TW200427835A - Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) Taiwan isolate and immunodiagnostic device for the detection of SARS-CoV - Google Patents

Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) Taiwan isolate and immunodiagnostic device for the detection of SARS-CoV Download PDF

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TW200427835A
TW200427835A TW93116663A TW93116663A TW200427835A TW 200427835 A TW200427835 A TW 200427835A TW 93116663 A TW93116663 A TW 93116663A TW 93116663 A TW93116663 A TW 93116663A TW 200427835 A TW200427835 A TW 200427835A
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Pei-Jer Chen
Ding-Shinn Chen
Shiou-Hwei Yeh
Chuan-Liang Kao
Bin-Jon Shen
Wen Hai Tsai
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Tyson Biores Inc
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200427835 玖、發明說明： 【明屬 】 發明領域 本發明主要是有關於利用SARS冠狀病毒的多胜肽 5 (popypeptide)或蛋白抗原或是由此等衍生出的重組型產物 而製出的快速免疫檢驗裝置，以供仙從一被懷疑感染有 SARS冠狀病毒的個體所取得的生物樣品内是否存在有抗 SARS冠狀病毒抗體(anti-SARS_c〇v amib〇dies)。本案亦有 關於利用SARS-CoV的抗原所產生的單株(m〇n〇d〇nal)或多 10株(Polyclonal)抗體來供製作用以偵測一生物樣品中是否存 在有SARS-CoV抗原的快速免疫檢驗裝置。 L·. iltr ]1 發明背景 於2002年底，在中國大陸的廣東省爆發大規模的非典 15 型肺炎（atypical pneunomia)，而於同年的二月至三月初，在 香港、越南、加拿大等地區亦陸續地發生相同的病例。於 是，世界衛生組織(WHO)於該年的3月15曰發出全球警訊， 並將該流行病稱之為“嚴重急性呼吸道症候群(Severe Acute Respiratory Syndrome)”，簡稱SARS。此流行病的病徵特點 2〇 為發生瀰漫性肺炎及呼吸衰竭，且較諸於由已知的病毒、 細菌所引起的非典型肺炎更為嚴重。之後，SARS被鑑定出 是由一種新發現的冠狀病毒(Coronavirus)的感染所引起，該 病毒於是被稱為SARS冠狀病毒(SARS-CoV)。 在臨床上，有2-10%的人類急性上呼吸道感染的病原是 5 200427835 屬於冠狀病毒（通常是引起普通感冒或傷風），而且人類冠狀 病毒有HCoV-OC43與HcoV-229E這兩種不同的抗原型。但 是與鼻病毒不同的是，冠狀病毒不僅會引起上呼吸道感 染，它也會導致下呼吸道感染（例如，非典型肺炎的併發症）。 5 而在S ARS-CoV被確5忍疋引起嚴重急性呼吸道症候群 的主要元凶後’全球的生技、醫療研究人員即致力於發展 可用於快速偵測一個體是否感染有SARS的檢驗裝置，而被 採用的技術包括反轉錄酶聚合酶連鎖反應(RT-PCR)、免疫 螢光分析法（immunofhiorescent assay，IFA)、酵素免疫分析 10 法（enzyme immunoassay，EIA)等等0 在許多被用來4貞測和/或測定分析物（特別是生物學上 感興趣的分析物）的分析系統中，層析分析系統經常被醫師 和醫事技術人員所使用以供辦公室内之快速檢驗和治療監 控各種病狀與疾病。病人也漸增地自己在家中使用該等系 15 統以監控此等病狀與疾病。遠荨糸統中最重要的是“薄層’’ 系統，當中有一種溶劑會流過一個薄而平坦的吸附性介質。 可以利用該薄層被完成的試驗中最重要的是免疫分析 法，其係倚賴一抗原或半抗原與一對應抗體之間的專一性 相互反應。 20 在色層分析技術中通常與免疫分析法被合用的是一種 被稱為免疫色層分析法的操作程序，其中一種顆粒性直接 標識[諸如一金溶膠體(a g〇ld sol)或是一有色的乳膠粒子(a colored latex particle)]被用來顯示在一諸如多孔性條片之 多孔載體上所進行的分析之結果。位在該條片上之一個相 6 當小的偵測區域内的顆粒性標識的濃度顯示出分析結果。 在f貝用的貫施中，該條片包含有一個通常係位於該偵 測區域的下方之對照組區域，於該對照組區域中亦會有一 個顏色訊號被產生以供使用者來再確認該試驗有被正確地 進行。在大多數根據此概念的商業產品中，測試組和對照 組的訊號是使用相同的顆粒性標識被產生之。 除了免疫色層分析法之外，亦知道可用以酵素為主的 色層分析法。此類技術大致上與免疫色層分析法類似，但 使用一種酵素催化的反應而非一種抗原-抗體反應。酵素催 化的反應通常係產生一個可偵測的產物。其他類似的色層 分析法在本技藝中是為已知的。 基於SARS-CoV對於全球人類的健康所帶來的嚴重威 脅，對於發展出一反應速度快、使用簡便而且準確性高的 檢驗工具來供SARS-CoV的偵測，實存在有一迫切的需要。 C發明内容3 申請人從台灣患有嚴重急性呼吸症候群的病人的檢體 内成功地分離出一個SARS冠狀病毒(SARS-C〇v)台灣分離 株，它被命名為SARS冠狀病毒TW1。在該病毒的完整基因 序列（序列辨識編號：1)被定出後，申請人將之送往^^^則 的基因庫作登錄，並於2〇〇3年5月14日正式在NCBI網頁的 序列檢索系統被公開，寄存編號為Αγ291451，關於此點， 明參見申請人於2003年6月11日為本案的母案提出專利申 明時，隨專利申請文件一同檢附的附件（共計12頁，Yeh， S’H.，Ka〇, C，L·，Tsai，C，Y·，Liu，C.-J.，Chen5 D,S. and 200427835
Chen，R-J·，論文直接投稿於NCBI)。 SARS冠狀病毒的外套（envelope)主要包括三種糖蛋白 (glycoprotein) ··棘蛋白（spike protein)、外套蛋白（envelope protein)以及膜蛋白（membrane protein)。此外，該病毒具有 5 核殼體蛋白（nucleocapsid protein)來將病毒的RNA遺傳物質 包覆起來。除了那些結構性蛋白質（structural protein)以 外，該病毒尚具有其他非結構性蛋白質，例如複製酶 (replicase)、蛋白酶(protease)等等。而除了上述這些蛋白質 之外，該SARS冠狀病毒的基因組中還存在有一些被預測的 10 開放閱讀架構區（predicted open reading frames，ORFs) 〇 以所分離出的SARS冠狀病毒TW1的結構性蛋白質作 為基礎，申請人發展出快速檢驗試劑與裝置來供彳貞測一從 一被懷疑感染有SARS冠狀病毒的個體所取得的生物印品 内是否存在有與SARS-CoV相關的抗體或抗原，這包括，但 15 不限於，下面所述的方向： 1.利用SARS冠狀病毒的核殼體蛋白（包含重組型蛋白/多 胜肽)與膠體金(colloidal gold)、膠乳珠粒(latex bead)或 其他足以和該蛋白質結合而使之帶上標記的物質，經過 共軛反應(conjugation)之後，來和存在於從一被懷疑感 2〇 染有SARS冠狀病毒的個體所取得的生物樣品内的抗_ 核殼體蛋白抗體作用；而該抗·核殼體蛋白抗體經由免 疫層析法(immunochromatography)原理而與位在硝基纖 維素膜(nitrocellulose membrane)上的核殼體蛋白（包含 重組型蛋白/多胜肽)結合後，會在硝基纖維素膜上顯現 8 出一可區分的訊號，藉此，可以判斷該生物樣品内是否 含有抗-SARS-CoV抗體。關於這個部分，參見後文中所 描述的實施例1 ; 在硝基纖維素膜上塗覆抗-人類IgG或IgM抗體，其餘部 分的操作可參照上述第1項； 利用S ARS趣狀病毒的棘蛋白（Spike protein)(包含重組 型蛋白/多胜肽)與膠體金、膠乳珠粒或其他足以和該蛋 白質結合而使之帶上標記的物質，經過共軛反應之後， 來和存在於從一被懷疑感染有SARS冠狀病毒的個體所 取得的生物樣品内的抗-棘蛋白抗體作用；而該抗-棘蛋 白抗體經由免疫層析法原理而與位在硝基纖維素膜上 的棘蛋白（包含重組型蛋白/多胜肽)結合後，會在硝基纖 維素膜上顯現出一可區分的訊號，藉此，可以判斷該生 物樣品内是否存在有抗-SARS-CoV抗體。