TW200535142A - Drug screening - Google Patents

Description

200535142 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於hRRM2與p53R2蛋白中的多個胺基 酸殘基。包括兩個酪胺酸殘基在内之該些胺基酸殘基，係 參與在RNR酵素活性之必要穩定自由基的生成反應中。 【先前技術】

核醣核苷酸還原酶（Ribonucleotide reductase，RNR)為 一種DNA合成路徑上受到高度調控的酵素，其係由Ml與 M2兩種次單元所構成。在人體中，一個rnR係由兩個大 次單元（hRRM 1 )與兩個小次單元（兩個 hRRM2或兩個 p 5 3 R2次單元）所構成。此酵素負責執行將核醣核苷二磷酸 (ribonucleoside diphosphates)轉化為去氧核醣核苷二磷酸 (deoxyribonucleoside diphosphates)的轉化反應（de novo conversion)，該轉化反應對於DNA合成與修復來說為必要 的（Cory and Sato，1 983，Mol. Cell· Biochem. 53，257-266; and Thelander and Berg, 1 986， Mol. Cell Biol 6, 3 43 3 -3 442)。由於細胞增殖需進行DNA合成反應，因此抑 制RNR活性可能降低例如癌症等不想要的細胞增殖現 象。因此RNR對於治療癌症來說，可能是一個重要方向 (Nocentini, 1 996， Crit. Rev. Oncol. Hematol. 22, 8 9- 1 2 6)。然而’找出專一又有效之RNR抑制劑的計晝， 卻因缺乏對RNR結構的透徹暸解及特定篩選系統而進度 緩慢。 3 200535142 【發明内容】 本發明係根據（至少部分根據）在哺乳動物RNRs中或 利用活體外hRRMl及hRRM2或hRRMl及p53R2重組蛋 白所作出之活性RNR中，一雙鐵-雙酪胺酸自由基輔因子 中心（diferric-dityrosyl radical cofactor center)的發現所 作成。hRRMl、hRRM2與p53R2次單元之聚胜肽及核酸序 列係顯示如下： hRRM2 ^J(GenBank Accession No. S25854 ； 1) 1 mlslrvplap itdpqqlqls plkglslvdk entppalsgt rvlasktarr ifqeptepkt 61 kaaapgvede pllrenprrf vifpieyhdi wqmykkaeas fwtaeevdls kdiqhweslk 121 peeryfishv laffaasdgi vnenlverfs qevqitearc f^gfqiamen ihsemyslli 181 dtyikdpker ef Ifnaietm pcvkkkadwa lrwigdkeat ygervvaf aa vegif f sgsf 241 asifwlkkrg lmpgltf sne lisrdeglhc dfaclmfkhl vhkpseervr eiiinavrie 3 01 qef ltealpv kligmnctlm kqyiefvadr lmlelgf skv f rvenpfdfm enislegktn 361 ffekrvge^q rmgvmsspte nsftldadf (序列編號 1) hRRM2 核酸序歹丨J(GenBank Accession No. NM 一001034 ;序列編號 43)

1 cccaggcgca gccaatggga agggtcggag gcatggcaca gccaatggga agggccgggg 61 caccaaagcc aatgggaagg gccgggagcg cgcggcgcgg gagatttaaa ggctgctgga 121 gtgaggggtc gcccgtgcac cctgtcccag ccgtcctgtc ctggctgctc gctctgcttc 181 gctgcgcctc cactatgctc tccctccgtg tcccgctcgc gcccatcacg gacccgcagc 241 agctgcagct ctcgccgctg aaggggctca gcttggtcga caaggagaac acgccgccgg 301 ccctgagcgg gacccgcgtc ctggccagca agaccgcgag gaggatcttc caggagccca 361 cggagccgaa aactaaagca gctgcccccg gcgtggagga tgagccgctg ctgagagaaa 421 acccccgccg ctttgtcatc ttccccatcg agtaccatga tatctggcag atgtataaga 481 aggcagaggc ttccttttgg accgccgagg aggttgacct ctccaaggac attcagcact 541 gggaatccct gaaacccgag gagagatatt ttatatccca tgttctggct ttctttgcag 601 caagcgatgg catagtaaat gaaaacttgg tggagcgatt tagccaagaa gttcagatta 661 cagaagcccg ctgtttctat ggcttccaaa ttgccatgga aaacatacat tctgaaatgt 721 atagtcttct tattgacact tacataaaag atcccaaaga aagggaattt ctcttcaatg 781 ccattgaaac gatgccttgt gtcaagaaga aggcagactg ggccttgcgc tggattgggg 4 200535142

841 acaaagaggc tacctatggt gaacgtgttg taqcctttgc tgcagtggaa ggcattttct 901 tttccggttc ttttgcgtcg atattctggc tcaagaaacg aggactgatg cctggcctca 961 cattttctaa tgaacttatt agcagagatg agggtttaca ctgtgatttt gcttgcctga 1021 tgttcaaaca cctggtacac aaaccatcgg aggagagagt aagagaaata attatcaatg 1081 ctgttcggat agaacaggag ttcctcactg aggccttgcc tgtgaagctc attgggatga 1141 attgcactct aatgaagcaa tacattgagt ttgtggcaga cagacttatg ctggaactgg 1201 gttttagcaa ggttttcaga gtagagaacc catttgactt tatggagaat atttcactgg 1261 aaggaaagac taacttcttt gagaagagag taggcgagta tcagaggatg ggagtgatgt 1321 caagtccaac agagaattct tttaccttgg atgctgactt ctaaatgaac tgaagatgtg 1381 cccttacttg gctgattttt tttttccatc tcataagaaa aatcagctga agtgttacca 1441 actagccaca ccatgaattg tccgtaatgt tcattaacag catctttaaa actgtgtagc 1501 tacctcacaa ccagtcctgt ctgtttatag tgctggtagt atcacctttt gccagaaggc 1561 ctggctggct gtgacttacc atagcagtga caatggcagt cttggcttta aagtgagggg 1621 tgacccttta gtgagcttag cacagcggga ttaaacagtc ctttaaccag cacagccagt 1681 taaaagatgc agcctcactg cttcaacgca gattttaatg tttacttaaa tataaacctg 1741 gcactttaca aacaaataaa cattgttttg tactcacggc ggcgataata gcttgattta 1801 tttggtttct acaccaaata cattctcctg accactaatg ggagccaatt cacaattcac 1861 taagtgacta aagtaagtta aacttgtgta gactaagcat gtaattttta agttttattt 1921 taatgaatta aaatatttgt taaccaactt taaagtcagt cctgtgtata cctagatatt 1981 agtcagttgg tgccagatag aagacaggtt gtgtttttat cctgtggctt gtgtagtgtc 2041 ctgggattct ctgccccctc tgagtagagt gttgtgggat aaaggaatct ctcagggcaa 2101 ggagcttctt aagttaaatc actagaaatt taggggtgat ctgggccttc atatgtgtga 2161 gaagccgttt cattttattt ctcactgtat tttcctcaac gtctggttga tgagaaaaaa 2221 ttcttgaaga gttttcatat gtgggagcta aggtagtatt gtaaaatttc aagtcatcct 2281 taaacaaaat gatccaccta agatcttgcc cctgttaagt ggtgaaatca actagaggtg 2341 gttcctacaa gttgttcatt ctagttttgt ttggtgtaag taggttgtgt gagttaattc 2401 atttatattt actatgtctg ttaaatcaga aattttttat tatctatgtt cttctagatt 2461 ttacctgtag ttcataaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa (序歹編號 43)

p53R2 聚胜肽序列（GenBank Accession No· NP—056528 ;序列編號 5) 1 mgdperpeaa gldqdersss dtneseiksn eepllrkssr rfvifpiqyp diwkmykqaq 61 asfwtaeevd lskdlphwnk lkadekyfis hilaf faasd givnenlver fsqevqvpea 121 rcfygfqili envhsemysl lidtyirdpk kref lfnaie tmpyvkkkad walrwiadrk 181 stfgervvaf aavegvf fsg sfaaifwlkk rglmpgltf s nelisrdegl 乜cdfaclmfq 241 ylvnkpseer vreiivdavk ieqef lteal pvgligmnci lmkqyiefva drllvelgf s 301 kvfqaenpfd fmenislegk tnffekrvse ^qrfavmaet tdnvftldad f (序歹丨J 編號15) p53R2核酸序列（GenBankAccessionNo·NM_015713;序列編號44) 5 200535142 1 ggctggccga agttaggcgg agccccgagg cgggggaggc ggggccgggc cggcgcaggg 61 agagtcactc aatggacagg cgagaaagca ggaccggcgc ggcggggcgg ggccggccga 121 gtccctagag ctgggggcgg ggcggaccca gcggaccagc ggaccacctg ggtgctgtcg 181 tagttggagg tggcctgagg agctcagttc cctcagcgcc cgtagcttcg gcggagtctg 241 cgcgatgggc gacccggaaa ggccggaagc ggccgggctg gatcaggatg agagatcatc 3 01 ttcagacacc aacgaaagtg aaataaagtc aaatgaagag ccactcctaa gaaagagttc 361 tcgccggttt gtcatctttc caatccagta ccctgatatt tggaaaatgt ataaacaggc 421 acaggcttcc ttctggacag cagaagaggt cgacttatca aaggatctcc ctcactggaa 481 caagcttaaa gcagatgaga agtacttcat ctctcacatc ttagcctttt ttgcagccag 541 tgatggaatt gtaaatgaaa atttggtgga gcgctttagt caggaggtgc aggttccaga 601 ggctcgctgt ttctatggct ttcaaattct catcgagaat gttcactcag agatgtacag 661 tttgctgata gacacttaca tcagagatcc caagaaaagg gaatttttat ttaatgcaat 721 tgaaaccatg ccctatgtta agaaaaaagc agattgggcc ttgcgatgga tagcagatag 781 aaaatctact tttggggaaa gagtggtggc ctttgctgct gtagaaggag ttttcttctc 841 aggatctttt gctgctatat tctggctaaa gaagagaggt cttatgccag gactcacttt 901 ttccaatgaa ctcatcagca gagatgaagg acttcactgt gactttgctt gcctgatgtt 961 ccaatactta gtaaataagc cttcagaaga aagggtcagg gagatcattg ttgatgctgt 1021 caaaattgag caggagtttt taacagaagc cttgccagtt ggcctcattg gaatgaattg 1081 cattttgatg aaacagtaca ttgagtttgt agctgacaga ttacttgtgg aacttggatt 1141 ctcaaaggtt tttcaggcag aaaatccttt tgattttatg gaaaacattt ctttagaagg 1201 aaaaacaaat ttctttgaga aacgagtttc agagtatcag cgttttgcag ttatggcaga 1261 aaccacagat aacgtcttca ccttggatgc agatttttaa aaaacctctc gttttaaaac 1321 tctataaact tgtcattggt aaatagtagt ctattttcct ctgcttaaaa aaaattttaa 1381 gtatatcctt taaaggactg ggggtttgct caaaaggaaa tccaaaacct attctaaaca 1441 atttgcattt atataatttt cctgtttaac aacaagagtg tgacctaaat gcttttgtct 1501 tgtcactgaa ataaaagatg gcattatgtg gttaagagca tggggcgagg ggtcagacat 1561 gagtctaagg ttctgccctt actccagtgt gtgacccttg gcaagtcagt taatcttggt 1621 aaacctcggt gtacttatct ttaaaatggg agtaatagta ggtcctaaat tcatagagtg 1681 gatattagga ttaggatgca aaaataaatg cttaaccaac actactactg ttagcaccac 1741 tactaattat cattcattga taatattaat tgcaatgatg ttgtaataaa atactctcat 1801 ttccttaaaa taattgtgat tctaggtcct aggatctaga attagatctt tgtattttta 1861 atgcttaggg gaagaatata agtatctcct taaaaagaac ataattctca ttcacgcaag 1921 aataagttct ttgaattcct tagtatgtag tgaagaaaat ttagttgtta gttgctttgg 1981 gaagcctact tatggagtgg aaaccaggag gttatcatgg tagttgacct tataagaaaa 2041 atgattcttc ttcagaaatt aaaaacataa ctattgccag atttagctct ggaatgttta 2101 gaatcaggct agaatagcat tttccaaaga atattctaag agctattagc tcctctagat 2161 atttttttgg gggaaaaagg ggattctgtg gtcagatgag tttgggaaat gctgaacact 2221 tcattcttct ttagcaagta cagtcagtac atcaaagact gagcagttca gtggtacata 2281 aatttatctc gccctgcata ttcccaacat acttaacaca gatgtttttt acctgttaac 2341 atctcaccca gctagtgttc ctcagaacaa agattggaaa aagctggccg agaaccattt 2401 atacatagag gaagggctta tggactgaga aagggagaac atggtaggga ttattgaatc 2461 atttcaaatt tataccagcc tgaatagtgt accagcaatt gacttaggct gtgtttcttt 6 2521 atggttttaa aactcttgag ctgttataag agatagttct tttaatgtga ctatgcaaca 2581 tgatagccaa tggtgaggga aaaggaggtt tctctagaag agtctgatga aaggccggga 2641 accaaggttt ttgagaagtc tgcccctatt tatttttagt aagtatcaag aggtagcctg 2701 agcctagtta gagttagacc tgtctttgga tgaagaagtc ttaatactga aatactgaat 2761 ttttaataca ttattatttg gtattctgta taccccttca agcagttgtt tcccattccc 2821 aacaaactgt actttataca attctggatg ctaaaactta gagattttct ctttgcataa 2881 attttggctc cattctttcc ataacaatct aatcaaaact gggagttctc aagtgaatgc 2941 aaaaggagca ggccataact ttatttgtta gatacactgt cagaaacttg agatcttttg 3001 gcctatgata ataccattaa tttttgcatt gcttcagttt gccaagtgtt tttacatcat 3061 ctcatttgat ctcaaaacag cttgacagag caactgttat tgaaatatta cagatggaaa 3121 gaatgaggct cagggaagtt aaatgacttg gccaagatct gctcatcgtc actgtctgta 3181 cagtattttt ttttagaggt tgtaatgtct cagatttagt cctttaccat ctatgttgat 3241 ttgcttttgt ctatttcctc attaattgaa tatactttaa atatatatat taaagtatca 3301 aaatatagag agacatttga actgtattca ggtaatatgt ttaaagatat ttatatattg 3361 ccatacaaaa acttaacatt taaaactgat aatatctgta atgacatcag aatgaaagaa 3421 aaaaaattgt acagtgtata ttcctttgtt ttgaatccaa atctttttca taggtaatga 3481 cagatgcctt aatgtgaagc ttatttataa tagcaataaa cctaactgga tttggatgaa 3541 gaagtcttaa tactgacata ctggattttt aatgcactgg tttgttattt ggtattctat 3601 ctctttttcc aggcctccag gttgcacatt tatttattat gttcaatact ttggttctta 3661 gttcttaaag aatcaagaag ttgtgtaatc ttttaaaaat attatcttgc agataaagaa 3721 aaaaattaag agtgtgttta caactgtttt ctctttttta cagtacatgt atttaaatca 3781 ttgctataat aaagttaagt tcattaggaa tataaaaact tgcagttcta tgatagattg 3841 catttattaa aaatgtttca ttgtatcaca tagaaatatg gccaggaagg acttgagaag 3901 acagtttgat ccattgcttt tagacaggac tgggttttgc tgtccaatta tatacaataa 3961 tagtttttct tacaactaag ctggccccag ccttgtcttg atattaatac atgaaatttt 4021 tataattgtc tcattgtctc atttagaaac atccatattt ttctgctttt tctattgcca 4081 ttttttattt gtgcatgaat tgattattga gaaaatgtag cagtttgcat atttaaaaat 4141 taatcatttt gcattttaca tttaaatatg ctaacatcac tgtcatagaa ttcccaaatt 4201 tcatttgtag atactgaact aagggctaat gtcaggagct gatttttaat gataaagctg 4261 cagatgggct aaataaaagc caaattaatc ctacaatcag gtattatgtt tttaaaccaa 4321 gttgagtgaa ttggtagtgg acttgggaaa tcttccccag cagaatctgg atgaatggca 4381 cagaattgaa atctctttgt ttcccaccat ttccctttaa gtgctctgct cctttgtaaa 4441 aagttaaaga tttgaaagag aatctcatat tcccgaggca ttaggaagaa aggatttaat 4501 cccttcaatt tggggcttaa tcttgtttaa aaaaatgtaa gtgaagatgg aaggctggag 4561 agaatgattg ctttttgtac agttaaataa ggtcacaata ttcttacata ctttgtttta 4621 caactgtgtt ttcatttttt caaatgtctg gccatttagc aaagttattt actatttact 4681 gtgtacatag aaagctttat tatgtgtggt gtatctaaat tttttttgct gaaatacatt 4741 atggtcaatc aagccaagcc tgcatgtaca gaatttgttt ttttttcaaa taaattagtt 4801 gttttcttat ttttttggct tagtatgttg aaataaacta tggtatcttc atcattttgt 4861 acatttcctt tttgaggaag gtttctttat aagtgcaagg gctaccctaa taaaggaatg 4921 tatatactta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa (序歹 j 編號 44) 200535142 11尺11]\41聚胜肽序歹丨](〇€118&11]<:八(^551〇111^〇.816680;序歹丨[編號29)

