TW200424214A

TW200424214A - Plasmid mediated GHRH supplementation for renal failures

Info

Publication number: TW200424214A
Application number: TW093110884A
Authority: TW
Inventors: Ruxandra Draghia-Akli; Clara Scott; Patricia A Brown
Original assignee: Advisys Inc
Priority date: 2003-04-21
Filing date: 2004-04-19
Publication date: 2004-11-16
Also published as: EP1620131A2; CA2563312C; CA2563312A1; EP1620131B1; DE602004023927D1; WO2004093920A3; US20050004060A1; WO2004093920A2; ATE447415T1

Description

200424214 狄、發明說明：相關申請案本申請案請求美國臨時專利申請案60/464,266號之優先權，其案名為「用於腎衰竭的質體中介的GHRH補充」，申明曰為2003年4月21曰，其全部内容以參考資料合併於本文。 [發明所屬之技術領域] 本發明係關於治療及預防腎衰竭、治療貧血、以及患者中其他一般與慢性腎衰竭相關病症之經單離之組成物及籲方法。詳言之，本發明係關於生長素釋素（gr〇wth h〇rm〇ne releasing h0rmone，GhRH)組成物之質體-中介的補充，以及其使用方法。該GHRH係經單離之組成物或經單離之核酉文刀子’該核酸分子可編碼GHrh或其生物等同物。本發明另一觀點包括將本發明之組成物遞送至患者之方法，以治療及預防慢性腎衰竭、治療貧血、以及於患者中其他一般與慢性腎衰竭相關之病症。 [先前技術] ¥ 腎衰竭及其併發症，例如貧血，會降低預期壽命，且其他主要與腎衰竭相關之病症，例如腎小球腎炎 (g merulonephritis)或腎盂腎炎（pyelonephritis)係長期慢性疾病（如癌症、心衰竭、糖尿病、或嚴重過敏反應）所造成之結果。本發明係關於下列所述之質體-中介之補充： (1) 治療及預防腎衰竭； (2) 治療腎衰竭之併發症，例如貧血及耗損（wasting); (3) 增加腎衰竭病患之存活者以及延長其預期壽命；以 200424214 及 (4)改善患者之生活品質。腎I瘦:_經預估增加之腎衰竭與末期腎病時期之人數係保險醫事服務系統之重大負擔（Hostetter及Lising， 2002)。為了減輕負擔，需要改進檢測腎病的策略，以及預防方法必須係針對具有最大風險之疾病者（Crook等人， 2002)。重要的風險因子包含高金壓、糖尿病、肥胖、以及癌症（A1 Suwaidi 等人，2002 ; Nampoory 等人，2002)。血清肌酸酐（serum creatinine)、蛋白尿（proteinuria)、以及微量白蛋白尿（microalbuminuria)係作為腎病早期檢測之重要指標’但是可延緩或預防腎衰竭之治療行為對病患以及醫藥系統來說係具有顯著之利益（LeBrun等人，2000 ; Sakhuja 等人，2000)。已證實重組之人類生長素（Recombinant human gr〇wth hormone，GH)可有效促進患有慢性腎衰竭之矮小兒童在腎臟移植之前或之後的生長。GH及其中介物，類騰島素生長因子-I (insulin_like growth factor-I，IGF-I)，對身體組成、蛋白質、葡萄糖、以及骨質代謝之作用提供給此等病患確實的治療選擇。其一為改善患有末期腎衰竭成人之異化作用（catabolic state)。在少數試驗性研究與為期6個月之兩種安慰劑-對照組研究中，以GH治療之洗腎的成人清楚的顯不出合成代謝的效果，而顯著增加精瘦的身體質量（貿以^ 及 Schaefer，2002)。對人類及同伴的動物（例如，寵物）來說，慢性腎衰竭 200424214

