不同處理組中在T8橫切後 二2=3=發明的不同處理組中在Τ8橫切後 染色的大鼠脊^CS_56免疫 200817015 圖5顯示了在ChABC 1 U/ml組和對照组中2B6免疫染 色的大鼠脊柱的組織化學横切面。 圖6頒示了在chABC 1 U/ml組中HRP描繪的(HRP traced)大鼠脊柱的組織化學橫切面。 圖7A顯示了在ChABC 1 U/ml組中GAP-43免疫染色的 大鼠脊柱的組織化學橫切面。 圖7B _示了得自圖7A的上側殘肢(rostral stump)損傷部 位的高解析度圖像。 圖7C為付自圖7A的瘋痕組織(c)的中心區域的高解析度 圖像。 【主要元件符號說明】 無 12

Claims (1)

1. 200817015 十、申請專利範圍： 1· 一種利用藥物組合物促進受試者軸突再生和行為功能的用 途’其中所述樂物組合物包含用於促進患有神經損傷的受試者幸由 突再生和行為功能恢復的安全有效量的軟骨素酶ABC(ChABC)。 2.根據申睛專利範圍第1項的用途，其中所述藥物組合物包 含約 0.1 U/ml 至約 1〇 u/ml 的 ChABC。 口 匕 3·根據申請專利範圍第1項的用途，其中所述藥物組合物包 含約 0.5 U/ml 至約 5 U/ml 的 ChABC。

   4·根據申請專利範圍第〗項的用途，其中所述藥物組合 含約 1 U/ml 的 ChABC。 5·根據申請專利範圍第丨項的用途，其中所述藥物組合物 由輸注給藥至損傷部位。 句 6·根據申請專利範圍第5項的用途，其中所述藥物組合 經由硬膜外鞘内導管給藥。 馬 7·根據申請專利範圍第5項的用途，其中每次輸注約1μ1至 '·、勺ΙΟΟμΙ的藥物組合物給藥至損傷部位。 ,8·根據申請專利範圍第7項的用途，其中所述輸注為每天進 行一次或每隔一天進行一次。 心申請專利範圍* 1項的用途，其中所述神經損傷包括 品神、、至糸統(CNS)損傷或周圍神經系統(pNS)損傷。 括脊H。射料纖_9項的贿，其巾所述神經損傷包 乳動2。根據申請專利範圍第1項的用途，其中所述受試者為哺 12·根據申請專利範圍第i項的用途，其中所述受試者為人 13 200817015 類 13. 一種用於促進患有神經損傷的受讀去紅扣壬/一达 功能恢復的藥物組合物，所述藥物組合物包$ 素酶ABCXChABC)純藥上可接受的魏料里的軟骨 項的藥物組合物，其包含約 項的樂物組合物，其包含約 項的藥物組合物，其包含約 14·根據申請專利範圍第13 0.1 U/ml 至約 10 u/ml 的 ChABC。 15.根據申請專利範圍第13 0·5 U/ml 至約 5 U/ml 的 ChABC。

   16·根據申請專利範圍第13 1 U/ml 的 ChABC 〇 14