1 mhvikrdgrq ervmf dkits riqklcygln mdfvdpaqit mkviqglysg vttveldtla 61 aetaatlttk hpdyailaar iavsnlhket kkvf sdvmed lynyinphng khspmvakst 121 ldivlankdr lnsaiiydrd f synyfgfkt lersyllkin gkvaerpqhm lmrvsvgihk 181 edidaaiety nllserwf th asptlfnagt nrpqlsscf 1 lsmkddsieg iydtlkqcal 241 isksaggigv avsciratgs yiagtngnsn glvpmlrvyn ntaryvdqgg nkrpgaf aiy 301 lepwhldife f ldlkkntgk eeqrardlf f alwipdlfmk rvetnqdwsl mcpnecpgld 361 evwgeefekl yasyekqgrv rkvvkaqqlw yaiiesqtet gtpymlykds cnrksnqqnl 421 gtikcsnlct eiveytskde vavcnlasla lnmyvtseht ydfkklaevt kvvvrnlnki 481 idinyypvpe aclsnkrhrp igigvqglad afilmrypfe saeaqllnkq ifetiyygal 541 eascdlakeq gpyetyegsp vskgilqydm wnvtptdlwd wkvlkekiak ygirnsllia 601 pmptastaqi lgnnesiepy tsniytrrvl sgefqivnph llkdltergl wheemknqii 661 acngsiqsip eipddlkqly ktvweisqkt vlkmaaerga f idqsqslni hiaepnygkl 721 tsmhfygwkq glktgmyylr trpaanpiqf tlnkeklkdk ekvskeeeek erntaamvcs 781 lenrdeclmc gs (序列編號 29) hRRMl 核酸序歹丨J(GenBank Accession No. NM—001033 ;序列編號 45) 1 attcgaaccc cgtcgcgccc ctttgtgcgt cacgggtggc gggcgcggga aggggatttg 61 gattgttgcg cctctgctct gaagaaagtg ctgtctggct ccaactccag ttctttcccc 121 tgagcagcgc ctggaaccta acccttccca ctctgtcacc ttctcgatcc cgccggcgct 181 ttagagccgc agtccagtct tggatccttc agagcctcag ccactagctg cgatgcatgt 241 gatcaagcga gatggccgcc aagaacgagt catgtttgac aaaattacat ctcgaatcca 301 gaagctttgt tatggactca atatggattt tgttgatcct gctcagatca ccatgaaagt 361 aatccaaggc ttgtacagtg gggtcaccac agtggaacta gatactttgg ctgctgaaac 421 agctgcaacc ttgactacta agcaccctga ctatgctatc ctggcagcca ggatcgctgt 481 ctctaacttg cacaaagaaa caaagaaagt gttcagtgat gtgatggaag acctctataa 541 ctacataaat ccacataatg gcaaacactc tcccatggtg gccaagtcaa cattggatat 601 tgttctggcc aataaagatc gcctgaattc tgctattatc tatgaccgag atttctctta 661 caattacttc ggctttaaga cgctagagcg gtcttatttg ttgaagatca atggaaaagt 721 ggctgaaaga ccacaacata tgttgatgag agtatctgtt gggatccaca aagaagacat 781 tgatgcagca attgaaacat ataatcttct ttctgagagg tggtttactc atgcttcgcc 841 cactctcttc aatgctggta ccaaccgccc acaactttct agctgttttc ttctgagtat 901 gaaagatgac agcattgaag gcatttatga cactctaaag caatgtgcat tgatttctaa 961 gtctgctgga ggaattggtg ttgctgtgag ttgtattcgg gctactggca gctacattgc 1021 tgggactaat ggcaattcca atggccttgt accgatgctg agagtatata acaacacagc 1081 tagatatgtg gatcaaggtg ggaacaagcg tcctggggca tttgctattt acctggagcc 1141 ttggcattta gacatctttg aattccttga tttaaagaag aacacaggaa aggaagagca 12 01 gcgtgccaga gatcttttct ttgctctttg gattccggat ctcttcatga aacgagtgga 1261 gactaatcag gactggtctt tgatgtgtcc aaatgagtgt cctggtctgg atgaggtttg 1321 gggagaggaa tttgagaaac tatatgcaag ttatgagaaa caaggtcgtg tccgcaaagt 8 200535142

1381 tgtaaaagct cagcagcttt ggtatgccat cattgagtct cagacggaaa caggcacccc 1441 gtatatgctc tacaaagatt cctgtaatcg aaagagcaac cagcagaacc tgggaaccat 1501 caaatgcagc aacctgtgca cagaaatagt ggagtacacc agcaaagatg aggttgctgt 1561 ttgtaatttg gcttccctgg ccctgaatat gtatgtcaca tcagaacaca catacgactt 1621 taagaagttg gctgaagtca ctaaagtcgt tgtccgaaac ttgaataaaa ttattgatat 1681 aaactactat cctgtaccag aggcatgcct atcaaataaa cgccatcgcc ccattggaat 1741 tggggtacaa ggtctggcag atgcttttat cctgatgaga tacccttttg agagtgcaga 1801 agcccagtta ctgaataagc agatctttga aactatttat tatggtgctc tggaagccag 1861 ctgtgacctt gccaaggagc agggcccata cgaaacctat gagggctctc cagttagcaa 1921 aggaattctt cagtatgata tgtggaatgt tactcctaca gacctatggg actggaaggt 1981 tctcaaggag aagattgcaa agtatggtat aagaaacagt ttacttattg ccccgatgcc 2041 tacagcttcc actgctcaga tcctggggaa taatgagtcc attgaacctt acaccagcaa 2101 catctatact cgcagagtct tgtcaggaga atttcagatt gtaaatcctc acttattgaa 2161 agatcttacc gagcggggcc tatggcatga agagatgaaa aaccagatta ttgcatgcaa 2221 tggctctatt cagagcatac cagaaattcc tgatgacctg aagcaacttt ataaaactgt 22 81 gtgggaaatc tctcagaaaa ctgttctcaa gatggcagct gagagaggtg ctttcattga 2341 tcaaagccaa tctttgaaca tccacattgc tgagcctaac tatggcaaac tcactagtat 2401 gcacttctac ggctggaagc agggtttgaa gactgggatg tattatttaa ggacaagacc 2461 agcagctaat ccaatccagt tcactctaaa taaggagaag ctaaaagata aagaaaaggt 2521 atcaaaagag gaagaagaga aggagaggaa cacagcagcc atggtgtgct ctttggagaa 2581 tagagatgaa tgtctgatgt gtggatcctg aggaaagact tggaagagac cagcatgtct 2641 tcagtagcca aactacttct tgagcataga taggtatagt gggtttgctt gaggtggtaa 2701 ggctttgctg gaccctgttg caggcaaaag gagtaattga tttaaagtac tgttaatgat 2761 gttaatgatt tttttttaaa ctcatatatt gggattttca ccaaaataat gcttttgaaa 2821 aaaagaaaaa aaaaacggat atattgagaa tcaaagtaga agttttagga atgcaaaata 2881 agtcatcttg catacaggga gtggttaagt aaggtttcat cacccattta gcatgctttt 2941 ctgaagactt cagttttgtt aaggagattt agttttactg ctttgactgg tgggtctcta 3001 gaagcaaaac tgagtgataa ctcatgagaa gtactgatag gacctttatc tggatatggt 3061 cctataggtt attctgaaat aaagataaac atttctaagt gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa (序列編號24) 如上所示之核酸序列中，標示底線的部分為編碼序列 (coding sequence)，即，基因庫序號NM一001 034(序列編號 2)中第 195 至 1 364 個核苷酸（nts);基因庫序號 NM_01 5713(序列編號16)中第245至1 300個核苷酸（nts); 以及基因庫序號 NM_00 1 03 3(序列編號：30)中第 233至 2 6 1 1個核苷酸。 9 200535142

本發明之特徵在於一種已分離的聚胜肽，其包含 hRRM2聚胜肽（序列編號：；[)或p53R2聚胜肽（序列編號15) 之免疫片段。該片段係該序列編號1中橫跨（span)胺基酸 殘基Y162或Y369之片段，或是該序列編號15中橫跨胺 基酸殘基Y1 24或Y331之片段（參閱該序列編號1或15中 之底線部分）。該片段之長度至少為1 0個胺基酸殘基，即， 任何⑴該序列編號1中，長度介於9至3 89個胺基酸殘基 之間，但不包括9與3 89在内之片段，或（ii)該序列編號 15中’長度介於9至351個胺基酸殘基之間，但不包括9 與351在内之任意長度片段。也就是，該聚胜肽並不包含 序列編號1或1 5之全長序列。在一範例中，該片段包含該 序列編號 1 中從 Y162 至 Y176 之序列（即， YGFQIAMENIHSEMY ;序列編號31)，或包含該序列編號 1 中 從 Aspl38 至 His269 之序列（即 ， DGIVNENLVERFSQEVQITEARCFYGFQIAMENIHSEMYSL LIDTYIKDPKEREFLFNAIETMPCVKKKADWALRWIGDKEA TYGERVVAFAAVEGIFFSGSFASIFWLKKRGLMPGLTFSNEL