關於這個部 分，參見後文中所描述的實施例3 ; 在硝基纖維素膜上塗覆抗_人類IgG或IgM，其餘部分的 操作可參照上述第3項； 利用S ARS冠狀病毒的膜蛋白（membrane protein)(包含 重組型蛋白/多胜肽)與膠體金、膠乳珠粒或其他足以和 該蛋白質結合而使之帶上標記的物質，經過共軛反應之 後’來和存在於從一被懷疑感染有SARS冠狀病毒的個 體所取得的生物樣品内的抗-膜蛋白抗體作用；而該抗-膜蛋白抗體經由免疫層析法原理而與位在硝基纖維素 膜上的膜蛋白（包含重組型蛋白/多胜肽)結合後，會在硝 基纖維素膜上顯現出一可區分的訊號，藉此，可以判斷 "玄生物樣品内是否存在有抗-SARS-CoV抗體； 6·在硝基纖維素膜上塗覆抗_人類IgG或IgM，其餘部分的 操作可參照上述第5項； 利用SARS旭狀病毒的外套蛋白（envei〇pe (包含 重組型蛋叫胜肽)與膠體金、膠乳珠粒或其他足以和 蛋白貝結合而使之帶上標記的物質，經過共軛反應之 後，來和存在於從一被懷疑感染有SARS冠狀病毒的個 體所取得的生物樣品_抗_外套蛋白抗體作用；而該 抗-外套蛋白抗體經由免疫層析法原理而與位在硝基纖 、隹素膜上的外套蛋白（包含重組型蛋白或多胜肽）結合 後，會在石肖基纖維素膜上顯現出一可區分之訊號，藉 此，可以判斷該生物樣品内是否存在有抗SARS-CoV抗 體； 8·在硝基纖維素膜上塗覆抗_人類⑽或_，其餘部分的 操作可參照上述第7項； 利用以SARStij狀病毒的核殼體（包含重組型蛋白/多胜 )斤生成的單株或多株抗體，和膠體金、膠乳珠粒或 -他足以和4抗體結合而使之帶上標記的物質，經過共 反應之後I與存在於從-被懷疑感染有SARS冠狀 病毒的個體所取得的生物樣品内的SARS冠狀病毒抗原 乍用，而SARS旭狀病毒抗原經由免疫層析法原理而與 位在硝基雜素膜上的另—組抗體仙而結合，會在硝 基纖維素膜上顯現出_可區分的訊號，藉此，可以判斷 檢體中是否存在有SARS-CoV之抗原； 利用以SARS冠狀病毒的棘蛋白（包含重組型蛋白或多 胜肽)所生成的單株或多株抗體，和膠體金、膠乳珠粒 或其他足以和該抗體結合而使之帶上標記的物質，經過 共軛反應之後，來和存在於從一被懷疑感染有SARS冠 狀病毒的個體所取得的生物樣品内的S A R S冠狀病毒抗 原作用；而該SARS冠狀病毒抗原經由免疫層析法原理 而與位在硝基纖維素膜上的另一組抗體作用而結合，會 在硝基纖維素膜上顯現出一可區分的訊號，藉此，可以 判斷該生物樣品内是否存在有SARS-CoV之抗原； 利用以SARS冠狀病毒的膜蛋白（包含重組型蛋白/多胜 肽)所生成的單株或多株抗體，和膠體金、膠乳珠粒或 其他足以和該抗體結合而使之帶上標記的物質，經過共 軛反應之後，來和存在於存在於從一被懷疑感染有 SARS冠狀病毒的個體所取得的生物樣品内的SARS冠 狀病毒抗原作用；而該SARS冠狀病毒抗原經由免疫層 析法原理而與位在硝基纖維素膜上的另一組抗體作用 而結合，會在硝基纖維素膜上顯現出一可區分的訊號， 藉此，可以判斷該生物樣品内是否存在有SARS-CoV之 抗》原， 利用以SARS冠狀病毒的外套蛋白（包含重組型蛋白/多 胜肽)所成生的單株或多株抗體，和膠體金、膠乳珠粒 或其他足以和該抗體結合而使之帶上標記的物質，經過 共軛反應之後，來和存在於從一被懷疑感染有SARS冠 狀病f的個體所取得的生物樣品内的SARS冠狀病毒抗 原作用，而該SARS冠狀病毒抗原經由免疫層析法原理 而與位在硝基纖維素膜上的另一組抗體作用而結合，會 在確基纖維素膜上顯現出一可區分的訊號，藉此，可以 判斷该生物樣品内是否存在有SARS_c〇v之抗原； 13·就上述所使用的8八汉8冠狀病毒的蛋白 質的編碼基因’ 可以藉由分子選殖技術而將多個基因或它們的基因片 重、、且以I成一個複合基因建構物（⑺mp〇site gene construct) ’而由此所衍生出的基因產物（包含重組型蛋 1〇 白/多胜肤)也可供上述第1至8項的應用，俾以供用於判 斷從一被懷疑感染有SARS冠狀病毒的個體所取得的生 物樣品内是否存在有抗-SARS_c〇v抗體；以及 14·在用於偵測生物樣品的裝置中，也可以利用蛋白質A (Protein A)、蛋白質g (protein G)或其他可以和抗體結合 15 的物質’和膠體金、膠乳珠粒或其他足以和前述物.質結 合而使之帶上標記的物質，經過共軛反應之後，來和存 在於存在於從一被懷疑感染有SARS冠狀病毒的個體所 取得的生物樣品内的抗體作用後，經由免疫層析法原理 而與位在硝基纖維素膜上的s A R s _ c 〇 v抗原作用而結 2〇 合，會在硝基纖維素膜上顯現出一可區分的訊號，藉 此，可以判斷該生物樣品内是否存在有抗_ s A R s -CoV 抗 體。 本發明將就下面實施例來作進一步說明，但應瞭解的 疋，該等實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發 12 200427835 明的實施之限制。 I：實施方式]| 實施例1· SARS-CoV之一核殼體抗原的製備 1· SARS-CoV TW1分離株是於VeroE6細胞中被培養出來 5 的’並利用隨機六員體（random hexamer)來進行 SARS-CoV的cDNA存庫(cDNAlibrary)的複製，其中利 用cDNA純株第三號作為模版(tempiate)，以下面所設計 的一對引子(primer pair)來進行PCR反應，而擴增出一 編碼SARS-CoV之一核殼體抗原的DNA片段： 10 5’端引子： acggatccatgtctgataatggacccca(序列辨識編號：2) 3’端引子： acgaattcttatgcctgagttgaattcag(序列辨識編號：3) 該5’端引子具有一個5_ΗΙ切割位址，而該3,端引子具 15 有一個五coRI切割位址。在PCR後，利用如mHIAEcoRI限制 酵素來切出所欲的DNA片段。 2. 上述藉由PCR而被擴增出的DNA片段被推斷是編碼一 具有一如下所示的胺基酸序列的S A R S - C ο V核殼體抗 原：
20 MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQ
GLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKM KELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVL QLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGET ALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFG 13 200427835 RRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTY HGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPT VTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADSTQA(序列辨識編號：4)。 3. 上述步驟（1)所得到的編碼SARS-CoV核殼體抗原的 5 DNA片段被插入經過BamHl/EcoRl處理過之pGEX-1 (Pharmacia)或 pRSETA (Invitrogen)蛋白質表現載體 内。於是，由此所形成的重組型載體可以表現出在N-端處分別接有GST-Tag及His-Tag的重組型蛋白/多胜 肽，而這兩種重組型蛋白/多胜肽皆可利用親和力管柱 10 層析法（affinity column chromatography)而被方便地純 化。 (1)·蛋白質表現裁體pRSETA: 上述步驟（1)所得到的編碼SARS-CoV核殼體抗原的 ONA片段被併入至蛋白質表現載體pRSETA内，接而將由此 I5所形成的重組型載體轉移至大腸桿菌菌株DH5a的細胞 内。經抗生素篩選後，從被轉形的重組型菌株抽取出質體 DNA ’並以限制酵素來確定被插入的DNA的大小及方向， 然後選取選殖成功的蛋白質表現載體來進行核酸定序確 認。 20 (2).蛋白質表現裁體pGEX-Ι : 上述步驟⑴所得到的編碼SARS-CoV核殼體抗原的 DNA片段被併入至$白質表現裁體ρ(3Εχ巧内，接而將由此 所形成的重組型載體轉移至大腸桿菌菌株D Η 5 a的細胞 内。經抗生素篩選後，從被轉形的重組型菌株抽取出質體 14 200427835 DNA ’並以限制酵素來確定被插入的dna的大小及方向， 然後選取選殖成功的蛋白質表現載體來進行核酸定序確 認。 (3) ·誘導重組型蛋白的表現·· 5 (3-l).His-tag重組型蛋白的表現： 將上面所得到的重組型蛋白表現載體pRSETA轉移至 大腸桿菌菌株BL21(DE3)lys S的細胞中。於1.5 ml的新鮮 LB/ΑΡ培養基[内含5〇 gg/ml胺苄青黴素(ampidllin)]内予以 加入1/100體積之隔夜細菌培養液，並於37°C恆溫箱振盪培 10 養歷時3至6小時，然後加入1 mMIPTG並繼續培養歷時3小 時。之後，取出20〜50 μΐ的培養菌液並加以離心以收集菌 體，然後以SDS-PAGE來分析重組型蛋白的表現情形。 (3-2).GST-tag重組型蛋白的表現： 將上面所得到的重組型蛋白表現載體pGEX-Ι轉移至 15 大腸桿菌菌株BL21(DE3)lys S的細胞中。於1.5 ml的新鮮 LB/ΑΡ培養基内予以加入1/100體積之隔夜細菌培養液，並 於37°C恆溫箱振盪培養歷時1至3小時，然後加入0.1 mM IPTG並繼續培養歷時3小時。之後，取出20〜50 μΐ的培養菌 液並加以離心以收集菌體，然後以SDS-PAGE來分析重組型 20 蛋白的表現情形。 (4) .重組型蛋白的大量表現： 上述所得到的重組型裁體pGEX或pREST被證實會生 成在N-端處分別接有GST-Tag及His-Tag的重組型 SARS-CoV核殼體抗原性蛋白。 15 200427835 誘導His-tag重組型蛋白和GST_tag重組型蛋白的大量 表現，基本上和誘導小量表現時的條件相同，但在大量誘 導的條件中，需注意誘導的起始時間。通常培養菌液的濃 度為不超過0.5〜0.6 (OD_)。 5 (5)·重組型蛋白的純化：
His-tag重組型蛋白和GST-tag重組型蛋白的純化是參 照各商業套組中所提供的操作手冊。
