TW200526783A - Phosphodiesterase 9 inhibition as treatment for obesity-related conditions - Google Patents

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200526783 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明提供減少動物體重及/或體脂肪之方法，例如用 於/α療過重或肥胖病患，及關於投予磷酸二酯酶9(PDE9) 抑制劑治療飲食障礙（例如暴食行為或暴食症）病患之方 法。本發明特徵亦在於以PDE9基因中斷之基因改造哺乳 動物及基因改造老鼠。 【先前技術】 !知斷為肥胖或過重的個體，患有衍生出其他健康狀 況，，例如心肌梗塞、中風、高血壓、第二型糖尿病、血脂 異常、睡眠窒息症、骨關節《、膽囊疾病、憂鬱症及特定 型式的癌症(例如子宮内膜癌、乳房癌、攝護腺癌及直腸 癌）增高的危險性。肥胖的負面健康結果使其成為美國可 預防死因中弟二主要原因，且對社會產生了顯著的經濟及 社會心理效果（見例如MeGmniaF()ege，mma咖22〇7· 2212, 1993)。
由於肥胖漸增流行，i已成A 已成為主要公共健康所關注之 事’且其現在被認為是一種慢性疾病，需要治療以降低與 其相關之健康危險性。雖然體重減少其本身為一重要的治 療結果’肥胖管理的主要目# 罟目‘之一，係改善心血管及代謝 值以降低肥胖相關發病率及死亡 ^ ^ ^ ^ ^ 手、、工顯不，減少5-10% 的肢重，可貫質上改善代謝值 痄。+ a於#立 Η血糖、血壓及脂肪濃 又因此，咸“畜思減少5-1 〇。/。的！#會 死亡率。 月旦重，可降低發病率及 9575 Ldoc 200526783 環苷麟酸二S旨酶（PDEs)催化環普之水解，例如第二信使 cAMP(環腺苷3’5’-單磷酸S旨）及cGMP(環鳥苷3’5，-單雄酸 酯）。因此，在廣泛的訊號轉換途徑中，PDE扮演關鍵的調 節角色（Beavo，Physiol· Rev. 75: 725-748，1995)。例如，pdes 調節涉及視力（McLaughlin等人，Nat· Genet. 4: 13〇_134， 1993)、嗅覺（Yan等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 92: 9677-81，1995)、血小板凝集（Dickinson等人，Biochem. J. 323: 371-377，1997)、醛固酮（aldosterone)合成（MacFarland 等人，J. Biol. Chem. 266: 136-142，1991)、胰島素分泌 _ (Zhao 等人，J. Clin. Invest. 102: 869-873，1998)、T細胞活化 (Li 等人，Science 283: 848-51，1999)及平滑肌放鬆（Boolell 等人，Int. J. Impot. Res. 8: 47-52，1996; Ballard等人，j· Urol. 159: 2164-171，1998)等過程。 PDEs形成一酵素超族（superfamily)，可再次分成11種主 要基因族（Beavo，Physiol. Rev. 75: 725-748，1995; Beavo等 人，Mol. Pharmacol. 46: 399-405，1994; Soderling等人，
Proc. Natl· Acad. Sci· USA 95: 8991-8996，1998; Fisher等 _ 人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 246: 570-577，1998; Hayashi 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 250: 751-756，1998; Soderling等人，J. Biol· Chem. 273: 15553-58， 1998; Fisher等人，J. Biol. Chem. 273: 15559-15564，1998; Soderling等人，Proc. Natl. Acad· Sci· USA 96: 7071-7076， 1999及 Fawcett等人，Proc· Natl· Acad. Sci· USA 97: 3702-3707, 2000) 〇 95751.doc 200526783 每種PDE基因族編碼一種由獨特的酵素特性及藥物輪廓 之功能上有所區隔的磷酸二酯酶。此外，每一族具有明顯 的組織、細胞及次細胞表現型（Beavo等人，Mol· Pharmacol. 46: 399-405，1994; Soderling等人，Proc. Natl· Acad. Sci. USA 95: 8991-8996，1998; Fisher等人，Biochem· Biophys· Res. Commun· 246: 570-577，1998; Hayashi等人，
Biochem. Biophys. Res. Commun. 250: 751-756, 1998; Soderling 等人，J· Biol. Chem. 273: 15553-15558，1998; Fisher等 人，J. Biol. Chem. 273: 15559-15564, 1998; Soderling等人， Proc· Natl· Acad. Sci. USA 96: 7071-7076，1999; Fawcett等 人，Proc. Natl· Acad. Sci· USA 97: 3702-3707, 2000; Boolell等 人，Int. J. Impot. Res. 8: 47-52，1996; Ballard等人，J.
Urol· 159: 2164-71，1998; Houslay，Semin. Cell Dev· Biol· 9: 161-67，1998及 Torphy 等人，Pulm. Pharmacol· Ther. 12: 131_135，1999)。因此，藉由投予可選擇性調節PDE酵素之 一族或次族活性之化合物，其可能在一細胞或組織特異方 式t調節cAMP及/或cGMP訊號轉換途徑。
Fisher 等人（J. Biol· Chem. 273: 15559-15564，1998)鑑別 出PDE9酵素為新的PDE酵素家族成員，其可選擇性地水解 cGMP更甚於cAMP。PDE9存在於多種人類組織中，包括 睪丸、腦、小腸、骨絡肌、心臟、肺、胸腺及脾臟。 PDE9抑制劑已被報導用於治療心血管疾病（WO 03/037899) 及胰島素阻抗症候群、高血壓及/或第二型糖尿病（WO 03/037432) ° 95751.doc 200526783 【發明内容】 本發明第-方面’其特徵在於治療動物減少體重 法’其包括投Μ要料治療之動物-醫療上有效量之 觸：制劑。較佳地，該動物為人類或伴㈣物(例如 狗、^、馬)且係為過重的，更佳地，該動物係為肥胖 的。在另—較佳實施態樣中，該動物係為糧食動物（例如 牛或豬）且此治療係為了產製瘦肉。在另—較佳實施 態樣中’肖PDE9抑制劑係為PDE9選擇性抑制劑或該咖: 抑制劑係經口服投予。 本發明第二方面，其特徵在於治療動物飲食障礙之方 法，其包括投予需要此等治療之動物一醫療上有效量之 PDE9抑制劑。較佳地，該飲食障礙為暴食行為或暴食 症’該PDE9抑制劑係為PDE9選擇性抑制劑或該叩即抑制 劑係經口服投予。 本發明第三方面，其特徵在於治療動物代謝病症之方 、 〃包括ί又予需要此寻治療之動物一醫療上有效量之 PDE9抑制劑。較佳地，該PDE9抑制劑係為PDE9選擇性抑 制劑或該PDE9抑制劑係經口服投予。 本务明特徵亦在於基因改造老鼠，其中該老鼠係為 PDE9基因中斷之同基因型，且其中該老鼠在六週的高脂 肪飲食後，相較於野生型老鼠在六週的高脂肪飲食後，顯 示出減少之體重或脂肪組織中（adip〇se dep〇t)減少之脂肪 質量。在一較佳實施態樣中，在控制PDE9基因的調節序 歹1J情況下，該老鼠可表現外來報導基因或該老鼠顯現出無 95751.doc .200526783 法偵測之PDE9活性。在一相關+ 相關方面，本發明提供一種衍
生自上述老鼠之經培養之基因改造之鼠類細胞。在另一相 關方面，本發明提供一種製造上述老鼠之方法，其包括·· (a)將DNA序列導入至一老鼠防細胞中，其中該序 列包括-PDE9基因標定構築冑，其經與pDE9基因重组後 可中斷酬9基因；⑻選定一基因組含有pDE9基因中斷之 老鼠ES細胞’·⑷將步驟⑻選定之防細胞導人至—老鼠囊 胚或桑椹體（m_lae)中；⑷將步驟⑷之囊胚或桑摇體移 植至假孕老鼠中；⑷發育該經移轉之囊胚或桑椹體至一期 間以製得-喪合鼠；及⑺使性徵成熟之欲合鼠及pDE9基 因中斷之異基因型老鼠交配，而得到基因中斷之同 基因型老鼠；其中該老鼠在六週的高脂肪飲食後，相較於 野生型老鼠在六週的高脂肪飲食後，顯示出減少之體重或 脂肪組織中（adipose depot)減少之脂肪質量。
本發明特徵亦在於基因改造之經培養哺乳動物細胞，其 中该細胞係為PDE9基因中斷之同基因型，且其中該細胞 或衍生自或該細胞之繼代細胞，顯現出無法偵測之pDE9 胜狀活性’其中該細胞或繼代細胞具有PDE9胜肽活性缺 乏該同基因型中斷。在一較佳實施態樣中，該細胞為為胚 胎幹（ES)細胞，更佳地，該細胞為鼠類ES細胞或人類以細 胞0 在另一方面，本發明提供一種經分離核酸分子，其包括 一 PDE11基因標定構築體，其中該構築體經與PDE9基因重 组後可中斷PDE9基因。 95751.doc •10- 200526783 熟習此項技術者將可充份瞭解本發明敘述及所附申請專 利範圍中所用以敘述本發明之詞彙。除非另有所述，下列 詞彙之定義如下文所述。 「PDE9抑制劑」意指可減少或減弱PDE9胜肽活性之藥 劑。此種藥劑可包括蛋白質（如抗PDE9抗體）、核酸（如 PDE9反義股或RNA中斷（RNAi)核酸）、胺基酸、胜肽、醣 類、小分子（有機或無機），或任何其他藉由有效降減少細 胞中PDE9存在的量或降低PDE9胜肽活性之酵素活性，而 可降低PDE9胜肽活性之化合物或組合物。作為pdE9抑制 劑之化合物，包括化合物之所有溶劑化物、水合物、醫藥 上可接受鹽、互變異構物、立體異構物及前藥。較佳地， 用於本發明之小分子PDE9抑制劑具有IC5〇低於1〇 μΜ，更 佳為低於1 μΜ，再更佳為低於〇· 1 μΜ。用於本發明之任何 PDE9抑制劑較佳係為選擇性對抗一些或所有其他的 PDEs，較佳係對抗 PDE1A、PDE1B、PDE1C、PDE2、 PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、 PDE5、PDE6、PDE7A、PDE7B、PDE8A、PDE8B、 PDE10及 /或 PDE11。 「選擇性」PDE9抑制劑意指一種抑制PDE9活性之藥 劑，其IC5G較抑制一或多種其他PDEs之IC5〇至少低於10 倍，較佳為至少低於1〇〇倍。較佳地，此種藥劑係與醫藥 上可接受傳送媒介物或載體組合。PDE9基因或抑制其表 現之mRNA之反義股寡核苷酸，係根據標準技術所製得（參 見例如 Agrawal 等人 Methods in Molecular Biology: 95751.doc 200526783
Protocols for Oligonucleotides及 Analogs，Vol. 20，1993)。 同樣地，擔任降低細胞中PDE9酵素製造功能之RNA分 子，可根據此技藝中所習知之標準技術製得（參見例如 Hannon, Nature 418: 244-251, 2002; Shi5 Trends in Genetics 19: 9-12，2003; Shuey等人，Drug Discovery Today 7: 1040-1046， 2002) 〇 PDE9抑制劑之實例為本文或WO 03/037899，WO 03/03 743 2及2003年4月30日所申請之美國臨時申請案第 60/466,639號中所提供者，在此併入參考。 「減少（降低）之PDE9活性」意指由於基因中斷或操縱 _ PDE9基因功能而弓1起細胞中功能性PDE9多肽水平的降低 的結果，或由於投予抑制PDE9活性的藥物的結果，而使 PDE9酵素的多肽活性經操縱地減少。 「醫藥上可接受的」一詞係指經指定的載體、媒介物、 稀釋劑、賦形劑及/或鹽，與配方中所含的原料，可一般 性化學及/或物理性地相容，且與接受者可生理上相容。 「前藥」一詞係指一化合物其為藥的前驅物，在經投藥 後，在活體内經由化學或生理過程（例如達到生理pH或透 過酵素活性）而釋放出藥物。前藥的合成及用途之討論， 由 Higuchi及 Stella，Prodrugs as Novel Delivery Systems，vol. 14 of the ACS Symposium Series，及 Bioreversible Carriers in Drug Design，ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association及Pergamon Press，1987之内容所提供。 「鹽」及「醫藥上可接受鹽」等詞係指化合物的有機及 無機鹽，化合物的立體異構物，或化合物的前藥。 95751.doc 12 200526783 「過重」及較嚴重的「肥胖」狀況，在1 8歲或更年長的 成年人中，為具有較理想體重為重（更特言之，較理想體 脂肪為重），且一般由身體質量指數（BMI，與總體脂肪及 遭受過早死亡或殘疾之相對危險性有關，其係因過重或肥 胖結果所引起之疾病）所界定。健康的危險性隨著過度體 脂肪的增加而增加。BMI係為體重（公斤）除以身高（平方公 尺）(kg/m2)，或體重（英磅）除以身高（平方英吋）再乘上 703(lbsx703/in2)所得。「過重」典型上為BMI值介於25.0至 29.9之間。「肥胖」典型上定義為BMI為30或更大（見例如 籲 National Heart，Lung及 Blood Institute，Clinical Guidelines on the Identification，Evaluation及 Treatment of Overweight 及 Obesity in Adults，The Evidence Report, Washington，DC: U.S. Department of Health^ Human Services, NIH publication no. 98-4083, 1998)。在大肌肉的個體中，BMI、體脂肪及疾 病危險性的相關性，較其他個體為弱。因此，是否大肌肉 個體真的為過重或肥胖之評估，可由其他的測量更為正確 _ 地進行，例如直接測量總體脂肪或腰部至臀部比例評估。 施予基因改造或野生型老鼠之「高脂肪飲食」，係指至 少由45%仟卡脂肪及較佳至少58%脂肪所構成的飲食。該 種飲食的實例包括史威特飲食（Surwit diet)(Surwit等人， Metabolism 47: 1354-1359; Surwit等人，Metabolism 47: 1089-1096, 1998; Surwit等人，J· Biol· Chem· 271: 9437-9440, 1996 及 Surwit 等人，Metabolism 44: 645-651，1995)，D12451 齧齒 動物飲食（45% 仟卡脂肪，Research Diets，Inc·，New 95751.doc 13 200526783