ISRDEGLH ;序歹ij編號35)。在另一範例中，該片段包含序 列編號 15 中從 Y124 至 Y138 之序列（即， YGFQILIENVHSEMY ;序列編號33)，或包含序列編號15 中從 AsplOO 至 His231 之序歹J (即，DGIVNENLVERFSQEVQ VPEARCFYGFQILIENVHSEMYSLLIDTYIRDPKKREFLFNA IETMP YVKKKAD WALRWIADRKSTFGERV VAFAAVEGVFFS 10 200535142 GSFAAIFWLKKRGLMPGLTFSNELISRDEGLH ；序歹J 編號 37) °

一「已分離的聚胜肽（isolated polypeptide)」係指實 質上不含其多種天然結合分子的一聚胜肽，例如，該聚胜 肽在乾重下至少有7 5 %的純度（即，介於7 5 %至1 〇 〇 %之間 的任意值，包括75%與100%)。可利用任何適當的標準方 法來測量純度（purity)，例如管柱色層分析法（column chromatography)、聚丙婦醢胺凝膠電泳法（polyacrylamide gel electrophoresis)或高效液相層析法（HPLC)等。可從天 然來源或由重組DNA技術或化學方法所製造出的來源中 分離出本發明之已分離聚胜肽，其中從該天然來源所分離 出來的係野生種聚胜肽。 本發明特徵亦在於一種含有該序列編號1或1 5之突變 種片段的已分離聚胜肽。在該突變種片段中，除了其所包 含的該序列編號1片段中第162或369位置上的胺基酸殘 基’或所包含的該序列編號i 5片段中第124或3 3 1胺基酸 殘基並非酪胺酸以外，該突變種片段係與橫跨該序列編號 1中胺基酸殘基Y162或Υ369之片段，或是橫跨該序列編 號15中胺基酸殘基Υ124或Υ331之片段完全相同。非酪 胺酸殘基之範例可包括苯丙胺酸（phenylalanine)與色胺酸 (tfyptophan)。該野生種片段之長度至少為1〇個胺基酸殘 基’即’任何長度介於1 0至3 8 9 (該序列編號1之序列長 度）之間（包括1 〇與3 8 9在内）之序列編號1的野生種片段， 11 200535142

或任何長度介於1 〇至3 5 1 (該序列編號1 5之序列長度）之 間（包括1 〇與3 5 1在内）之序列編號1 5的野生種片段。或 者，該已分離聚胜肽可為該序列編號1或1 5之全長序列的 突變種。在一實施例中，該野生片段包含上述序列編號3 1 或3 3。在另一實施例中，該野生種片段包含序列編號3 5、 序列編號3 7、序列編號1中Y162至Y3 69之序列（即，序 列編號3 9)、或序列編號1 5中Y1 24至Y3 3 1之序列（即， 序列編號 4 1 )。在又一實施例中，該聚胜肽包含該序列編 號1或1 5全長的一突變種，其中該序列編號1之Y162或 該序列編號 15之 Y124被突變成苯丙胺酸（F)或色胺酸 (W)。整理並顯示於下表中之序列係代表性的全長突變 種。部分之該些突變種包含一第二突變位置，也就是該序 列編號1中的Y167突變成F或W(即，表中的序列編號7、 9、1 1與13 )，或是該序列編號1 5中的Y1 3 8突變成F或 W(即，表中的序列編號21、23、25與27)。除了以苯丙胺 酸（TTT)或色胺酸（TGG)之譯碼來取代上述酪胺酸（TAT)之 譯碼外，該些片段可被編譯成該序列編號1或1 5中相對應 的編碼區。 12 200535142 H468101214182022242628 號核 編 列 序肽 胜 35791113171921232527 聚 全長突變種

hRPM2 Y162F hRPM2 Y162W hRPM2 Y162F/Y176F hRPM2 Y162F/Y176W hRPM2 Y162W/Y176F hRPM2 Y162W/Y176W p53R2 Y124F p53R2 Y124W p53R2 Y124F/Y138F p53R2 Y124F/Y138W p53R2 Y124W/Y138F p53R2 Y124W/Y138W 本發明之另一方向在於一種含有一段編碼著其中一種 上述免疫片段序列或其互補序列的已分離核酸。示範之該 核酸包括基因庫序號 NM_00 1 034或 NM — 015713之編碼 區，其編譯著序列編號3 1、3 3、3 5、3 7、3 9與4 1 (即，分 別為序列編號32、34、36、38、40與42)。本發明特徵亦 在於一種在含有一段編譯著其中一種上述突變種片段序列 或其互補序列的已分離核酸。在該些突變種核酸中，對應 至序列編號1之Y162或Y3 69、或對應至序列編號15之 Y 1 24或Y3 3 1的酪胺酸譯碼『TAT』係被取代成一個非酪 胺酸譯碼，例如苯丙胺酸譯碼（如，τ T T)或色胺酸譯碼（如， TGG)。

一 「核酸（n u c 1 e i c a c i d)」係指一 D N A 分子（例如一 cDNA或基因體DNA)、一 RNA分子（例如一 mRNA)、或 一 DNA或RNA類似物。可由核苷酸類似物來合成出一 DNA 13 200535142 或RNA類似物。該核酸分子可為單股或雙股dna，但以 MDNAw —「e^_„(is〇iatednucieicacid)」

係指一種其結構與天然核酸或任一天然基因體核酸片段之 結構不同的核酸。因此，該用詞係涵蓋如：（a)—種dna， 其具有一天然基因體DNA分子的部份序列，但位在該dna 兩側之序列並非其原來存在於有機生物基因體中的兩側序 列，（b)整合至一載體或一原核或真核生物之基因體 中的-…且所產生的分子不同於任何天然載體或基因 體DNA ; (c)—種分離分子，如一 cDna、一基因體片段、 一利用聚合酶鏈鎖反應（PCR)所產生的片段、或一限制片 段（restriction fragment);以及（d)—重組核苷酸序列其 係一雜合基因（hybrid gene，也就是序列上編碼有一融合蛋 白之基因）中的一部分。上述核酸可用來表現本發明之聚胜 肽。為達成此目標，可使該核酸可操作性地與一適當的調 控序列（regulatory sequence)相連接，以產生一表現載體。 一「載體（vector )」係指一種核酸分子，其能傳送已 與之連接的另一核酸。該載體具有自行複製或整合至一宿 主DNA中的能力。示範之載體包括一質體（plasmid)、黏接 質體（cosmid)或病毒載體。該載體包括一核酸，且其係以 適合用來在一宿主細胞中表現該核酸的形式存在於該载體 中。較佳係使該載體包含一或多個調控序列，且該些調控 序列可操作性地連接至欲表現的該核酸序列。一 r調控序 列（regulatory sequences)」係包含啟動子（promoters)、促 14 200535142

進子（enhancer)及其他表現控制區，例如聚腺普酸信號 (polyadenylation signals)等。調控序列包括該些月匕引導如 組織特異性調控及/或誘導序列等核苷酸序列的怪常性表 現（constitutive expression)。可根據如欲進行轉型之宿主 細胞的選擇、想要的蛋白或RNA表現量及其他因素來設計 該表現載體。並可使該表現載體進入宿主細胞中，以表現 一種本發明之聚胜肽。本發明之範圍亦涵蓋一種包含上述 核酸的宿主細胞。示範之該些細胞包括大腸桿菌細胞（E · coli cell)、昆蟲細胞（例如使用桿狀病毒表現載體時）、酵 母細胞（y e a s t c e 11)或哺乳動物細胞（m a m m a 1 i a n c e 11)(例如 可參考 Goeddel，(1 990) Gene Expression Technology:

Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego, CA)。為製造出本發明之聚胜肽，其中一種方法係在允許 表現本發明核酸所編碼之聚胜肽的條件下，將一宿主細胞 培養在一培養基（medium)中，並從該培養細胞或該細胞之 培養基中純化出該聚胜肽。或利用如T7啟動子調控序列 及T 7聚合酶，來進行本發明之核酸序列的體外（丨n v丨t『〇) 轉錄及轉譯作用。本發明之聚胜肽可用來鑑定一種可抑制 RNR酵素活性的化合物。由於rNr會調控細胞生長，因 此上述化合物可能作為一種治療細胞增殖相關疾病（如癌 症）的藥物。該方法包括使一化合物與一發明之聚胜肽接 觸’且若該化合物與該聚胜肽之間有任何結合作用，則測 定該結合作用。所出現之該結合作用係表示該化合物可能 15 200535142 是一種能抑制該RNR酵素活性的候選化合物。該化合物可 能是一小有機分子、一小無機分子、一寡聚核苷酸、一胜 肽、一蛋白或一碳水化合物。該「小有機分子（small organic m ο 1 e c u 1 e)」係指除了寡聚核苷酸、胜肽或碳水化合物之外 的小有機分子。

一本發明之聚胜肽或是核酸可用來產生一種專一性抗 體，其能專一性地與一 RNR次單元結合。特別是可藉著將 該聚胜肽或核酸提供給一非人類之動物，以產生該些抗 體。因此，本發明範圍涵蓋一種免疫組合物，其包含一種 上述該些聚胜肽或核酸及一藥學上可接受載體。該組合物 可用來在人體或非人類之動物體内產生多株抗體 (polyclonal antibodies)。可以標準技術來產生多株抗體。 該些能專一性地與 RNR結合並抑制其活性的抗體亦可能 是用來治療一細胞增殖相關疾病的候選藥物。本發明又一 方向在於一種重組 RNR 二聚體（reconstituted dimeric RNR)。該重組RNR包含一個具有一第一天然RNR次單元 序列之第一純化聚胜肽，以及一個具有一第二天然RNR次 單元序列之第二純化聚胜肽。該第一次單元可為一大次單 元，即，R1次單元。該第二次單元可為一小次單元，即， R2或p5 3R2次單元。一重組人類RNR二聚體可用來鑑定 一種治療一細胞增殖相關疾病的化合物。該方法包括使一 化合物與一重組RNR二聚體反應，並偵測該RNR活性強 度。若有該化合物存在時的RNR活性，低於沒有該化合物 16 200535142 存且以相同方法所測得之RNR活性時，判斷該化合物具有 治療該細胞增殖相關疾病的效果。本發明範圍還涵蓋一種 RNA ’或在序列上編碼著該RNA序列的DNA，其可用來 抑制在序列上編碼著序列編號1或1 5之基因的表現。該 RNA包含一第一核苷酸序列與一第二核苷酸序列，該第一 核芽8文此在嚴苛的條件下與上述基因雜合，以及該第二核 普酸序列與該第一核酸序列互補且可與該第一核酸序列雜 s以^/成 雙股結構。該用詞「嚴苛條件（stringent c ο n d i t i ο n s )」係指在6倍濃度之氯化納/檸檬酸納溶液 (sodium chloride/sodium citrate，6x SSC)中及 45 °C 下進行 雜合反應，隨後以含有0.1%SDS之0.2倍的SSC溶液在 5 0至6 5 °C下清洗一次或數次。該第一核苷酸序列與該第二 核苷酸序列可位在同一條股鏈上，或分別位在兩條不同的 股鏈上以形成一雙股RNA。為求能更有效地抑制一基因表 現’該第一核苷酸序列之長度至少為丨9個核苷酸，例如長 度為19至29個核苦酸（nts) 本發明之一或多個較佳實施例之細節係以下述内容詳 述如下。並可由該敘述内容及申請專利範圍來瞭解本發明 之其他特徵、目的與優點。 【實施方式】 本發明係有關於hRRM2與P53R2蛋白中的多個胺基 酸殘基。包括兩個酪胺酸殘基在内之該些胺基酸殘基，係 17 200535142 參與在對於RNR酵素活性來說為必要之穩定自由基的生 成反應中。 目如已知蛋白貝自由基（pr〇tein free radicals)為RNR 之酵素活性的必要因子（Reichard et al., 1983，Science 221，514-9; Jordan et al·，1 998，Annu. Rev. Biochem. 67,