His tag 重組型蛋白是以 Ni-Sepharose™ (Amersham Biosciences)來純化。將細胞萃取液裝載至充填有 10 Nl_SePharoseTM以裝載緩衝液(i〇ading buffer)[〇.i5 M NaCl， 20 mM Na-P〇4, pH 7.4, 5 mM口米唾(imidazol)]來洗提管柱， 接而以清洗緩衝液(0.15M NaC卜20mM Na-P04，pH 7.4， 55mM imidazol)來洗提管柱共計二次，然後以洗提緩衝液 (elution buffer)(0.15M NaCl ^ 20 mM Na-P04 ? pH 7.4? 500 15 mM咪唑）來將His-tag重組型蛋白洗提出。 GST-tag 重組型蛋白是以 Glutathione-Sepharose™ (Amersham Biosciences)來純化。將細胞萃取液裝填至一充 填有Glutathione-Sepharose™的管柱内，以PBS (ρΗ7·4)、1% Triton Χ-100來洗提管柱，然後以一含有50 mM Tris-HCl 2〇 (pH 8.0)與10 mM還原態榖胱甘肽(glutathione)的洗提緩衝 液來將GST-tag重組型蛋白洗提出。 (6) ·利用SDS-PAGE來確認所純化出的蛋白質的純度。 (7) .利用蛋白質分析染劑(protein assay dye，Bio-Rad)來進 行蛋白質濃度的測定。 16 200427835 實施例2·製備用於偵測抗SARS冠狀病毒抗體之含有 SARS-CoV之一重組型核殼體抗原的快速免疫檢 驗裝置 L 膠體金共輕物(colloidal gold conjugate)的製備： 5 首先，使用〇·2Μ K2C03來將一0.4%之膠體金(colloidal gold)溶液的PH值調整至大於7.79，即為溶液A。之後，將 經純化的重組型GST-Tagged或His-Tagged核殼體抗原加入 至溶液A中，加入的蛋白質量為10〜30 pg蛋白質/ml溶液A。 於室溫下反應歷時30〜60分鐘後’予以加入溶液A的百分之 10 一 體積的 20%聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)水溶液以 及溶液A的二十五分之一體積的牛血清白蛋白（b〇vine serum albumin, BSA)水溶液，俾以中和未反應的膠體金。 以高速離心（12,500 rpm，20min，4°C)來進行濃縮處理，而得 到一被濃縮的核殼體抗原-金共輛物溶液，即為溶液B。 I5 2·製備核殼體抗原塗覆的-頌基纖維素膜(nitrocellulose membrane，NCM): 將經純化的重組型GST-Tagged或His-Tagged核殼體抗 原塗覆在硝基纖維素膜（寬度2.2 cm)上，塗覆濃度為 0.10〜0.15 mg/ml，藉此而於硝基纖維素膜上形成一測試線 20 段(test line) 〇 此外，硝基纖維素膜(NCM)上也被塗覆以一條山羊抗_ 小白鼠（goat anti-mouse) IgG 或兔抗-小白鼠（rabbit antimouse) IgG 區帶 ，塗覆 濃度為 1 ·5 〜 2.0 mg/ml ， 藉 此而於NCM 上形成一對照線段(control line)。 17 200427835 在長度為一公尺的NCM上，被塗佈的線段具一寬度為 1〜2 mm ’塗佈量為〇_〇86〜0· 114 ml。 測試線段及對照線段之塗佈示意圖如圖1所示，其中對 照線段與測試線段之間的間隔為0.5 cm。 5 在完成塗覆後，將NCM送入至一相對溼度低於20%的 乾燥房來進行隔夜乾燥處理，藉此而得到一經核殼體抗原 塗覆的-NCM。 3·製備經核殼體抗原塗覆的-纖維玻璃膜（fiber glass membrane, FGM)： 10 利用稀釋緩衝液（dilution buffer)(Tris，0.2M; NaCl， 0.15M;蔗糖，2〇g/l; PEG，lg/1; Tween-20，0.5%; NaN3, 0.02%;絡蛋白（casein)，0.4%; ρΗ7·2)來調配出一為 10〜20% 的溶液Β，再加入最終濃度為3%的鼠免疫球蛋6G_膠體 金，即形成溶液C。 15 將溶液C塗覆在一長度為一公尺的纖維玻璃膜(FGM) 上’而形成一寬度在〇·4〜〇·6 cm之間，塗佈量為2〜3 ml的膠 體金-抗原線段。圖2顯示該纖維玻璃膜4之一塗佈示意圖。 在完成塗覆後，將該纖維玻璃膜(FGM)立即送入至一 真空冷凍乾燥機内，在予以冷凍至-40〜50°C後，開始進行 20真空冷凍乾燥，時間為20小時，藉此而得到一經核殻體抗 原塗覆的-FGK1。 4·測试母版的製備： 利用該經核殼體抗原塗覆的-NCM以及該經核殻體抗 原塗覆的-FBM來黏貼出一具一長度為7.2〜7.5 cm以及一寬 18 200427835 度為5.3 cm的長條狀測試母版。黏貼的程序如下： 將該經核殼體抗原塗覆的-NCM (寬度2.2 cm)黏貼於 一底板上，接而將該經核殼體抗原塗覆的_FGM (寬度1〜2 cm)貼在該核殼體抗原塗覆的—NCM下方，並使FGM的上緣 5的下緣相疊接1 mm，而且是FGM的上緣壓住NCM 的下緣。 之後將一全血過濾膜（寬度為3·0〜3.8 cm)貼在該FGM 的下方，並使全血過濾膜的上緣與該FGM下緣相疊接1 mm，而且是該全血過濾膜的上緣壓住該17(}]^的下緣。該全 · 10 血過遽膜是一種過渡全血的裝置，例如Cytosep (Pall)，而 一全血樣品在經過此過濾膜後可以分離出血漿。 最後，將一吸水紙貼在該NCM的上方，以使該吸水紙 的下緣與该NCM的上緣相疊接1 mm ’而且是該吸水紙的下 緣壓住該NCM的上緣。於是，一具有圖3所示的結構配置的 15 測試母版即被完成。 將由此而製得的測試母版送入一裁紙機内，以便裁穿j 出具一寬度為〇·3〜0·7 cm以及一長度為7.2 cm的測試片。圖 _ 4顯不一^固依據本發明的測試片之結構配置。之後，將測1 片放入檢驗盒内，並送入一自動鋁箔封包機内來進行封聲。 20 以上有關依據本發明的快速免疫檢驗裝置的所有操作 , 最好是在一相對溼度低於20%的工作房内進行。 圖5顯示一個依據本發明的快速免疫檢驗裝置的結構 配置，其中符號C表示對照線段的所在位置，符號τ表示測 試線段的所在位置’ S1為供加入樣品的區域，以及Jg 1為供 19 200427835 加入緩衝液的區域。 以上所述的操作最好是在一相對溼度低於20%的工作 房内進行。 實施例3· SARS-CoV之一棘抗原的製備 5 1. SARS-CoV TW1分離株是於VeroE6細胞中被培養出來 的’並利用隨機六員體（random hexamer)來進行 SARS-CoV的cDNA存庫（cDNA library)的複製，其中利 用cDNA純株第三號作為模版(template)，以下面所設計 的一對引子(primer pair)來進行PCR反應，而擴增出一 10 編碼SARS-CoV之一棘抗原的DNA片段： 5’端引子： acggatcctccactgaccttattaagaa(序列辨識編號：5) 3’端引子： acgaattcgttcgtttatgtgtaatgta(序列辨識編號：6) 15 該5’端引子具有一個如mHI切割位址，而該3’端引子具 有一個五coRI切割位址。在PCR後，利用5amHI/及^RI限制 酵素來切出所欲的DNA片段。 2. 上述藉由PCR而被擴增出的DNA片段被推斷是編碼一 具有一如下所示的胺基酸序列的SARS-CoV之一棘核 20 抗原：
MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPD EIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWV FGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCT FEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKP 20 200427835
IFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAV DCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKF PSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGD DVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRP 5 FERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPA TVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPK TSEILDISPCSFGGVSVITPGTNAS SEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYST GNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLG ADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGS 10 FCTQLNRALSGIAAEQDRNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRS FIEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYT AALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAIS QIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAE VQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYH 15 LMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQ RNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGImNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDV DLGDISGINAS VVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYVWLGFIA GLIAIVMVTILLCCMTSCCSCLKGACSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT (序列 辨識編號：7)。 