Co* renal ⑽，⑽）的治療選擇係有限制性的。至今，有三種策略可利於延緩而非治療慢性腎病之進展：病患之早期確認、減輕風險因子、以及完成最佳Μ㈣用。不幸地，由於並無有效藥物治療法以支持咖病患，而顯著地增加其發病率及死亡率（Levin’2G()i)。長期洗腎及腎臟移植係人類最常見的做法。在美國及其他國家，每年接受洗腎之老年病患的比例皆增加。兩種治療末期腎病方法，亦即洗腎與移植，後者提供較多的自由以及較佳的臨 =成效（Rao, 2002)。不幸地，僅提供腎臟移植給不具有顯著共同病症或其他風險因子者變得日趨重要，俾改進腎臟移植後成功的機會（Levin，2001)。等待腎臟移植之病患曰漸增加，而有些病患在等到換腎前，臨床症狀可能已經惡化（Braun ， 2002) 〇至於寵物，大部分的研究係專注於營養學以及飲食的改變，其為目前可得的療法。任食之飼養方式及增加灰質之攝取會增加罹患CRF的機會。增加腾食纖維、鎭、蛋白質、以及納會降低罹患CRF的機會（Hughes等人，2002 ; Polzin等人’ 2000)。其他數據則建議，若需要可用經特別調配之飲食與磷酸鹽結合藥物餵飼患有CRF之貓俾符合所需、控制而礙血症（hyperphosphataemia )以及次發性腎副曱狀腺充進（secondary hyperparathyroidism )可延長存活時間（Elliott等人，2000)。飲食的改變有益於使患有輕微的與中度自發性CRF之狗的尿毒症腎臟外表現形式以及死亡率降至最小。其結果與假設一致，延緩尿毒症危險期之 200424214 進展以及經餵飼腎臟食物之狗的死亡率，因此至少在某種程度上降低腎衰竭之進展（Jacob等人，2〇〇2)<>在少數狗之腎臟移植例子中，術後平均存活時間為8個月人，2000) 〇 t血：貧血之情形係指體内血液流動中紅血球之數目或體積減少或者係血紅素之總體積減少，造成患者蒼白或全身虛弱。哺乳動物中紅血球之產生已知為紅血球生成。紅血球生成主要係由紅血球生成素（，Ep〇 ) 所控制，其為一種酸性糖蛋白。Ep〇可刺激產生新的紅血球以替代老化過程中所損失者。此外，在組織缺氧之情況下可刺激EPO之產生，組織缺氧係指組織之氧供給量減少至低於正常之生理程度而損害組織經由血液之適當的灌注。組織缺氧可能由出血、放射線引起之紅血球破壞、各種貧血、南海拔、或長期無意識所引起。組織對缺氧緊迫之反應為EPO會增加紅血球之產生，其係藉由刺激骨髓中之原生刚駆物轉變成前母紅血球（proerythroblasts)，接著成熟、合成血紅素然後釋放至循環中成為紅血球。 EP0正常地係以低濃度存在於血漿中，其足以維持正常之紅血球損失（亦即，經由老化）與紅血球產生之平衡。貧血係由紅血球產量減少或紅血球的破壞增加而造成紅血球質量減少所引起的。目前係使用EPO補充法來治療各種與疾病相關之貧血，例如末期腎衰竭（Creinagnani等人， 1993b ; Diez等人，1996b)以及後天免疫不全症（aCqui]red immunodeficiency syndrome，AIDS) (Sowade 等人，1998)， 200424214 尤其係以齊多夫定（zidovudine，AZT)治療者。EPO亦用於改善與癌症化療相關之貧血（Vansteenkiste等人，2002)。有大量數據顯示CRF病患之貧血係與不利的GH軸線改變相關。短期之研究證實，以重組人類紅血球生成素 (rhEPO)療法進行之貧血矯正在洗腎之尿毒症病患中伴隨有數種GH分泌之改變（Diez等人，1996a)。長期以rhEPO 治療係與索馬特托普（soinat〇trope)細胞功能之複合及深切的效果相關’其特徵為GH反應之多樣化作用刺激不同機制釋出GH。在索馬特托普功能中某些由rhEp〇引起的改變係根據持續治療的時間。例如，在回應GHRH之刺激下，貧血之矯正作用係伴隨著GH分泌曲線下之面積及基準線上之面積顯著的增加。在3及6個月之治療後，這些改變在統计學上係有意義的，儘管在1 2個月並未觀察到改變 (Diez 等人，1996b)。另一類的貧血疾病各自係由遺傳上不正常之血紅素蛋白（globin)生產所造成的，稱為血色素疾病 (hemoglobinopathies)。血色素疾病包含光譜上的異常而可大致上分為兩種類型。第一類係由血紅素蛋白鏈中之一者的遺傳結構改變所造成，例如，鐮形細胞貧血。這些病症引起不正常血紅素分子之產生（papas sotiri〇u等人，2〇〇〇)。血色素疾病之第二主要分類係地中海貧血，其係由企紅素蛋白鏈中之一或多者在合成速率上的遺傳缺陷所造成的。由於不適當之紅血球之生產而造成無效的紅血球形成作用、溶血（hemolysis)、以及不同程度的貧血。此外Ep〇可 200424214 用於治療貧血，例如，以低或有缺陷之紅血球生產為特徵之血色素疾病以及/或增加之紅血球破壞（Makis等人， 2001 ; Payen 等人，2001)。其他研究指出，患有泛腦垂體功能不足 (panhypopituitarism，先不論以甲狀腺劑及腎上腺皮質素之適冨的取代’該症狀顯示出血紅素（hem〇gi〇bin，fjb)之濃度低至11 ·〇克/公合）之貧血病患以重組之人類GH治療後其EPO增加（Sohmiya及Kato，2000)。在持續12個月皮下注入重組之人類GH時，血漿EP0的濃度提昇近兩倍且伴隨著增加Hb的濃度。當人類GH之投予中斷時，血漿Ep〇的濃度及Hb的濃度降低。在投予人類GH之前或投予人類 GH時，血漿GH與Hb的濃度係密切相關的。因此，在投予人類GH之前或投予人類Gh時，血漿GH與Hb的濃度係充分相關的。血漿IGF-I濃度亦與Hb濃度相關，但是並不與血漿EPO濃度相關。美國專利案第5,846,528號（簡稱為‘528專利案）以及美國專利案第6,274，158號（簡稱為‘158專利案）揭示貧血之症狀可經由謹慎地增加EP0予以治療。此外，‘528專利案揭示使用重組之腺相關病毒（adeno_ associated virus， ΑΑγ) 病毒粒子將編碼EPO之DNA分子遞送至肌肉細胞及組織以治療貧血。該‘528專利案顯示於活體内直接將重組AAV 病毒粒子注射至肌肉組織（例如，肌内注射），以及肌肉細胞之活體外轉導可持續地引入患者體内進行治療。因此，經遞送之可編碼EPO的核苷酸序列在持續高程度表現後， 200424214 使經轉形之肌肉細胞分泌EPO而產生全身性遞送。該‘i58 專利案揭示利用皮下、靜脈内、<口服投予重組人類ep〇作為止血劑以治療或預防涉及因良性療、非絲或難以治療之損害、或者放射性傷；造= 何器官或身體部分的出血。簡言之’貧血可由特定疾病、環境因+、或疾病治療之作用造成。如上所述，可以直接（例如注射重組Ep〇)或間接（例如注射重組GH)之方法增加Epo的循環濃度。然而不欲受限於理論，相關技藝指出，經由可增加Ep〇循環濃度之方法或化合物，可成功地治療貧血症狀。然而，熟於此技藝者指出，生物系統係無法測量的複雜，且正確地預測何種方法或化合物可引起特定生物反應之能力係超出熟於此技藝者之範圍。只有經過努力不懈的實驗才可發現治療貧血之化合物或方法。起損·患者之耗損可界定為個體之理想體重降低至少 5至1 0%，其特徵為脂肪組織及肌肉質量顯著的損失，其使患有進行性疾病（例如，癌症、AIDS等）之病患特別難以增加體重。耗損及精神萎頓係典型的臨床現象其喚起臥病的歷史印象而使病患「憔悴」。在希臘語中簡單的說即係「不良的健康狀態」。腎衰竭晚期、癌症、AIDS、或結核病、以及其他慢性病症會加速造成骨骼肌的損失（Barber等人，1999; Weinroth等人，1995)。其他臨床表現包含厭食、肌肉耗損、以及/或脂肪組織之損失、以及疲勞，進而造成不良的健康狀態（Davis及Dickerson，2000)。由於體重損 200424214 失及不良的健康狀態導致不良的預後，耗損可直接造成死亡。相對於單純的飢餓，體重損失不可以激進的餵食處理。體重損失不全然歸因於不良的攝食，其亦為基礎能量消耗增加之結果。營養失調及耗損係洗腎之慢性腎衰竭病患發病及死亡之重要決定因素。即使病患具有相對穩定程度之慢性腎功能不足，仍以降低之精瘦身體質量、骨礦物質含量、以及基礎能量消耗為特徵（O’Sullivan等人，2002)。再者，半軏餓（semi-starvation)、降低之生理活動、以及老化係外在因子，其可能會混亂主要器官損傷與周圍骨骼肌改變以及運動量間之直接關係（Franssen等人，2002 ; Hansen等人， 2000)。然而不欲受限於理論，細胞激素（cytokine )之釋出以及/或活化、與釋放係視為耗損症狀之反應。相關技藝揭示已評估許多藥劑用於治療耗損，僅發現黃體激素類之藥劑具有適合的利益（Barber等人，1999 ; Nelson，2001)。反之，使用重組之GH、IGF-I、以及IGF·結合蛋白質3 (IGF-binding protein 3 ，IGFBP-3)之療法在不同原因之精神萎頓上產生效益（Bartlett等人，1994 ; Welle，1998)。這些有用的激素可為合成代謝劑，以抵消在手術壓力、腎衰竭、肌肉萎縮症、醣皮質素之投予、以及HIV之感染下肌肉的耗損（Welle，1998)。因此，相關技藝指出可經由增加循環中GH、 IGF-I、或IGFBP-3之濃度之方法或化合物來治療耗損（Chen等人，2001)。不幸地，由於生物系統之複雜性無法正確地預測何種方法或化合物可引起特定的生物 12 200424214 反應。因此，只有經由熟於此技藝者闡明嚴密的實驗才可發現治療耗損之化合物或方法。