71-98; and Henriksen et al.5 1 994, J. Am. Chem. Soc. 116, 97 73-97 74)。各種的rnrs可根據其所需要之主要自由基 而分成二類· I、II 及 III 類（Reichard，1993，Science 260, 1 7 73-7)。在原核生物、真核生物與病毒中可發現到的第i 類RNR係一蛋白複合體（pr〇tein complex)，其特徵在於具 有兩個同源二聚體（homodimer)，R1與R2。每個R1大次 单元含有一^個配位體結合催化位置（ligand binding catalytic site)與一個調節專一性位置（reglliatory specificity site)，而每個R2小次單元則會提供自由基（free radical)。主要發現在細菌中的第二類RNR則含有一個短 暫出現的 5-去乳腺音酸自由基（transient 5’-deoxyadenosyl radical)。發現於厭氧細菌中的第三類 RNR則包藏著一個穩定的甘胺酸自由基（F〇ntecaVe et al.， 2002，Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 72，95- 1 27) 〇 通常係以大腸桿菌（R_ coli)之RNR來作為第i類酵素 的模型系統。曾發現每個大腸桿菌的R2次單元僅在Tyrl22 的位置上具有一個穩定的酪胺酸自由基（其係相對應於小 鼠類似物上之的Tyrl77)。此自由基「洞（hole)」會通過一 個長程的質子耦合電子傳遞路徑（long_range 18 200535142 proton-coupled electron-transfer)而傳遞至該 Ri 催化位置 上（Zhou et al·, 2003，Cancer Res.63，65 83-94; Shao et al.， 2004，Cancer Res. 64，1-6; and Larsson et al.，1 986, Embo J. 5，2037-40) °

如下列第二實施例所示，hRRM2或p53R2各自具有兩 個酪胺酸殘基（在hRRM2中為Tyrl 76與Tyr 1 62，在p53R2 中為Tyrl 3 8與Tyr 1 2 4)，該兩酪胺酸殘基係位在鄰近且分 置於一雙鐵原子團（d i - i r ο n c 1 u s t e r )之相反兩側處。然出乎 意料的是，該兩酪胺酸自由基（而非單只一個）對人類RNR 小次單元hRRM2與p53R2而言是必要的。在同一實施例 中更顯示出，位在該雙鐵原子團外側的酪胺酸（即，序列編 號1之Y3 6 9或序列編號1 5之Y3 3 1)對RNR活性來說亦是 必要的。一個含有缺乏其中一個該些必要酪胺酸之突變種 次單元的RNR複合體會實質喪失其RNR活性（例如喪失至 少 5 0 %、7 0 %、8 0 %、9 0 % 或 9 5 % 的 RNR 活性）。 因此，本發明特徵係關於一種已分離的聚胜肽，其包 含：（i) 一段橫跨序列編號1之Y 1 62或橫跨序列編號1 5之 Y 124的免疫片段；或（ii)一段缺乏其中一個上述必要酪胺 酸之序列編號1或1 5的突變種片段或其全長序列。可利用 標準突變技術來產生該突變種聚胜肽，並可利用電子順磁 共振光譜儀（electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy)及如下述實施例中所序述之酵素分析法來分 析之。本發明範圍亦涵蓋該些與上述人類野生種或突變種 聚胜肽相似的非人類哺乳動物類似物。 19 200535142

本發明之聚胜肽可能是一個合成或重組的聚胜肽。可 將一段編碼有該聚胜肽之核酸序列與一個編碼有如麩胱苷 肽硫轉移酶（Glutathione-S-Transferase，GST)、六組胺酸表 位標籤（6x His epitope tag)或 M13 基因 3 蛋白（M13 Gene 3 protein)等融合分子的另一核酸序列結合，以製備出一重組 聚胜肽。所產生的融合核酸可在適當的宿主細胞中表現出 一融合蛋白’並可以多種習知方法分離出該融合蛋白。有 多種宿主表現載體系統（host-expre ssion vector systems)可 供使用。該些宿主表現載體系統包括··微生物（如經重組噬 菌體DNA、質體DNA或黏接質體DNA表現載體轉型的細 菌）、經重組酵母菌表現載體轉型的酵母菌、以及經重組病 毒或質體表現載體轉染的人類細胞株。可利用包括諸如製 備式色層分析法及使用單株或多株抗體的免疫分離法等傳 統方法來分離與純化該些重組聚胜肽或其片段。更可以諸 如酵素剪切來處理該已分離的融合蛋白，以移除該融合分 子，而獲得本發明之重組聚胜肽。 可利用一本發明之聚胜肽在動物（用於抗體製造）或人 類（用於疾病治療）體内產生抗體或其片段。單株或多株抗 體的製造方法在相關領域中係已知技術（例如參閱 Harlow e t al·， 1 988， Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，NY)。「抗體（antibody)」一詞係 包括完整的抗體分子與其片段，例如 Fab、F(ab’）2、Fv、 scFv(單鏈抗體，single-chain antibody)與 dAb(功能區抗 體，domain antibody; Ward et. al·， 1 989 Nature, 341， 20 200535142 5 4 4)。該些抗體可用來偵測一 RNR次單元或用來鑑定能與 該聚胜肽結合的化合物。特別是，該些能專一地與上述用 來形成該雙鐵原子團之必要胳胺酸或其殘基結合的抗體可 能作為一 RNR抑制劑，而對治療一細胞增殖相關疾病有極 大用處。可藉著抗體對上述突變種片段或其野生種類似物 的特異結合來鑑定出對該些酪胺酸具有專一性的抗體。

大致而言，可將一本發明之聚胜肽耦合至一個諸如 KLH 等載體蛋白（carrier protein)，並與一輔劑（a(jjuvant) 混合後注射到一宿主動物體内。隨後可利用胜肽親和色層 分析法（peptide affinity chromatography)來分離出該動物 體内所產生的抗體。常用之宿主動物包括兔子、小鼠、天 竺鼠與大鼠。該些用來提高免疫反應的各種辅劑則根據宿 主種類來加以選擇，且其包括完全與不完全型佛氏佐劑 (complete and incomplete Freund’s adj uvant)、礦物膠（如氫 氧化鋁，aluminum hydroxide)、介面活性劑，例如溶血即 鱗脂（lysolecithin)、普羅尼多元醇（piuronic p〇iy〇is)、聚 陰離子（polyanions)、胜肽、油質乳化物、透孔螺血氰蛋白 (keyhole limpet hemocyanin, KLH)與二硝基酚 (dinitrophenol)。可用的人類輔劑包括卡介疫苗（bcG， bacille Calmette-Guerin)與 小 型 棒 狀 桿 菌 (Corynebacterium parvum)。多株抗體（抗體分子之異質族 群）係出現在該發生免疫反應之實驗目標的血清中。可利用 標準融合瘤技術來製備可抗本發明聚胜肽之單株抗體（抗 體分子之同質族群）（例如參考Kohler et al. ( 1 975) Nature 21 200535142

256，495 ; Kohler et al. ( 1 976) Eur. J. Immunol. 6, 511 i Kohler et al· (1 976) Eur. J. Immunol. 6，292 ;以及 Hammerling et al. (1981) Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.等文獻資料）。特別是，單 株抗體可藉著諸如下述各種技術來獲得，例如：連續細胞 培養之抗體製造方法（Kohler et al· (1975) Nature 256，495 及美國專利案 4，3 7 6，1 1 0號）、人類 B細胞融合瘤技術 (Kosbor et al. ( 1 9 8 3) Immunol Today 4，72 ； Cole et al. ( 1 983) Proc· Natl· Acad· Sci. USA 80，2026)、以及 EBV-融合瘤技術（Cole et al· (1983) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss，Inc., pp. 77-96) 〇 該些抗體 可以是任一型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、 IgD及該些免疫球蛋白的各種亞型（sub-class)。可以體外或 體内培養方式來培養該些能製造本發明之單株抗體的融合 瘤細胞。該融合瘤技術之所以能成為極佳抗體製造方法之 原因，在於其體内（in vivo)製造高單株抗體力價（titer)的能 力。 此外，亦可使用該些係發展用來製造「嵌合抗體 (chimeric antibodies)」的技術（例如參考 Morrison et al. (1 984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 ; Neuberger et al. (1 9 8 4) Nature 312，604 ；以及 Takeda et al. ( 1 984)

Nature 314:452等文獻）。嵌合抗體係一種其分子中具有來 自不同動物之部分的分子，例如，該些分子中具有來自大 鼠單株抗體之變異區（variable region)以及人類免疫球蛋 22 200535142

白之怪疋區（constant region)。或者，該些用來製造單鏈抗 體的技術亦可用來製造單鏈FV抗體的噬菌體庫（phage library)(美國專利案4,946,778與4,7〇4,692號係透過一 胺基S文架橋來連接抗體fv區的長鏈（heaVy chain)與短鏈 (light chain)片段，以形成一單鏈抗體。此外，亦可藉著已 知技術來產生抗體片段。例如，該些片段包括諸如利用胃 蛋白酶（pepsin)剪切一抗體分子所得到F(ab')2片段，以及 藉著還原該F(ab’）2中的雙硫鍵所製造出的Fab片段等。亦 可利用相關領域中的習知方法使該些抗體擬人化 (humanized)。例如，可大量地將具有特定結合專一性的單 株抗體擬人化（Scotgene，Scotland; and Oxford Molecular， Palo Alto，Calif.)。諸如該些表現在基因轉殖動物中的全人 類抗體（fully human antibodies)亦為本發明的特徵之一（參 考諸如 Green et al. (1994) Nature Genetics 7，13 以及美國 專利案5,545,806及5,569,825號等文獻）。 本發明特徵亦包含一種重組RNR蛋白，其係由已純化 的RNR次單元重組而成。如下列第一實施例所顯示，令人 意外的是該重組RNR蛋白仍保有其RNR活性。係將大次 單元與小次單元以一適當比例（例如1 : 1至1 : 3)來混合 後，來重組出該重組RNR蛋白，並可藉著標準方法來評估 其RNR活性。可使用全長的RNR大次單元與小次單元（包 括該些次單元之功能相等物）來重組出活性的重組RNR蛋 白。「功能相等物（functional equivalent)」係指一 RNR蛋 白之大次單元或小次單元的聚胜肽衍生物，例如一個經單 23 200535142 點或多點突變、插入、刪減（deletion)或截除（truiiction)的 蛋白、一融合蛋白或上述分子之組合物。一旦與其他次單 元共同形成一複合體，則所產生的該複合體會表現出野生 種RNR蛋白的活性。

上述聚胜肽與重組RNR蛋白可用來鑑定出能在一無 細胞系統（cell free system)中抑制RNR活性的化合物。依 上述方法所鑑定出的化合物可用於諸如預防及治療一細胞 增殖相關疾病等用途。可利用習知的組合庫方法 (combinatorial library methods)中的任一技術來獲得諸如 蛋白、胜肽、胜肽擬似物（peptidomimetic)、胜肽衍生物 (peptoid，或作甘胺酸胺基取代陽離子寡聚合物）、抗體、 小分子或其他藥物等候選化合物。該些化合物包括：胜肽 庫、胜肽衍生物庫（係指該些具有胜肽功能，但具有無法進 行酵素剪切作用之新型非胜肽骨架結構之分子的組合 庫）、空間定位平行固相或液相合成法（spatially addressable parallel solid phase or solution phase)戶斤得到 之胜肽庫、利用去旋繞（d e c ο η v ο 1 u t i ο η )或親和色層分析篩 選所獲得之合成庫、以及該 「一珠一化合物（one-bead one-compound)」組合庫等（參閱如 Zuckermann et al. 1994, J. Med. Chem. 37:2678-2685 與 Lam, 1 997，Anticancer

Drug Des. 12: 145等文獻）。用來合成該些分子庫的範例方 法可在諸如下述文獻中查知：DeWitt et al·，1993，PNAS USA 90:6909 ； Erb et al., 1994，PNAS USA 9 1:1 1422 ； Zuckermann et al·，1994，J. Med. Chem. 37:2678; Cho et 24 200535142

al·，1 993，Science 26 1:1 303 ； C arrell et al., 1 994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059 ; Carell et al·，1994，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:206 1 ；以及 Gallop et al.，1994 J. Med· Chem. 37:1233。該些化合物庫可存在溶液中（如 Houghten，1992，Biotechniques 13:412-421)或位在珠粒 (Lam，1991，Nature 3 54:82-84)、晶片（Fodor，1 993，Nature 364:555-556)、細菌（美國專利案5,223,409號）、孢子（美國 專利案 5,223,409 號）、質體（Cull et al.，1992，PNAS USA 89:1865-1869)或嗤菌體上（Scott and Smith 1990， Science 249:3 86-390 ; Devlin，1 990，Science 249:404-406 ; Cwirla et al.，1 990，PNAS USA 87:6378-6382; Felici 1991，J. Mol Biol· 222:30卜310 與美國專利案 5,223,409 號）。 鑑定RNR抑制劑的方法之一，係使一候選化合物在一 上述無細胞製備系統中共同反應。隨後評估該化合物與該 聚胜肽之間的結合作用，或比較該化合物存在時以及無該 化合物存在時的無細胞系統之RNR活性。評估RNR活性 的方法係為習知技藝者所熟知。在該無細胞系統中，若該 化合物存在時的RNR活性低於該化合物不存在時的rnr 活性，則判斷該化合物對於預防及治療一細胞增殖相關疾 病有助益。如上所述，一個含有缺乏其中一個該些必要酪 胺酸之突變種次單元的RNR複合體會實質喪失其RNR活 性。因此’根據本發明，一種缺乏其中一個該些必要酿胺 酸的聚胜肽可鹿以顯性抑制的方式（dominant negative manner)來抑制RNR活性。故此種聚胜肽或一序列上編碼 25 200535142 著該聚胜肽的核酸可用來預防或治療一細胞增殖相關疾 病。 一種本發明之 RNA可用來抑制一細胞内的 rnR活 性，而藉以預防或治療一細胞增殖相關疾病。該RNA可透