20 3. 上述步驟（1)所得到的編碼SARS-CoV棘抗原的DNA片 段被插入經過五coRl處理過之pGEX-1 (Pharmacia)或 pRSETA (Invitrogen)蛋白質表現裁體 内，其中所使用操作步驟大體上是參照實施例1中所述 者來進行。於是，由此所形成的重組型載體可以表現 21 200427835 出在N-端處分別接有GST-Tag及His-Tag的重組型蛋白/ 多胜肽。 實施例4·製備用於偵測抗SARS冠狀病毒抗體之含有 S ARS-Co V之一重組型棘抗原的快速免疫檢驗裝 5 置 本實施例的操作步驟大致上係參照實施例2來進行。 1.製備膠體金共軛物： 首先，用0.2MK2C〇3將一0.4%膠體金溶液的pH值調整 至低於6.88，是為溶液A。之後，將經純化的重組型 春 10 GST-Tagged或His-Tagged棘抗原加入至溶液a中，加入的蛋 白質量為1〜1〇 gg蛋白質/ml溶液A。於室溫下反應歷時 30〜60分鐘後，予以加入溶液A的百分之一體積的2〇% peg 水溶液以及溶液A的二十五分之一體積的bsa水溶液，俾以 中和未反應的膠體金。以南速離心（12,500 rpm，20min，4°C) 15來進行濃縮處理，而得到一被濃縮的棘抗原-金共輛物溶 液，即為溶液B。 2·製備棘抗原-硝基纖維素膜(NCM) : ^ 參照實施例2中所述，將經純化的重組型GST_Tagged 或His-Tagged棘抗原塗覆在硝基纖維素膜（寬度2·2 cm)上， 20塗覆濃度為0·01〜0·05 mg/m卜藉此而於硝基纖維素膜上形 成一測試線段(test line)。
此外’硝基纖維素膜(NCM)上也被塗覆以一條山羊抗一 小白鼠（goat anti-mouse) IgG 或兔抗-小白鼠（rabbit anti-mouse) IgG區帶，塗覆濃度為1.5〜2·〇 mg/ml，藉此而於NCM 22 200427835 上形成一對照線段(control line)。塗覆完成後送入相對溼度 低於20%之乾燥房，即得到棘抗原塗覆的_NCM。 3·製備棘抗原塗覆的-纖維玻璃膜(FBM): 利用稀釋緩衝液（dilution buffer)(Tris，0.2Μ; NaCl， 5 〇·15Μ;蔗糠，20g/l; PEG，lg/1; Tween-20，0.5%; NaN3, 〇·〇2%;路蛋白（casein)，0.4%; ρΗ7·2)來調配出一為 10 〜20% 的溶液Β ’再加入最終濃度為3%的鼠免疫球蛋白G-膠體 金’即形成溶液C。 將溶液c塗覆在一長度為一公尺的纖維玻璃膜(FGM) 10上’而形成一寬度在〇·4〜〇.6 cm之間，塗佈量為2〜3 ml6勺膠 體金-抗原線段。 在完成塗覆後，將該纖維玻璃膜(FGM)立即送入至一 真空冷/東乾燥機内，在予以冷凍至-40〜-50°C後，開始進行 真空冷凍乾燥，時間為20 小時，藉此而得到一經棘抗原塗 15 覆的-FGM。 4·測試母版的製備： 利用上述所製備的該經棘抗原塗覆的·NCM以及該經 棘抗原塗覆的-FBM[來黏貼出一具一長度為7.2〜7.5 cm以及 一寬度為5.3 cm的長條狀測試母版。黏貼的程序係如實施例 20 2中所述。 之後’將所製得的測試母版送入一裁紙機内，以便裁 製出具一寬度為〇·3〜〇·7 cm以及一長度為7.2 cm的測試 片’然後將測試片放入檢驗盒内，並送入一自動鋁箔封包 機内來進行封裝。 23 200427835 實施例5.抗-SARS抗體的快速檢驗 1. 將一如圖5所示之依據實施例2所製得的抗SARS抗體 快速檢驗裝置於桌面上，於樣品加入區（S!)内滴入30 μΐ 的全血樣品或15 μΐ的血清/血漿。在30秒之内，於緩 5 衝液加入區（S2)内滴入將100〜250 μΐ的緩衝液，等待 15〜20分鐘後，以目視方法來判讀結果。 2. 參見圖6所示，若在測試區帶(Test line，Τ)顯現出訊號， 而對照組區帶（control line，C)也出現有訊號，則為 SARS-CoV抗體陽性反應結果。若只有對照組區出現有 10 訊號，而測試區帶（Test line，T)無出現訊號，則為 SARS-CoV抗體陰性反應結果。而若對照組區帶（C)沒有 出現訊號，無論測試區帶(T)有沒有出現訊號，這樣的測 試結果都是無效的。 雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地 15 在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變 化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附的申請專利範 圍所示者的限制。 24 200427835 I：圖式簡單說明3 圖1是一用於製備本發明的快速免疫檢驗裝置的硝基 纖維素膜的示意圖，其上面塗佈有一測試線段與一對照線 段，其中該對照線段與該測試線段之間的間隔為0.5 cm ; 5 圖2是一用於製備本發明的快速免疫檢驗裝置的纖維 玻璃膜的示意圖，其上面塗佈有一膠體金-抗原線段； 圖3顯示一用於製備本發明的快速免疫檢驗裝置的測 試母版之結構配置； 圖4圖4顯示一用於製備本發明的快速免疫檢驗裝置的 10 依據本發明的測試片之結構配置； 圖5顯示一依據本發明的快速免疫檢驗裝置的之結構 配置；以及 圖6顯示在使用本案明的快速免疫檢驗裝置後之結果 的解說。 15 【圖式之主要元件代表符號表】 (無） 25 200427835 序列表 <110>台欣生物科技硏發股份有限公司 <120〉嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒(SARS-CoV)台灣分離株以及用於檢測SARS冠狀 病毒的免疫檢驗裝置 <130> NP-17578 <150〉 092115845 <151> 2004-06-11 <160〉 7 <170> Patentln version 3.2
<210> 1 <211> 29729 <212> DNA <213> SARS coronavirus TW1 <400> 1 atattaggtt tttacctacc caggaaaagc caaccaacct cgatctcttg tagatctgtt 60 ctctaaacga actttaaaat ctgtgtagct gtcgctcggc tgcatgccta gtgcacctac 120 gcagtataaa caataataaa ttttactgtc gttgacaaga aacgagtaac tcgtccctct 180 tctgcagact gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagtcgat catcagcata cctaggtttc 240 gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgttc ttggtgtcaa cgagaaaaca 300 cacgtccaac tcagtttgcc tgtccttcag gttagagacg tgctagtgcg tggcttcggg 360 gactctgtgg aagaggccct atcggaggca cgtgaacacc tcaaaaatgg cacttgtggt 420 ctagtagagc tggaaaaagg cgtactgccc cagcttgaac agccctatgt gttcattaaa 480 540 200427835 cgttctgatg ccttaagcac gacggcattc agtacggtcg gaaaccccaa ttgcataccg ggtcatagct atggcatcga cccattgaag attatgaaca ctcactcgtg agctcaatgg ccagatgggt accctcttga tgcactcttt ccgaacaact gaccatgagc atgaaattgc acacccttcg aaattaagag tttgtgtttc ctcttaactc actgagggtt tcatggggcg aacaatatgc acttgtctac acgtgcgact ttctgaaagc ggacctacta catgtgggta tgtcaagacc cagagattgg attgaaactc gactccgcaa tatgttggct gctataataa tcaggccata ctggcattac caatcacggc cacaaggtcg tagcggtata acactgggag caatgttctt cttcgtaaga tctaaagtct tatgacttag aaactggaac actaagcatg aggtgcagtc actcgctatg ttgcatcaaa gattttctcg tgattacatc gagtcgaaga ctggttcact gagcgctctg tgccaagaaa tttgacactt aaaagtcaaa gtcattcaac tatacgctct gtgtaccctg cttgatgaaa tgtaatcatt cacttgtgaa cattgtggca cctacctact aatgctgtag acctgagcat agtgttgcag gggaggtagg actagatgtt gcgtgcctac tgggttcctc tggtgacaat gtggagacct ttgagctggt tgcagaaatg tactcgtgcc acatgtgggc acggtaataa gggagccggt gtgacgagct tggcactgat gcagtggtgc actccgtgaa tcgacaacaa tttctgtggc cacgcgcggg caagtcaatg gaggtgtcta ctgctgccgt ataagagcta cgagcaccag tcaaagggga atgcccaaag cacgtgttga aaagaaaaag ttgcatctcc acaggagtgt gcgatgaagt ttcatggcag ctgaaaattt agttattgaa tgaaaatgcc atgtcctgcc attatcacaa ccactcaaac ttggaggctg tgtgtttgcc gtgctagtgc tgatattggc tgaatgagga tctccttgag 600 660 720 780 840