生長素（GH)以及免疫功能：於人類及其他脊椎動物中，GH的中心角色係控制身體生長，且已知由腦下垂體調控GH分泌之生理相關的途徑。GH之生產途徑係由一系列相關之基因所組成，這些基因之產物為正常生長所需。gh 途徑基因包含：（1)配體（ligand)，例如GH及IGF-I ; (2)轉錄因子，例如pit-Ι、或prop_i、以及沖」之傳達物；⑺ 激動劑與結抗劑，例如，分別為生長素釋素⑴HRH)、以及· 體抑素（somatostatin，SS);以及（4)受體，例如gHRH受體 (GHRH-R)以及GH受體（GH-R)。這些基因係於不同器官與組織中表現’包含下視丘（hypothalamus)、腦下垂體、肝臟、以及骨。GH途徑之有效性以及經調控之表現係理想的線性成長，以及碳水化合物、蛋白質之體内平衡、以及脂肪代謝所需。腦下垂體前葉之GH合成與分泌係經由ghrH2 刺激以及由體抑素以及下視丘激素所抑制'gh可增加 IGF-I之生產，主要於肝臟以及其他標的器官。及· 依次會回饋至下視丘以及腦下垂體以抑制Ghrh& gh< 釋放。GH可引起周圍組織之直接或間接作用，間接作用主要係由IGF_1調節。免疫功能係由祕！調控’其對6細胞發展具有兩種主要作用：增益（potentiation)及成熟，以及與白介素_7 (IL-7)-起作為B細胞增生之辅因子。這些活性係由利用抗 IGF-I抗體、IGW之反義序列予以鑑定，且利用重組叩 13 200424214 替代該活性。已有證明指出巨噬細胞係jGFq之豐富的來源。以重組IGF-Ι治療小鼠之結果證實此觀測，其増加骨髓中前-B細胞與成熟之b細胞的數量（Jardieu等人， 1994)。該成熟之B細胞仍會對敏感，而於體外或體内，免疫球蛋白產生亦會受到IGIM之刺激（R〇bbins等人， 1994) 〇於近二十年重組蛋白質之生產對治療許多不同病症提供了有用的工具。例如，重組蛋白質可用於治療身材矮小兒童之GH-缺乏。重組蛋白質亦於燒傷、敗血症、與Αι〇8 病患中作為合成代謝劑。然而，於營養失調及感染中有報告指出對GH作用的抗性。臨床上廣泛地使用gh取代療法，該療法係具有利益的，但是該療法亦具有數種缺點： GH必須經由皮下或肌内投予，一天一次或者一週三次持續數月或數年；會發展出胰島素抗性以及葡萄糖耐受不良；以及於小兒科病患中加速骨無（epiphysis)之生長及閉合 (Blethen 及 MacGillivray，1997; Blethen 及 Rundle，1996)。反之，實質上並無報導指出重組GHRH療法之副作用。顱外分泌之GHRH，其為成熟之胜肽或經截斷分子（如胰島細胞瘤與各種位置之類癌腫瘤所分泌者），經常係具有生物活性且甚至可產生肢端肥大（Esch等人，1982; Thorner 等人，1984)。對GH-缺乏之兒童或成人投予重組之GHRH 會提高IGF-Ι的濃度、隨著GHRH的劑量而成比例地增加 GH之分泌，然而大劑量之重組GHRH仍會造成反應（Bercu 等人，1997)。因此，GHRH之投予可表示另一種增加低下 14 200424214 之GH與IGF-Ι濃度的生理方法（Corpas等人，1993)。 GH係以特殊之脈動性模式進行釋放，其對GH之生理活性極具重要性（Argente等人，1996)。GH之分泌係由 GHRH刺激以及由體抑素與下視丘激素所抑制（Thorner等人，1995)。GH脈衝係GHRH分泌之結果，GHRH分泌係與體抑素分泌之減少或停止相關。此外，脈衝產生之機制係由GH-負回饋進行時間上之控制。對外因性GH投予之干擾的節律，使GH分泌之内生性節律受到帶動。GH與 IGF-Ι途徑之有效性以及經調控之表現係理想的線性成長，碳水化合物、蛋白質之體内平衡，以及脂肪代謝所需，以提供正氮平衡（Murray及Shalet，2000)。許多於人類、羊或豬之研究顯示持續注入重組之GHRH蛋白質可恢復正常的GH分泌模式，且由於此系統具有回饋調節而不會使 GHRH受體不敏感或耗盡GH的供給，但是於GH療法中則會破壞此系統（Dubreuil等人，1990 ; Vance等人，1990 ; Vance等人，1985)。雖然重組GHRH蛋白質療法可帶動及刺激正常之週期性GH分泌而實際上不具副作用，但是體内GHRH之半生期短需要經常（每天一至三次）以靜脈、皮下、或鼻内（需要高於300倍之劑量）投予之方式補充。因此，作為長期治療GHRH之投予並不具可行性。在人類（Frohman等人，1984)與畜牧動物之循環系統中，野生型GHRH的半生期相當短。在血漿中培養60分鐘後，95%之GHRH(1-44)NH2會降解，然而在類似條件下培養該激素之較短的（1-40)OH型式，培養60分鐘後僅77% 15 200424214 之胜肽降解（Frohman等人，1989)。將可編碼特定蛋白酶-抗性GHRH類似物之cDNA併入治療性核酸載體可使其餘血清中具有較長的半生期、效力增加、以及於經注射質體之動物中提供較大之GH釋放（Draghia-Akli等人，1999，此處以參考資料合併於本文）。經由對蛋白酶敏感性胺基酸之胺基酸取代作用所造成之突變可延長GHRH分子之血漿半生期。再者，藉由使用可增強GHRH對特定受體之結合親合力之超-活性類似物來增強GHRH之生物活性 (Draghia-Akli 等人，1999)。顱外分泌之GHRH，如經處理之蛋白質形式 GHRH( 1-40)羥基或GHRH( 1-44)胺基或者甚至如較短之經截斷的分子，係具有生物活性的（Thorner等人，1984)。已有報告指出血液中低濃度的GHRH (100微微克/毫升）足以刺激GH分泌（Corpas等人，1993)。直接質體DNA基因轉移法係目前許多新興的核酸治療策略之基礎且其不需要病毒基因或脂質粒子（Aihara 及 Miyazaki，1998 ; Muramatsu 等人，2001)。由於骨骼肌纖維具有較長的生命期限且可經由環狀DNA質體（此質體可於具有免疫能力之宿主中表現數月或數年）轉導，故可將骨骼肌作為標的組織（Davis等人，1993 ; Tripathy等人，1996)。先前的報導於小鼠中證實人類GHRH cDNA可經由可注射之肌生性表現載體遞送至肌肉中，其於肌肉中瞬間刺激GH分泌且延長至超越兩週之期間（Draghia-Akli 等人，1997)。已有報導指出為了增加生長素之釋放之目的，可投予 16 200424214 新穎之GHRH類似物蛋白質（美國專利第5,847,066、 5846,936、5,792,747、5,776,901、5,696,089、5,486,505、 5，137,872、5,084,442、5,036,045、5,023,322、4,839,344、 4,410,512、RE33,699號）或者投予合成之或自然產生之 GHRH胜肽片段（美國專利第4,833，166、4,228，158、 4,228，156、4,226,857、4,224,316、4,223,021、4,223,020、 4,223,019號）。已有報導（美國專利第5,846,936號）指出含有下列突變之GHRH類似物：位置1之Try突變為His ; 位置2之Ala突變為Val、Leu、或其他胺基酸·，位置8之Asn 突變為Gin、Ser或Thr;位置15之Gly突變為Ala或Leu ; 位置27之Met突變為Nle或Leu ;以及位置28之Ser突變為Asn。GHRH類似物係美國專利申請案序號〇9/624,268 (簡稱為’268號專利申請案）所揭示之主題，其中GHRH類似物包含可改進引起生長素釋放之能力之突變。此外， 5亥268號專利申請案係關於治療生長缺陷；改進生長表現；相對於正常生長，於動物中刺激產生較多的GH ;以及利用投予GHRH類似物而加強生長，此處該申請案以參考資料合併於本文。美國專利案第5，0 6 1，6 9 0號係揭示經由對懷孕的雌性哺乳動物補充足量的人類GHRH或其類似物之一者i〇_2〇天’發現可增加出生體重以及乳產量。於哺乳期間持續投予該類似物。然而，多重投予係存在的，以及並未揭示關於生長素釋素（或因子）呈DNA分子之形式（例如以質體作為媒介之治療技術）之投予。美國專利第5,134，12〇號（簡稱 17 200424214 為’ 120號專利）以及第5,292,721號（簡稱為，721號專利）揭示於豬隻懷孕最後兩星期與哺乳期間前三星期謹慎地增加 OH，其結果使新生的豬仔在出生後禁食時具有增強之維持葡萄糖血漿濃度與游離脂肪酸的能力。此外，該，12 〇號專利與’72 1號專利揭示於哺乳期治療乳豬可增加初乳之乳脂以及增加乳產量。這些效果對增強新生豬仔之存活能力以及斷奶期間體重增加來說係重要的。然而，該，丨2〇號專利與’721號專利並未揭示關於以DNA形式投予GHRH。先前研究已顯示GH (Ziegler等人，1991)與IGF-I可改善腎衰竭病人之腎功能（Vijayan等人，1 999)。GHRH可刺激IGF-I，且有數據證實於分解作用狀態下及尿毒症病患中’ IGF-I (而非紅金球生成素）係紅血球形成作用中主要的中介物（Urena等人，1992)，以及IGF-I可引起身體質量與氧運送能力成比例的增加（Kurtz等人，1990)。血紅素與血球比容（Hematocrit)之增加證明體内GH之紅血球生長-促進作用，該作用亦可在GH-缺乏之兒童或成人以GH治療時發現（Christ 等人，1997 ; Valerio 等人，1997)。然而，同時對正常的14週齡以上的米格魯犬投予GH可產生劑量相關性之正常血色素、正常血球、以及非再生性貧血 (non-regenerative anemia)(Prahalada 等人，1998)。