過 RNA 干擾作用（RNA interference，RNAi)來抑制一 rnR

次單元基因的表現。「RNA干擾（RNAi)」係一種利用雙股 RNA來引導mRNA進行同源序列專一性降解（homologous sequence-specific degradation)的作用 ° 在一哺乳動物細胞 中，可在不需活化該宿主細胞之干擾素應答反應 (interferon response)的情況下，藉著一個長度為21個核苷 酸的雙股小干擾RNA來誘發RNA干擾作用。若此作用能 抑制該細胞中一 RNR次單元基因的表現時，則該小干擾 RNA便可能用來治療一細胞增殖相關疾病。 可利用習知技術來合成出一本發明之RNA(例如參閱 Caruthers et al.， 1992， Methods in Enzymology 211， 3-19 ； Wincott et al.? 1 995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684 ； Wincott et al·，1 997，Methods Mol. Bio. 74, 59 ; Brennan et al·，1 998，Biotechnol Bioeng·，61，3 3 -45, 以及Brennan等人之美國專利案6,001，311號等參考文獻 内容）。亦可藉著一表現載體來轉錄出該 RNA，並以標準 技術來分離之。同樣可利用習知方法將一本發明之RN A或 載體送入目標細胞中（參閱 Akhtar et al·，1 992，Trends C e 11 B i ο . 2，1 3 9)。例如，藉著微脂粒（1 i p 〇 s o m e)、水凝膠 (hydrogel)、環糊精（cyclodextrins)、生物可降解式奈米膠 26 200535142 囊（biodegradable nanocapsules)或生物黏附性微粒 (bioadhesive micro spheres)等方法將該RNA或載體送入細 胞中。或者’利用直接注射或一滴注式栗浦（i n f u s i ο n p u m p ) 以局部性的方式來輸送該RNA或載體。其他方法則包括各 種輸送或載體糸統之利用，例如透過結合體（c 〇 n j u g a t e s) 或生物可降解性聚合物來輸送該RNA或載體。

本發明範圍亦涵蓋一種藥學組合物，其包含：（丨）一活 性試劑，例如上述抗體、突變種RNR次單元、RNAi試劑 或經鑑定為RNR抑制劑之化合物中的其中之一；以及（2) 一種藥學上可接受載體，以及其他包含一反義寡聚核苷 酸、一胜肽或是含有rRM2次單元C端胺基酸序列之聚胜 肽的活性試劑。例如，曾發現在體外將一段位在RRM2次 單元之C端上且長度為7個胺基酸的胜肽序列（FtldADF) 以1 0 : 1 (胜肽：酵素）的比例加入人類RNR酵素中時，能 顯著地抑制該RNR活性。更曾觀察到，一個缺乏上述位在 C端之7個胺酸的截短型（trurlcated form)M2次單元無法與 該對應的Μ 1大次單元共同形成一複合體。該些結果暗示 著，該7-胺基酸胜肽可能會與M2次單元競爭Ml次單元 上的結合位置。可利用上述或其他習知方法來產生及使用 此種胜肽或t胜肽。並可在體外對用來治療一細胞增殖相 關疾病之該藥學組合物的藥效進行初步評估。該藥學組合 物的體内效用研究係將該組合物注射到一動物體内，隨後 评估該組合物的治療效果。 可利用傳統方法將一活性藥劑製備成各種劑型，以用 27 200535142 於各種不同的用藥途徑。例如，可將該活性藥劑製備成膠 囊、軟膠囊（g e 1 - s e a 1)或旋劑以供口服之用。通常，係將一 活性藥劑懸浮在一藥學可接受在體中（如生理食鹽水），並 以口服、靜脈滴注或皮下、肌肉内、脊椎管内、腹腔内、 直腸内、陰道内、鼻内、胃内、氣管内或肺内等注射或植 入的方式來用藥。或可將該化合物直接送入癌組織中，以 預防或治療癌症。

可視諸如用藥途徑、配方性質、患者病症特性、患者 之身材、體重、體表面積年齡與性別、是否使用其他活性 藥劑以及該患者之主治醫師的判斷等因素來決定所需要的 劑量。適合的劑量範圍約介於0.0 1毫克/公斤至1 0 0.0毫 克/公斤（mg/kg)之間。可根據可用化合物的種類及各種用 藥途徑的效率不同，來預估所需要的劑量。例如，口服用 藥所需的劑量將可能較靜脈滴注所使用的劑量要高。可利 用相關領域中習知用來取得最佳化用藥的評估標準經驗常 規來調整使用劑量。將該化合物封裝於適當釋放媒介中（如 聚合體微粒子或植入式元件）可能提高藥物的釋放效率，特 別是口服用藥時。 本發明特徵更有關於一種治療一細胞增殖相關疾病的 方法。可利用諸如此類疾病的標準診斷方法，或偵測取自 該患者身上的一樣品中的一 RNR基因體DNA、其RNA量、 蛋白質含量或 RNR活性等方法來判斷出該些需要接受治 療的患者。例如，當取自患者之樣品中之上述該些偵測項 目的量高於取自正常受驗者之樣品中的該些項目之量時， 28 200535142

則該患者需要接受一有效劑量之能降低η x 活性之化合 物的治療。「治療（treating)」一詞係指斜 增殖相關疾病之患者使用一組合物，以求 減輕 、補救、預防或改善該疾病、該疾、庄丄 六柄之症 個患有一細胞 達到治癒、緩和、 狀、該疾病 之次要症狀或罹患該病症之機會 (effective amount)」一詞係指能夠在 上產生想要之醫療效果的組合物劑量 劑量。該方法可單獨使用或與其他藥 下述特定實施例僅作示範之用， 叩。「有效劑量 ~接受治療之患者身 ’例如’如上所述之 物或治療合併使用。 並不能限制本揭露内 容的其他實施例。習知技藝者再不需更進— ^ 步的說明下， 即可根據此處之敘述内容，而最廣泛地痄用士找α 馬用本發明。且所 有引用於此處的公開文獻均全體納入以供參考。 第一實施例

在此實施例中，係利用人類RNR次單元來重組出活性 的RNR蛋白。人類RNR蛋白具有兩個相似的小次單元， hRRM2與P5 3R2。該p5 3R2次單元係直接受到腫瘤抑制因 子p 5 3蛋白所調控。p 5 3蛋白被認為在細胞週期之g 1與 G2時期、細胞凋亡（apoptosis)以及調控修復受損DNA過 程中之核苷酸供給作用中扮演著關鍵角色（Tanaka, H. et al.，2000，Nature 404，42-9 ; Levine，1 997, Cell 88, 323-3 1 與 Gui 11 e t，et al ·，2 0 0 1，J · B i o 1 · Chem · 2 7 6，4 0 64 7 _ 5 1)。並 曾提出該p53R2會與p53蛋白交互作用而形成一蛋白-蛋白 複合體（Xue，et al·，2003，Cancer Res 63，980 - 6)°P53 蛋白 29 200535142

會反應基因壓力（genomic stress)而脫離p53R2，並誘導其 自身的轉錄作用（Zhou et al.，2003， Cancer Res· 63, 65 8 3 -94)。所產生的自由p53R2則會與R1次單元結合，以 啟動 DNA 修復作用（Guittet，et al.，2001，J. Biol. Chem· 276，40647-51)。有關p53R2與hRRM2次單元對鐵螯合物 (iron chelators)、自由基抑止劑（radical quenchers)與其他 RNR抑制劑之反應的酵素性質研究則顯示出 p53R2與 hRRM2 兩者之間的特徵差異（Shao et al·，2004，Cancer Res 64，1 -6) o 係原核性地表現出三種標記有 6 ’組胺酸標籤的人類 RNR次單元蛋白（hRRM2、p53R2與hRRMl)，並利用鎳樹 酯親和色層分析來純化該些次單元蛋白，且根據標準技術 將該些已純化的次單元蛋白保存在 50 mM Tris-HCl、 ρΗ7·4、100 mM氯化鉀（KC1)及一 70°C的條件下，以備用 來重組一活性RNR蛋白。以十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺 凝膠電泳法（S D S - P A G E)來分析該些已純化的蛋白。並確認 該些已純化的蛋白幾乎保持完整。將1 μΜ之hRRM2或 p53R2蛋白與〇·5 μΜ的hRRMl置於一多孔盤中共同反 應，以重組出RNR蛋白。隨後根據標準技術來測試該重組 RNR蛋白的RNR活性。並發現該些重組RNR蛋白具有rnR 活性。 利用上述重組RNR蛋白來筛選RNR抑制劑。係選擇 羥基尿素（hydroxyurea，HU，係一種已知的RNR抑制劑）、 胺基脲（semicarbazide，SC)以及四種羥基尿素衍生物：編 30 200535142 號2、.21、24與29之羥基胺基脲席夫鹼類（SB-HSC)來進 行試驗。 h2n

NHOH

Η〇’ 〇Η C=N-N Η 〇 Λ

NHOH SB-HSC 21

Hydroxyurea

Η2ΝΗΝ 人 νη2 o2n

NHOH SB-HSC 24 S emi c arb az i d

將不同濃度之每種化合物分別與該些已純化的 hRRM2及hRRMl或p53R2及hRRMl混合，並於室溫下反 應 3 0分鐘。隨後在該混合物中加入一酵素反應緩衝液 (enzymatic reaction buffer)，使最終體積為 100 微升（μΐ) 後，再置於3 7 °C下反應3 0分鐘。其中，該反應緩衝液中 含有0.125 mM之[3H] CDP、50 mM之羥乙基呱嗪乙磺酸 31 200535142

(HEPES，pH 7·2)、6 mM 之二碗代蘇糖醇（DTT)、4 mM 之 醋酸鎮（MgOAC)、2 mM 之 ΑΤΡ、〇 〇5 mM 之 CDP、100 mM 之氯化鉀及0 · 2 4 mM之還原型菸鹼胺腺嘌呤雙核苷酸磷酸 鹽（NADPH)。可將60 mM之三氯化鐵（FeCi3)加入上述緩衝 液中，以作為鐵來源。待完成去磷酸化反應後 • (dePhosPhorylation)，以一連接有高效液相層析儀的放射 • 活度偵測器來分析每個反應混合物的上清液。隨後以下列 • 非線性迴歸方程式f(x)來計算IC5G值。 f(x) = (a-d)/[l+(x/c)b] + d 所彳于結果顯不羥基尿素能顯著地抑制該含有hRRM2 或P53R2次單元之RNR蛋白的活性，並指出該重組RNR 蛋白可用來篩選RNR抑制劑。並發現到，在上述兩種情況 中，羥基尿素較胺基脲更能有效抑制該RNR活性。在存有 鐵及還原劑的情況下，羥基尿素對含有hRRM2之RNR蛋 白的抑制效果高於其對含有p53R2之RNR蛋白的抑制效 果。亦發現到，DMSO對含有P53R2之RNR蛋白的抑制效 ® 果问於其對含有hRRM2之RNR蛋白的抑制效果，故顯示 • 出相較於hRRM2而言，DMSO對p53R2的專一性較高。 • 有趣的是’丨％與2.5%的DMSO在羥基尿素對兩種小次單 元之抑制作用上具有相同的影響效果。 以上述相同方法，利用體外RNR活性分析來測試上述 四種羥基胺基脲席夫鹼類（SB-HSCs)的抑制能力及其次單 元選擇性（subunit-selectivity)。實驗結果係顯示出該些化 a物的劑里依賴性抑制曲線（d〇se-dependent inhibition 32 200535142 curves)。並將對應於該些化合物之IC5〇值整理餘下方表一 中 〇 表一、RNR抑制劑之IC5〇值 化合物 體外RNR活性(IC5〇 士 sd，uM) 細胞活性試 驗 (IC50 士 S4UM) M2/M1 p53R2/Ml 平均值 選擇指數 SC (indH20) >5000 >5000 >5000 ΝΑ >2192 HU(indH20) 164.68±7.95 190.37土 6.43 177.52 0.87 82.0 ±6.0 HU(indH20+FeC13) 555.70±24.10 1986.16±71.18 1270.93 0.28 HU (in 1%DMS0) 147.57±7.34 158.74±6.82 153.16 0.93 HU(in2.5%DMSO) 155.17±6.59 145.81 土 6.06 150.49 1.06 SB-HSC21 (in 1%DMS0) 11.48±0.63 13.56土 0.70 12.52 0.85 2.7 ± 0.6 SB-HSC24 (in 2.5%DMSO) 51.99士 2.03 11.48±0.60 31.73 4.53 10.6 ±0.3 SB-HSC2 (in2.5%DMSO) 110.73 士 6.64 30.60±1.62 70.66 3.62 6.5 ± 0.6 SB-HSC29 (in 2.5%DMSO) >250 >250 >250 ΝΑ 4.4 ±0.0