Brunswick，NJ)，及D1233 1齧齒動物飲食（58%仟卡脂肪， Research Diets，Inc·)。 本文中所定義之「代謝病症」，根據第三版成人治療流 程（ATP III ;國家衛生院（National Institute of Health):美 國國家膽固醇教育計劃對檢測、評估及治療成人高膽固醇 之第三次報告（Adult Treatment Panel III)，執行摘要； Bethesda，MD，國家衛生院，國家心臟、肺臟與血液研究
院（National Heart，Lung and Blood Institute)，2001 (NIH 第01-3 670公告），其出現在當一個人具有以下三或多個標 準時： 1·腹部肥胖：男性腰圍>102公分及女性腰圍>88公分； 2·尚二甘油脂：g 1 5〇毫克/升（1.695毫莫耳/升） 3·低HDL膽固醇··男性為<40毫克/升（1〇36毫莫耳/升）及女 性為<50毫克/升（1.295毫莫耳/升）； 4·局血麼·· —130/85 mmHg ; 5·高空腹血糖：-110毫克/升（$61毫莫耳/升）；或， 根據世界愤生組織標準（Alberti and Zimmet，Diabet Med 15·· 539-53, 1998)，當-個人具有糖尿病、葡萄糖耐受異 吊、空腹血糖異常或胰島素阻抗，加上以下二或多個不正 常情況： 1 ·高血壓·· - 1 60/90 mmHg ; 2·高血脂··三甘油脂濃度-15〇毫克/升（1·695毫莫耳/升）， 及/或HDL膽固醇在男性為<35毫克/升（〇9毫莫耳/升）， 及女性為<39毫克/升（ι·〇毫莫耳/升）； 95751.doc 14 200526783 3·軀幹肥胖：腰至臀比例在男性為>〇·9〇，及女性為 >0.85，及/或ΒΜΙ〉30公斤/平方公尺； 4.微白蛋白尿：尿蛋白排泄率-20微克/分鐘或白蛋白對 肌酸比例^20毫克/公斤。 「醫療有效的」意為導致體脂肪減少。 「中斷的PDE9基因」係指PDE9基因經基因改造後，使 得經中斷的基因所編碼的PDE9多肽之細胞活性，在可正 常表現野生型PDE9基因的細胞中為降低的，或較佳地為 去除的。當基因改造有效地去除所有細胞中野生型PDE9 基因時（例如基因改造、非人類哺乳動物或動物細胞為 PDE9基因中斷之同基因型，或PDE9基因僅原先存在而後 經中斷），相較於表現野生型PDE9基因之對照細胞，此基 因改造可導致PDE9多肽活性之降低。此Pde9多肽活性下 降’係由於降低的PDE9基因表現（即，pdE9 mRNA水平經 有效地減少，導致PDE9多肽的降低水平），及/或因為經中 斷的PDE9基因編碼經功能改變（如下降）的突變多肽（相較 於野生型PDE9多肽）。較佳地，基因改造、非人類哺乳動 物或動物細胞中的PDE9多肽活性，係下降至野生型水平 之50%或更低，更佳地為25%或更低，再更佳地為1〇%或 更低。最佳地，同基因型PDE9基因中斷，在顯示具有野 生型PDE9活性類型的細胞中，係導致細胞中無法測得的 PDE9活性。 含有中斷PDE9基因的「基因改造、非人類哺乳動物」， 係指非人類哺乳動物由遺傳工程所創造出含有經中斷 95751.doc -15- 200526783 咖9基因，及繼承財斷PDE9基因之此種非人類哺 物的繼代細胞。基因改造、非人類哺亀，可藉由例如 創造帶有所欲基因改造之囊胚或胚胎，錢將囊胚或胚妒 植入養育母體中在子宮發育而製得。I因改造的囊胚或： 胎，當為老鼠的情況時，可由將基因改造的胚胎幹細胞植 入至老鼠囊胚’或將ES細胞及四倍體胚胎聚集而製得。或 者，不同種類的基因改造的胚胎，可由核轉移而得。當為 核轉移時，捐贈細胞為體細胞或多功能性幹細月包，且:娘 工程化後得到所欲之PDE9基因中斷之基因改造。此細： 的核隨後移轉至經摘除細胞核之受精或單性卵母細胞中； 所得的胚胎經重組並發育成囊胚。以上述任一種方法製造 之基因改造之囊胚，隨後再以至熟習此項技術者所已知之 標準方法，將其植入至養育母體中。「基因改造、非人類 哺乳動物」包括所有以上述方法創造的非人類哺乳動物之 繼代，除了該繼代繼承至少一基因中斷之基因改造之副 本。較佳地，所有的體細胞及幼體細胞基因改造、非人類 哺乳動物均含有該改造。較佳之經基因改造而含有中斷 PDE9基因之非人類哺乳動物，包括齧齒動物（如老鼠）、 貓、狗、兔、天竺鼠、倉鼠、綿羊、豬及白鼬。 含有中斷PDE9基因之「基因改造動物細胞」’係指由基 因工程改造而創造出含有中斷PDE9基因的動物細胞（較佳 為哺乳動物細胞），包括人類細胞，及子細胞及自基因改 造之親代ES或幹細胞分化之細胞，其繼承中斷pDE9基 因。這些培養物中之細胞可以此技藝中任何已知之標準方 95751.doc -16- 200526783 法以方式進行基因改造。基因改造培養物中之細胞之另一 方法’ 5亥非人類哺乳動物細胞亦可自含有PDE9基因中斷 之基因改造、非人類哺乳動物中分離。本發明之動物細 胞’可得自初級細胞或組織製備物，及適合培養、致腫瘤 或經轉形之細胞株。這些細胞及細胞株可衍生自例如内皮 細胞、上皮細胞、胰島、神經元及其他神經組織衍生細 胞、間皮細胞、骨細胞、淋巴細胞、軟骨細胞、造血細 胞、免疫細胞、主要腺體或器官（例如睪丸、肝臟、肺 臟、心臟、胃、胰臟、腎臟及皮膚）之細胞、肌肉細胞（包 括自骨骼肌、平滑肌及心肌之細胞）、外分泌或内分泌細 月已"戴、准母細胞及胚胎及其他全功能或多功能幹細胞（如 ES細胞、似ES細胞、胚胎幼體細胞、及其幹細胞，例如 前驅細胞及組織衍生幹細胞）。較佳的基因改造細胞為以 細胞、更佳為老鼠或大鼠ES細胞，最佳為人類Es細胞及 自基因改造ES細胞所分化的細胞。 「基因改造」之非人類哺乳動物或動物細胞係由基因工 程改造的異基因型或同基因型，該改造係導入至非人類哺 礼動物或動物細胞，或至先驅非人類哺乳動物或動物細胞 中。可導入該改造之基因工程之標準方法，包括同源重 、、且病毋載體基因誘捕（trapping)、放射線、化學突變、及 編碼反義RNA之核苷酸之轉基因表現（單獨或與催化性核 糖酶）。較佳之中斷基因之基因改造佳方法，係為可藉由 插入一「外來核酸序列」至基因位點而修改内源性基因之 方法，例如同源性重組或病毒載體誘捕。「外來核酸序 95751.doc 200526783 列」係非天然出現於基因中之外源性序列。外來疆之插 入可^生在PDE9基因之任何區域，例如在增強子、啟 動子、調節區域、非編碼㈣、編碼區域、内含子或外顯 子最佳之基因中斷之基因工程方法係同源性重組，其中 外來核酸序列係以目標化方式單獨插人，或結合了内源性 基因序列之部分刪除。 同基因型體」，當指在非人類哺乳動物或動物細胞中 之PDE9基因中斷日卞，意為具有pDE9基因之所有對偶基因 中斷之非人類哺乳動物或動物細胞。然而，每一中斷之對 偶基因之PDE9基因序列不須相同。例如，非人類哺乳動 物可為PDE9中斷之同基因型，其中？卿之_對偶基因由 於基因序列之一區域刪除而中斷，而另一對偶基因由於基 因序列之另一區域刪除而中斷。 「ES細胞」或「似ES細胞」意指衍生自胚胎、原生殖 細胞或畸胎癌之多功能幹細胞，其能不定性自我更新及分 化成所有三種胚胎層組織代表之細胞類型。 「微陣列」意指獨特聚核苷或多肽之在一基質上之排 列’在此更多欽述。 野生型」’當指非人類哺乳動物或動物細胞時，音為 非人類哺乳動物或動物細胞，根據具體情況而定，其不包 括中斷之PDE9基因。例如，將本發明之非人類哺乳動物 特性與野生型哺乳動物之特性比較時，野生型一詞係彳t不 含中斷PDE9基因之非人類哺乳動物（即哺乳動物的pDE9& 因為野生型）。較佳地，野生型非人類哺乳動物實質上與 95751.doc -18- 200526783 本發明之非人類哺乳動相似，更佳地為實質上相同，除了 其PDE9基因分別為非中斷及中斷。同樣地，例如，將本 發明之動物細胞特性與動物細胞之特性比較時，野生型一 詞係指不含中斷PDE9基因之動物細胞（即動物細胞的PDE9 基因為野生型）。較佳地，野生型動物細胞實質上與本發 明之動物細胞相似，更佳地為實質上相同，除了其PDE9 基因分別為非中斷及中斷。 根據下列的詳細序述及申請專利範圍，本發明之其他特 徵及優點將更為明顯。雖然本發明以特定的實施態樣敘 _ 述，吾人將明瞭可能進行之其他改變及修飾，亦為本發明 之一部份並在所附申請專利範圍之範疇内。本申請案意欲 涵蓋遵循本發明一般原則之任何相等、變更、應用或改 編，其包括即便悖離本揭示但在此技藝中為已知或慣例 者，及在不須過度實驗情況下可被確定者。關於製備及利 用核酸及多肽之額外導引，可見於分子生物學、蛋白質學 及免疫學之標準教科書（參照例如Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, · Inc·，New York，NY，1986; Hames 等人，Nucleic Acid Hybridization，IL Press，1985; Molecular Cloning，Sambrook等 人，Current Protocols in Molecular Biology，Eds. Ausubel 等 人，John Wiley 及 Sons，2001; Current Protocols in Human Genetics，Eds. Dracopoli 等人，John Wiley 及 Sons，1994;
Current Protocols in Protein Science, Eds. John E. Coligan 等人，John Wiley 及 Sons，2002;及 Current Protocols in 95751.doc -19- 200526783
Immunology, Eds. John E. Coligan 等人，John Wiley 及 Sons，1994)。 【實施方式】 本發明係關於減少動物體重及/或體脂肪之方法，例如 用於治療過重或肥胖病患（例如人類或伴侣動物），或作為 產製糧食動物（例如牛、雞或豬）中痩肉之方法，及關於投 予PDE9抑制劑治療飲食障礙（例如暴食行為或暴食症）之需 要此等治療病患之方法。本發明特徵亦在於進一步研究 PDE9功能之生物學工具，例如具有PDE9基因中斷之基因 改造老鼠及動物細胞。如實施例所揭示者，投予PDE9抑 制劑減少肥胖ob/ob老鼠模型之體重增加，且剔除PDE9基 因之老氣在暴露於高脂肪飲食之後對增加體重及增加肥胖 之發展，相對上較具有抵抗性。二個實施例均顯示引起 PDE9活性下降為降低體重及/或體脂肪有效之方法，及可 用於治療過重，肥胖或患有飲食障礙之動物病患，及可用 於產製糧食動物種類以產製痩肉。 例示之PDE9抑制劑 任何PDE9抑制劑均可用於本發明。PDE9抑制劑為此技 藝中所習知者，且可以此技藝中所習知之標準分析（例如 WO 03/037899及WO 03/037432)測定。用於本發明方法之 PDE9抑制劑包括揭示於WO 03/037899及WO 03/037432 者，及揭示於2003年4月30曰申請之美國臨時申請案第 60/466,639號者，在此併入本文中參考。揭示於上述美國 臨時申請案中作為PDE9抑制劑之化合物，包括： 95751.doc -20- 200526783 3-異丙基_5-[2-(2-嗎啉-4-基_乙氧基）_苯甲基]-1，6_二气 吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮（下文中指「化合物A」）； 1-{[2-(3-異丙基_7·氧基_6,7_二氫_1H•吡唑并[4,3^]嘧 咬-5-基甲基）_苯氧基]_乙醯基}_四氫0比咯羧酸； 3-異丙基_5-[2-(2_氧基-2·哌嗪-1_基-乙氧基）_笨甲基]· 1，6-二氫比唑并[4,3-d]嘧啶酮三氟醋酸鹽； 3 "丙基-5-[2-(2 -嗎琳-4-基-2-氧基_乙氧基）_笨甲基] 1，6-二氫-吡唑并[4,3-d]嘧啶_7_酮； 3-異丙基-5-[2-(2-氧基-2-四氫吡咯-1-基-乙氧基）_笨甲 基]-1，6·二氫-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7·酮； N，N-二乙基-2-[2_(3_異丙基_7_氧基_6,7_二氫_ih_吡唑并 [4,3-d]嘧啶基曱基）_苯氧基]_乙醯胺； {[ (3 "、丙基-7-氧基-6,7-二氫-1H-吼。