紅血球類細胞（erythr〇id cell)數主要係由紅血球生成素（EPO)調節，但會受許多生長因子影響。例如經切除腦下垂體之大鼠顯示出低血球細胞數之類紅血球、骨趙細胞、以及淋巴細胞，以及亦有大規模的文獻指出GH與IGF-I 200424214 兩者對造血系統有影響（Claustres等人，1987 ; Kurtz等人， 1982 ; Kurtz 等人，1990)。於多血症（p〇iyCythemia vera) 中，病患之紅血球類原始細胞對IGF-I、經增加之igf-結合蛋白質1以及表現出增加之敏感性，結果產生過多的紅

血球（Correa等人，1994 ; Mirza等人，1997)。以人類GH 治療後，血漿中之EPO濃度加倍，伴隨著Hb濃度的增加（相對於正常程度）。當中斷投予GH時，血漿中EP0濃度與 Hb濃度皆下降。 IGF-I (GHRH之下游作用子）顯示經由直接作用於腎小管（glomerular vasculature)維持腎小管之過濾作用且藉由加強近端腎小管細胞（proximal tubule cells)之DNA合成以加速腎小管再生（Hammerman，1999 ; Vijayan等人， 1999)。數種研究顯示以重組蛋白質形式遞送之π。〗於疑似有腎衰竭之個體中可防止急性腎衰竭之發展，亦可使已具有急性腎衰竭之個體加速復原，以及可加強末期腎病患者之腎功能（Fervenza 等人，1998;Miller 與 Rabkin，1997)。基因遷送以及體内表現·近年來’已證明可將特定美因遞送至體組織以矮正天生的或後天缺陷與不均衡狀態之方法（Herzog 等人，2001 ; Song 等人，2〇〇1 ; VUquin 等人， 2〇〇υ。相對於投予重組蛋白質，以基因為主之藥物遞送提供了許多優點。這些優點包含原始蛋白質結構之轉變、改善生物活性、避免全身性毒性、以及避免感染以及毒性物質。此外，由於新分泌之蛋白質係持續存在於血液循環中，因此核酸載體療法可細胞長期暴露於治療範圍之蛋白質 200424214 下。於少數例子中，於注射單一質體後所達到之相當低濃度之蛋白質表現係足以使分泌之胜肽達成生理上可接受之生物活性（Danko 及 Wolff，1994 ; Tsunimi 等人，1996)。

使用重組蛋白質之主要的限制係每次投予後蛋白質之可利用性受到限制。利用可注射之DNA質體載體之核酸載體療法則可克服此缺點，這係因為單一注射至病患的骨骼肌後可使生理表現延長（WO 99/053 00以及WO 01/06988)。載體之注射可促進動物體内酵素及激素之產生以更貼切地模仿自然的程序。於以質體為主之表現系統中，除了編碼治療性基因產物之核酸外，非-病毒性基因載體可組成合成性基因遞送系統。於此方法中’可避免關於使用多數病毒載體之風險。由於使用「特殊種類」之成分作為基因遞送，該非-病毒性表現載體產物通常具有低毒性，該非_病毒性表現載體可使與病毒載體相關之免疫性風險最小化。此外，至今並未有報導指出於活體内將質體序列整合至宿主染色體，因此，此形式之核酸載體療法不會活化致癌基因也不會使腫瘤抑制基因失去活性。至於存在於染色體外之游離基因體系統 (P System) ’質體之已確定的藥物動力學以及消除側緣而使標的組織中之基因表現持續期間受限。 ;體内作為基因轉移之非_病毒技術，直接將質體Dn a 注射至肌肉之技術係簡單的、價錢低廉、且安全的。然而，過去在直接注射質體上有所限制。於單一直接注射後，肌肉纖維所攝取之無效之DNA會造成相當低的表現程度 200424214 (Prentice 等人，1994 ; Wells 等人，1997)。此外，轉移基因之表現期限較短（Wolff等人，1990)。大部分成功之前臨床應用係限於疫苗（Danko與Wolff，1994 ; Tsurumi等人， 1996) ° 為了加強質體DNA遞送至細胞所進行之物理方法包含電穿孔法（electroporation)、超音波所產生之細胞膜通透性增加（sonoporation)、以及壓力。最近，發現於活體内利用電穿孔法增強質體遞送方面上有顯著的進展。藉由電穿孔法來投予質體係涉及脈衝式電場之應用俾於細胞膜上創造出瞬間孔洞而不會對細胞產生永久性的傷害。因此可引入外生性分子（Smith及Nordstrom，2000)。經由調整由電穿孔系統產生之電子脈衝，核酸分子可穿過細胞上由上述程序產生之通道或孔洞。美國專利第5,704,908號說明一種電穿孔儀器，其可於病患體腔中之選定的位置將分子遞送至細胞。這些脈衝電壓注射裝置亦揭示於美國專利第 5,439,440 與 5,702,304 號，以及 PCT WO 96/12520、 96/12006、95/19805、以及 97/07826。電穿孔法已成功地用於在注射質體後轉染腫瘤細胞 (Lucas等人，2002 ; Matsubara等人，2001)或者將抗腫瘤藥物平陽黴素（Bleomycin)遞送至人類皮膚或皮下腫瘤 (Gehl等人，1998 ; Heller等人，1996)。電穿孔法亦已廣泛地應用於小鼠（Lesbordes等人，2002 ; Lucas等人，200 1 ; Vilquin 等人，2001)、大鼠（Terada 等人，2001 ; Yasui 等人， 2001)、以及狗（Fewell等人，2001)，俾遞送可編碼多種激 21 200424214 素、細胞激素、或酵素之治療性基因。於某些例子中，經由電穿孔法治療之效果係引人注目的。抑鈣素（calcitonin)基因-相關之胜肽（CGRP)的基因轉移可選擇性抑制促進發炎Th 1子集以及促進抗發炎Th2子集。該治療法可顯著地降低糖尿病之發病、改善血糖過高症（hyperglycemia)以及胰島素缺乏，且抑制淋巴細胞浸潤至小島，亦即保護/5細胞對抗自體免疫之破壞（Sun等人， 2003)。於部分腎臟切除之大鼠（5/6)中，經由電穿孔法將肝細胞生長因子（HGF)基因轉移至骨骼肌可有效抵抗型態上的傷害。經處理之大鼠顯示出在體重上較未經處理之大鼠具有較佳之生長。相較於未經處理之大鼠，經由HGF基因轉移之大鼠在組織學上具有改變，例如腎小球硬化症 (glomerulosclerosis)以及質間纖維化（interstitial fibrosis) 獲得顯著的改善（Tanaka等人，2002)。先前使用GHRH之研究顯示結合電穿孔之質體療法係可行的且表示其於大行動物及人類中係可誘導蛋白質之生產及調節分泌之大有可為的方法（Draghia-Akli 等人，1999 ; Draghia_Akli 等人， 2002b) 〇如上述，已有文件證實利用電穿孔法可增強質體攝入至骨絡肌之能力。此外，發現以聚麩胺酸（PLG)或聚乙烯咬洛烧酮（PVP)設計之質體可加強質體之轉染作用以及所欲之轉殖基因的表現。該陰離子性聚合物鈉PLG可於低質體濃度下增強質體之攝入，同時降低任何可能由該程序對組織所造成之傷害。PLG係一種穩定之化合物且可抗高 22 200424214 溫（Dolnik等人，1993)。先前PLG係用於疫苗製劑中增加穩定度（Matsuo等人，1994)且不會增加免疫性 (immunogenicity)。PLG亦可作為吸入抗原或暴露於臭氧後之抗-毒素（Fryer及Jacoby，1993)。此外，發現以PLG或 PVP設計之質體可於小鼠、大鼠、及狗之骨骼肌中增強基因轉染作用以及使表現量增加10倍（Fewell等人，2001 ; Mumper等人，1998)。PLG可用於增加抗-癌藥物之穩定性 (Li等人，2000)以及作為「黏著劑」以於受傷及組織修復時閉合傷口或防止組織出血（Otani等人，1996; Otani等人， 1998) 〇雖然此技藝中已有關於真核細胞以線形DNA進行之電穿孔法的參考資料（McNally等人，1988 ; Neumann等人， 1982)( Toneguzzo 等人，1 988)( Aratani 等人，1992 ; Nairn 等人，1993; Xie 及 Tsong，1993; Yorifuji 及 Mikawa，1990)，這些實例闡明細胞懸浮液、細胞培養等之轉染作用，並未提出體組織中之轉染的細胞。美國專利第4,956,288號係關於製備重組宿主細胞之方法，該宿主細胞包含高重複數量（copy number)之外來 DNA，其係藉由於外來DNA存在下使細胞群進行電穿孔而得，接著培養細胞、以及殺死具有低重複數量外來DNA之細胞。簡言之，治療腎衰竭之相關病症，例如貧企、耗損、免疫功能障礙、或其他一般與腎衰竭相關之症狀，係不經濟的且受限制。雖然可以有限之能力利用重組蛋白質技術 23 200424214 士治療這些不同的疾病病症，但此等治療可能具有某些顯 =、、、點T編碼重組纟白質之核酸表現構築體係解決經吊=庄射以及雨成本之傳統重組療法之辦法。在生產蛋白質前’於經編碼之重組蛋白質中引入點突變係值得注意之 :驟’該蛋白質在活體内比野生型蛋白質更加穩定。於特定之重組蛋白質中各個胺基酸變異將會使重組蛋白質之功能改變（例如穩定度增加或下降），而各個胺基酸變異應經 L個別”平估以正確地預測其對結構造成何種改變（例如胺基酸序列）。因此，可編碼表現蛋白f之核酸表現構築體的效果可經由進行實驗加以確認。$ 了擴展對病患之治療，扁要利用、屋單離之核酸表現構築體，將該核酸表現構築體遞送至病患體内，並使其於活體内表現穩定之治療性蛋白質。 [發明内容] 本發明係關於利用質體中介的基因補充之組成物及方法。本發明之特定具體實施例係關於腎衰竭及其併發症之 ⑺療及預防，例如貧血、耗損、免疫功能障礙、平均餘命降低、生活品質下降、及其他主要係與腎病相關之症狀，例如腎小球性腎炎或腎盂腎炎或者由長期慢性疾病（例如，癌症、心衰竭、糖尿病、或嚴重過敏反應）所造成之病症。本發明之一具體實施例包括將可編碼生長釋素（GHRH) 或其生物等同物之經單離的核酸表現構築體送至組織中，例如患者之肌肉組織。當此核酸序列經遞送至患者之特定 24 200424214 細胞後，可完成ghrh之組織特異柹矣亏共性表現。將具有結構性啟動子及GHRH或其類似物之編碼成兩馬序列之核酸序列直接遞送至患者之細胞的較佳方法係藉由活體内電穿孔程序。電穿孔法涉及外部提供之電極’例如針，内部提供之電極以幫助所進人患者之細胞’同時該細胞係患者組織中之-份子。於-特定具體實施例中，患者之細胞係體細胞、幹細胞、或生殖細胞。另一車父佳具體實施例係關於該經單離之核酸表現構築體，違核酸表現構築體可編碼出生長釋素（gHRH)或其生物等同物。於特定具體實施例中，該經單離之核酸表現構築體與列於 SeqlD Νο· · 11、SeqlD No. : 12、SeqlD N。· ： 13、