960 1020 1080 1140 1200 1260
1320 1380 1440 1500 1560 1620 -2- 200427835 atactgagtc gtgaacgtgt taacattaac attgttggcg attttcattt gaatgaagag 1680 gttgccatca ttttggcatc tttctctgct tctacaagtg cctttattga cactataaag 1740 agtcttgatt acaagtcttt caaaaccatt gttgagtcct gcggtaacta taaagttacc 1800 aagggaaagc ccgtaaaagg tgcttggaac attggacaac agagatcagt tttaacacca 1860 ctgtgtggtt ttccctcaca ggctgctggt gttatcagat caatttttgc gcgcacactt 1920 gatgcagcaa accactcaat tcctgatttg caaagagcag ctgtcaccat acttgatggt 1980 atttctgaac agtcattacg tcttgtcgac gccatggttt atacttcaga cctgctcacc 2040 aacagtgtca ttattatggc atatgtaact ggtggtcttg tacaacagac ttctcagtgg 2100 ttgtctaatc ttttgggcac tactgttgaa aaactcaggc ctatctttga atggattgag 2160 gcgaaactta gtgcaggagt tgaatttctc aaggatgctt gggagattct caaatttctc 2220 attacaggtg tttttgacat cgtcaagggt caaatacagg ttgcttcaga taacatcaag 2280 gattgtgtaa aatgcttcat tgatgttgtt aacaaggcac tcgaaatgtg cattgatcaa 2340 gtcactatcg ctggcgcaaa gttgcgatca ctcaacttag gtgaagtctt catcgctcaa 2400 agcaagggac tttaccgtca gtgtatacgt ggcaaggagc agctgcaact actcatgcct 2460 cttaaggcac caaaagaagt aacctttctt gaaggtgatt cacatgacac agtacttacc 2520 tctgaggagg ttgttctcaa gaacggtgaa ctcgaagcac tcgagacgcc cgttgatagc 2580 ttcacaaatg gagctatcgt tggcacacca gtctgtgtaa atggcctcat gctcttagag 2640 attaaggaca aagaacaata ctgcgcattg tctcctggtt tactggctac aaacaatgtc 2700 tttcgcttaa aagggggtgc accaattaaa ggtgtaacct ttggagaaga tactgtttgg 2760 200427835 gaagttcaag gttacaagaa gtgcttaatg aaaagtgctc gcatgtgttg tagcagaggc aacatgggta ttgatcttga ggtgaagaaa acttttcatc gaggacgatg cagagtgtga acagaggatg attatcaagg gttgaggaag aagaagagga ccagaaccag aacctacacc actgacaatg ttgccattaa atggtgattg taaatgctgc ctcaacaagg caaccaatgg ggccctctta cagtaggagg ctgcatgttg ttggacctaa tatgaaaatt tcaattcaca ggtgctaaac cacttcagtc attgcagtca atgacaaagc aagcctagag tggaagcacc gaggagaaat ctgtcgtaca tgtgagaatc acatttgagc tgtctacact gttgaatccg tgttgtgaag actttacaac tgagtggagt gtagctacat acgtatgtat tgttcctttt ggaagaagaa attgatgaaa tctccctctg gaatttggtg agactggctg gatgatacta tgaagaacca gttaatcagt atgtgttgac atcgttaagg taacatacac ctgaaacatg tgccatgcaa aaggagagtg gtcttgtttg ctttctggac cctaaatgca ggtgaggaca ggacatctta cttgcaccat tttacaagtg tgcgtgcaga tctttatgag caggttgtca taaacaagag gagccaccaa gaagcctgtc gatgtgaagc ttgatgaacg tgttgacaaa gtaccgaagt tactgagttt cagtttctga tctccttacc tctacttatt tgatgatgct accctccaga tgaggaagaa cctgtgaaca tgagtacggt cctcggctga aacagttcga ctgagcaatc agagattgag ttactggtta tttaaaactt aggcacaaag tgctaatcct gtggtggtgt agcaggtgca atgattacat taagctaaat ataatcttgc taagaagtgt tccagcttct taaggcagca tgttgtcagc aggcatattt cggttcgtac acaggtttat tggattatct tgataacctg acacagaaga ttccaaaact caaaaattaa ggcctgcatt 2820 2880 2940 3000 3060 3120
3240 3300 3360 3420 3480 3540
3600 3660 3720 3780 3840 3900 -4- 200427835 gatgaggtta ccacaacact ggaagaaact aagtttctta ccaataagtt actcttgttt gctgatatca atggtaagct ttaccatgat tctcagaaca tgcttagagg tgaagatatg tctttccttg agaaggatgc accttacatg gtaggtgatg ttatcactag tggtgatatc acttgtgttg taataccctc caaaaaggct ggtggcacta ctgagatgct ctcaagagct ttgaagaaag tgccagttga tgagtatata accacgtacc ctggacaagg atgtgctggt tatacacttg aggaagctaa gactgctctt aagaaatgca aatctgcatt ttatgtacta ccttcagaag cacctaatgc taaggaagag attctaggaa ctgtatcctg gaatttgaga gaaatgcttg ctcatgctga agagacaaga aaattaatgc ctatatgcat ggatgttaga gccataatgg caaccatcca acgtaagtat aaaggaatta aaattcaaga gggcatcgtt gactatggtg tccgattctt cttttatact agtaaagagc ctgtagcttc tattattacg aagctgaact ctctaaatga gccgcttgtc acaatgccaa ttggttatgt gacacatggt tttaatcttg aagaggctgc gcgctgtatg cgttctctta aagctcctgc cgtagtgtca gtatcatcac cagatgctgt tactacatat aatggatacc tcacttcgtc atcaaagaca tctgaggagc actttgtaga aacagtttct ttggctggct cttacagaga ttggtcctat tcaggacagc gtacagagtt aggtgttgaa tttcttaagc gtggtgacaa aattgtgtac cacactctgg agagccccgt cgagtttcat cttgacggtg aggttctttc acttgacaaa ctaaagagtc tcttatccct gcgggaggtt aagactataa aagtgttcac aactgtggac aacactaatc tccacacaca gcttgtggat