該結果顯示，相較於含有hRRM2之RNR蛋白而言， 四種羥基胺基脲席夫鹼類均為對含有P53R2之RNR蛋白 具有較高且不同程度之專一性的有效RNR抑制劑。並更進 一步利用標準細胞活性試驗（c e 11 - b a s e d a s s a y)來驗證該分 析結果，並發現能得到相近的結論。該結果顯示羥基尿素 對兩種小次單元之 RNR活性的抑制效果隨著劑量而變化 (即抑制效果為劑量依賴型），且羥基尿素上的（N)-OH基對 RNR活性的抑制作用而言是必要的。在存有鐵及還原劑的 條件下，羥基尿素對hRRM2具有較佳的抑制效果。該結 果亦顯示出，SB-HSC29之作用機轉與其他SB-HSC不同。 隨後執行電子順磁共振光譜分析。進行電子順磁共振光譜 分析之前，先使蛋白樣品分別與每種上述化合物在室溫下 33 200535142 反應3 0分鐘。並將電子順磁共振光譜分析參數設定如下： Τ = 20 Κ(飢氏溫標）、微波頻率（micr〇wave frequency) = 9.376 十億赫茲（GHz)、微波功率（microWave power) = 0.5毫瓦 (mW)、調幅（modulation amplitude)為 4 高斯（gauss)、調頻 (modulation frequency)為 1〇〇 仟赫（KHz)。所得之 EPR 測

量結果顯示出，羥基尿素與四種羥基胺基脲席夫鹼類能抑 止兩種RNR小次單元上的酪胺酸自由基。當經過該些化合 物處理後，觀察到在酪胺酸自由基EPR光譜中的強度趨勢 與RNR活性的變化一致。隨後，在存有鐵及還原劑的條件 下，執行上述之EPR分析。發現到，經基尿素對兩種RNR 小次單元中的路胺酸自由基的抑止作用較小，且此影響效 果對p 5 3 R2次單元來說更為明顯。下圖係鐵依賴性活化酪 胺酸自由基中心（active-essential iron-tyr〇syl radical center)之再生作用的示意圖，也因此可看出兩種小次單元 在接受羥基尿素處理後以及與與鐵及還原劑反應後的 RNR活性。

34 200535142

Fe(III>02-Fe(III)-RR-Tyr-0 (active protein)

Reductants

Fe(II)-02-Fe(II)-RR-Tyr-0H (reduced protein) ★

Fe(III).〇2-Fe(III)-RR-Tyr-OH (oxidized protein)

上述結果係暗示上述化合物對 RNR活性的抑制效果 隨著劑量而變化（即劑量依賴性），且該些化合物上的 (N)-OH基對於抑制作用來說是必要的。該些化合物對RNR 蛋白之抑制效果的排列順序依次為 SB-HSC 21、SB-HSC 24、SB-HSC 2、羥基尿素及 SB-HSC 29。SB-HSC 21 對於 兩種小次單元的抑制效果幾乎相等，而 SB-HSC 2與 SB-HSC 24貝，J對p53R2次單元具有較顯著的抑制效果。

概括而言，本發明係藉著重新組合該些重組次單元蛋 白（hRRM2與hRRMl或p5 3R2與hRRMl)，來發展出一種 可用來高速鑑定新 RNR抑制劑之抑制效果及其對小次單 元之選擇性的體外RNR標準試驗法。可同時進行多個上述 試驗。例如可利用一組偵測裝置以每2 4小時分析至少1 0 0 個樣品的速度來進行樣品分析。因此，上述方法適合用於 高速化合物筛選。並且，上述有關抑制機轉的研究能提供 進行理論性地設計新型RNR抑制劑所需之必要資訊。 35 200535142 第二實施例 在此實施例中，係偵測出hRRM2與p53R2次單元中 的一個路胺酸在自由基生成反應中扮演著樞紐角色。並對 六種第I類小RNR次單元進行序列比對分析。此六種RNR 小次單元分別是大腸桿菌R2次單元（E.coliR2)、披衣菌R2 次單元（ChlamydiaR2)、酵母菌R2次單元（YeastR2)、小鼠 R2次單元（MouseR2)、人類之hRRM2與p53R2次單元。

112 | 127 I 134 317 ChlamydiaR2 IFKHVTNPEA 1 RQYLLRQAFE 1 EAVHTHTFLY 1 ICESLGLD— 1 .…KNFFETRVIE YQHAASLTW 108 | 122 129 I 356 I E.eoliR2 LLPLISIPEL 1 ETWVETWAFS I ETIHSRSYTH 1 IIRNIVNDPS 1 .…VAPQEVEVSS YLVGQIDSEV 169 I 183 1 190 I 376 I YeastR2 FSTEVQIPEA 1 KSFYGFQIMI 1 ENIHSETYSL 1 LIDTYIKDPK .· 1 .…TNFFEKRVSD YQKAGVMSKS 163 1 177 | 184 1 370 | MouseR2 FSQEVQVTEA 1 RCFYGFQIAM 1 ENIHSEMYSL 1 LIDTYIKDPK .. 1 ,.…TNFFEKRVGE YQRMGVMSNS 162 | 176 1 183 1 369 hRRM2 FSQEVQITEA 1 RCFYGFQIAM 1 ENIHSEMXSL 1 LIDTYIKDPK .. 1 ,·…TNFFEKRVGE YQRMGVMSSP 124 1 138 I 145 I 331 1 p53R2 FSQEVQVPEA 1 RCFXGFQILI 1 ENVHSEMXSL I LIDTYIRDPK ., 1 ,·…TNFFEKRVSE YQRFAVMAET

已知在hRRM2與p53R2次單元中有8個保留的酪胺 酸。利用定點突變法（s i te -d ir e c 1 m u ta g e n e s丨s)將該些酷胺 酸取代成苯丙胺酸（F)或色胺酸（W)。該方法係以 pET-hRRM2或pET-p53R2做為模板來進行聚合酶鏈鎖反應 (PCR)而將hRRM2中的Tyr 162突變成Phe 162，或是將 p53R2 中的 Tyrl24 突變成 Phel24。用來在 hRRM2 Y162F 與p5 3R2 Y124F位置上進行定點突變的寡聚核苷酸引子分 別如下： 36 200535142 5，-ATTACAGAAGCCCGCTGTTTCTTTGGCTTCCAAATTGCCATGGAA-3，’ 以及 5, GTTCCAGAGGCTCGCTGTTTC1XXGGCTTTCAAATTCTCATCGAG-3， (粗體字母表示突變後的編碼） 並可利用如Applied Biosystems DNA/RNA合成裝置（型號 3 92)來合成該些突變寡聚核苷酸。

所進行之PCR反應則如下述步驟：將含有1毫微克（ng) 之pET-hRRM2或pET-p53R2質體、各3 30毫微克之上述 引子及 0.2 mM dNTP (Amersham Pharmacia Biotech)之混 合物於P/w聚合酶適用緩衝液（Stratagene)中預熱至95。〇， 且持續1分鐘；隨後使該混合物於9 5 °C持續3 0秒、5 5 °C 持續3 0秒及6 8 °C持續1 2分鐘之條件下反應1 8個循環。 待該混合物之溫度降至室溫，於該反應混合物中加入；[微 升的Dpnl限制酶後，使其在37°C下作用1小時。將質體 架構中含有突變編碼序列的產物轉型至大腸桿菌 BL21(DE3)中（Stratagene，La Jolla，CA)，並以異丙基 _1_硫 -β-D-半 乳糖 °夫喃 糖皆(isopropyl -1 - thio-p-D-galactopyranoside，IPTG)來誘導該大腸桿菌表現出突變種 hRRM2與p53R2聚胜肽（分別標示為「Y162F-M2」與 「Y124F-p53R2」）。 更明確地說，係將20毫升（ml)之培養隔夜的已轉型菌 液加入含有30微克/毫升（pg/ml)鏈黴素之1升的LB培養 液中，並使該培養液於3 7 °C下培養2至3小時，並檢查菌 液之O.D6〇〇值不超過0.9。隨後加入1 mM之IPTG來誘導 蛋白質的表現後，再使細菌繼續在3 0 °C下生長1 6小時。 37 200535142

激烈攪拌所收取到的細菌細胞以分散之，並使該些細胞與 Bugburster- Benonase 試劑（Qiagen)在 4 °C 下作用 30 分鐘。 將固定化之二價鎳離子親和層析樹脂（immobilized Ni(II) affinity chromatography resin，Ni-NTA，Qiagen)懸浮在溶 胞上清液（lysate supernatant)中，並在4 °C下作用30分鐘， 隨後將該樹脂裝填至一重力沈降管柱中，再以至少3 0倍填 充體積（bed volume)之含有 50 mM 填酸二氫鈉 (NaH2P〇4)、800 mM 氯化鈉（NaCl)、50 mM 味唾 (imidazole)、0.1% Triton_X 100 與 10 mM 2-氫硫乙醇 (2-Mercaptoethano)且pH 7·0之緩衝液來清洗該樹脂。以 含有5 0 mM構酸二氫鈉、300 mM氣化鈉及12 5 mM咪唑 之緩衝液（pH 7.0)來洗脫該些蛋白，並使該些蛋白在4 °C下 於2 000倍樣品體積的25 mM之Tris-HCl緩衝液（pH 7.4) 中透析一個晚上。除了在洗脫步驟中所使用之緩衝液不添 加 2 -氫硫乙醇之外，可以類似上述方法來表現並純化 hRRMl。使用蛋白分析試劑（Bio-Rad，Hercules，CA)來定量 製備出來的蛋白。並對經考馬斯藍染色後之十二烷基磺酸 鈉-聚丙烯醯胺凝膠進行密度掃瞄來判斷該些蛋白的純度。 根據上述相同方法來製造所有突變種質體 (pET-hRRM2Y176F、pET_hRRM2Y162F、pET-p53R2Y138F、 pET-p53R2Y124F、pET-hRRM2Y369F、pET-p53R2Y331F、 pET-hRRM2Y176W、pET-hRRM2Y162W、pET-p53R2Y138W 及 pET-p53R2Y124W)及其各自的突變種蛋白。 利用配備有 Oxford氦氣低溫恆溫器（〇xford helium 38 200535142

cryostat)之Bruker EMX光譜儀來測定該些蛋白的X-波段 電子順磁共振光譜（X-band Electron Paramagnetic Resonance)。將蛋白填入光譜儀之偵測孔（cavity)之前，先 以液態氮冷凍已純化之hRRM2與P53R2蛋白。使用之設 備參數為·· T = 20 K、微波頻率=9.376十億赫茲、微波功率 =0 · 5毫瓦、調幅為4高斯、調頻為1 〇 〇什赫茲。並發現野 生種之大腸桿菌、小鼠與人類RNR小次單元具有相似的9 十億赫兹EPR光譜圖，此結果係表示在這三種酵素中，其 酪胺酸之Cp-H鍵與垂直於該芳香環之軸心間的二面角很 小（Pesavento et al.， 2001， Adv Protein Chem 53 3 17-8 5)。野生種hRRM2與p53R2之EPR測量會產生典型 的RNR蛋白酪胺酸自由基訊號。而hRRM2中 Y176F與 p53R2中 Y138F 的突變點（分別標示為 Y176F-M2與 Y138-p53R2)會使此兩種小次單元成為 EPR沈默蛋白 (EPR-silent protein)，此結果表示 Tyrl76-M2 與 Tyrl38-p53R2係分別是hRRM2與p53R2兩次單元中持有 穩定自由基的胺基酸殘基。而此結果先前大腸桿菌及小氣 次單元蛋白的研究結果一致。意外的是，若使該兩次單元 發生Y162F-M2與Y124F-p5 3R2突變，亦會得到EPR沈默 的結果。由於兩個酪胺酸中（Tyrl62-M2與 Tyrl76-M2或 Tyrl24-p53R2與yrl38-p53R2)，不論哪一個發生突變都將 失去該穩定酪胺酸自由基，故表示兩個酪胺酸對於生成 RNR人類蛋白中的穩定酪胺酸自由基來說均極為重要，且 該兩酪胺酸之間具有功能上的相互關連。除上述四個突變 39 200535142 種蛋白以外，其餘六個酪胺酸突變種蛋白之EPR光譜並無 顯著的變化，顯示這些酪胺酸殘基對於自由基生成而說並 非必要的。

hRRM2/hRRMl與p53R2/hRRMl的活性係利用一種變 化的[3 Η ] C D P還原分析試驗來加以測量。所使用之反應混 合物中含有 0.125 μΜ [3H] CDP (0.3 pCi)、50 mM HEPES (pH 7·2)、6 mM DTT、4 mM 的醋酸鎂、2 mM ATP、0.05 mM CDP，100 mM氣化鉀及0.24 mM NADPH。隨後以上述反 應混合物將〇·5 μΜ的Μ1蛋白與1 μΜ之hRRM2或p53R2 蛋白之總樣品體積調整到1 0 0毫升，以測試其酵素活性。 待上述樣品於3 7 °C下反應1 5至3 0分鐘並以磷酸雙酯酶 (phosphodiesterase)進行去磷酸化反應後，使用C-18逆相 管柱以高效液相層析儀來分析該樣品之上清液，以分離[3H] 胞°密σ定（cytidine)與[3H]去氧嘴唆（deoxycytidine)。隨後利 用一 P-RAM-2B流式放射線β/γ偵測器（IN/US Systems， Tampa，FL)來測量該些HPLC分裝產物的放射性強度。所 測的之酵素活性係以 dCDP/(CDP + dCDP)相對活性百分比 來表示（即，dCDP在總核醣核苷二磷酸與去氧核醣核苷二 磷酸中所佔百分比）。假設C D P轉化為d C D P的轉化率為 1 0 0 %，並將所有樣品結果均以其野生種蛋白之結果來正常 化（normalized)。該特定酵素活性係以每毫克蛋白在每分鐘 内所能生成之dCDP的毫微莫耳數來表示（nm〇1 〇f dCDP formed/min/mg protein)，並將結果整理餘下方表二 中。表中的每個數據係2至3次測量結果的平均值，且其 40 200535142 偏差小於0.3 %。