SeqlD No.： 14^SeqID No.： 17>SeqID No.： 18>SeqID No.： 19、SeqlD No. · 20、或 SeqlD No· ·· 21 之序列具有至少 90¾ 之相似性。本發明之經單離之核酸表現構築體實質上不具有病毒架構。該經單離之核酸表現構築體可進一步包括促進轉染作用之多肽’其較佳係一種帶電荷之多肽且最佳為聚-L-麩胺酸。將該經單離之核酸表現構築體遞送至患者之組織（較佳為肌肉細胞）後，開始表現該經編碼之GHRH或其生物等同物。該經編碼之GURU係一種生物活性多肽。該經編碼之GHRH的生物等同物係一種多肽，該多肽係經生物工程製作而含有與GHRH多肽相較下同時具有相似或經改善生物活性之不同的胺基酸序列。特定經編碼之GHRH或其生物等同物之一具體實例係與式SeqID No. ·· 6之序列具有至 25 200424214 少90%之相似性者。該GHRH或其生物等同物係由經單離之核酸表現構築體編碼出來的且用於本發明之核酸表現構築體包括下列一般序列之胺基酸結構：

-XrXrDAIFTNSYRKVL-XrQLSARKLLQDI-XrXjQQG e_x6-nqe-x7-ga-oh (SEQID No. ： 6) 其中··又：係胺基酸酪胺酸（“Y”）或組胺酸（“H”）之〇_或^異構物；X2為胺基酸丙胺酸（“Α”）、纈胺酸（“ν”）、或異白胺酉文（I)之D-或L-異構物；X3為胺基酸丙胺酸（“Α”）或甘胺酉文（G )之D-或L-異構物；X4為胺基酸甲硫胺酸（“μ”）或白胺酸（“L”）之D-或L_異構物；Xs為胺基酸絲胺酸（“s”）或天冬醯胺酸（“N”）之D-或L-異構物；χ6為胺基酸精胺酸（“R”）或絲胺酸（“S”）之D-或L_異構物；χ7為胺基酸麩醯胺（“Q”）或精胺酸（“R”）之D·或L-異構物；及其組合。亦提出用於本發明中特定實例之GHRH或其生物等同物之胺基酸序列。於特定具體實施例中，該經編碼之GHRH或其生物等同物可於接受該經單離之核酸表現構築體之患者體内促進生長素（GH)分泌。於另一具體實施例中，將重組之GHRH多肽或其生物等同物遞送至患者體内。該重組之GHRH多肽係一種生物活性多肽，而GHRH之生物等同物係一種多肽，該多肽係經生物工程製作而含有與GHRH多肽相較下同時具有相似或經改善生物活性之不同的胺基酸序列。特定之GHRH或其生物等同物之一具體實施例係式SeqlD No. : 6。 26 200424214 本發明之特定具體實施例係關於質體中介之補充方法，其係用於治療貧血、患者之總紅血球質量增加、反向耗損、反向之不正常的體重降低、治療免疫功能障礙、以及延長慢性病患者之餘命，尤其係慢性腎衰竭患者。於另一特疋具體實施例中，該患者係動物。 [實施方式] 名詞定義：本文中所使用之「一」（“a，，或“an”）係指一者或多者。於申請專利範圍中，當與「包括」一詞連接時，「一」（‘、，, 或“an”）係指一者或大於一者。本文中所使用之「其他」係指第二者或第二者以上。本文令所使用之「異常的體重喪失」一詞係定義為體重減少達個體之最小理想體重之至少5至1〇%，其特徵為脂肪組織與肌肉質量兩者有顯著的損失。本文中所使用之「AIDS療法」一詞係指經由任何醫療或物理方式治療後天免疫不全症（AIDS)，包含，但非限於：抗反轉錄病毒、核苷類似物、非-核苷反轉錄酶抑制劑 (NNRTIs)、蛋白酶抑制劑、以及/或其他用於增強免疫系統之藥物。本文中所使用之「類似物」一詞包含GHRH之任何突變物’或合成的或自然產生的GHRH之胜肽片段，例如 HV-GHRH (SEQID N。· ： 1)、TI-GHRH (SEQID N。· ： 2)、 TV-GHRH (SEQID N。· ： 3)、15/27/28-GHRH (SEQID No·: 27 200424214 )(44)NH2 (SEQID No. : 5)、或⑴叫⑽（SEQID N〇 : 6)形式，或者任何多達（1_29)胺基酸之較短的形式。、本文中所使用之貧▲」一詞係指紅血球數目及/或體積減：之情況或者血流中血紅素總量減少之情況，而造成患者蒼白、全身無力等。本文中所使用之「抗病毒療法」一詞係指一群藥物，其分為,種主要的類型，包含：㈣類似物藥物、蛋白酶抑制劑藥物、以及非·核普反轉錄酶抑制劑（nnrtIs)。本文中所使用之「基值」一詞係指於特定類型之受者中比較=常生物參數與不正f生物參數時作為基準之測定值"十算值、或濃度。例如，狗企清中肌酸針之正常範圍或基值係於約〇.4至1>8毫克/公合之範圍内，其中貓血清中肌馱酐之正常範圍或基值係於約〇·8至2 3毫克，公合之範圍内。某些生物基值在不同生物中係不同的，但是熟於此技藝者可確認正常的基值與下列症狀之高於或低於基值的數值：腎衰竭、貧血、耗損、以及免疫功能障礙。本文中所使用之「體脂肪比例」一詞係定義為身體脂肪質量除以總體重。曰本文中所使用之「惡病質（cachexia)」一詞係定義為骨骼肌之損失加速。 …月本文中所使用之「組合體（CasseUe)」一詞係定義為一或多種基因轉殖表現載體。本文中所使用之「細胞-轉染脈衝」一詞係定義為可將載體，例如線型DNA片段，轉染至細胞中之傳送的力量、。 28 200424214 於某些具體實施例中’該力量係來自電，如電穿孔去戈者該力量係來自血管的壓力。本文中所使用之「編碼區」一詞係指DNa序列中之任何部分’其可轉錄成信息RNA (mRNA)然後轉譯出特定多肽之胺基酸序列。本文中所使用之「遞送（delivery或delivering)」一 1 係指在有壓力或無壓力存在下，利用化學或生物程序、、、主射、混合、電穿孔、音波、或此等組合之手段將物質引入組織、對象、細胞、或任何接受者之方法。本文中所使用之「DNA片段」或「核酸表現構築體」係指實質上為雙股之DNA分子。然而該片段可由此技藝中已知之任何標準分子生物方法而產生，於某些具體實施例中，該DNA片段或表現構築體係利用限制酶切割原本之 DNA分子而產生。「表現載體」、「表現組合體」、或「表現質體」可交替使用。該原本之分子可為任何標準分子生物 DNA試劑，於某些具體實施例中，該原本之係質體。本文中所使用之慢性病」係定義為患有例如慢性阻塞性肺部疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease)、慢性心衰竭、中風、癡呆、髖骨骨折後之修復、慢性腎衰竭、類風濕性關節炎、以及多種老年病之患者，其每個月需要看醫生或住院治療一次，且此情形持續至少兩年。本文中所使用之「捐贈者」係指動物界中之任何物種其中取出細胞且於捐贈者體外之任何期間使該細胞維持於存活的狀態。 29 200424214 本文中所使用之「捐贈-細胞」係指經取出之任何細胞且於捐贈者體外之任何期間使該細胞維持於存活的狀態。本文中所使用之「電穿孔法」係指一種利用電脈衝將核酸序列遞送至細胞中的方法。本文中所使用之「電脈衝」與「電穿孔法」係指為了使細胞攝入核酸分子而對組織或細胞給予電流。熟於此技藝之人士皆了解此等名詞係與「脈衝電場」、「脈衝電流裝置」、以及「脈衝電壓裝置」相關。熟於此技藝之人士皆了解電脈衝之量及持續時間係根據受者之組織、尺寸大小、以及整體健康而決定，再者，熟於此技藝之人士可憑經驗決定此等參數。本文中所使用之「經編碼之GHRH」係生長釋素之生物活性多肽。本文中所使用之GHRH之「生物等同物」係一種多肽，該多肽含有與GHRH多肽相較下，同時具有相似或經改善生物活性而與野生型GHRH多肽不同的胺基酸序列。該生物等同物可為自然產生的或特別經過修飾的。熟於此技藝之人士應了解本說明書中使用之相似或經改善生物活性係指可促進以及/或釋放生長素或其他腦下垂體激素。熟於此技藝之人士應了解於某些具體實施例中，GHRH之經編碼的生物等同物係一種多肽，該多肽係經生物工程製作而含有與GHRH多肽相較下同時具有相似或經改善生物活性之不同的胺基酸序列。此技藝中已知之設計序列的方法包含定點突變（site-directed mutagenesis)。 200424214 本文中所使用之「生長素（GH)」係指一種與生長相關之激素且係作為一種化學傳令員以於標的細胞發揮其作用。該生長素可經由生長釋素之作用而釋放。本文中所使用之「生長釋素（GHRH)」係指一種可促進或刺激生長素釋放之激素，以及狹隘的其他腦下垂體激素，例如泌乳激素。本文中所使用之「異種核酸序列」係指包括不同調節及表現元件之DNA序列。本文中所使用之「免疫功能障礙」係指患者之免疫系統不正常、經損害、或功能不完整，且係直接或間接由免疫特定標記（例如IGF-I濃度或淋巴細胞之％)加以判定。本文中所使用之「免疫療法」係指任何可促進或加強身體之免疫系統以建立保護用之抗體之處置，該免疫療法將可減少醫療上之症狀以及/或降低對醫藥的需求。本文中所使用之「瘦肉組織（leanbodymass，lBm)」係指動物身體中非-脂肪組織（例如肌肉）之質量。本文中所使用之「慢性疾病患者之生命延長」係指接受治療之患者與未接受治療之患者相較下，其實際壽命較長。本文中所使用之「淋巴細胞形成作用（lymph〇p〇iesis)」係指淋巴細胞之生產。本文中所使用之「腎衰竭（kidneyfailure)」、或「腎臟的衰竭（renal failure)」或「慢性腎衰竭」係指腎臟之局部缺血或毒素傷害使腎小球過濾率突然或慢性下降，或由主 31 200424214 要的疾病造成，例如感染、腎小球腎炎、心臟疾病、或糖尿病，以及包括腎小球毛細滲透性之降低、腎小球滅液之回滲、腎小管阻塞（tubular obstruction)、以及腎臟内血萬收縮（intrarenal vasoconstriction)。本文中所使用之「腎衰竭療法」係指以任何醫藥或物理方式治療腎衰竭，包含，但非限於免疫療法、透析、腎臟移植以及營養療法（nutritional therapy^)。本文中所使用之「經修飾之細胞」係指得自受者之細胞具有其他經引入該細胞之核酸序列。本文中所使用之「經修飾之·捐贈_細胞」係指任何捐贈-細胞，其具有經引入之編碼GHRH的核酸序列。本文中所使用之「核酸表現構築體」係指任何形式之基因構築體，包含可轉錄出RNA之核酸。本說明書中「核