坐并[4,3-d]。密 疋5基·甲基）_苯氧基]_乙醯基卜四氫吡咯_2_羧酸甲酯； 95751.doc 200526783 3-異丙基-5-[2-(2-嗎啉-4-基-乙氧基）-環己基曱基]-1,6-二氫比嗤并[4,3-dp密咬-7-¾ ; 5-[5 -氣-2-(2-嗎°林-4-基-乙氧基）·本甲基]-3-異丙基-1，6-1 二氫比嗤并[4,3-(1]口密咬-7-酉同； 3-環戍基- 5- [5 -氟-2-(2 -嗎琳-4·基-乙氧基）-苯甲基]-1，6-二氫-π比吐并[4,3-(1]°密ϋ定-7-酮； 9-(1，2-二曱基-丙基）-2-[2-(2 -嗎σ林-4 -基-乙氧基）-本甲 基]-1，9-二氫-17票呤-6-_ ; 2- [2-(2·嗎琳-4-基-乙氧基）-苯甲基]-9-(四鼠-ϋ夫喃-3-基）-1，9-二氫-嘌呤-6-酮； 5-[2-(2-二乙基胺基-乙氧基）-苯曱基]-3-異丙基-1，6-二 氫_。比。坐并[4，3 -d]鳴σ定-7-酉同； 3- 環戊基-5-[2-(2-嗎啉-4-基-乙氧基）-苯甲基]-1，6-二氫- 口比σ坐并[4，3 -d]σ密咬-7-酉同； 9-(l(R)，2-二曱基-丙基）-[2-(2-嗎啉-4-基-乙氧基）-苯甲 基]-1，9-二氮-°票0令-6-嗣， 9-(2-甲基-丁基）-2-[2_(2 -嗎琳-4-基-乙氧基）-本甲基]-1，9-二氳-嗓吟-6-酮； 9-ί哀戍基-2- [2-(2-嗎°林-4-基-乙氧基）-苯甲基]-1，9-二鼠-σ票呤-6 - _ ; 5-[2-(2-嗎啉-4-基-乙氧基）-苯甲基]-3^比啶-3-基-1，6-二 氫比η坐并[4,3-(1]。密咬-7-麵I ; • 9-(1，2-二甲基-丙基）-2-[2-(2-嗎啉-4-基-乙氧基）-苯甲 • 基]-1，9·二氫-嘌呤-6-酮； 95751.doc -22- 200526783 9-異丙基-2-[2-(2-嗎琳_4_基·乙氧基）_苯甲基]+ 9·二氮_ σ票吟-6-酮； 2-[2-(2·馬林4_基-乙氧基）·苯甲基]_9_(四氫_咬喃士基曱 基）-1，9-二氫-ϋ票吟-6-酉同； 9-(1-異丙基-2-甲基-丙基）·2_[2_(2_嗎琳_4•基-乙氧基卜苯 甲基]-1，9-二氫-嗓呤-6-嗣； 9-(1 -乙基-丙基Μ '馬啉-4-基-乙氧基）_苯甲基]_ 1，9-二氫-嘌呤-6-_ ;及 Ν-[2-(3-異丙基-7-氧基_67 -片irr ，一一虱-1H-吡唑并[4,3_d]嘧啶-5-基甲基）·環己基]_2•四氫^各+基—乙酿胺。 熟習此項技術者當明睁上列彳μ人仏 緊上列化合物之所有立體異構物、 互變異構物、溶劑化物、泱入仏 、，— 物纟合物、前藥及醫藥上可接受 鹽，均包括在本發明内。 治療方法 經鑑定為舰9抑制劑之藥 脂肪’例如減少一或多個脂肪組織質量之劑量投藥。此種 醫療有效量可利用日常最佳化技術決定，例如由病患或動 物之狀況、投藥途徑、配方、從業人員的判斷、及1他、 習此項技術者根據本發明揭示為顯而易知的因素而決、/、、 、適用於本發明之卿抑制劑可單獨投藥，但在二。 治療時，則與根據給藥途徑及標準醫藥習慣 '白、 藥賦型劑，稀釋劑或載劑混合投藥。 ^田醫 例如，適用於本發明之PDE9抑制 具鹽或溶劑仆 物，可以錠劑、膠囊（包括軟膠膠囊 ；夕俽粒、凝膠、薄 95751.doc -23- 200526783 膜、栓劑（ovules)、酿劑（elixirs)、溶液或懸浮液之型式 以口服、口頰或舌下方式投藥，其可包含調味劑或；色 劑’用於即釋、緩#、控釋、長效、雙控釋放或脈衝釋放 之應用。㈣化合物亦可經由快速分散或快速溶解劑型， 或以：能分散液形式或作為經包衣顆粒之方式投藥。適合 的醫藥配方依所欲可為包衣或未包衣。 此等固體醫藥組合物’例如錠劑，可包括賦型劑⑼微 晶纖維素）、乳糖、擰檬酸納、碳_、魏氫_、甘胺 酸及殿粉（較佳為玉米、馬鈴薯或木薯粉）、崩解劑（如甘醇 酸澱粉納）、交聯甲基纖維素鈉及某些複合石夕酸鹽，及粒 化結著劑（如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素 (醒〇、經丙基纖維素（Hpc)、醋酸琥轴酸經丙基甲基纖 維素（HPMCAS)、蔗糖、明膠及阿拉伯膠）。又，亦可包含 潤滑劑，例如硬脂酸鎮、硬月旨酸、^酸甘油（脚― behenate)及滑石粉。 相似類型的固體組合物亦可作為明膠踢囊或H p m C膠囊 的充填物。此方面較佳的賦型劑包括乳糖、澱粉、纖維 素、乳糖（mUk Sugar)或高分子量聚乙二醇。對於水性懸浮 液及/或酏劑，PDE9抑制劑化合物可與不同的甜味或調味 劑、著色劑或色素，及乳化劑及/或懸浮劑及稀釋劑（如 水、乙醇、丙二醇及甘油，及其組合。 調釋及脈衝釋放劑型可包括賦型劑（如前詳述用於即釋 劑型及其他作為釋放速率修飾劑之賦型劑），其可塗覆在 表面及/或内含於該藥物裝置之内部。釋放速率修飾劑包 95751.doc -24- 200526783 括但非專限於HPMC、HPMCAS、曱基纖維素、羧曱基纖 維素鈉、乙基纖維素、醋酸纖維素、聚環氧乙烷、黃原 膠、卡波姆（carbomer)、銨基羧甲基丙烯酸酯共聚物、氫 化蓖麻油、巴西棕櫚蠟、石蠟、鄰苯二曱酸醋酸纖維素、 鄰笨二甲_丙基甲基纖維f、甲基丙稀酸共聚物及其混 合物。調釋及脈衝釋放劑型可包釋放速率修飾賦型劑之一 種或組合。釋放速率修飾賦型劑可存在於 質内）及/或在劑型上（即在表面或包衣上）。内（P在基 快速分散或溶解敎方（FDDFs)可包含下列原料：阿斯 巴甜、續酸内i旨鉀、擰檬酸、交聯f基纖維素納、交聚維 _(Crospovidone)、二壞血酸、丙稀酸乙醋、乙基纖維 素、明膠、經丙基甲基纖維素、硬脂酸鎮、甘露醇、甲基 丙稀酸甲S旨、薄荷調味劑、聚乙二醇、無煙妙石、二氧:匕 矽、甘醇酸殿粉納、硬脂酸富馬酸納、山梨醇、木糖醇。 在此用以敘述㈣Fs之分散或溶解一詞，視所使用之藥物 =解度而H當藥W性時，可製備成快速崩解 別型，當藥物為可溶性時，可製備成快速溶解劑型。 ^適用於本發明之PDE9抑制劑，亦可以非㈣道方式投 樂，例如海綿體注射、靜脈注射、動脈 射、椎管内注射、腦室内注 / 、見、内注 A+ , /主射尿道内注射、胸骨内注 射、顧内注射、肌肉内注射， ^ ^ 4. - /皮下，主射，或其可以點滴或 無針技術投樂。對於此等非經 ^ — 非、·二腸道方式投藥，其最佳可用 、…、囷水〉谷液之形式，其可包含1 弋贫^一他物^ ’例如足夠的鹽 或葡萄糖使溶液與血液等張。水 夜視而要應適當地缓衝 95751.doc -25. 200526783 化（較佳為PH 3至9)。適當的非經腸道配方在無菌狀況下之 製備，可以此技藝中熟習此項技術者標準製藥技術完成。 對於人類病患之口服及非經腸道投藥者，用於本發明之 PDE9抑制劑之每日劑量水平，通常為a·毫克（單次或 分開之劑量）。較佳的劑量範圍為約以克至約ι〇〇毫克。 該劑量可為單次劑量，#日二次劑量或每日多次劑量。或 者，連續劑量’例如經由控制釋放劑型，其中該連續劑型 可以-天為基礎方式投藥，或其中該連續劑型可經由每次
超過一天的慢釋型配方給藥。 士此適用於本發明之PDE9抑制劑之旋劑或膠囊，可 包含例如1毫克至250毫克之活性化合物，適當地用於每次 單一或二或多次投藥。較佳的錠劑或膠囊可包裝約丨毫克 至約50宅克之活性化合物，適當地用於每次單一或二或多 次投藥。無論如何，醫師可決定最適合於任何病患之實^ 劑量，且其將依年齡，體重及特殊病患之反應而有所變
化。當然，亦有單獨情況下為較高或較低的劑量範圍，此 亦在本發明之範》壽内。 適用於本發明之PDE9抑制劑亦可鼻内或吸入方式投 藥，其傳統上係以乾粉吸入器或氣溶膠喷霧方式之形式傳 遞，該氣溶膠喷霧方式為增壓容器、幫浦、噴霧器或霧化 器，並利用適當的推進劑（如二氣二氟曱烷、三氣三氟曱 烷、二氣四氟曱烷、氫氟曱烷（如丨丄丨义四氟曱烷（hfa 134ATM或1，1，1，2,3,3,3-七氟丙烷（（HFA 227EATM)，二氧化 石反或其他適當的軋體）。若為增壓的氣溶膠，該劑量單位 95751.doc -26- 200526783 可由提供一閥而傳遞計算之量而決定。增壓容器、幫浦、 噴霧器或霧化器可包括活性化合物之溶液或懸浮液，利用 例如乙醇及推進劑之混合物作為溶劑，其可另包含潤滑气 (如山梨糖醇酐三油酸酯）。用於吸入器或吹藥器之膠囊及 軟膠囊（如自明膠製備），可調配成含有本發明化合物之粉 末混合及適當之粉末基底（如乳糖或澱粉）。 氣溶膠或乾粉配方適當地安排使得每一計量之劑量或每 T出含有1至50¾克之PDE9抑制劑，以傳遞至接受治療 之動物中。全部的每日劑量及氣溶膠在1至5〇毫克之範圍 内’其可以每曰單次劑量，或較常以每曰二次劑量投藥。 適用於本發明之PDE9抑制劑亦可調配成經由噴霧器方 式傳遞。用於喷霧器裝置之配方可包含下列成份作為增溶 劑、乳化劑或懸浮劑：水、乙醇、甘油、丙二醇、低分子 ϊ聚乙二醇、氣化鈉、氟碳物、聚乙二醇醚、山梨糖醇酐 三油酸自旨、油酸。 或者，適用於本發明之PDE9抑制劑可以栓劑或陰道栓 劑形式投藥，或其可以凝膠、水凝膠、洗液、溶液、乳 膏、油膏或隔離霜之形式局部塗敷。適用於本發明之 PDE9抑制劑亦可以皮膚或穿透皮膚方式投藥，例如利用 皮膚貼布。其亦可以肺或直腸途徑投藥。 適用於本發明之PDE9抑制劑亦可以眼部途徑投藥，用 於眼藥時，該化合物可在等張、pH調整、無菌生理食鹽水 中凋配成微化懸浮液，或較佳地，在等張、調整、無菌 生理食鹽水中調配成溶液，視需要與防腐劑（如苯扎氯 95751.doc -27- 200526783 銨）或者，其可在油膏（如凡士林）中調配。 用於局部塗敷至皮膚時，適用於本發明之PDE9抑制可 調配成適當之含有活性原料或藥劑、懸浮或溶解於例如一 或多種下列物質之混合物之油膏：碌物油、液態凡士林、 白色凡士林、丙二醇、聚氧基乙基聚氧基丙基化合物、乳 匕鼠及水。或者’其可調配成適當之懸浮或溶解於例如一 或夕種下列物貝之混合物之洗液或乳膏：礦物油、山梨醇 酐單硬脂酸醋、聚乙二醇、液態石蟻、聚山梨醇_〇1 、_醇、2_辛基十二烧醇、苯甲醇及水。 _適用於本發明之PDE9抑制亦可與環狀糊精結合使用。 環狀糊精已知可與藥物分子形成内含及非内含複合物。藥 物-環狀糊精複合物之形成，可改變藥物分子之溶解戶、 溶_率、生體可利用率及/或穩定性質。藥物環狀㈣ =物-般可用於大部分的劑型及投藥途徑。或者，為使 :、複合化，技狀糊精可作為辅助添加物，例如作為載 劑、稀釋劑或增溶劑精為最常使^ 一些種類，適當的範例敘述於w〇 91/1丨172、w WO 98/55148。 ⑽ 18及 般而言’口服投藥係較佳的途徑，其最 受者患有㈣障礙或口服投藥後對藥物吸收損害之；： 下，藥物可以非經腸，舌下或口頻方式投藥。之“ 用於獸醫時，PDE9抽也丨t丨π ^ Ρ制知彳可以根據一般獸醫習慣之、高 Π，：方投樂’獸醫外科醫生可決定最適合於特別動 物之給樂方法及途徑投藥。該動物包括過重、肥胖或= 95751.doc -28- 200526783 過重或肥胖危險之伴伯動物。根據本發明可治療之其它動 物為製糧食動物，其係為了產製瘦肉。 此等咖9抑制劑之醫療效果，可根據標準醫療程序， 在細胞培養物或實驗動物中測定，例如測定ED5〇(5〇%族群 有療效之劑量）。 自細胞培養物分析及動物研究所得的數據，可用於調配 :於亡類的劑量範圍。該劑量係有所化，例如依配方及投 藥达仅而&。對於用於本發明之方法巾之抑制劑， 該醫療有效量最初可自細胞培養物分析中估算出。劑量可 在動物核型中5周配’以達到一包括在細胞培養物中測定之 ICy之循環血漿濃度範圍。該資料可用於更正確地決定用 於人類中的劑量。血漿濃度可以例如高效能液相層析測 量。 適用於本發明之PDE9抑制劑亦可與其他用於治療本文 t所述疾病、狀況及/或障礙之其他藥劑共同使用。因 此，包括投予PDE9抑制劑與其他藥劑之治療方法，亦包 括在本發明中。可用於與本發明之化合物之適當藥劑包括 抗肥胖劑（如&腎上腺素受體拮抗劑）、載脂蛋白b (aPoliP〇protein-B)、分泌/微粒體三甘油酯移轉蛋白（印〇 B/MTP)抑制劑、胜肽ΥΥ3_36及其類似物、MCR_4促進劑: 膽囊收縮素-A (CCK-A)促進劑、單胺再吸收抑制劑（如西 布特胺（sibutramine))、交感神經作用劑、麻受體括抗^ (如利莫納班（rimonabant)(SR-141，716A))、多巴胺促進巧 (如伯莫克利婷（bromocriptine))、黑色素細胞刺激激素為 95751.doc -29- 200526783 體類似物、5HT2c促進劑、黑色素濃縮激素拮抗劑、瘦體 素（leptin)(〇B蛋白）、瘦體素類似物、瘦體素受體促進劑、 甘丙肽（galamn)拮抗劑、脂肪酶抑制劑（如四氫立普斯達丁 (tetrahydrolipstatin)，即奥列司他（〇distat))、厭食劑（如蛙 皮素促進劑）、神經肽-Y拮抗劑、擬甲狀腺劑、脫氫表雄 留酮或其類似物、糖皮質激素受體促進劑或拮抗劑、食慾 素（orexin)受體拮抗劑、似騰高血糖素肽_ 1受體促 進劑、毛狀神經營養因子（如購自Regener〇n pharmac⑽