表二、 突變種R2蛋白之 RNR活性 突變 p53R2 活性(％) hRRM2 活性(％) Y-〉F 124 ND 162 3.6 138 ND 176 2.4 331 ND 369 ND Y-〉W 124 27.8 162 ND 138 ND 176 ND 注意· ND =無法偵測

此測量結果與EPR結果一致，亦無法偵測到P53R2之 Y 1 3 8F與Y 1 24F突變種的酵素活性，故確認此兩個酪胺酸 對於p5 3 R2蛋白活性來說是重要的。並且，所偵測到的 hRRM2之Y176F與Y162F突變種的活性極小（Y176F突變 種之活性小於2.5 %的天然蛋白活性；Y 1 62F突變種之活性 小於 3.6 %的天然蛋白活性）。此兩種突變種的殘餘活性極 引人探討。該Y176F突變種的低活性暗示著在hRRM2蛋 白中可能形成負責催化受質還原反應的過渡或穩定的自由 基。且此觀察到的結果與先前對大腸桿菌及小鼠的研究相 呼應（Bollinger et al·， 1991，Science 253，292-8 and S ahlin et al·，1 994，J. Biol. Chem. 269，1 1 699-702) 〇 而 Y162F-M2 突變種所出現類似的低活性亦暗示 ： (l)Tyrl62-M2是在Y176F-M2突變種中一個能形成其他自 由基的位置；（2)人類RNR蛋白之小次單元中需同時具有 Tyrl76與Tyrl62，則RNR蛋白方能具有完全的活性。另 一方面，由Y369F-M2/Y331F-p53R2突變種次單元所構成 41 200535142 的人類RNR蛋白雖然表現出典型的epR訊號，但卻不具 有酵素活性。上述酪胺酸（Tyr33 1 -p53R2)係分別對應至小 鼠R2之Tyr3 70以及大腸桿菌r2之Tyr3 70的此，且其係 在R1- R2介面間之長程電子傳遞路徑中的一部分（Climent

et al·，1 992，Biochemistry 31，480 1 -7 與 R〇va et al.，1 999, J· Biol· Chem· 274, 23 746-5 1)。因此，突變此胺基酸殘基 可抑制自由基傳遞作用，進而抑制酵素活性，但卻不影響 小次單元中穩定自由基的形成。該實驗結果證實了此酪胺 酸是人類RNRs之電子傳遞路徑的一部分。 由於無法取得人類R2蛋白的晶體結構，故根據最近 所發表之大鼠p53R2(PDB編號：1 W69)的X-射線晶體結構 來建立 hRRM2及 p53R2結構的立體同源模擬（3D homology model)。並在該結構上標示出上述8個酪胺酸， 以顯示其可能的作用功能。序列排比的結果顯示出hRRM2 及p5 3R2與結構為1W69之大鼠R2在Asn65至Glu3 52之 288個胺基酸之間具有高度的同源性（homology)，分別為 95.5%與8 1.2%。利用SYBYL Protable模組來模擬該結構 模型，以確保該蛋白結構的正確性。如同已還原之大鼠R2 蛋白的 X -射線結構所顯示的，該雙鐵中心（b i n u c 1 e a r i r ο η center)係位在 P53R2 與 hRRM2 中的一個四螺旋束内 (four-helix bundle) (Strand et al·，2003，Biochemistry 42, 1 2 223-34)。如同P5 3R2蛋白，顯示出的hRRM2結構模型 顯示出每個鐵原子分別與四個配位體配位：第一鐵原子 (Fel)之四個配位體為 Hisl34、Aspl00、Glul31 與 Glu228; 42 200535142

第二鐵原子（Fe2)之四個配位體係His231、Glul94、Glu228 與Glul31。而Glul3 1與Glu228的羧基則橋接至該兩鐵原 子，且相距3.4 A。該兩酪胺酸（Tyr 1 7 6與1 6 2)分別位在該 雙鐵原子團的相反兩側，並各自鄰近一個鐵原子。該 Tyr* 1 7 6-M2之氫氧基上的氧距離第一鐵原子約5.6 A，以及 Tyrl62-M2之氫氧基上的氧距離該第二鐵原子約10.8 A。 此結構模型指示出該兩酪胺酸均被極相似的親水性環境所 包圍。但環繞在Tyrl76四周的大多是白胺酸與異白胺酸， 而環繞在Tyr 1 62四周的則大多為苯丙胺酸。 如同 Tyrl76-M2 與 Tyr 1 3 8 -p 5 3 R2 般，Tyr 1 62-M2 及

Tyrl24-p53R2對於人類 RNR蛋白的功能來說亦是重要 的。然而，Tyr 1 62-M2與Tyrl24-p53R2所具有的是過渡自 由基或穩定自由基仍有待確認。因此對該兩酪胺酸執行 EPR 光讀模擬（R〇Va et al·，1 999，J· Biol. Chem. 274, 2 3 746-5 1 )。則結果顯示，Tyr 162-M2可能包藏著一個其EPR 光譜與 Tyrl76-M2 之 EPR 光譜極為相似的自由基 (S vistunenko et al·，2004，Biophys. J. 87，5 82-95)。

Svistunenko與C ο o p er所建立的方法係藉著比較一酪胺酸 苯環之旋轉/二面角（Θ)與由酪胺酸自由基之EPR光譜形狀 所獲得之該角度的模擬值，來預測出一蛋白中酪胺酸自由 基的EPR光譜。Svistunenko與Cooper由大鼠M2次單元 之高磁場與X-波段EPR光譜圖來模擬出該穩定酪胺酸自 由基（Tyr 17 7)的旋轉角度，並計算出一大鼠M2晶體結構中 43 200535142 之Tyrl 77的二面角，該大鼠M2晶體結構為ρ〇Β編號： 1XSM，且與 hRRM2 具有 96% 的同源性（Schmidt et al.， 1 996，J. Biol. Chem. 271，23 6 1 5 -8、Sahlin et al.，1 987, Biochemistry 26，5 5 4 1 - 8 與 Kauppi et al·，1 996，J. Mol. Biol. 262，706-20)。並發現到具有自由基之酿胺酸的二面 角計算值（Θ)為3°。在此實施例中，係利用Svistunenko與 Cooper之方法來計算1XSM結構中所有酪胺酸的可能旋轉 角度（參閱表三）。 表三、小鼠R2與hRRM2蛋白中之酪胺酸基之旋轉角度 酪胺酸（小鼠） 酪胺酸（hRRM2) 角度Θ 3 7 4 3 2 4 85678922 oo 11 1 11 11 2 3 87 27.8 94 98.6 162 6.5 176 18.3 183 164.2 192 77.6 221 84.2 323 77.4 注意：粗體為可能藏有酪胺酸自由基的胺基酸殘基·

如表三所示，小鼠之Tyrl 77與Tyrl 63之旋轉角度與 模擬出來的結果（Θ = 3°)極接近。Tyr 177之旋轉角度的計 算結果（Θ = 18.3。）與Svistunenko及Cooper法的結果相 符。且對應至人類Tyrl62的Tyrl63之旋轉角度（Θ = 6.5。） 隶接近該穩定路胺酸自由基的模擬值（㊀=3。）。根據此方 法’則Tyrl 63處之自由基的EPR光譜圖應與Tyr! 77的EPR 44 200535142 光譜圖相似。該結構之間的比較顯示出人類Tyr 1 6 2與大鼠 Tyr 1 6 3各自被1 〇個相同胺基酸殘基所環繞，故顯示出根 據大氣蛋白結構所做之計算方法可套用在人類蛋白上。

上述角度計算分析顯示出人類 Tyrl62-M2 與 Tyr 1 7 6-M2均具有相似的二面角，進而顯示出此兩個酪胺 酸的EPR訊號可能是一致的。上述定點突變所得到人類 Tyr 162-M2可能是一個自由基位置的觀察結果可支持上述 計算結果。 接著’進行第二次突變實驗以更進一步區別與比較該 兩絡胺酸自由基之間的差異。係將人類γ丨76與γ 1 62分別 突變成色胺酸（W)，其係一個與酪胺酸類似且具有還原活 性的胺基酸。發現到，不論是y176W-M2或Y162W-M2突 變種均無EPR訊號，故此結果顯示出將hRRM2中的該兩 酿胺酸取代成色胺酸，並無法形成穩定自由基。此結果與 該兩酪胺酸對於自由基之形成來說是極為重要的論點相呼 應’且更進一步強化之。對照苯丙胺酸的突變種（γ丨76F與 Y162F)’色胺酸突變種（Y176w and Y162W完全不具有酵 素活性（參考表二）。而兩突變種之間的差異係由於苯丙胺 酸與色胺酸形成自由基之能力懸殊所造成。將兩酪胺酸取 代成兩色胺酸後，由其共同組成之中心所形成的自由基， 係較由兩個非自由基苯丙胺酸共同組成之中心所形成之自 由基衰退得更快。且根據色胺酸突變種（小鼠Y1 77 W)之受 質轉化率小於苯丙胺酸突變種（小鼠 Y177F)之受質轉化率 的結果更支持了上述解釋（Potsch，et al·，1 999，J· Bi〇i 45 200535142 亦

Chem· 274，17696-704)。並亦發現 Y138W-p53R2 突㈣ 無E P R訊號且失去酵素活性。然而，相較於野生種 交種 P53R2 蛋白’ Y124W-p5 3R2保留了 1/3的EPR訊號與酵夸 丁厅、'性 HRRM2與p53R2之間鄰近胺基酸殘基的差異來解 問題。根據EPR光譜儀與第一次突變實驗的結果顯八 不出 ， 如同 Tyrl76-M2 與 Tyr 1 3 8-p 5 3 R2 ， Tyr 1 6 2 , 與 /Tyrl24-p5 3R2對於人類RNR蛋白之酵素活性與穩〜 “疋自由

基的形成來說極為重要。加上該兩酿胺酸對於自由武^ 與酵素活性來說是必要的，故Tyrl76與Tyrl62右沾w %、、、。構上 接近雙鐵原子團提高了 Tyr 176與Tyr 162與該雙鐵原 共同形成人類RNR蛋白中之雙鐵雙酪胺酸自由基辅因子 中心的可能性。 在上述第二突變實驗中，完全缺乏酵素活性的色胺酸 突變種排除了因任何與該雙酪胺酸自由基中心無關的其他 自身活性、或因受到野生種蛋白污染而造成苯丙胺酸突變 種Y 1 76F與Y1 62F之殘留活性的可能性。儘管極微，但所 有偵測到的活性確屬事實。模擬計算結果更暗示了 Tyrl62-M2與Tyr124-P53R2具有包藏自由基的能力。然而 令人疑惑的是，人類RNR小次單元的EPR光譜中並未偵 測到額外的路胺酸自由基訊號。可由兩種理由來解釋此現 象：（1)由於旋轉角度（Tyrl62-M2 之 Θ = 6.5 ; Tyrl76-M2 之Θ = 1 8 · 5。）相似而造成無法分辨兩個酪胺酸自由基的 EPR 訊號；或（2)由 Tyri62-M2/Tyrl24-p53R2 所提供的過 渡自由基在接受偵測之前便已衰退。 46 200535142