酸表現構築體」可與「表現載體」交互使用。於特定1負實施例中’該核酸表現構築體包括：啟動子；所欲之核1 酸序列；以及3,端未轉譯區；其中該啟動子、所欲之核q 酸序列、以及3,端未轉譯區係經過操作性連結的；以及，欲之核普酸序列於活體内之表現係由啟動子所調節。本文中所使用之「操作性連結」係指核酸序列中之件或結構係經由可操作之技能加以連接^自Μ在^ 置…件或結構可經由所欲之操作而完成或者該元件結構係以經由所欲之操作而完成為特徵。熟於此技藝之士應了解核酸序列中之元件或結構在操作上不需以串聯相鄰之順序加以連結。 32 200424214 本文中所使用之「聚-L-麵胺酸（PLg)j係指一種^麵胺酸之可生物降解的聚合物’不論是否進行電穿孔法，其皆適合作為載體或輔佐DNA轉移至細胞。本文中所使用之「注射後」係指將核酸組合體 acid cassette)引人至受者細胞中之後的時間，其中該核酸組合體包含可編碼GHRH或其生物等同物之異種核酸序列，以及使該經編碼之基因於該活體生物中之經過修飾之細胞内開始表現。本文中所使用之「質體」，一般係指一種含有外來染色體遺傳物質之構築體，通常為環狀雙股DNA，該dna可獨立於染色體DNA自行複製。可將質體或其片段作為載體。質體係雙股DNA分子，其係發生於或衍生自細菌與其他微生物（極少數）。不過，一般係排除粒線體與葉綠體 DNA、殺手酵母（yeast killer)與其他實例。本文中所使用之「經中介之基因補充之質體」係指一種於體内藉由利用經單離之核酸表現構築體，使受者長時間暴路於治療性蛋白質之治療範圍下的方法。本文中所使用之「脈衝電壓裝置」或「脈衝電壓注射裝置」係關於一種儀器，其藉由對細胞發射局部脈衝電流而使有機體之細胞攝入核酸分子。由於脈衝電流使細胞膜不穩定，而形成通道或孔洞。此型式之一般裝置係經過校準俾使使用者可選擇或調整所欲之電壓振幅以及脈衝電壓所持續的時間。脈衝電壓裝置之主要的重要性係該裝置幫助本發明組成物，特別係線形DNA片段，遞送至有機體之 33 200424214 細胞之能力。本文中所使用之「質體骨幹（plasmid backb〇ne)」係指一種DNA序列，其包含由細菌而來之複製作用，以及細菌之抗生素選擇基因，經適當質體轉形之細菌必須具有該抗生素選擇基因才可於特定條件下生長。然而，有一種質體，稱為迷你圓圈（mini-circle)，其不含抗生素抗性基因以及複製作用之起點（Darquet等人，1997; Darquet等人，1999; Soubrier等人，1999)。利用體外增幅之表現質體DNA (亦即非-病毒表現系統）可避免與病毒載體相關之風險。由於該非-病毒表現系統係利用「特定種類」之構成要素進行基因遞送，因此其產物通常係低毒性的，故可將與病毒載體相關之免疫性風險降至最低。本發明之一觀點係該質體骨幹不含病毒核苷酸序列。本文中所使用之「啟動子」係指一種與基因轉錄作用相關之DNA序列。啟動子可指導原核或真核基因之轉錄作用。啟動子可為「誘發性」，亦即，使用誘發劑起始轉錄作用，或者，相反地，啟動子可為「本質性」，亦即，誘發劑無法調節轉錄作用之速率。啟動子可以「組織_特異性」咬「組織-較佳性」之方法加以調節，使其僅於特定組織類型或典型中具有活性以轉譯經操作性連結之編碼區。本文中所使用之「複製元件」包括可使質體於特定宿主中進行複製之核酸序列。熟於分子生物領域之人士皆了解該複製元件包含，但非限於選擇性標記基因啟動子、核糖體結合位置、選擇性標記基因序列、以及複製起點。 34 200424214 本文中所使用之「殘餘之線形質體骨幹」包括質體骨幹之任何片段，其係在製造線形核酸表現質體過程末期所留下的。本文中所使用之「接受者」係指動物界中任何種類的動物’其中經修飾之-捐贈·細胞係引自捐贈者。本文申所使用之受者的「紅血球質量（RBC_mass)」係由下列三種試驗中之一種決定：1}血球比容：血漿中紅血球之比例；2)紅血球（紅血球）計數：血漿中紅血球之數目；以及3)血紅素··受者紅血球中攜氧蛋白質之程度。本文中所使用之「調節子蛋白質（regulator pr〇tein)」係指任何可用於控制基因表現之蛋白質。本文中所使用之「受者」或「動物」係指動物界中任何種類之動物。於較佳具體實施例中，特別係指人類以及經馴養之動物，例如寵物（如貓、狗等）；工作動物（如馬等）；食用動物（牛、雞、魚、羊、豬等）；以及所有其他已知之動物。本文中所使用之「組織」係指聚集之類似細胞及其周圍之細胞間物質。熟於此技藝者知曉，組織係由在特定功能表現上類似之經特化的細胞聚集而成。本發明範圍中，組織一詞並不係指細胞株、懸浮細胞、或細胞培養。特定具體實施例中，該組織係於活體内經電穿孔。熟於此技藝者知曉，體内具有四種基本組織：1)上皮組織；2)結締組織，包含血液、骨骼、以及軟骨；3)肌肉組織；以及4)神經組織。特定具體實施例中，該方法及組成物係關於經由 35 200424214 電穿孔法將線形DNA轉移至肌肉組織中。本文中所使用之「治療元件」包括可在活體中表現經編碼之基因產物之核酸序列。熟於分子生物領域之人士皆了解該治療元件可包含，但非限於啟動子序列、轉殖基因、聚 A 序列（p〇ly A sequence)、或者 3,或 5，UTR。本文中所使用之「轉染」係指將核酸引入真核細胞。某些具體實施例中，該細胞並非植物組織或酵母菌細胞。本文中所使用之「載體」係指任何可將核酸送入細胞或有機體中之媒介。其實例包含質體載體、病毒載體、微脂粒、或陽離子基脂質（cationic lipid)。本文中所使用之「耗損」可界定為脂肪組織及肌肉質量兩者顯著的損失，其使患有進行性疾病（例如，腎衰竭、癌症、AIDS等）之病患特別難以增加體重。耗損可能與疾病本身或治療之作用相關，或者兩者皆有關係。本文中所使用之「病毒骨幹」係指未含有啟動子、基因、以及3 ’端聚A信號或未轉譯區之核酸序列，其所包含之元件包含，但非限於位置·特異性之基因體集成Rep (site_specific genomic integration Rep)、反向的末端重複序列（Inverted terminal repeats，ITRs)、以及於反轉錄時提供給tRNA引子之結合位置。病毒骨幹亦包含核酸序列構成要素，當注入活體内時，該核酸序列構成要素可引起病毒免疫性反應，然後進行整合，影響組織特異性啟動子之專一性及活性’使轉錄作用默化（transcriptional silencing)，或對受者造成安全上的風險。 36 200424214 血管壓力脈衝」係指由大量液體壓力所產生之脈搏，可幫助細胞攝入載體。熟於此技藝者了解血管壓力脈衝之畺與持續時間係根據受者動物之組織、尺寸大小、以及整體健康，再者，熟於此技藝者可憑經驗明瞭如何決定此荨參數。本文中所使用之「載體」係指一種包括基因物質之構築體，該構築體係經設計，並藉由將核酸序列遞送至標的、、、田胞中，使該細胞進行轉形作用。載體可含有多個基因元件，該等元件在位置上及順序上係與其他必須元件排列，♦ 使得所包含之核酸組合體（nucleic acid cassette)可經轉錄且當需要時可於該經轉染之細胞中進行轉譯作用。這些元件係操作性連結的。「表現載體」係指一 DNA質體，該質體包含所有於異種細胞中產生重組蛋白質所需之資訊。本發明之一觀點係於受者中治療或預防腎衰竭及其併發症之方法。本發明之特定具體實施例係關於治療腎衰竭之併發症，例如貧血、耗損、免疫功能障礙、餘命減少、生活品質降低、以及其他主要與腎臟病相關之症狀。本發馨月之具體實施例包括將經單離之核酸表現構築體（該核酸表現構築體可編碼出生長釋素(GHRH)或其生物等同物）遞送至受者之組織中，例如肌肉。接著受者體内或其生物等同物之活體内表現係足以治療或預防腎衰竭、= 療貧血、以及其他一般與腎衰竭相關之症狀以增加存活率及改進患有腎衰竭之動物的健康。 ' 另一較佳具體實施例中，該經單離之核酸表現構築體 37 200424214 係利用活體内電穿孔法進行遞送。可藉由將數個電極置於 k擇的組織中以加強遞送方法’將經單離之核酸表現構 /、體遞送至所選擇的組織且插人數個電極之區域中，然後對所選擇的組織且經遞送核酸表現構築體之區域施加細胞 /轉染脈衝(例如電)。然而，該細胞_轉染脈衝不需要為電脈衝亦可使用血管壓力脈衝。於特定具體實施例中，將經單離之核酸表現構築體（該核酸表現構築體可編碼出ghrh 或其生物等同物）遞送至受者中之電穿孔法，亦可使用直接射基因搶、或金粒子轟擊（g〇ld particle b〇mbardment)。於較佳具體實施例中，受者之細胞係體細胞、幹細胞、或生殖細胞。本發明中之受者包括動物（例如人類、豬、馬、牛鼠大鼠、猴、綿羊、山羊、狗、或|苗）。另一特定具體實施例中包含經單離之核酸表現構築體的特疋元件。例如’該構築體包括組織特異性啟動子；GHrh 或其生物等同物；以及經操作性連結之3,端未轉譯區（3， TR)該組織-特異性啟動子可為肌肉-特異性啟動子（例如 SPc5 12 (SeqlD Νο_· 7))’以及該核酸表現構築體之3，utr 可為人類生長素3, UTR (SeqlD No· : 8)、牛類生長素3， UTR、骨骼肌α肌動蛋白3, UTR、或S V40多腺苦酸化訊號。本發明之經單離之核酸表現構築體包括一種實質上不含病毒骨幹之構築體。此外，較佳之具體實施例中，核酸表現構築體之特定實例可為具有SeqlD No. : 11、SeqID Ν〇· ·· 12、SeqlD No· ·· 13、以及 SeqlD No· ·· 14 之質體。然而不欲受限於理論，可藉由轉染-促進性多肽來改進組織細 38 200424214 胞攝入該核酸表現構築體之能力。本發明之特定具體實施例中，該轉染-促進性多肽包括帶電荷之多肽，較佳為聚_L_ 麩胺酸。將該核酸表現構築體遞送至動物受者之細胞後，開始表現該經編碼之GHRH或其生物等同物。於較佳具體實施例中，該表現作用發生於受者之肌肉細胞中。該經編碼之 GHRH包括一種生物活性多肽。該經編碼之GHRH的生物等同物包括一種多肽，該多肽與GHRH多肽相較下具有相似或經改善生物活性。該GHRH或其生物等同物係由經單離之核酸表現構築體編碼出來的且用於本發明之核酸表現構築體包括下列一般序列之胺基酸結構（SeqlD No. : 6):

-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQG

E-X6-NQE-X7-GA_OH 其中：Xi係胺基酸酪胺酸（“Y”）或組胺酸（“Η”）之D-或 L-異構物；X2為胺基酸丙胺酸（“a”）、纈胺酸（“V”）、或異白胺酸（“I”）之D-或L-異構物；X3為胺基酸丙胺酸（“a”）或甘胺酸（“G”）之D_或L-異構物；Χ4為胺基酸甲硫胺酸（“Μ，，）或白胺酸（“L”）之D-或L-異構物；义5為胺基酸絲胺酸（“s”）或天冬醯胺酸（“Ν”）之D-或L-異構物；又6為胺基酸精胺酸 (“R”）或絲胺酸（“S”）之D-或L·異構物；Χ7為胺基酸麵醯胺 (“Q”）或精胺酸（“R”）之D-或L-異構物；及其組合。適用於本發明GHRH或其生物等同物之胺基酸序列的特定實例係