atgtctatga catatggaca gcagtttggt ccaacatact tggatggtgc tgatgttaca aaaattaaac ctcatgtaaa tcatgagggt 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 200427835 aagactttct ttgtactacc catactcttg atgagagttt tggaaatttc ctcaagttgg ttgtctagtg ttttattagc caagaggctt attatagagc gcttacagta ataaaactgt ctacagcatg ctaatttgga ggtcagaaaa ctactacctt tatgataatc ttaagacagg tatctagtac aacaagagtc ttacagcaag gtacattctt tacactcata taactgctaa atgtcagagt acaaaggacc accatcaagc ctgtgtcgta ttggatgggt attataaaaa ccaactcaac cattaccaaa aaatttgctg atgatttaaa tctgtcacat tcttcccaga tcagcgagtt tcaagaaagg tagtgatgac acactacgta tcttggtagg tacatgtctg tggtttaact tcaattaaat acttcaacag cttgaagtca ccgtgctggt gatgctgcta tggcgagctt ggtgatgtca atctgcaaag cgagttctta aacgggtgta gaagctgtga tgtttccatt ccatgtgtgt ttcttttgtt atgatgtctg atgtgcgaat gagtacactg ggagaccctc tatcgtattg agtgactgat gttttctaca taaactcgat ggagttactt ggataatgct tactatacag tgcgagtttt gataatttca tcaaatgaca ggcttcacaa cttgaatggc gatgtagtgg tgctaaatta ctgcataagc gtgaagcttt cgagtactac ctttaaacca cacaaagaaa gggctgataa caattgttat aattcaatgc accagcactt acttttgtgc actcatactc gagaaactat gacccatctt atgtggtgtg taaacattgt tgtatatggg tactctatct gtggtcgtga tgctacacaa caccacctgc tgagtataaa gtaactatca gtgtggtcat acggagctca ccttacaaag aggaaacatc ttacactaca acacagagat tgaaccaaaa agcagcctat agaccttgta aactcacatg ttctaacaca agccagcttc acgagagcta ctattgacta tagacactat caattgtttg gcacattaac 5100 5160 5220 5280 5340 5400
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cttcaaaaat cttaggattg cctacgcaga ctgttgattc atcacagggt tctgaatatg actatgtcat attcacacaa actactgaaa cagcacactc ttgtaatgtc aaccgcttca atgtggctat cacaagggca aaaattggca ttttgtgcat aatgtctgat agagatcttt atgacaaact gcaatttaca agtctagaaa taccacgtcg caatgtggct acattacaag cagaaaatgt aactggactt tttaaggact gtagtaagat cattactggt cttcatccta cacaggcacc tacacacctc agcgttgata taaagttcaa gactgaagga ttatgtgttg acataccagg cataccaaag gacatgacct accgtagact catctctatg atgggtttca aaatgaatta ccaagtcaat ggttacccta atatgtttat cacccgcgaa gaagctattc gtcacgttcg tgcgtggatt ggctttgatg tagagggctg tcatgcaact agagatgctg tgggtactaa cctacctctc cagctaggat tttctacagg tgttaactta gtagctgtac cgactggtta tgttgacact gaaaataaca cagaattcac cagagttaat gcaaaacctc caccaggtga ccagtttaaa catcttatac cactcatgta taaaggcttg ccctggaatg tagtgcgtat taagatagta caaatgctca gtgatacact gaaaggattg tcagacagag tcgtgttcgt cctttgggcg catggctttg agcttacatc aatgaagtac tttgtcaaga ttggacctga aagaacgtgt tgtctgtgtg acaaacgtgc aacttgcttt tctacttcat cagatactta 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Gin Gin Gin Gly Gin Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser 245 250 255
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Asp Gin Asp Leu He Arg Gin Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gin 290 295 300
He Ala Gin Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg 305 310 315 320
He Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly 325 330 335 ·
Ala lie Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gin Phe Lys Asp Asn Val He 340 345 350
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Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gin Pro Leu Pro 370 375 380 -30- 200427835
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<210〉 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic primer for SARS-CoV spike protein <400〉 5 28 acggatcctc cactgacctt attaagaa
<210〉 6 <211> 28 <212〉 DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic primer for SARS-CoV spike protein <400> 6 acgaattcgt tcgtttatgt gtaatgta -31 - 28 200427835
<210〉 7 <211> 1255 <212〉 PRT <213> SARS-CoV <400〉 7
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Pro Ser Gin
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Gly Thr Ser
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He He Thr
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Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp He Ser Gly He Asn 1145 1150 1155
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Val Asn He Gin Lys Glu lie Asp Arg Leu Asn Glu 1160 1165 1170
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-40·

Claims (1)