Inc·，Tarrytown，NY及 Procter & Gamble c〇mpany，❿此蝴，〇h 之AxokineTM)、人類刺鼠色蛋白相關蛋白（AGRp)、胃飢餓 素（ghrelin)受體拮抗劑、組織胺3受體拮抗劑或逆促進劑、 神經介素U受體促進劑、„心羥基類固醇脫氫酶_丨抑制劑及 其類似物。其它抗肥胖劑，包括下文所述之較佳藥劑，亦 為技藝人士熟知者或根據本發明之揭示係為顯而易見者。 特佳者為選自包括奥列司他、西布特胺、伯莫克利婷、 麻黃素、痩體素、偽麻黃素及胜肽YY3 36(包括其類似 物）。較佳地，本發明之化合物及醫療組合係配合運動及 明智的限定飲食下投藥。 用於該組合、醫藥組合物及本發明方法之抗肥胖劑，可 利用熟習此項技術者習知之方法製備，例如西布特胺可以 如美國專利第4,929,629號所述者製備；伯莫克利婷可以如 美國專利第3,752,814及3,752,888號所述者製備；奥列司他 如美國專利第 5,274，143、5,420,305、5,540,917 及 5,643,874號所述者製備；及胜肽γΥ336(包括其類似物）可 95751.doc -30- 200526783 以如美國專利申請號第2002/0 141985號及WO 03/027637所 述者製備。 技藝人士當認知可影響需有效治療哺乳動物之劑量及時 間之特定因素，其包括但非限於疾病或障礙之嚴重度、前 處理、哺乳動物的一般健康情況及/或年齡、及其他存在 的疾病。再者，以醫療有效量之PDE9抑制劑對哺乳動物 之治療，可包括單一性治療，或可包括一連串之治療。 基因改造非人類哺乳動物及細胞 本發明之基因改造、非人類哺乳動物及基因改造動物細 · 胞（包括人類細胞），係經PDE9基因中斷之改造之異基因型 或同基因。動物細胞可衍生培養物中之基因工程細胞，或 當其為非人類哺乳動物時，該細胞可自基因改造、非人類 哺乳動物分離。 PDE9基因之中斷 為創造本發明之基因改造非人類哺乳動物及哺乳動物細 胞，PDE9基因位點可利用此技藝中所習知之基因改造技 術中斷，其包括化學致突變（Rinchik，Trends in Genetics 7: 15- · 21，1991，Russell，Environmental & Molecular Mutagenesis 23 (Suppl· 24): 23-29，1994)、PDE9基因反義股RNA之轉基因表 現（單獨或與催化性核糖酶序列）(Luyckx等人，Proc· Natl·
Acad· Sci. 96: 12174-79, 1999; Sokol 等人，Transgenic
Research 5: 363-71，1996; Efrat 等人，Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91: 205 1-55，1994; Larsson等人，Nucleic Acids Research 22: 2242-48, 1994)，及進一步如下所討論者，將 95751.doc •31 · 200526783 外來核酸序列插入至PDE9基因位點之PDE9基因中斷。較 佳地，該外來基因係以同源性重組插入或以病毒載體插 入。最佳地，本發明之創造基因改造非人類哺乳動物及動 物細胞之PDE9基因中斷之方法，係同源性重組，其包括 部分内源性PDE9基因序列之刪除。 外來序列之欲入係透過一或多種下列機制中斷PDE9基 因：干擾PDE9基因轉錄或轉譯過程（例如干擾啟動子之辨 識，或導入轉錄終止位點或轉譯終止密碼至PDE9基因 内）；或扭曲PDE9基因編碼序列使其不再編碼具有正常功 _ 能之PDE9多肽（例如插入外來編碼序列至PDE9基因編碼序 列，導入移碼突變或胺基酸取代，或當其為雙重交叉情況 時，刪除一部分功能性PDE9蛋白質表現所需之PDE9基因 編碼序列）。 根據此敘述，為插入外來基因至細胞染色體之之PDE9 基因位點以創造本發明之基因改造非人類哺乳動物及動物 細胞，該外來基因序列係根據此技藝中習知之標準方法導 入至細胞中，例如電穿孔法、鈣-磷酸鹽沉澱法、逆轉錄 ® 病毒感染、微注射法、基因槍法、微脂體轉染、DEAE-右 旋糖苷轉染法、或轉移感染法（transferrinfection)(參照例 如 Neumann 等人，EMBO J. 1: 841-845，1982; Potter 等人，
Proc。Natl. Acad· Sci USA 81: 7161-65，1984; Chu等人，
Nucleic Acids Res. 15: 1311-26，1987; Thomas及 Capecchi，
Cell 5 1: 503-12, 1987; Baum等人，Biotechniques 17: 1058-62，1994; Biewenga等人，J. Neuroscience Methods 71: 67-75， 95751.doc -32- 200526783 1997; Zhang等人，Biotechniques 15: 868-72，1993; Ray及 Gage，Biotechniques 13: 598-603，1992; Lo，Mol· Cell.
Biol· 3: 1803-14，1983; Nickoloff等人，Mol· Biotech. 10: 93-101，1998; Linney等人，Dev. Biol. (Orlando) 213: 207-16，1999; Zimmer及 Gruss，Nature 338: 150-153，1989及 Robertson等人，Nature 323: 445-48, 1986)。導入外來 DNA 至細胞之較佳方法為電穿孔法。 同源性重組 同源性重組之方法係以中斷PDE9基因為標定，其係導 _ 入PDE9基因標定載體至含有ρ〇Ε9基因之細胞中。以中斷 PDE9基因為標定之載體之能力，源自於利用在載體中之 一核苷酸係與PDE9基因同源（即相關）。該同源區域促使載 體及PDE9基因之内源性序列雜交。雜交後，在標定載體 及染色體序列間的基因交換事件之或然率便增加。該基因 父換事件導致該載體序列嵌入至PDE9基因位點及PDE9基 因功能破壞。 關於建構用於標定之載體之一般原則，可見於Bra(Jley · 等人（Biotechnol. 10: 534, 1992)。二種不同類型的載體可 藉由同源性重組用於DNA插入：插入載體或置換載體。插 入載體係為環狀DNA，其包含雙股中斷之PDE9基因同源 性區域。在該同源性區域及内源性PDE9基因雜交後，在 雙股中斷位置之單一基因交換事件導致全部的載體基因在 基因交換位點上插入至該内源性基因。 以同源性重組創造本發明之基因改造非人類哺乳動物及 95751.doc -33- 200526783 動物細胞之較佳載體，係置換載體，其為共線性而非環 狀。置換載體嵌入至PDE9基因需有雙重基因交換事件， 即在標定載體及PDE9基因間在二個雜交位點發生基因交 換。此雙重基因交換事件導致夾在二個基因交換位點間的 載體序列嵌入至PDE9基因，並導致原先橫越二個基因交 換位點之對應内源性PDE9基因序列之刪除（見例如Thomas and Capecchi等人，Cell 51: 503-12，1987; Mansour等人， Nature 336: 348-52，1988; Mansour等人，Proc· Natl· Acad· Sci· USA 87: 7688-7692, 1990及Mansour，GATA 7: 219-227, 1990)。 用於創造本發明基因改造非人類咕乳動物及動物細胞之 標定載體内之同源性區域，一般長度至少為100個核苷 酸。最佳地，該同源性區域kb係至少為長度1 - 5千驗基對 (kb)。雖然未見有同源性區域所需最小長度或最低程度之 相關性，同源性重組的標定效率一般與標定載體及PDE9 基因位點間的相關性及長度相符合。在使用置換載體及部 分内源性PDE9基因在同源性重組後被刪除的情況下，需 額外考量内源性PDE9基因被刪除部份的大小。若此部分 的内源性PDE9基因長度大於1 kb，則推薦使用帶有同源性 區域長於1 kb的標定卡匣，以增進重組效率。基於本發明 之敘述，關於該同源性重組有效序列之選擇及利用，其進 一步的導引係敘述於文獻中（見例如Deng&Capecchi，Mol. Cell. Biol. 12: 3365-3371, 1992; Bollag #、，Annu.Rev· Genet. 23: 199-225，1989及 Waldman及 Liskay，Mol. Cell·
Biol. 8: 5350-5357，1988)。 95751.doc -34- 200526783 基於本發明，技藝人士當認知到廣泛種類的選殖載體可 作為建構本發明之PDE9基因標定載體之載體骨架，包括 pBluescript相關質體（如 Bluescript KS+11)、pQE70、 pQE60、pQE-9、pBS、pDIO、phagescript、phiX174、 pBK 噬菌粒（Phagemid)、pNH8A、pNH16a、pNH18Z、 pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、及 pRIT5 PWLNEO、pSV2CAT、pXTl、pSG (Stratagene)、 pSVK3、PBPV、PMSG、及pSVL、pBR322 及pBR322為基礎 的載體、pMB9、pBR325、pKH47、pBR328、pHC79、嗤 菌體 Charon 28、pKBll、pKSV-10、pK19 相關質體、 pUC質體、及pGEM系列之載體。這些載體可購自不同的 商業來源（如 Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis， IN; Qiagen，Valencia，CA; Stratagene, La Jolla，CA; Promega， Madison，WI及 New England Biolabs，Beverly，MA)。然而， 任何其他載體，如質體、病毒或其部份，只要可在所欲的 宿主内自行複製及存活，便可使用。該載體亦可包含可使 其在基因組欲被改造的宿主内自行複製的序列。此種載體 的應用可發生重組期間擴大交互作用期，增加標定效率 (見 Molecular Biology，ed. Ausubel 等人，Unit 9.16，圖 9.16.1)。 用於繁殖本發明之標定載體之宿主並不限定。實例包括 大腸桿菌 K12 RR1 (Bolivar等人，Gene 2: 95，1977)、大腸桿 菌 K12 HB101 (ATCC No· 33694)、大腸桿菌 MM21 (ATCC No. 3 3 6780)、大腸桿菌 DH1 (ATCC No· 3 3 849)、大腸桿菌 95751.doc -35- 200526783 株DH5o;、及大腸桿菌STBL2。或者，亦可使用例如酵母菌 或枯草桿菌之宿主。上述宿主可自商業上購得（如 Stratagene，La Jolla，CA及 Life Technologies，Rockville， MD)。 為創造標定載體，PDE9基因標定構築體係加入至上述 載體骨架中。本發明之基因標定構築體具有至少一 PDE9 基因同源性區域。為製備PDE9基因同源性區域，其係使 用PDE9染色體或cDNA序列作為製造PCR引子組之基礎。 這些引子組係用於高忠實性PCR以增幅PDE9基因上所欲之 _ 區域（Mattila等人，Nucleic Acids Res. 19: 4967，1991; Eckert 及Kunkel 1: 17, 1991及美國專利第4,683, 202號）。染色體序 列係自染色體選殖庫或染色體DNA之製備而取得，較佳係 自將進行PDE9基因中斷標定之動物取得。PDE9 cDNA序 列可用於製備PDE9標定載體（如GenBank® NM008804(老鼠） 或 GenBank® NM002606 (人類））。 較佳地，本發明之標定構築體亦可包含編碼陽性標記蛋 白質之外源性核苷酸序列。在載體嵌入後之陽性標記的穩 ® 定表現，可賦予細胞可辨認的特性，理想地其並不影響細 胞存活性。因此，當其為置換載體時，該標記基因係位於 二段側翼同源性區域間，使其在雙重基因交換事件後可嵌 入至PDE9基因，在某種意義上該標記基因係置於用以彼 入後表現之位置。 較佳地，該陽性標記蛋白質係為可篩選的蛋白質；此蛋 白質在細胞内之穩定表現賦予經選擇之特性，即，該特性 95751.doc -36- 200526783 在不為致命的情況下增強了細胞的存活。因此，由利用經 選擇的條件，基於存活能力情況下，吾人可自其他不具成 功嵌入該載體序列之細胞中，分離出能穩定表現陽性經選 擇之標記編碼載體序列之細胞。陽性可筛選的標記蛋白質 (及其選擇劑）之實例，包括neo(G418或卡那黴素 (kanomycin))、hyg(效高黴素（hygromycin))、hisD (組氨酉分 (histidinol))、gpt (黃嘌呤）、ble (博萊黴素（bleomycin))、 及hprt (次百嗓呤）（見例如Capecchi及Thomas，美國專利 弟 5,464,764號及 Capecchi，Science 244: 1288-92, 1989)。 其他可作為可筛選標記之陽性標記，包括報導蛋白，如心 半乳糖酶、螢火蟲螢光素酶、或綠螢光蛋白（見例如 Current Protocols in Cytometry, Unit 9.5?及 Current