上述結果顯示的p53R2與hRRM2之間的相似與相異 處。p53R2與 hRRM2 具有 8 3 %的序歹J 一致性（sequence identity)。p53R2與hRRM2兩者均在上述第一次突變實驗 中產生出EPR沉默蛋白。反之，不同於Y176F-M2與 Y162F-M2，Y138F-p53R2 與 Y124F-p53R2 突變種不具有可 測得的酵素活性（參考表二）。在第二次突變實驗中，則測 得以色胺酸來取代酪胺酸的 Y138W-p53R2與 Y176W-M2 兩突變種之間具有相似的 RPE光譜與酵素活性（參見表 二）。然而，有趣的是，該Y124W-p53R2突變種保留了約 1/3的自由基與天然酵素活性，而該Y162W-M2卻沒有EPR 訊號與酵素活性。p53R2與hRRM2之間的差異在於該兩蛋 白中靠近輔因子中心處的一個胺基酸不相同。但若不考慮 兩小次單元間之差異的話，整體而言，hRRM2之雙酪胺酸 自由基中心的生成作用可套用於p53R2上。Y124F-p53R2 無EPR活性而Y124W-p53R2具有部份EPR活性的這個事 實，係顯示該p5 3R2蛋白係如同EPR模擬計算結果所假設 的在Tyrl24位置上藏有一個自由基。 如同上述内容所提及的，大腸桿菌RNR曾被作為研究 第I型RNR的微生物模型。並曾被認為所有第I型酵素的 自由基升成反應均遵循類似的路徑（Stubbe et al«，1998, Chem. Rev· 98，705-762)。然而，如上所述，各種RNR之 間的序列排比顯示出，當哺乳動物RNR之小次單元序列非 常相似時（例如80%的同源性），則該些哺乳動物RNR不同 於其他物種的第I型酵素（例如與大腸桿菌rNR具有25〇/〇 47 200535142

的同源性）。大鼠與大腸桿菌R2其各自雙鐵原子團之第二 鐵原子附近的胺基酸組成有者顯著的不同（K a u p p i e t a 1 ·， 1996，J· Mol· Biol. 262，706-20)。特別是大腸桿菌 R2 在其 分別對應至鄰近第二鐵原子處之小鼠 Tyr 163與人類 Tyrl62-M2/Tyrl24-p53R2的第108個胺基酸位置上並非酪 胺酸。有趣的是，曾在大腸桿菌Y122F突變種蛋白中的第 二鐵原子位置附近發現一些色胺酸自由基的過渡生成反 應，而使其具有1 %至2 %的野生種活性（s a h 1 i n e t a 1.，1 9 9 4， J. Biol. Chem. 269, 1 1 699-702； Sahlin et al., 1 999, J. Biol Chem. 274，1 7696-704 ; Katterle et al·，1 997，J· Biol. Chem. 272，10414-21 與 Larsson et al·，1 986. Embo· J· 5, 2037-40)。在披衣菌 RNR中發現到另一種 R2亞型（Ic 型）（Hogbom et al·，2004，Science 305，245-8)。不解的是， 此型R2次單元在第一鐵原子的附近缺乏典型的酪胺酸自 由基位置，卻能偵測到該型R2次單元具有一個較短暫的 EPR訊號。結構排比顯示出，披衣菌R2中鄰近該第二鐵 原子位置的兩個酿胺酸殘基（Tyrll2與Tyrl89)可能是可替 換的酪胺酸殘基。本文中所敘述之實驗結果暗示人類RNR 蛋白之Tyrl 62-M2/Tyr 1 24-p53R2，以及小鼠RNR蛋白之 Tyr 1 63可能作為一可替換的自由基位置。其顯示哺乳動物 較細菌具有更複查的自由基形成機轉。 大鼠R 2中的雙鐵原子團的移動性（m 〇 b i 1 i t y)與可及性 (accessibility)遠較於大腸桿菌R2中的雙鐵原子原，而易 於形成雙酪胺酸自由基輔因子中心（dityrosyl radicai 48 200535142

cofactor c en t e r ) ( S t r an d et al.，2004，J. Biol. Chem. 279, 46794-80 1 ； Kauppi et al., 1 996, J. Mol. Biol. 262, 706-20 ; Strand et al.，2003，Biochemistry 42，1 2223-34) ° 上述蛋白結構的研究則顯示出當該輔因子中心的兩個酪胺 酸均被包埋在該酵素内部時，Tyr 1 62-M2與Tyrl 24-p53R2 較Tyrl76-M2與Tyrl3 8-p5 3R2更接近表面，而使得前者較 可及。自由基-鐵原子中心的高活動性與可及性可能有助於 哺乳動物RNRs的自由基形成、反應性與電子傳遞作用 (Strand et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, 46794-801 ； Atta et al.，J. Am· Chem. Soc. 116,6429-6430)。此外，相較於 大腸桿菌R2之鐵離子結合作用，大鼠R2中的鐵離子之結 合作用係反映哺乳動物R2中兩酪胺酸的高協調性，而有 著高度協調性（Strand et al.，2003，Biochemistry 42, 12223-3 4)。此外’在雙氧還原反應中需要四個電子，而目 前已知的是該蛋白僅提供三個電子，其中兩個電子來自於 鐵離子，另一個則來自於已知的酪胺酸自由基，而該額外 增加的酷胺酸自由基可能在該自由基重組反應中提供該第 四個電子（Bollinger et al·，！ 99 j，science 253, 292-8)。 其他實施例 本說明書所揭露之上述特徵可以任何形式加以組合使 用’且均能以提供相同、相等或相似目的之替代特徵來取 代。因此，除非另作說明’否則此處所揭露之每個特徵僅 為本發明一系列相等或相似特徵的代表範例。 49 200535142 根據上述說明，習知技藝者可輕易地實施本發明之必 要特徵，且在不偏離本發明範圍與精神下，當可配合不同 用途與條件而作各種變化與修飾。故其他較佳實施例亦為 下述申請專利範圍所涵蓋。 【圖式簡單說明】 無

【元件代表符號簡單說明】 無 50

Claims (1)

1. 200535142 拾、申請專利範圍: 1. 一種已分離的聚胜肽，其包含一序列編號1或1 5 之免疫片段，其中該片段之長度至少為1 〇個胺基酸殘基， 且橫跨該序列編號1之胺基酸殘基Y1 62或Y3 69，或橫跨 該序列編號1 5之胺基酸殘—基Y 1 24或Y3 3 1。

   2.如申請專利範圍第1項所述之聚胜肽，其中該免疫 片段包含序列編號3 1或3 3。 3 .如申請專利範圍第1項所述之聚胜肽，其中該免疫 片段包含序列編號3 5或3 7。 4. 一已分離的聚胜肽，其包含一序列編號1或15之 突變種片段，其中該突變種片段之長度至少為1 〇個胺基酸 殘基，且除了該序列編號1之第162或第369個胺基酸殘 基或序列編號1 5之第1 24或第3 3 1個胺基酸殘基係一非酪 胺酸殘基以外，該突變種片段與該橫跨序列編號1之胺基 酸殘基Y 1 62或Y3 69或是橫跨該序列編號1 5之胺基酸殘 基Y124或Y331的野生種片段完全相同。 5 .如申請專利範圍第4項所述之聚胜肽，其中該非酪 胺酸殘基係一苯丙胺酸或一色胺酸。 51 200535142 6.如申請專利範圍第4項所述之聚胜肽，其中該野生 種片段包含序列編號3 1或3 3之序列。 7 ·如申請專利範圍第6項所述之聚胜肽，其中該野生 種片段包含序列編號3 5、3 7、3 9或41之序列。

   8 .如申請專利範圍第7項所述之聚胜肽，其中該突變 種片段包含序列編號3、5、7、9、1 1、1 3、1 7、19、21、 23、25或27之序歹|J。 9. 一種已分離的核酸，其包含一段在序列上編碼有如 申請專利範圍第1項所述之聚胜肽的序列或其互補序列。 1 0.如申請專利範圍第9項所述之核酸，其中該序列 包含序列編號3 2或3 4之序列。

   1 1 .如申請專利範圍第1 0項所述之核酸，其中該序列 包含序列編號3 6、3 8、40或42之序列。 1 2. —種載體，其包含如申請專利範圍第9項所述之 核酸。 1 3 . —種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第9項所 52 200535142 述之核酸。 1 4. 一種製造一聚胜肽的方法，其包括：在允許一核 酸序列上所編碼之聚胜肽進行表現的條件下，在一培養基 中培養如申請專利範圍第1 3項所述之宿主細胞；以及從該 已培養的細胞或該細胞之培養基中純化該聚胜肽。

   1 5. —種已分離的核酸，其包含一段在序列上編碼著 一聚胜肽的序列，該序列包含一序列編號1或1 5之突變種 片段或其互補片段，其中該突變種片段之長度至少為10 個胺基酸殘基，且除了該序列編號1之第1 62或第3 69個 胺基酸殘基或序列編號1 5之第1 24或第3 3 1個胺基酸殘基 非酪胺酸殘基以外，該突變種片段與該橫跨序列編號1之 胺基酸殘基Y 1 6 2或Y 3 6 9或是橫跨該序列編號1 5之胺基 酸殘基Y124或Y331的野生種片段完全相同。 1 6.如申請專利範圍第1 5項所述之核酸，其中該序列 編號1或1 5之野生種片段包含序列編號3 1或3 3之序列。 1 7.如申請專利範圍第1 6項所述之核酸，其中該序列 編號1或1 5之野生種片段包含序列編號3 5、3 7、3 9或41 之序列。 53 200535142 1 8 . —載體，其包含如申請專利範圍第1 5項所述之核 酸。 1 9. 一宿主細胞，其包含如申請專利範圍第1 5項所述 之核酸。 ·* 20. —種製造一聚胜肽的方法，其包括：在允許一核 ^ 酸序列上所編碼之聚胜肽進行表現的條件下，在一培養基 中培養如申請專利範圍第1 9項所述之宿主細胞；以及從該 已培養的細胞或該細胞之培養基中純化該聚胜肽。 2 1 . —種用來抑制在序列上編碼有序列編號1或1 5之 基因所表現的RNA，該RNA包含一第一核苷酸序列與一 第二核苷酸序列，該第一核苷酸序列可在嚴苛的條件下與 該基因之一片段雜合，以及該第二核苷酸序列與該第一核 〇 苷酸序列互補，且能與該第一核苷酸序列雜合，以形成一 一 雙股結構。 22. 如申請專利範圍第21項所述之RNA，其中該第 一核苷酸序列與該第二核苷酸序列係位在同一股鏈上。 23. 如申請專利範圍第21項所述之RNA，其中該RNA 係一雙股RNA。 54 200535142 2 4.如申請專利範圍第21項所述之RNA，其中該第 一核苷酸序列之長度至少為1 9個核苷酸。 2 5.如申請專利範圍第24項所述之RNA，其中該第 一核苷酸序列之長度係1 9至2 9個核苷酸。 2 6. —種DN A載體，其包含一個在序列上編碼有如申 請專利範圍第2 1項所述之RNA的核酸。 2 7. —種鑑別出可抑制一核醣核苷酸還原酶之酵素活 性之化合物的方法，該方法包括： 使一化合物與如申請專利範圍第1項所述之聚胜肽接 觸；以及 若該化合物與該聚胜肽之間有結合作用，測定該結合 作用， 其中所出現之該結合作用表示該化合物是一種能抑制 該核醣核苷酸還原酶之酵素活性的候選化合物。 2 8 .如申請專利範圍第2 7項所述之方法，其中該化合 物係一小有機分子、一小無機分子、一寡聚核苦酸、一胜 肽、一蛋白或一碳水化合物。 55 200535142 2 9 . —種具有核醣核苷酸還原酶活性的重組核醣核苷 酸還原酶二聚體，其包括： 一第一純化聚胜肽，其包含一天然核醣核苷酸還原酶 的一第一次單元序列；以及 一第二純化聚胜肽，其包含該天然核醣核苷酸還原酶 的一第二次單元序列。 3 0.如申請專利範圍第2 9項所述之還原酶，其中該核 醣核苷酸還原酶係一人類核醣核苷酸還原酶。 3 1 .如申請專利範圍第3 0項所述之還原酶，其中該第 一次單元係一 R1次單元。 3 2.如申請專利範圍第3 1項所述之還原酶，其中該第 二次單元係一 R2次單元或一 p53R2次單元。 3 3 . —種鑑別出可治療一細胞增殖相關疾病之化合物 的方法，該方法包括： 使一化合物與如申請專利範圍第 2 7項所述之重組核 醣核苷酸還原酶二聚體反應；以及 測定該核醣核苷酸還原酶的核醣核苷酸還原酶活性強 度， 其中，若在該化合物存在時的核醣核苷酸還原酶活性 56 200535142 低於沒有該化合物存且以相同方法所測得的核醣核苷酸還 原酶活性時，判斷該化合物具有治療該細胞增殖相關疾病 的效果。 3 4 ·如申請專利範圍第3 3項所述之方法，其中該化合 物係一小有機分子、一小無機分子、一寡聚核苦酸、一胜 狀、一蛋白或一碳水化合物。 57 200535142 柒、指定代表圖 (一） 、本案指定代表圖為：第 圖。 (二） 、本代表圖之元件代表符號簡單說明·· 無

   捌、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明 特徵的化學式：