  1. 拾、申請專利範圍： 1. 一種嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒（SARS coronavirus) 台灣分離株，其基因組具有一如下所示的核苷酸序列： 1 atat taggt t 11 tacctacc caggaaaagc caaccaacct egatetettg taga tc tgt t 61 c tc t aaacga act t taaaat ctgtgtagct gtcgctcggc tgcatgccta gtgcacctac 121 gcagtataaa caataataaa 111 tactgtc gt tgacaaga aacgagtaac tcgtccctct 181 tctgcagact get taeggt t tcgtccgtgt tgeagtegat catcagcata cc taggt t tc 241 gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agcct tgt tc ttggtgtcaa cgagaaaaca 301 cacgtccaac tcagt t tgee tgtcct tcag gt tagagacg tgctagtgcg tgget teggg 361 gactctgtgg aagaggccct ateggaggea cgtgaacacc tcaaaaatgg cacttgtggt 421 ctagtagagc tggaaaaagg cgtactgccc cagct tgaac agccctatgt gt teat taaa 481 cgt tctgatg cc t taageae caatcacggc cacaaggtcg ttgagctggt tgcagaaatg 541 gacggcat tc agtacggtcg tageggtata acactgggag tactcgtgcc acatgtgggc 601 gaaaccccaa t tgcataccg caatgt tet t ct tegtaaga acggtaataa gggagccggt 661 ggtcatagct atggeatega tetaaagtet tatgact tag gtgaegaget tggcactgat 721 cccat tgaag at tatgaaca aaactggaac actaagcatg gcagtggtgc ac tccgtgaa 781 ctcactcgtg agctcaatgg aggtgcagtc actcgctatg tcgacaacaa tttctgtggc 841 ccagatgggt accctct tga t tgcatcaaa gattttctcg cacgcgcggg caagtcaatg 901 tgcac tc 111 ccgaacaact tgat tacatc gagtegaaga gaggtgtcta ctgctgccgt 961 gacca tgagc atgaaat tgc ctggt tcact gagegetetg ataagageta cgagcaccag 1021 acaccct teg aaat taagag tgccaagaaa tttgacactt tcaaagggga atgcccaaag 1081 tttgtgtttc ctct taactc aaaagtcaaa gtcat tcaac cacgtgt tga aaagaaaaag 1141 actgagggtt tcatggggcg tataegetet gtgtaccctg t tgcatctcc acaggagtgt 1201 aacaatatgc act tgtctac ct tgatgaaa tgtaatcat t gegatgaagt ttcatggcag 1261 acgtgcgact t tctgaaagc cact tgtgaa cattgtggca ctgaaaat 11 agttattgaa 1321 ggacctacta catgtgggta cctacctact aatgctgtag tgaaaatgcc atgtcctgcc 1381 tgtcaagacc cagagat tgg acctgagcat agtgt tgcag at tatcacaa ccactcaaac 1441 at tgaaactc gactccgcaa gggaggtagg actagatgt t ttggaggctg tgtgt t tgee 1501 tatgt tgget getataataa gcgtgcctac tgggt tee tc gtgctagtgc tgatat tgge 1561 tcaggccata ctggcat tac tggtgacaat gtggagacct tgaatgagga tctcct tgag 1621 atactgagtc gtgaacgtgt taacat taac at tgt tggcg attttcattt gaatgaagag 1681 gt tgccatca 111 tggeate tttctctgct tctacaagtg cctttattga cactataaag 1741 agtet tgat t acaagtcttt caaaaccat t gt tgagtcct gcggtaacta taaagt tacc 1801 aagggaaagc ccgtaaaagg tget tggaac a t tggacaac agagatcagt 11 taacacca 1861 ctgtgtggtt t tccctcaca ggctgctggt gt tatcagat caa1111 tgc gcgcacact t 1921 gatgeageaa accactcaat tcctgat t tg caaagagcag ctgtcaccat acttgatggt 1981 at t tctgaac agteat tacg tet tgtegae gccatggt 11 atact tcaga cctgctcacc
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    37 200427835 27781 gaaac t tc tc at tgt 11 tga cttgtatttc tctatgcagt tgcatatgca ctgtagtaca 27841 gcgctgtgca tctaataaac ctcatgtgct tgaagatcct tgtaaggtac aacactaggg 27901 gtaatac t ta tagcactgct tggct t tgtg ctctaggaaa ggt 11 tacct tt tcatagat 27961 ggcacactat ggt t caaaca tgcacaccta atgt tactat caactgtcaa gatccagctg 5 28021 gtggtgcgct tatagctagg tgttggtacc t tcatgaagg tcaccaaact gctgcattta 28081 gagacgtact tgttgtttta aataaacgaa caaat taaaa tgtctgataa tggaccccaa 28141 tcaaaccaac gtagtgcccc ccgcat taca tttggtggac ccacagat tc aactgacaat 28201 aaccagaatg gaggacgcaa tggggcaagg ccaaaacagc gccgacccca aggt t taccc 28261 aataatactg cgtcttggtt cacagctctc actcagcatg gcaaggagga act tagat tc 10 28321 cctcgaggcc agggcgt tcc aatcaacacc aatagtggtc cagatgacca aat tggctac 28381 taccgaagag ctacccgacg agttcgtggt ggtgacggca aaatgaaaga gc t cagcccc 28441 agatggtact tctat tacct aggaactggc ccagaagct t cact tcccta cggcgctaac 28501 aaagaaggca tcgtatgggt tgcaac tgag ggagccttga atacacccaa agaccacat t 28561 ggcacccgca a tcc taataa caatgc tgcc accgtgctac aact tcctca aggaacaaca 15 28621 t tgccaaaag gcttctacgc agagggaagc agaggcggca gtcaagcctc t tctcgctcc 28681 tcatcacgta gtcgcggtaa t tcaagaaat tcaactcctg gcagcagtag gggaaattct 28741 cctgctcgaa tggctagcgg aggtggtgaa actgccctcg cgctat tgct gctagacaga 28801 t tgaaccagc t tgagagcaa agtttctggt aaaggccaac aacaacaagg ccaaactgtc 28861 actaagaaat ctgctgctga ggcatctaaa aagcc tcgcc aaaaacgtac tgccacaaaa 20 28921 cagtacaacg tcactcaagc atttgggaga cgtggtccag aacaaaccca aggaaat t tc 28981 ggggaccaag acctaatcag acaaggaact gat tacaaac at tggccgca aat tgcacaa 29041 11 tgctccaa gtgcctctgc at tct t tgga atgtcacgca t tggcatgga agtcacacct 29101 tcgggaacat ggctgact ta tcatggagcc at taaat tgg atgacaaaga tccacaattc 29161 aaagacaacg tcatactgct gaacaagcac a t tgacgcat acaaaacat t cccaccaaca 