Protocols in Molecular Biology, Unit 9.6, John Wiley & Sons，New York，NY，2000) 〇 上述之陽性選擇步驟，並無法區別含有由標定同源性重 組在PDE9基因位點嵌入之載體之細胞，與任意、非同源 性重組嵌入載體序列至任何染色體位置之細胞。因此，當 使用置換載體進行同源性重組製備本發明之基因改造非人 類哺乳動物及動物細胞時，其較佳係包含—編媽陰性可筛 «記蛋白。陰性可篩選標記蛋白引起細胞表現㈣，者 曝露在特μ劑下（即標記蛋白在料可_選條件下對: 胞變成具有致命性）以失去在 天去存活力。陰性可筛選標記(及其 致印劑）包括單純癌疹病毒胸腺喂π定激酶（更昔洛韋 (ganCyClGvir)或：[，2·去n氟姑阿拉伯糖咬喃基巧-埃尿 95751.doc •37- 200526783 嘧啶），Hprt (6-巯基鳥糞嘌呤或6_巯基黃嘌呤），及白喉毒 素、蓖麻毒素及胞嘧啶脫胺酶（5-氟胞嘧啶（5_ fluorocytosine)) ° 編碼陰性可篩選標記之核苷酸序列係位於置換載體二個 同源性區域之外部。由於該配置，若該嵌入係以任意、非 同源性重組發生時，細胞將僅嵌入並穩定表現陰性可篩選 標記；PDE9基因及標定構築體内的二段同源性區域間之 同源性重組，自該嵌入排除出編碼陰性可篩選標記之序 列。因此，利用陰性條件，含有以任意、非同源性重組嵌 入標定載體之細胞會失去存活性。 由於一連串的陽性及陰性篩選步驟可經設計，以便更有 效地篩選經由同源性重組嵌入載體及因此可能具有中斷的 PDE9基因之細胞，上述陽性及陰性可篩選標記之組合， 較佳係在用於製備本發明之基因改造非人類哺乳動物及動 物細胞之標定構築體中。陽性_陰性設計、可篩選標記及 標定構築體之進一步實例，係敘述於例如美國專利第 5,464,764 號、W0 94/06908、美國專利第 5,859,312 號及 Valancius及 Smithies，Mol. Cell· Biol· 11: 1402，1991 中。 為使k §己蛋白在載體嵌入後能穩定地被表現出，標定載 體可經設計，使標記編碼序列在載體嵌入後，係可操作地 連結至内源性PDE9基因啟動子。該標記之表現隨後由通 常表現PDE9基因之細胞内之pDE9基因啟動子所驅動。或 者’ 5亥載體之標定構築體内的每一標記，可含有其本身驅 動表現的啟動子，而不依賴PDE9基因啟動子。後者的設 95751.doc -38- 200526783 計具有顧及典型上不表現PDE9基因之細胞中標記表現之 優點（Smith及 Berg，Cold Spring Harbor Symp· Quant· Biol· 49: 171, 1984; Sedivy及 Sharp，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 227，1989; Thomas及 Capecchi，Cell 5 1: 503，1987)。 可用於驅動標記基因表現之外源性啟動子，包括細胞特 異或階段特異性啟動子、組成型啟動子及可誘導或可調節 啟動子。這些啟動子之非限制實例包括單純疱疹病毒胸腺 嘧啶激酶啟動子、巨細胞病毒（CM V)啟動子/增強子、 SV40啟動子、PGK啟動子、PMCl-neo、金屬硫蛋白啟動· 子、腺病毒晚期啟動子、牛痘病毒7.5K啟動子、鳥類/3-球 蛋白啟動子、組蛋白啟動子（如老鼠組蛋白H3-614)、卜肌 動蛋白啟動子、神經元特異烯醇酶啟動子、肌肉肌動蛋白 啟動子、及花椰菜鑲嵌病毒35S啟動子（一般參見Sambrook 等人，Molecular Cloning，Vols. 1-111，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989,及 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York，NY，2000; Stratagene，La Jolla，CA) o 當製備本發明之基因改造非人類哺乳動物及動物細胞 時，為確定細胞是否具有嵌入載體序列至標定PDE9基因 位點上，對所欲載體嵌入事件特異之引子或基因組探針， 可與聚合酶鏈鎖反應（PCR)或南方墨點分析共同使用，以 鑑別所欲載體嵌入至PDE9基因位點之存在與否（Erlich等 人，Science 252: 1643-51，1991; Zimmer及 Gruss，Nature 338: 150，1989; Mouellic等人，Proc· Natl· Acad· Sci· 95751.doc -39- 200526783 (USA) 87: 4712，1990及 Shesely 等人，Proc· Natl· Acad· Sci· (USA) 88: 4294, 1991)。 基因誘捕 根據本發明之敘述，插入外來核苷酸序列至PDE9基因 位點以中斷PDE9基因之其他可利用之方法，為基因補 獲。該方法利用存在於所有哺乳動物細胞中的細胞機器， 其可剪接外顯子成mRNA以隨機方式插入一基因誘補載體 編碼序列至一基因中。一旦插入後，該基因誘補載體引起 可中斷被誘捕的PDE9基因之突變。與同源性重組相反 地，此致突變系統產生大量的隨機突變。因此，為得到含 有中斷PDE9基因的基因改造細胞，含有此特別突變的細 胞必須自含有在不同基因上隨機突變的細胞庫中被鑑定及 篩選出。 基因誘捕系統及載體已被敘述用於基因改造的老鼠細胞 及其他細胞類性中（見例如Allen等人，Nature 333: 852-55, 1988; Bellen等人，Genes Dev. 3: 1288-1300，1989; Bier等 人，Genes Dev. 3: 1273-1287，1989; Bonnerot 等人，J.
Virol· 66: 4982-91，1992; Brenner等人，Proc· Nat· Acad· Sci. USA 86: 55 17-21，1989; Chang 等人，Virology 193: 737-47，1993; Friedrich及 Soriano，Methods Enzymol. 225: 681-701，1993; Friedrich及 Soriano，Genes Dev. 5: 1513-23, 1991; Goff, Methods Enzymol. 152: 469-81，1987; Gossler 等人，Science 244: 463-65，1989; Hope，Develop. 113: 399-408，1991; Kerr等人，Cold Spring Harb. Symp. Quant. 95751.doc -40- 200526783
Biol· 2: 767-776，1989; Reddy等人，J· Virol· 65: 1507- 1515，1991; Reddy等人，Proc· Natl. Acad· Sci. U.S.A· 89: 6721-25, 1992; Skarnes等人，Genes Dev· 6: 903-918, 1992; von Melchner 及 Ruley，J. Virol· 63: 3227-3233，1989 及
Yoshida等人，Transgen· Res. 4: 277-87，1995)。 含有中斷的PDE9基因之個別突變細胞株，鑑定為突變 細胞群者，可利用例如逆轉利（RT)及PCR鑑定PDE9基因序 列内的突變。此方法可由匯集選殖株（pooling clones)而改 進。例如，為尋找含有中斷PDE9基因的個別選殖株，利 用錨定在基因誘捕載體内之一引子，及位於PDE9基因序 列中之另一引子進行RT-PCR。陽性RT-PCR結果顯示載體 序列編碼於PDE9基因轉錄子上，其顯示PDE9基因已被 基因誘捕嵌入引起中斷（見例如Sands等人，WO 98/14614，美國專利第 6,080,576號）。 時間、空間及可誘導之PDE9基因中斷 在本發明特定的具體實施態樣中，内源性PDE9基因之 功能破壞發生在特定發展或細胞周期階段（時間中斷）或特 定細胞類型（空間中斷）。在其他的具體實施態樣中，在特 定條件存在時，PDE9基因中斷係為可誘導的。重組酶切 除系統，例如Cre-Lox系統，在特定發展階段、特定組織 或細胞類型或在特定環境條件下，可使PDE9基因活化或 失活。通常，利用Cre-Lox技術之方法係根據如Torres及 Kuhn5 Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press，1997所述者完成。類似其敘述 95751 .doc -41 - 200526783
Cre-Lox系統之方法，亦可使用FLP-FRT系統。關於利用重 組酶切除系統以同源性重組或病毒插入有條件地中斷基因 之進一步報導，例如見於美國專利第5,626，159、 5,527,695、5,434,066 號、WO 98/29533、美國專利第 6?2285639Μ λ Orban# Λ 5 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 6861-65，1992、O’Gorman等人，Science 251: 1351-55，1991、Sauer 等人，Nucleic Acids Research 17: 147-61，1989、Barinaga， Science 265: 26-28，1994及 Akagi 等人，Nucleic Acids Res. 25: 1766-73，1997。超過一種重組酶系統可用於本發明之 基因改造非人類哺乳動物或動物細胞。 當利用同源性重組以時間、空間或可誘導方式，使用重 組酶系統（如Cre-Lox系統）中斷PDE9基因時，一部份的 PDE9基因編碼區域被含有PDE9基因編碼區域（其側接ΙοχΡ 位點）的標定構築體所置換。帶有此基因改造之非人類哺 乳動物及動物細胞，含有功能性loxP側接PDE9基因。 PDE9基因中斷之時間、空間或可誘導方面，係由額外的 轉基因（Cre重組酶轉基因）表現形式引起，該轉基因在非人 類哺乳動物或動物細胞中，在分別控制所欲的空間調控啟 動子、空間調控啟動子或可誘導啟動子情況下可被表現。 Cre重組酶標定ΙοχΡ位點以進行重組。因此，當Cre表現被 活化後，loxP位點遭受重組以切除夾在中間的PDE9基因編 碼序列，導致PDE9基因的功能破壞（Rajewski等人，J. Clin. Invest. 98: 600-03，1996; St.-Onge等人，Nucleic Acids Res· 24: 3875-77，1996; Agah等人，J. Clin· Invest· 100: 95751.doc -42- 200526783 169-79，1997; Brocard等人，Proc. Natl. Acad· Sci. USA 94: 14559-63，1997; Feil等人，Proc· Natl· Acad. Sci· USA 93: 10887-90, 1996及 Kiihn等人，Science 269: 1427-29, 1995)。 含有Cre重組酶轉基因及loxP側接的PDE9基因二者之細 胞，可經由標準轉基因技術，或在其為基因改造非人類哺 乳動物時，在控制所欲啟動子情況下，由交配基因改造之 非人類哺乳動物（其中一親代含有loxP側接PDE9基因而另 一者含有Cre重組酶轉基因）而產生。關於利用重組酶系統 及特定啟動子以時間、空間或有條件地中斷PDE9基因之 _ 進一步指引，建立於例如 Sauer，Meth· Εηζ· 225: 890-900， 1993、Gu 等人，Science 265: 103-06，1994、Araki等人， J. Biochem. 122: 977-82，1997、Dymecki，Proc. Natl· Acad·
Sci. 93: 6191-96，1996及 Meyers等人，Nature Genetics 18: 136-41， 1998 。 PDE9基因之可誘導中斷，亦可由利用四環黴素反應性 二元系統而完成（Gossen 及 Bujard，Proc. Natl· Acad· Sci. USA 89: 5547-5 1，1992)。此系統涉及基因改造一細胞以導 入Tet啟動子至内源性PDE9基因調節元素，及表現四環黴 素調控抑制子（TetR)之轉基因。在此細胞中，四環黴素投 藥活化TetR，其依次抑制PDE9基因表現，因此中斷PDE9 基因（St.-Onge 等人，Nucleic Acids Res· 24: 3875-77， 1996;美國專利第5,922,927號）。 上述用於PDE9基因之時間、空間或可誘導中斷之系 統，亦可當利基因誘補作為基因改造方法時，如wo 95751.doc -43- 200526783 98/295 33及美國專利第6,288,639號所述，亦可被採用以創 造本發明之基因改造非人類哺乳動物及動物細胞。 創造基因改造、非人類哺乳動物及動物細胞 上述之基因改造方法實質上可用以中斷衍生自動物之任 何類型的體細胞或幹細胞PDE9基因，以創造本發明之基 因改造動物細胞。本發明之基因改造動物細胞包括但非限 於哺乳動物細胞（包括人類細胞）及鳥類細胞。這些細胞可 衍生自基因工程化之任何動物細胞株，例如適合培養、致 腫瘤或經轉形之細胞株、分化的基因工程化Es細胞，或其 籲 可自帶有所欲PDE9基因改造之基因改造、非人類哺乳動 物。 細胞可為PDE9基因中斷之異基因型或同基因型。為得 到PDE9基因中斷之同基因型（_/_)之細胞，可進行直接、連 續標定對偶基因之二者。該方法可藉由再循環陽性可篩選 標記而促成。根據此設計，編碼陽性可篩選標記之核皆酸 序列，利用Cre-LoxP系統中斷一對偶基因後被移除。因 此，相同的載體可用於隨後標定以中斷第二個PDE9基因 寒 對偶（Abuin 及 Bradley，Mol· Cell· Biol· 16: 185 1-56，1996;
SedWy等人，T.I.G. 15·· 88-90, 1999; Cruz等人，Pr〇c. Natl.