列於 SeqlD No. : 1 ; SeqlD No. : 2 ; SeqlD No· : 3 ; SeqlD

No· : 4 ; SeqlD No. : 10 ;以及 SeqlD No. : 22。於特定具 39 200424214 體實施例t，該經編碼之GHRH或其生物等同物可於接受該核酸表現構築體之受者體内促進生長素（GH)分泌。本發明之又一具體實施例係關於治療或預防腎衰竭及其併發症之方法，該方法係將特定之重組GHRH多肽或其生物等同物引入至受者體内。該重組GHRH係一種生物活性多肽，以及其生物等同物係經生物工程製作而含有與 GHRH多肽相較下同時具有相似或經改善生物活性之不同的胺基酸序列。特定之重組GHRH或GHRH之生物等同物之一具體實施例係式SeqID No^ 6。投予該經編碼之gHRH 或其生物等同物可促進受者體内生長素（gh)之分泌。此外，本發明係關於一種質體_中介之補充方法，可用於治療貧血、耗損、免疫功能障礙、或其他一般與腎衰竭相關之症狀，以增加健康與生活的品質且延長慢性病患者之壽命。貧血之情形係指體内血液流動中紅血球之數目或體積減少或兩者皆減少，或者係血紅素之總體積減少，造成患者蒼白或全身虛弱等。患者之耗損可界定為體重降低，其特徵為脂肪組織及肌肉質量顯著的損失，其使患有進行性疾病（例如，腎衰竭、癌症、AIDS等）之病患特別難以增加體重。腎衰竭及其伴隨之症狀，例如貧血、耗損、免疫功能障礙、以及生活品質與餘命之降低，皆與特定疾病或疾病治療之作用相關。詳言之，本發明係關於一種將可編碼出GHRH或其生物等同物之異種核酸序列遞送至受者細胞（例如體細胞、幹、、’田胞、或生殖細胞）中之方法，以及使該經過修飾之細胞於 200424214 受者體内表現該可編碼出GHRH或其生物等同物之基因。後續GHRH或其生物等同物之表現係受到組織特異性啟動子，例如肌肉啟動子，之調節。由經修飾之細胞的顱外表現以及之GHRH或其生物等同物之釋放可治療或預防腎衰竭及其併發症。另一特定具體實施例中，該受者係動物。臨床上廣泛地使用重組GH替代療法且該療法係具有效益的，但通常其劑量係超越生理上的正常水準。此高劑里之重組GH會結合有害之副作用，例如，有報告指出高達3 0。/。之以重組GH治療之病患會產生胰島素抗性 (Blethen ’ 1995 ; Verhelst等人，1997)或於小兒科病患中加速骨無之生長及閉合（Blethen及Rundle，1996)。此外，循環中之GH的分子異質性（m〇ieeuiar heterogeneity)與生長及體内平衡間具有重要的關聯，其會使GH降低效能，亦即降低GH刺激泌乳激素受體之能力（Sat〇zaWa等人， 2000 ; Tsunekawa 等人，1999 ; Wada 等人，1998)。以重組之外生性GH蛋白質治療會造成非所欲之副作用而提高GH的基值（basal level)以及破壞GH之自然不連續的脈衝。反之，並未提出關於重組GHRH療法之副作用。腦下垂體門脈循環中GHRH之正常濃度範圍係150至8〇〇微微克/毫升，然而該激素之全身性循環值係約1〇〇至5〇〇微微克/毫升。某些患有由顱外腫瘤引起之肢端肥大症的病患，其GHRH的濃度係高達近10倍（例如50毫微克/毫升之免疫反應性GHRH)(Thorner等人，1984)。於兒童及老年人中利用GHRH療法之長期研究（1至5年）結果顯示並未出 200424214 現典型的GH副作用，例如禁食之葡萄糖濃度改變，或於小兒科病患中經加速之骨骺生長及閉合或股骨頭之滑脫 (slipping of capital femoral epiphysis) (Chevalier 等人， 2000) ( Duck 等人，1992 ; Vittone 等人，1997)。於人類、羊或豬之許多研究顯示出持續注入重組之GHRH蛋白質可恢復正常的GH分泌模式，而不會使GHRH受體不敏感或耗盡GH的供給（Dubreuil等人，1990)。由於此系統具有回饋作用，但是於GH療法中此回饋作用遭到破壞，因此 GHRH重組蛋白質療法比GH療法更具生理性。然而，由於GHRH於活體内之半生期短，經常需要（一天一至三次）經由靜脈、皮下或鼻内（需要300倍之高劑量）投予GHRH (Evans等人1985 ; Thorner等人，1986)。因此，作為慢性療法，重組GHRH蛋白質投予係不實際的。然而，基因轉殖法可克服GHRH使用上之限制。再者，治療上可使用廣範圍之劑量。由於GHRH之基因、cDNA與其原態（native) 以及數種突變之分子已於豬及其他物種中特徵化，且該療效之測量法係簡單且明確的，因此以選擇GHRH基因療法為佳（Bohlen 等人，1983 ; Guillemin 等人，1982)。使用GHRH之先前研究顯示利用電穿孔之質體療法係可行的且代表一種於大型動物及人類中可引起蛋白質之生產與調節之大有可為的方法（Draghia_Akli等人，1999 ; Draghia-Akli等人，2002b)。電穿孔法亦已廣泛地用於嚙齒類及其他小型動物（Bettan等人，2000 ; Yin及Tang， 2001) 。已發現電極之配置會影響電場的分布以及接著的結 42 200424214 果（Gehl等人，1999 ; Miklavcic等人，1998)。初步的實驗指出於大型動物模式中，與外部卡式電極相較下針狀電極可得到一貫再現性之結果。此外’於小鼠、大鼠、及狗之骨骼肌中發現以PLg或聚乙烯吡咯烷酮（PVP)設計之質體可增強基因之轉染作用以及接著的基因表現高達1(^(Fewell等人，2〇〇1;]y[umper 專人’ 199 8)。然而不欲受限於理論，於進行電穿孔過程期間不僅藉由穩定該質體DNA與促進穿過細胞膜孔洞之細胞内運送，且亦經由主動機制來增加質體之轉染作用。例如，細胞上帶正電之表面蛋白質經由蛋白質_蛋白質間之交互作甩而與連接至質體DNA之帶負電的pLG形成複&物。g施加電場時，該表面蛋白質的方向反轉且主動地攝入該DNA分子，此方法實質上可增加轉染作用的效果。再者，PLG可防止與活體内質體遞送相關之肌肉傷害 (Draghia-Akh等人，2002a)以及於注射前增加質體於體外之穩定度。質體補充法可用於治療或預防腎衰竭、治療貧血、耗知、免疫功能障礙、以及其他與腎衰竭相關之症狀，其目的為增加本文所述之慢性病患者之健康、生活品質以及延長其可命’且該方法可提供克服直接注射重組GH或GHRH 蛋白質之限制之優點。新穎之GHRH生物等同物（其具有血凊蛋白酶抗性）的表現作用可藉由合成性肌肉-特異性啟動子所控制之質體的表現加以控制。此等ghrh或其生物等同物之表現可於受者體内引起高濃度之GH及IGF-I，而該 43 200424214 受者體内具有經由肌内注射與活體内電穿孔所遞送至細胞中之編碼序列。雖然活體内電穿孔係將異種核酸編碼系統引入至受者細胞之較佳方法，然而熟於此技藝者亦知曉尚方法了引入該異種核酸編碼系統，例如電穿孔、脂質體（lipofectamine)、磷酸鈣、活體外基因治療㈣咖）轉形作用、直接注射、DEAE葡萄聚糖、音波載荷、受體中介之轉染作用、粒子搶法（micr〇pr〇jectile b〇mbardment) 等。例如，亦可先自受者或捐贈者之身體取出細胞，培養該細胞，然後藉由各種已知之方法（例如電穿孔、脂質體、隹磷酸鈣、活體外基因治療轉形作用、直接注射、deae葡萄聚糖、音波載荷、受體中介之轉染作用、粒子槍法等）將核酸編碼系統引入，以及最後重新將該經修飾之細胞引入原來的受者或其他宿主體内（活體外基因治療法），而將編碼該GHRH或其生物等同物之核酸序列直接引入到受者之細胞中。該GHRH序列可選殖至腺病毒載體或由腺病毒改造之載體且利用簡單的肌内注射或經由靜脈或動脈内之方式遞送。帶有該GHRH序列之質體DNA可與陽離子性脂質· 或微脂粒複合且經由肌内、靜脈内或皮下之方式遞送。本文中之投予係指將DNA之載體或媒介物引入體内之途徑。可針對標的組織投予或於全身性投予後經由標記而遞送至標的組織。尤其，為了於組織内可對任何特定核酸序列建立用於質體中介補充之經控制在特定程度之表現作用’本發明可經由載體之投予來治療疾病。投予載體之較佳方法以及遞送之規劃皆已詳述於上述内容中。 44 200424214 將DNA粒子（呈溶液、懸浮液、或膠體形式）簡單注射至肌肉後’肌肉細胞具有自細胞外之空間攝入DNA之獨特的能力。由此方法進行之DNA表現可持續數個月。且可利用活體内電穿孔來加強肌肉細胞攝入DNA。遞送經設計之DNA載體係涉及將DNA合併至巨分子複合物，該複合物可經由胞飲作用（end〇cyt〇sis)進入標的細胞。此等複合物包含脂質、蛋白質、碳水化合物、合成之有機化合物、或無機化合物。與載體複合之複合物的特徵 (尺寸大小、表面特徵、組成）決定了該載體於體内之生物利用率。該設計中之其他元件可作為與細胞表面或内部之特定受體交互作用的配體。該設計中之其他元件可加強複合物進入細胞、自内體（end〇s〇me)釋出、以及進入細胞核。亦可經由DNA運送子進行遞送。DNA運送子係指一種可結合DNA載體之分子且可經由表皮細胞攝入。DNa 運送子包含可非-共價結合至DNA之分子複合物且有效地運送該DNA穿越細胞膜。較佳為該運送子可運送該dna 穿越細胞核膜。參見，例如，下列申請案，該等申請案（包含圖式）皆以參考資料合併於本文：（丨）w〇〇等人之美國專利案第6,150,168號，案名為「DNA運送子系統及其使用方法（A DNA Transporter System and Method of Use)」；（2) W〇〇等人之PCT/US93/02725，案名為「DNA運送子系統及其使用方法（A DNA Transporter System and Meth〇d 〇f

Uw)」，申請曰為1993年3月19日；（3)w〇〇等人之美國專利案第6,177,554號’案名為「核酸運送子系統及其使用 45 200424214 方法（Nucleic Acid Transporter Systems and Methods of Use)」；（4) Szoka等人之美國專利案第5,955,365號，案名為「自我組裝之聚核皆酸遞送系統（Self_Assembling Polynucleotide Delivery System)」；以及（5) Szoka 等人之 PCT/US93/03 406，案名為「自我組裝之聚核苷酸遞送系統 (Self-Assembling Polynucleotide Delivery System)」，申請曰為1993年4月5曰。其他遞送方法包含DNA運送子系統。該DNA運送子系統係由包含數種元件之粒子所組成，該粒子可獨立地且非-共價鍵結至DNA。各元件係由配體組成，該配體可識別特定的受體或其他官能性基團例如與陽離子基團複合而結合至DNA之蛋白質。可使用之陽離子的實例包含精胺 (spermine)、精胺衍生物、組織蛋白（hist〇ne)、陽離子胜肽以及/或聚離胺酸（polylysine)。其中一種元件可與DNA載體以及標的細胞之細胞表面受體結合。此等元件之實例為可與去唾液酸糖蛋白受體（asialoglye〇pr〇tein reeept〇r)、葉酸受體、甘露糖-6-磷酸鹽受體、或副肉精（carnhine)受體交互作用之有機化合物。第二種元件可與DNA載體以及細胞核膜上之受體結合。細胞核配體可識別運送子系統及將其運送穿越細胞核膜。此等配體之實例為SV4〇之hrge τ 抗原或組織蛋白之細胞核標的序列。第三種元件可與DNA 載體以及引起游離基因體裂解(epis〇mal lysis)之元件結合。其實例包含去活性的病毒粒子，例如腺病毒、與流行性感冒病毒紅血球凝集素相關之胜肽、或者於上述sk〇ka 46 200424214 等人之專利案中說明之GALA胜肽。亦可藉由脂質進行投予。該脂質可形成微脂粒，其係由脂質組成織中空球形小囊，該脂質之排列為單層、雙層或多層形式且内部水性空間可包覆水溶性化合物，例如 DNA，微脂粒之直徑係自〇〇5至數微米間。脂質亦可以非微脂粒之形式使用。其特定實例包含陽離子性脂質以及含有DOPE之複合物，其可與dna以及標的細胞之細胞膜進行交互作用而促使DNA進入細胞。基因遞送亦可經由移植經基因工程修飾之細胞而進行。例如’利用不成熟之肌肉細胞（稱為肌胚細胞）將基因載運至肌纖維。經生物工程設計以表現重組人類生長素之肌胚細胞可分泌生長素至動物的血液中。經合併之基因所表現之分泌作用可持續至3個月。最後肌胚細胞進行分化以及融合至現有之肌肉組織。由於該細胞係合併至現有的結構，故該細胞不僅是經包容亦是經培育。肌胚細胞可輕易地自需要質體_中介之補充作用之個體的肌肉組織中取知，且该經基因工程修飾過之細胞亦可在不會對病患之肌肉造成傷害下輕易地放回肌肉組織中。同樣地，亦可使用角質細胞將基因遞送至組織。可經由培養小量的生物活組織以產生大量的角質細胞。該培養可為分層片狀培養且者移植至人類時，可產生表皮且於數年内持續改進組織之性質。該角質細胞係經基因工程修飾而於培養時以適當的载體進行轉染作用。雖然該角質細胞可分離自分隔真皮與表皮之基膜，人類角質細胞可將所產生之蛋白質分泌至循環 47 200424214 系統中。亦可利用病毒載體進行遞送。例如，腺病毒載體可藉由將病毒基因體之E1區以本發明所述之載體元件替代而予以構成，該元件包含啟動子、5，UTR、3，UTR、以及核酸組合體’且將此重組基因體引入293細胞，該細胞會將此專基因包裝成無感染性之病毒粒子。由此細胞得到之病毒可用於感染活體外或活體内之組織而將該載體引入組織，使核酸組合體内之基因進行表現。然而不欲受限於理論，咸信為了於人類中提供一種使用此等異種核酸序列之可接受的安全極限，採用經調節之基因表現系統以控制低程度之GHRH基礎表現且仍保留誘發之高能力。之面此力。该HV-GHRH或生物等同物分子