25 29221 gagcc taaaa aggacaaaaa gaaaaagact gatgaagc tc aged t tgcc gcagagacaa 29281 aagaagcagc ccactgtgac tcttcttcct gcggctgaca tggatgattt ctccagacaa 29341 ct tcaaaat t ccatgagtgg agct tctgct gat tcaactc aggcataaac actcatgatg 29401 accacacaag gcagatgggc tatgtaaacg 111 tcgcaat teegt t tacg ataca tagtc 29461 tactcttgtg cagaatgaat tctcgtaact aaacagcaca agtaggttta gttaacttta 30 29521 atctcacata gcaatct t ta atcaatgtgt aacat taggg aggact tgaa agagccacca 29581 cat 11 tcatc gaggccacgc ggagtacgat cgagggtaca gtgaataatg ctagggagag 29641 ctgcctatat ggaagagccc taatgtgtaa aattaatttt agtagtgcta tccccatgtg 29701 at 11 taatag ct tct tagga gaatgaeaa (序列辨識編號：1) 〇 2. 一種SARS冠狀病毒的核殼體蛋白（nucleocapsid 35 protein)，其存在於如申請專利範圍第1項的SARS冠 狀病毒台灣分離株的核鞘（nucleocapsid)上，且為申請 專利範圍第1項中所示的基因組的一個核苷酸片段所 38 200427835 編碼。 3. —種SARS冠狀病毒的核殼體抗原或其重組型產物或 合成產物，其具有一如下所示的胺基酸序列： MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQ
    5 GLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKM KELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVL QLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGET ALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFG RRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTY 10 HGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPT VTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADSTQA (序列辨識編號·· 4)。 4. 一種SARS冠狀病毒的棘蛋白（spike protein)，其存在 於如申請專利範圍第1項的SARS冠狀病毒台灣分離 株的外套(envelope)上，且為申請專利範圍第1項中所 15 示的基因組的一個核苷酸片段所編碼。
    5· —種SARS冠狀病毒的棘抗原（spike antigen)或其重組 型產物或合成產物，其具有一如下所示的胺基酸序列： MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPD EIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWV 20 FGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCT FEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKP IFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAV DCSQNPLAELKCS VKSFEI DKG IYQTSNFR VVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKF PSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGD 39 200427835 DVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRP FERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRWVLSFELLNAPA TVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPK TSEILDISPCSFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYST 5 GNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLG
    ADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGS FCTQLNRALSGIAAEQDRNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRS FIEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYT AALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAIS 10 QIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAE VQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYH LMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQ RNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDV DLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYVWLGFIA 15 GLIAIVMVTILLCCMTSCCSCLKGACSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT (序列辨 識編號：7)。
    6· —種膠體金共輛物，該共輛物係由膠體金與一如申請 專利範圍第2項的SARS冠狀病毒的核殼體蛋白或其 重組型產物或合成產物結合而形成。 20 7. 一種膠體金共軛物，該共軛物係由膠體金與一如申請 專利範圍第3項的SARS冠狀病毒的核殼體抗原或其 重組型產物或合成產物結合而形成。 8· —種用於檢驗SARS冠狀病毒的免疫檢驗裝置，其特 徵在於包含有由申請專利範圍第6或7項的膠體金共 40 200427835 軛物來供檢測結果的判定。 9. -種膠體金共輛物’該共輕物係由膠體金與一如申請 專利範圍第4項的SARS冠狀病毒的棘蛋'白或其重組 型產物或合成產物結合而形成。 5 10. -種膠體金共輛物，該共麵物係由膠體金與一如申請 專利範圍第5項的SARS冠狀病毒的棘抗原或其重組 型產物或合成產物結合而形成。 11. 一種用於檢驗SARS冠狀病毒的免疫檢驗裝置，其特 · 徵在於包含有由申請專利範圍第9或1〇項的膠體金共 1〇 軛物來供檢測結果的判定。 12. -種SARS冠狀病毒的重組型核殼體抗原，其係為， DNA片段所編碼，該DNA序列所具有的核㈣序列 係實質上對應於一藉由以申請專利範圍第丨項中所示 的基因組序列作為模版，並以下列所示的引子對來進 15 行pCR而被生成的DNA片段： 5’端引子： _ acggatccatgtctgataatggaccccW序列辨識編號·· 2) 3’端引子： n acgaattcttatgcctgagttgaattcag (序列辨識編號：3)。 · 20 I3· 一種膠體金共軛物，該共軛物係由膠體金與一如申請 專利範圍第12項的SARS冠狀病毒的重組型核殼體抗 原結合而被形成。 14· 種用於檢驗SARS冠狀病毒的免疫檢驗裝置，其特 徵在於包含有由申請專利範圍第13項的膠體金共軛 41 200427835 物來供檢測結果的判定。 15. 一種SARS冠狀病毒的重組型棘抗原，其係為一 DNA 片段所編碼，該DNA序列所具有的核苷酸序列係實質 上對應於一藉由以申請專利範圍第1項中所示的基因 5 組序列作為模版，並以下列所示的引子對來進行PCR 而被生成的DNA片段： 5’端引子： acggatcctccactgaccttattaagaa(序列辨識編號：5) 3’端引子： 10 acgaattcgttcgtttatgtgtaatgta (序列辨識編號·· 6)。 16. —種膠體金共軛物，該共軛物係由膠體金與一如申請 專利範圍第15項的SARS冠狀病毒的重組型棘抗原結 合而被形成。 17. —種用於檢驗SARS冠狀病毒的免疫檢驗裝置，其特 15 徵在於包含有由申請專利範圍第16項的膠體金共軛 物來供檢測結果的判定。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111239400A (zh) * 2020-03-17 2020-06-05 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 检测covid-19的胶体金免疫层析装置及其使用方法

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