Acad. Sci. (USA) 88: 7170-74，1991; Mortensen等人，proc Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 7036-40，1991; te Riele等人，
Nature (London) 348: 649-651, 1990) 〇 另一得到PDE9-/-之ES細胞之策略，係自一群ρ〇Ε9基因 中斷（PDE9+/-)之異基因型細胞進行細胞同質化。該方法 95751.doc -44- 200526783 利用的設計，係基於該表現可篩選抗藥性標記PDE9+/-標 定之選殖株，經選定可抗非常高的藥物濃度；該選擇促使 細胞表現二套編碼抗藥性抗藥性標記，因此其係為PDE9 基因中斷之同基因型（M or tensen等人，Mol· Cell· Biol· 12: 23 91-95，1992)。此外，基因改造動物細胞可得自基因改 造PDE9-/-非人類哺乳動物，其係由交配PDE9+/•非人類哺 乳動物進一步討論如下。 在所欲細胞或細胞株之基因改造後，可根據此技藝中所 習知之標準PCR或南方墨點法，由PCR分析確認PDE9基因 位點為改造位置（見例如美國專利第4,683,202號及Erlich等 人，Science 252: 1643，1991)。亦可對PDE9基因的功能性 中斷之做進一步修飾，若在正常表現PDE9基因的細胞内 的PDE9基因信使RNA (mRNA)水平及/或PDE9多肽水平降 低。PDE9基因mRNA的水平可利用RT-PCR、北方墨點分 析或定點雜交進行測量。由細胞製造的PDE9多肽水平之 定量，可由例如此技藝中所習知之標準免疫分析方法達 成。該免疫分析包括但非限於競爭型及非競爭型分析系 統，其係利用例如RIAs(放射線分析）、ELIS As(酵素連結 免疫吸附分析）、「三明治」免疫分析、免疫放射測定分 析、膠體擴散沉澱反應、免疫擴散分析、定點免疫分析 (利用如膠體金、酵素性或放射性同位素標記）、西方墨點 法、二維膠體分析、沉澱反應、免疫螢光分析、蛋白質A 分析及免疫電泳分析。 本發明較佳的基因改造動物細胞係胚胎幹（ES)細胞及似 95751.doc -45- 200526783 ES細胞。該細胞係衍生自不同的預移植胚胎及囊胚，例如 老鼠（Evans 等人，Nature 129:154-156，1981; Martin, Proc.
Natl· Acad· Sci·，USA，78: 7634-7638，1981)、豬及綿羊 (Notanianni等人，J. Reprod· Fert· Suppl·，43: 255-260，1991; Campbell等人，Nature 380: 64-68，1996)及靈長類（包括人 類）（Thomson等人，美國專利第5,843,780號，Thomson等 人，Science 282: 1 145-1147，1995及 Thomson等人，Proc.
Natl· Acad· Sci. USA 92: 7844-7848, 1995)。已有報導在人 類ES細胞内之同源性重組媒介的基因中斷已成功（Zwaka及 ®
Thomson，Nature Biotech. 21: 319-21，2003) 〇 細胞類型為多功能性的，係指在適當的條件下，其可自 三種胚胎層組織（内胚層、中胚層及外胚層）分化成廣泛種 類的細胞型式。依培養條件不同，ES細胞的樣本可當作幹 細胞不確定地培養，使其在單一樣本中分化成廣泛種類的 不同細胞型式，或分化成特定的細胞型式，例如似巨嗟細 胞、神經元細胞、心肌細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、平滑 _ 肌細胞、内皮細胞、骨骼肌細胞、角質細胞、及造血細胞 (如嗜伊紅性球、肥大細胞、紅血球前趨細胞、或巨核細 胞）。導引分化的完成係包括特定生長因素或培養條件中 基質成份，其進一步如Keller等人，Curr. Opin. Cell Biol. 7: 862-69，1995; Li 等人，Curr· Biol. 8: 971，1998; King等 人，J· Clin· Invest· 98: 216-24，1996; Lieschke等人，Exp. Hematol· 23: 328-34，1995; Yamane等人，Blood 90: 3516-23， 1997 及 Hirashima 等人，Blood 93: 1253-63，1999 中所敘 95751.doc -46- 200526783 述。
用於基因改造的特定胚胎幹細胞並不限定；仿鼠類ES細 胞株，包括 AB-1 (McMahon 及 Bradley，Cell 62:1073-85, 1990)、E14 (Hooper等人，Nature 326: 292-95，1987)、D3 (Doetschman 等人，J. Embryol. Exp. Morph. 87: 27-45, 1985)、CCE (Robertson等人，Nature 323: 445-48, 1986)、 RW4 (Genome Systems，St. Louis，MO)及 DBA/llacJ (Roach 等人，Exp. Cell Res. 221: 520-25，1995);仿人類 ES 細胞 株，為 Hl.l 細胞（Zwaka及 Thomson，Nature Biotech. 21: 319-321，2003)。根據已發表的方法 published procedures (Robertson, 1987，Teratocarcinomas 及 Embryonic Stem Cells: A
Practical Approach, Ed. E. J. Robertson, Oxford: IRL Press, pp. 71-112，1987; Zjilstra 等人，Nature 342: 435-438，1989 及 Schwartzberg等人，Science 246: 799-803，1989)，基因改 造鼠類ES細胞可用於創造基因改造老鼠。 在確定ES細胞含有所欲的PDE9基因功能中斷後，這些 ES細胞可根據此技藝中已知之方法，隨後注射至適當的囊 胚宿主内，以生產散合鼠（Capecchi，Trends Genet. 5: 70, 1989)。用於本發明之特別的老鼠囊胚並不限定，這些囊 胚的實例，包括衍生自C57BL6鼠、C57BL6白化鼠、瑞士 遠親雜交（outbred)鼠、CFLP鼠及MFI鼠。或者，ES細胞可 在夾在四倍體胚胎間聚集（Nagy等人，Proc· Natl· Acad. Sci· USA 90: 8424-8428, 1993)。 含有基因改造ES細胞之囊胚或胚胎，隨後植入假孕母鼠 95751.doc -47- 200526783 中並使其在子宮内發育（Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，NY 1988 及 Teratocarcinomas 及 Embryonic Stem Cells: A Practical Approach，E.J· Robertson，ed·，IRL Press，Washington， D.C·，1987)。育母所產的繼代可經篩選後鑑定出其係PDE9 基因中斷之彼入。一般而言，此繼代含有一些衍生自基因 改造贈予ES細胞之細胞，及衍生自原始囊胚之細胞。在此 種情況下，繼代可在最初時篩選其鑲嵌體色，其中體色筛 選方法已被用於區別衍生自贈予ES細胞之細胞與其他囊胚 細胞。或者，自繼代尾部組織得到的DNA，可用於鑑定含 有基因改造細胞的老鼠。 交配幼體細胞内含有PDE9基因中斷之嵌合鼠，其可產 生在所有幼體細胞及體細胞中擁有PDE9基因中斷之後 代。PDE9基因中斷的異基因型老鼠，可經交配後產生同 基因型體（見例如美國專利第5,557,032及5,532，158號）。 上述自細胞移轉基因改造至整個動物之ES細胞技術之另 一種方法，係使用核移轉。此方法可用於產製除了老鼠以 外之其他基因改造非人類哺乳動物，例如羊（McCreath等 人，Nature 29: 1066-69，2000; Campbell等人，Nature 389: 64-66，1996及 Schnieke等人，Science 278: 2130-33，1997) 及牛（Cibelli等人，Science 280: 1256-58，1998)。簡言之， 體細胞（如纖維母細胞）或多功能幹細胞（如似ES細胞）係選 擇作為核贈予細胞，且經基因改造成含有PDE9基因之功 95751.doc -48- 200526783 能中斷。當插入DNA載體至體細胞以突變PDE9基因時， 較佳係使用不含啟動子之標記於載體中，使得載體嵌入至 PDE9基因後，在PDE9基因啟動子的調控下可導致標記的 表現（Sedivy及 Dutriaux，T.I.G. 15: 88-90，1999; McCreath 等人，Nature 29: 1066-69, 2000)。然後將從具有適當的破 壞PDE9基因之贈予細胞所得來的胞核，轉移到已摘除胞 核的受精或孤雌生殖的卵母細胞上（Campbell等人，Nature 380: 64，1996; Wilmut等人，Nature 385: 810，1997)胚胎經 重組、培養後發展至桑椹體/囊胚階段，並移轉至育母中 以在子宮内全期發育。 本發明亦包括基因改造非人類哺乳動物及基因改造動物 之後代。雖然後代為PDE9基因中斷之基因改造之異基因 型或同基因型，其並不一定與親代非人類哺乳動物及動物 細胞之基因相同，此乃由於突變或環境之影響；除在 PDE9基因之原始基因中斷之後代，此亦可能發生在以後 的繼代。 衍生自非人類基因改造動物之細胞，可利用此技藝中所 習知之技術，自組織或器官分離出。在一具體實施例中， 本發明之基因改造細胞經株化（immortalized)。根據該具體 實態樣’細胞可由將端粒酶基因（其係致癌基因，如m〇s或 v-src)或細胞凋亡抑制基因（如bcl_2)進行基因工程化至細 胞内進行株化。或者，細胞可利用熟習此項技術者已知的 技術，以雜交工具經融合方式株化。 「擬人類化」（Humanized)非人類哺乳動物及動物細胞 9575 l.doc -49- 200526783 含有中斷之内源性PDE9基因之本發明基因改造非人類 哺乳動物及動物細胞（非人類），可進一步經修飾以表現人 類PDE9序列（下文簡稱「擬人類化」）。擬人類化細胞之較 佳方法包括將内源性PDE9基因以編碼人類PDE9序列之核 酸序列’以同源性重組取代（jak〇bsson等人，Proc. Natl. Acad· Sci· USA 96: 7220-25, 1999)。此載體係與傳統上關 於5’及3’同源臂及陽性/陰性篩選設計用之標定載體類似。 然而’這些載體在重組後，亦包括以人類PDE9編碼序文 取代内源性序列之序列，或影響鹼基對改變、外顯子取代 或密碼取代（其等係修改内源性序列以編碼人類PDE9基因） 之序列。一旦同源性重組物經鑑定出，便可利用Cre或Flp 媒介位點主導的重組，修剪任何具選擇基礎的序列（如ne〇) (Dymecki，Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 6191-96，1996)。 ©以人類PDE9序列取代内源性序列時，較佳係將這些 改變直接導入至内源性轉譯起始位點之下游。此定位可保 存PDE9基因之内源性時間及空間表現形式。人類序列可 為帶有附接在3,端以適合於加工之多a尾巴之全長人類 cDNA序列，或整個基因組序列（Shia〇等人，。抓巧⑶化 Res· 8: 295-302，1999)。關於以人類對應物進行基因改造 細胞及非人類哺乳動物，以取代其内源性基因表現方法， 其進一步指導可見於例如Sullivan等人，j· Bi〇1· chem. 272: 17972-17980, 1997, Reaume等人，J·則〇1· Chem. 271: 23380. 23388，1996及Scott等人，美國專利第號）。 創造此種「擬人類化」生物體之另一種方法，係為二步 95751.doc -50- 200526783 驟方法，包括内源性基因之中斷， 射將m相广, _及接者精由原核顯微注 射將、扁碼人類序列之轉基因導入至基因剔除的胚胎中。 基因改非人類哺乳動物及動物細胞之應用 PDE9功能及醫療相關性，可由另外研究本發明之舰9 /_非人類哺乳動物及動物細胞之表型，得到進— ， 如下列實施所例示。例如，基因改造ΡΜ从非二類哺乳 動物及動物細胞，可用於測定pDE9 土 在引起或予黃 防症狀或表型發展成特定的疾病（肥胖、進食障礙、二血 官疾病、胰島素阻抗徵候群、高血屢、及/或第二型糖尿 病)模型上’扮演重要的角色。若在跡/·非人類哺乳動 物或㈣細胞之症狀或表型’相較於野生型（咖叫）或 ΓΓ+/_非人類哺乳動物或動物細胞有所不同，則咖9多 肽在症狀或表型相關之調節功能上扮演一角色。可用於評 估PDE9功能之測試實例，包括比較pDE9_/_老鼠愈野生型 老鼠在體重、體脂肪、血壓、葡萄糖/胰島素代謝、(如，在 分離組織中的葡萄糖攝取、肝醣代謝酵素活性之變化、肝 或肌肉中肝醣水平之變化、及/或體組成之變化)，及比較 胰島素發信號途徑中各成份的磷酸化狀態或活性。 乂 此外，在藥劑已經鑑定為PDE9促進劑或拮抗劑之情、兄 如，當藥劑投予至PDE9+/+或PDE9仏非人類哺乳動物 或動物細胞時，該藥劑明顯改變一或多個pDE9多肽活 性）’本發明之基因改造PDE9_/·非人類哺乳動物及^物細 胞可用於鑑定除了已知由PDE9促進或拮抗作用（即非人類 哺乳動物及動物細胞可作為負對照組）之藥劑之任何其他 95751.doc 51 200526783 效果。❹，若藥劑的投予在PDE9+/+非人類哺乳動物或 動物細胞内，引起不知是否與ΡΜ”肽活性相關之效 果，則吾人可決定是否該藥劑翠獨或主要運用此效果透過 PDE9之調節’經由投μ藥劑至對應的ρΜ9·/_非人類哺 乳動物或動物細胞中。芸与τ # s ^ , Τ右該效果在ΡΟΕ9·/-非人類哺乳動 物或動物細胞中不存在#明^ , 社次月頒地降低，則該效果至少部份 經PDE9調節。’然而，若PDE9_/·非人類哺乳動物或動物細 胞具有與PDE9+/+或PDE9+/·非人㈣乳動物或動物細胞 相當程度之效果，則該效果係經不涉及pDE9發信號之途 徑。 再者’若藥劑經懷疑可能具有主要經由測9途徑之效 果，則PDE9-/-非人類哺乳動物及動物細胞可作為負對照 組以測試此假設。若藥劑確實透過PDE9表現，則在投予 藥劑後’ PDE9-/-非人類哺乳動物及動物細胞應該不會顯 示出與在PDE9+/+非人類哺乳動物及動物細胞中相同的效 果。 本發明之基因改造非人類哺乳動⑯及動物細胞，亦可用 於鑑定在PDE9+/-或PDE9_/_非人類喷乳動物及動物細胞 中，相對於個別的野生型對照組，其經不同的調節方式表 現的基®。基於本發明之敘述，此技藝中所習知之技術可 用於鑑定此等基因。例如，DNA陣列可用於鑑定在 PDE9+/•或簡9·/_老鼠中經；^的調節方式表現的基因， 以補彳貞PDE9表現的缺點。DNA陣列係為熟習此項技藝者 所已知者（見例如Aigner等人，八地出匕及RheumaHsm 95751.doc -52- 200526783 44:2777-89，2001 ;美國專利第 5,965,352 號；Schena 等 人，Science 270:467-470，1995; Schena等人，Proc. Natl. Acad· Sci. USA 93: 10614-10619，1996; DeRisi等人， Nature Genetics 14: 457-460，1996; Shalon等人，Genome Res. 6: 639-645，1996;及 Schena 等人，Proc· Natl. Acad. Sci. (USA) 93: 10539-11286，1995;美國專利第 5,474,796 號；美國專利第 5,605,662號；WO 95/251 16; WO 95/35 505; Heller等人，Proc. Natl. Acad· Sci. 94: 2150-2155，1997)。 化學偶合程序及喷墨裝置可用於分析基材表面上的陣列 因子。類似墨點或吸潰分析之陣列，利用溫度、UV、化 學或機械鍵結程序，亦可用於安排及連結因子至基材表面 上。典型的陣列可以手工或利用可用的方法及機器及包含 任何適當數量的因子製得。在雜交後，移除未雜交的探針 並使用掃描器測量螢光的水平及圖案。與因子在微陣列雜 交的每一探針之互補程度及相對，可透過掃描影像的分析 進行評估。 全長CDNA、表現序列片段標籤（ESTs)或其等之片段， 可包括微陣列之因子。適用於雜交的片段，可利用此技藝 中所已知之軟體（例如LASERGENE軟體（DNASTAR))進行 選擇。與本發明之核苷酸序列對應或自本發明相關cDNA 庫隨機選擇之全長cDNA、表現序列片段標籤（ESTs)或其 等之片段，安排在適當的基材（如玻璃片）上。利用例如紫 外線交聯接著為加熱及化學處理及隨後乾燥的方式，將 cDNA固定到該片上。螢光探針經製備並用於與基材上之 95751.doc -53- 200526783 因子雜又。该基材以此技藝中所已知之程序分析後，例如 掃描及分析微陣列影像。 此外，本發明之基因改造非人類哺乳動物及動物細胞， 亦可用於鏗定在PDE9+/·或ΡΕ)Ε9·Λ非人類哺乳動物或動物 細胞中，相對於其個別的野生型對照組，其表現輪廓或後 轉譯修飾作用改變的蛋白質。基於本發明之敘述，熟習該 項技術者所已知之技術可用於鑑定此等蛋白質。例如，蛋 白體分析可用於鑑定在PDE9+/-或Ρ〇Ε9-/-老鼠中，表現輪 廓或後轉譯修飾作用改變的蛋白質，以補償PDE9表現的 參 缺點蛋白體分析係為熟習此項技藝者所已知者（見例如
Conrads等人，Biochem· Biophys· Res. Commun· 290: 896-890，2002; Dongre等人，Biopolymers 60: 206-211, 2001;
Van Eyk，Curr Opin Mol Ther 3: 546-553, 2001; Cole等人， Electrophoresis 21: 1772-1781，2000; Araki 等人，
Electrophoresis 21: 180-1889, 2000) ° 實例 1· PDE9標定㈣之㈣ * 標定載體構築體係根據圖1所示之示意圖設計。該構築 體含有與老鼠PDE9基因體序列同源之二臂：0.9 kb的5’同 源臂及4.3 kb的3’臂。該二臂將LacZ-Neo構築體夾在中 間。含有標定構築體之DNA係藉由電穿孔法插入至ES R1 細胞中（Deng等人，Dev. Biol. 185: 42-54，1997; Udy 等 人，Exp. Cell Res. 231: 296-301，1997)。在同源性重組 後，如圖2所示之PDE9 cDNA編碼序列之鹼基對142- 95751.doc -54- 200526783 175(鹼基對142-175係劃底線者），係自内源性基因刪除且 被LacZ-Neo卡匣所取代。具新黴素抗性的ES細胞經南方墨 點法方析確認PDE9基因之中斷。這些經標定的ES細胞隨 後用於產製嵌合鼠，其係將細胞注射至囊胚後，將囊胚植 入至假孕母鼠中（Capecchi等人，Trends Genet· 5: 70, 1989，Hogan 等人，Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988及 Teratocarcinomas 及 Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson，ed·，IRL Press，Washington, D.C·， 1987)。該嵌合鼠隨後與 C57BL/6 鼠（Jackson
Laboratories，Bar Harbor，ME)繁殖後創造出 FI PDE9+/-異 基因體，其依次繁殖後生產出F2 PDE9-/-同基因型老鼠 (Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。在異基因 體及同基因體之PDE9基因之功能中斷，由PCR及南方墨點 分析確認。 2· PDE9基因中斷對體重、體組成及代謝物之影饗
方法 如前所述，雄性及雌性PDE9 KO (-/-)老鼠及野生型（+/+) 同胎對照組，在本研究開始之前適應環境至少一週，並給 予自由取水及D11老鼠食品（Purina，Brentwood，Μ 0)。 雄性及雌性老鼠（年齡為17-19週）以每籠子二至五隻老鼠 方式分成四個實驗組。在六週的研究期間，每性別老鼠之 對照組保留D11老鼠食品，而每性別老鼠之其他組轉換成 由58计卡％脂肪（D12331齧齒動物飲食，Research Diets， 95751.doc -55- 200526783
Inc·，New Brunswick，NJ)所組成的飲食。體重在第0天時涓J 量，並於每週監測。脂肪組織質量在第0天及在研究結束 時分析，其進一步如下所述。 在第1天時，血漿葡萄糖經由眼底取血的樣本測定。將 25微升的血在微管（microtube)中加至0.025百分比之100微 升稀釋肝素液中（Denville Scientific，Inc.，Metuchen，NJ)。 將試管在Beckman Microfuge 12上以最高速旋盈2分鐘。收 集血漿後用於血漿葡萄糖及三甘油酯測定，其進一步如下 所述。在本研究期間，評估體重及食物之消耗，其取樣約 _ 8毫克用於血漿葡萄糖及三甘油酯測定，其進一步如下所 述。 在本研究最後一天的早上，血樣經由眼窩取樣用於血漿 葡萄糖及三甘油酯測定。隨後將老鼠犧牲後，收集約1微 升的血液於含有肝素裡的Microtainer®血漿分離試管 (Becton-Dickinson，Inc.，Franklin Lakes，NJ)内。將試管在 Beckman Microfuge 12上以最高速旋盪5分鐘。將血漿收集 於1.5毫升小管（Eppendorf tube)内，在液態氮中急速冷床 ^ 並儲存於_80°C中，直到進行胰島素、果糖胺或cGMP水平 之分析。 也漿葡萄糖、三甘油酯及果糖胺係利用Roche/Hitachi 912 臨床化學分析儀（Roche Diagnostics Corp·，Indianapolis，
IN)測量。血漿cGMP係利用BioTrakTM酵素免疫系統 (Amersliam，Piscataway，NJ)測量。血漿膜島素則經由類似 技術利用 ALPCO (Uppsala，Sweden)提供的 Mercodia ELISA 95751.doc -56- 200526783 胰島素套組進行評估。所有的分析均根據製造商的指示進 行。 脂肪組織質量的定量係在本研究結束五天前完成。為評 估脂肪組織質*，利用商業上購買之具有高解析度⑽ 磷屏幕探測器的微型電腦斷層掃描（CT)系統，可得^老鼠 的360。放射性顯像。掃描器係為圓柱形直徑/長掃描場為％ 随/36腿及”解析度低於5() _。狀線源係偏壓為4〇 Κ广陽極電流設定為〇·4 mA。將麻醉的老鼠以正仰解剖 妥勢置於放射線穿透的老鼠床上，尾端最靠近微型CT，嘴 *而在適當位置靠著麻醉管。將每隻老鼠的髂骨頂部集中於 掃描區後，在相對於老鼠床平面的90。下取得最初顯像， 使老鼠安置正確。一旦排列確定好，將每隻動物進行掃 描。每個掃描由196張個別投影組成，曝光時間為25〇 μδ/ 投影；總影像獲得時間在145 μΜ解析度下約為12分鐘。 利用“^^。入丁⑧重組及分析軟體（ImTek Inc，〇☆ Rid^， TN)(Paulus等人，Neoplasia 2·· 62-70，2000)，自老鼠的微 型CT掃描所得的196張投影進行影像重組的操作，以得到 老鼠的二度空間橫切面影像。將每隻老鼠於每次掃描創建 二組重組影像，以用於個別脂肪組織質量的測定。第一組 的六個重組影像提供了腹股溝及副睪脂肪組織質量的剪 衫。弟一組重組由九段切片組成，其由椎間及中椎部份決 定’其用於測量腹膜後及腸繫膜脂肪組織質量。 為分析影像，將重組的點陣圖像轉換成TIFF圖像。隨後 再將TIFF圖像進行分析並利用sci〇I1 image for Windows® 95751.doc -57- 200526783 (Scion Corporation，Frederick MD)分析脂肪組織質量。利 用晝刷工具（像素大小為#3)將個別的脂肪組織以分界線分 開，且每一脂肪區域的總像素數由Sci〇n 軟體所測 疋。選定上部及下部像素強度限值，在本研究中，查表運 算（LUT)介於115-187為最適捕獲脂肪組織。 計算出每片間的平均像素（片汁片n+l/2)。代表個別脂肪組 織的總像素，係以每片的平均像素乘上每片之間的平均像 素所計算而得。最後，將像素數值以下列方程式轉換成組 織質量：脂肪質量（毫克）=0·0009ΐ5克/微升χ〇·〇〇〇757微升/ 體素XI000毫克/克X體素數。第一參數係校正甘油基三 酉旨’其係脂肪組織中脂肪密度代表，即三甘油酯。第二參 數係每像素的體積及第三參數係將質量轉換成毫克單位。 結果 當雄性及雌性基因剔除（κο)老鼠進行高脂肪飲食時，相 較於其野生型’ PDE9中斷可導致減少的體重及下降的體 重（圖3)。雌性老鼠亦顯示具有身體長度6%的減少。連同 體重的下降，雄性及雌性Κ0老鼠在不同的脂肪組織中亦 顯示出下降的脂肪質量（圖4)。在雄性ΚΟ老鼠中，可見明 顯的腹膜後及腸繫膜脂肪組織；在雌性Κ〇老鼠中，可見 腹股溝、性腺及腹膜後脂肪組織。藉由比較，銀以標準齧 齒動物飲食的雌性老鼠中，在ΚΟ及野生型老鼠間並未觀 察到體重的差異（圖5 )，而下降的脂肪組織質量趨勢，則僅 以性腺脂肪組織為明顯的（圖6)。 關係高脂肪飲食後的血漿代謝物，雌性ΚΟ老鼠顯示出 95751.doc -58- 200526783 增加的cGMP、減少的葡萄糖及減少的胰島素（表1);雄性 KO老鼠顯示出增加的cGMP趨勢及減少的葡萄糖趨勢（表 1)〇 表1.在6週高脂肪飲食後的血漿代謝物 雌性 雄性 WT KO p value WT KO p value cGMP pmol/ml 8.0 士 0.50 13·7 士 0·6 <0.01 8.2 士 L0 11.5 士 1.8 0.14 葡萄糖 mg% 175 士 8 152±6 0.03 179土78 164±8 0.21 胰島素 ng/ml 1·58±0·25 0.88 士 0.15 0.03 3.53 士 0.48 3.28 士 0.48 0.72 三甘油酯 mg% 111土6 119土 9 0.42 200±13 191 士 1 0.61 3·藥理性PDE9抑制在ob/ob老鼠中對體重、體組成及食物 攝取之效果 方法 使用 6 至 10 週齡得自 Jackson Laboratories (Bar Harbor， ME)的雌性ob/ob老鼠。每籠内中飼養五隻老鼠，並允許其 自由喝水，最初餵以Dl 1老鼠飲食。在一週環境適應期 後，將老鼠換以粉末飲食（老鼠餵食器/Auto-JL K20老鼠飲 食，PMI Feeds，Inc·，St· Louis，M0)三天，使其在開始 PDE9抑制劑給藥期間開始前適應該飲食。 PDE9才卬制齊j J匕j物（4匕合物A)係在一 |史大小白勺粉末4匕老 鼠飲食，以化合物/飲食混合物中投藥（Research Diets, Inc·，New Brunswick，NJ);將化合物與飲食混合以達到特 定劑量範圍在1-200毫克/公斤/天之消耗。除了不含化合物 的對照組，亦包括消耗達格列酮（1毫克/公斤/天）的群組作 為正對照組。 95751.doc -59- 200526783 將老鼠隨意分配成 、、且 母龍有五隻老鼠。尤错Λ t T7 其後每週測量體重。在笛彳 ^在弟〇天及 本並測量血漿葡萄糖。 仟眼底採血樣 词擔在本研究最後一天時， 血液樣本用於葡萄糖、三 述取侍 一甘油s曰、胰島素及CGMP測量。 下述結果代表利用上十、 上述相同方法從數種分別的研究中 得的結果。圖7顯示出餵 呵九〒所 .., < 笔克/么斤/天之PDE9抑制劑 化合物之ob/ob老鼠，如击丄#〜人 於餵食不含化合物之對照飲食 或達格列㈣療飲食之老鼠，具下降之體重增加。化合物 A在2及4天治療後，在降低正常體重增加方面（圖8A)及降
低食物攝取方面（圖pi X 1 }均引起劑量依賴效果。PDE9對食 物攝取的效果可能為短暫 ' ^且曰的，其係因在本研究的後期階 4又’ 10 0毫克/公斤/天的中門 1八日]甲間劑Ϊ並未觀察到對食物攝取且 有效果（圖9)。 化口物A之100¾克/公斤/天之中間劑量亦引起降低的葡 萄糖、三甘油酿及果糖胺。代表性結果係分別如圖1〇、圖 11及圖12所示。 實施例均顯示出引起PDE9活性之下降係降低體重及/或 月且月曰肪之有效方法，且可用於治療過重、肥胖或患有飲食 障礙之動物病患，及可用於產製糧食動物以產製痩肉。 【圖式簡單說明】 圖1為所使用中斷PDE9基因標定構築體之示意圖。互補 於PDE9基因組序列之5,及3,同源f，長度分別為〇·9 kb及 4·3 kb，側接一 LacZ-Neo卡匣。每一同源臂之基因組序列 95751.doc -60- 200526783 之部份顯示於SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2。 圖2顯示鼠類PDE9 (SEQ ID NO: 3)之cDNA序列。在與 標定構築體進行同源性重組後，劃底線序列之鹼基對142-175被刪除並以LacZ-Neo取代。 圖3為詳解野生型（WT)及PDE9基因中斷之同基因型之基 因改造老鼠（剔除PDE9基因之老鼠），在六週的高脂肪飲食 療程後之體重變化線性圖。 圖4A(雄性）及圖4B(雌性）為顯示數種WT及剔除PDE9基 因之老鼠’在六週的高脂肪飲食療程後之數種脂肪組織質 量柱形圖。SC-皮下；TBW-總體重。 圖5為比較雌性WT及剔除PDE9基因之老鼠在六週控制 飲食後之體重之線性圖。 圖6A(基線）及圖6B(六週控制飲食後）為顯示雌性WT及 剔除PDE9基因之老鼠之脂肪組織質量柱形圖。（1吨_腹股 溝；Gon-性腺；RP-腹膜後；Mes-腸繫膜）。 圖7為詳解在對照組、化合物a治療（1〇〇毫克/公斤/天）及 達格列酮（Darglitazone)治療之各組雌性〇b/〇b老鼠體重增 加之時間線性圖。 圖8A為顯示化合物A劑量對雌性〇b/ob老鼠，在第二及四 天之體重影響之柱形圖。圖8B為化合物A劑量對雌性〇b/〇b 老执’在苐一及四天之食物消耗影響之柱形圖。 圖9為比較對照組、化合物A治療（1〇〇毫克/公斤/天）及達 格列綱（DargHtazone)治療組之雌性〇b/〇b老氣之間，食物 消耗時間之柱形圖。 95751.doc -61- 200526783 圖10為比較對照組、化合物A治療（100毫克/公斤/天）及 達格列酮（Darglitazone)治療組之雌性〇b/〇b老鼠之間，血 漿葡萄糖之線性圖。 圖Η為顯示對照組及化合物A治療（5〇及1〇〇毫克/公斤/ 天）治療之雌性〇b/〇b老鼠，在第一、一芬 你乐、一及四天三甘油酯之 線性圖。 克/公斤/天）及 鼠’在第十六
圖12為比較對照組、化合物A治療（1〇〇毫 達袼列酮（Darglitazone)治療之雌性〇b/〇b老 天血漿果糖胺之柱形圖。
95751.doc -62- 200526783 序列表 <110> 美商輝瑞公司
<120>磷酸二酯酶9抑制作用降低體重 <130> PC25667A <140> 093133068 <141〉2004-10-29 <150〉60/516,213 <151> 2003-10-31 <160〉 3 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211〉 200 <212〉 DNA <213〉小鼠 <400〉 1 ttgagggaga acctctcact ggcctgggtg accagcgagt acatgagttc tagggactga acttgggtca tcactcttag gtaggaagca cattactccc tgagccaact ctccagctca acttctgtgt tttgcaggtg gttttcagca agtactgcaa ctccagtgac atcatggacc tgttctgtat cgccaccggc <210> 2 <211> 200 <212〉 DNA <213〉 小鼠 <400〉 2 cagacgacgc catggtctcc atcgatccca ccatgcctgc gaattcagag cggtaagcga ctcctcctgg ggtgtctcac ttgtctatga tgtgtgccag ggagtctgca atttggcttt gtttactact gctaagacgt gtgaagtttc agcagaagag ggaaggaggc agatgggagg caggcggagg cttggttcac <210> 3 <211> 1929 95751.doc 200526783 <212> DNA <213〉小鼠 <400> 3 gcgggcgcga tgggggccgg ctcctcaagc taccggccca aggccatcta cctagacatc 60 gatggacgca tccagaaggt ggttttcagc aagtactgca actccagtga catcatggac 120 ctgttctgta tcgccaccgg cctgcctcgg aacaccacca tctccctttt aaccacagac 180 gacgccatgg tctccatcga tcccaccatg cctgcgaatt cagagcgcac tccctacaag 240 gtgagacctg tggctgtgaa gcaagtgtct gaacgagaag aacttatcca gggcgtgctg 300 gcccaggtgg cggaacaatt ttccagagcg tttaagatca acgagctgaa agccgaagtt 360
gcaaatcacc tggccgtgct ggagaaacgg gtggaattgg aaggacttaa agtggtggag 420 atcgaaaaat gcaagagtga cattaaaaag atgcgggagg agttggcagc taggaacagc 480 aggaccaact gtccatgtaa atacagtttt ttggataaca agaagttgac acctcgacgt 540 gatgtcccca cttaccccaa gtacctgctc tccccagaga ccatcgaagc cctacggaag 600 cccacctttg atgtctggct ttgggaaccc aacgagatgc tgagctgttt agaacatatg 660 taccacgacc t tggtctggt cagggacttc agcatcaacc caatcacgct ccgcaggtgg 720 ctgctctgtg tgcatgacaa ctacaggaac aaccccttcc acaacttccg gcactgcttc 780 tgtgtgacac agatgatgta cagtatggtc tggctctgtg gcctccagga gaagttttcc 840
cagatggaca tcttggtcct gatgactgca gccatctgcc atgacctgga ccacccaggg 900 tacaacaata cataccagat caatgcccgc acggaactcg ctgtgcgcta caacgacatc 960 tcaccgctgg agaaccacca ctgcgccatt gccttccaga tcctggcaag acctgagtgc 1020 aacatcttcg ccagtgtgcc acccgagggc ttcaggcaga tcaggcaggg gatgatcaca 1080 ttgatcctgg ctaccgacat ggcaaggcat gctgaaatta tggattcttt caaagaaaag 1140 atggagaatt ttgactacag caacgaggag cacctgaccc tgctgaagat gattctcata 1200 aaatgctgtg atatctccaa tgaagtccgt cccatggagg tggcagaacc gtgggtggac 1260 tgtttactgg aagaatattt tatgcagagt gaccgtgaga agtccgaagg ccttcctgtg 1320 95751.doc -2- 1380 200526783 gccccattca tggaccgaga caaagtgacc aaagcaacag cccaaattgg gttcatcaag tttgtcctga tcccaatgtt tgaaacagtg accaagctct tccccgttgt tgaggagacc atgctgcggc cgctctggga gtcccgagaa cactacgagg agctgaagca gctggacgat gccatgaagg agttgcagaa gaagacagag agcttaacat ctggggcccc ggaaaacacc acagagaaga acagagatgc aaaagacagt gaaggccatt ctcctccaaa ctgatggaca tctcaatgtg tgcacagact gtaccagtta gagcagatga attgtggcct gtgagtggac agagccaagc gaggcttccc aggatcttcc acacaaggat ggtcacgccc agacaaccct gatgacctgc tacagaccat gttttctaag aaccattttg ttccctgata taaaaacagg aatcccgatg ctgttcagaa tttttatttt taaactgttt tttaaataat atatttttac acagaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 95751.doc 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1929

Claims (1)

  1. 200526783 十 ι· 2. 3· 4· 5. 6. 7. 8· 9· 10 11 、申請專利範圍： 一種用於製造減少動物體脂肪之藥劑之磷酸二酯酶 9(PDE9)抑制劑之用途。 如明求項1之用途，其中該哺乳動物係為過重的。 如请求項1之用途，其中該哺乳動物係為肥胖的。 如明求項1之用途，其中該PDE9抑制劑係為PDE9選擇性 抑制劑。 種用於製造治療動物飲食障礙之PDE9抑制劑之用途。 如请求項5之用途，其中該pdE9抑制劑係為PDE9選擇性 抑制劑。 一種基因改造之經培養哺乳動物細胞，其中該細胞係為 PDE9基因中斷之同基因型（homozygous)，且其中該細胞 & Μ生自該細胞之繼代細胞，顯現出無法測得之PDE9胜 月太活性’其中該細胞或繼代細胞具有PDE9胜肽活性而無 該同基因型中斷。 如請求項7之基因改造之哺乳動物細胞，其中該細胞係 為胚胎幹（ES)細胞。 如請求項7之基因改造之細胞，其中該細胞係鼠類ES細 如請求項7之基因改造之細胞，其中該細胞係人類ES細 胞。 一種製造基因改造老鼠之方法，其包括： (a)將一 DNA序列導入至一老鼠ES細胞中，其中該DNA 序列包括一 PDE9基因標定構築體，其經與PDE9基因重 95751.doc 200526783 組後可中斷PDE9基因； ⑻選定-基因組含有PDE9基因中斷之老鼠职田胞，· ⑷將步驟⑻選定之队細胞導人至—老鼠囊胚或桑摇 體（morulae)中； (d) 將步驟（c)之囊胚或桑椹體移植至代養母鼠中； (e) 發育該經移轉之囊胚或桑椹體至一期間以製得一嵌 合鼠；及 (f)繁殖步驟（e)之嵌合鼠及PDE9基因中斷之異基因型 老鼠而得到PDE11基因中斷之同基因型老鼠； 其中δ亥PDE9基因中斷之同基因老鼠在六週的高脂肪飲 食後，相較於野生型老鼠在六週的高脂肪飲食後，顯示 出減少之體重或脂肪組織（adipose depot)中減少之脂肪 質量。 12. 一種經分離核酸分子，其包括一PDE9基因標定構築體， 其中該構築體經與PDE9基因重組後可中斷PDE9基因。 95751.doc
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