長其壽命。载體

胞為外來物或者該序列胞中複製。核酸序列可為動物本身之序列」，意指該序列對經引入載體之細朐 48 200424214 與細胞中之序列係同源的但是在該宿主細胞之核酸位置中通常無法找到該序列。載體包含質體、黏接質體（c〇smid)、病毒（噬菌體、動物病毒、以及植物病毒）、線形DNA片段、以及人造染色體（例如YAC)，然而於較佳具體實施例中該載體實質上不含有病毒序列。熟於此技藝者皆可經由標準重組技術來構築載體。「表現載體」係指任何形式之基因構築體包括可轉錄出RNA之核酸。於某些例子中，此等序列係不轉譯的，例如，產生反義分子或核糖核酸酵素（rib〇Zyme)。表現載體可含有各種「控制序列」，該控制序列係指轉錄作用所需之核酸序列及於特定宿主細胞中，經操作性連結之編碼序列進行轉譯作用可能需要之核酸序列。除了控制轉錄及轉譯作用之控制序列外’載體與表現載體可含有能提供下述其他功能之核酸序列。 I·質體載體於特定具體實施例中，以質體載體之線形DNA片段對真核細胞，尤其係哺乳類細胞，進行轉染作用。通常，含有複製子（replicon)與控制序列之質體載體係衍生自可與宿主細胞相容之物種，而在此等宿主間相互應用。一般地，載體含有複製位置’以及標兄序列’該標記序列可於經轉形之細胞中提供表現型的選擇條件。於一非限制性實例中，經常使用PBR322之衍生物進行大腸桿菌之轉形作用， pBR3 22係衍生自大腸桿菌屬之質體。pBR322質體包含氨比西林（ampicillin)與四環素（tetracycline)抗性基因，因而 49 200424214 提供了簡易辨識經轉形之細胞的方法。該pBR質體，或其他U生物备體或喔菌體必須含有，或經修飾後含有，例如，微生物有機體可使用於表現其本身蛋白質之啟動子。熟於此技藝者明瞭’此技藝中之任何質體經修飾後可應用於本發明之方法中。於特定具體實施例中，例如，應用於治療方面之GHRH載體係衍生自pBlueScript KS+，且具有康黴素（kanamycin)抗性基因。此外’含有複製子與控制序列之噬菌體載體可與宿主微生物相容’而在此等宿主間作為轉形載體。例如，嗟菌♦ 體λ GEM ·11可用於標記重組之噬菌體載體，而該重組之噬菌體載體可用於轉形宿主細胞，例如，大腸桿菌LE392。其他可使用之質體載體包含pIN載體（In〇uye等人， 1985)，以及pGEX載體，該載體可產生麩胺基硫轉移酶 (glutathione S-transferase，GST)，為一種可溶性融合蛋白夤，俾用於後續之純化作用以及分離或切割。其他適合之融合蛋白質為可與β_半乳糖苷酶、泛素（ubiquitin)等融合者。 · 細菌宿主細胞，例如，含有表現載體之大腸桿菌係生長於任何適合的培養基，例如LB液體培養基 (Luria_Bertani ’ LB)。熟於此技藝者應了解，於某些載體中可經由使宿主細胞與對某些啟動子具有特異性之藥劑接觸，而誘發該重組蛋白質之表現，例如，於培養基中添加異丙基硫代半乳糖η比喃苷（is〇pr〇pyl beta_D-thi〇galactopyranoside，IpTG)，或者於較高溫度下 50 200424214 進仃培養。將細g培養-段時間後，通常為2至Μ小時，利用離心收集該細胞且洗滌該細胞俾去除殘餘之培養基。 π·啟動子以及增強子（Enhaneers) 啟動子係核酸序列中之控制序列，其可控制基因表現之起始以及基因產物之轉錄速率。其包含調節作用之蛋白質以及分子（例如RNA聚合酶以及其他轉錄作用因子）可結合之基因元件，俾開始進行該等特異性核酸序列之轉錄作用。「操作性定位」、「操作性連結」、「經控制」、以及「經轉錄作用控制」等係指啟動子係位於核酸序列中之正確的力月b位置以及/或方向，以控制轉錄作用之起始以及/或該序列之表現。一般，啟動子包括一段用於定位RNA合成起始位置之序列。最廣為已知者係TATA盒（TATA box)，但是有些啟動子並無TATA盒，例如，哺乳動物之末端脫氧核苷酸轉移酵素基因（terminal deoxynucleotidyl transferase gene)以及 SV40末期基因之啟動子，其係位於起始位置後之不連續元件’可幫助固定起始位置。其他啟動子元件可調節轉錄作用起始之頻率。典型地，這些元件係位於起始位置上游3 〇至110 bp之區域，然而已顯示許多啟動子於起始位置之下游區域亦含有功能性元件。至於經啟動子「控制之」編碼序列’啟動子係位於轉錄閱讀架（transcriptional reading frame)之轉錄起始位置的5,端，亦即轉錄閱讀架係位於所選擇之啟動子的下游（亦即3’端）。「上游」之啟動子可刺激 DNA之轉錄作用以及促進經編碼之RNA的表現。 51 200424214 啟動子7〇件間的距離通常係具有彈性的，因此當元件彼此間轉向或經移動時，可維持啟動子功能。於tk啟動子之例，轉錄作用開使前，啟動子元件間的距離可增加至5〇 bP ’之後啟動子元件間的距離縮短。根據啟動子，其顯示個元件了相互配合或者獨立地活化轉錄作用。啟動子可選擇性地肖「增強子」—起作用，於核酸序列之轉錄活化作用中，「增強子」係一種順式_作用調節序列。啟動子可為天生與核酸序列相關者，其係經由單離該位於編碼片段以及/或外子（ex〇n)上游之5，非編碼序列而發現。此等啟動子可稱為「内生性」啟動子。同樣地，增強子可為天生與核酸序列相關者，其可位於核酸序列之下游或上游。此外，可經由在控制下將編碼序列加上重組之、合成的或異種的啟動子而獲得某些優點，亦即啟動子於其自然％境中非為天生與核酸序列相關者。重組之、合成的或異種的增強子係指該增強子於其自然環境中非為天生與核&L序列相關者。此等啟動子或增強子可包含其他基因之啟動子或增強子，以及單離自任何其他病毒、原核細胞、或真核細胞之啟動子或增強子，又非「自然產生」之啟動子或增強子，亦即包含不同轉錄調節區之不同元件以及或犬變者’可改變表現作用。例如，最常使用於重組Dna構築體之啟動子包含β-内醯胺酶（青黴素酶）、乳糖及色胺酸 (trp)啟動子系統。除了以合成方式產生啟動子及增強子之核酸序列外，亦可使用重組選殖及/或核酸增幅技術（包含 PCR™)與本文所揭示之文獻（美國專利案第4,683,2〇2與 52 200424214 5,928,906號）產生該核酸序列。再者經思忖後，亦可使用於非-核胞器（例如粒腺體、葉綠體等）中指導序列之轉錄作用及/或表現作用之控制序列。當然’重要的是於所選擇進行表現作用之胞器、細胞型態、組織、器官、或有機體中採用可有效指導DNa片段表現的啟動子及/或增強子。熟於分子生物學之人士皆明瞭利用啟動子、增強子、以及細胞型態之組合以表現蛋白質 (參見，例如（Sambrook等人，1989))。所採用之啟動子可. 為持續性的、組織-特異性的、誘發性的，及/或於適當條件馨下可指導經引入之DNA片段進行高度之表現作用，此係大規模產生重組蛋白質及/或胜肽之優點。啟動子可為外來的或内生性的。此外任何啟動子/增強子之組合（例如，真核細胞啟動子負料庫（Eukaryotic Promoter Data Base，EPDB)所揭示者）亦可用於驅動表現作用。其他具體實施例中可使用τ3、 Τ7、或SP6細胞質表現系統。若提供適合的細菌聚合酶，真核、、、田胞可支持某些細菌啟動子之細⑯質轉錄作肖，或者_ 部分遞送複合物或者其他基因表現構築體。表1及表2列出本發明中可採用之元件/啟動子的非限制實例，以調節RNA之表現。表2提供可誘發之元件的非限制實例該元件係可由特定刺激活化之核酸序列。 53 200424214 表1 啟動子及/或增強子啟動子及/或增強子相關之參考文獻 β-肌動蛋白 (Kawamoto 等人，1988 ; Kawamoto 等人，1989) 肌肉肌酸激酶（Muscle Creatine Kinase ? MCK) (Horlick 及 Benfield，1989 ; Jaynes 等人，1988) 金屬硫蛋白 (Metallothionein，MTII) (Inouye 等人，1994 ; Narum 等人，2001 ; Skroch 等人， 1993) 白蛋白 (Pinkert 等人，1987 ; Tronche 等人，1989) β -血球蛋白 (Tronche 等人，1990 ; Trudel 及 Costantini，1987) 胰島素 (German 等人，1995 ; Ohlsson 等人，1991) 大鼠之生長素 (Larsen 等人，1986) 人類血清澱粉樣蛋白A (Human Serum Amyloid A， SAA) 心肌旋轉蛋白（Troponin I， TN I) (Lin 等人，1991 ; Yutzey 及 Konieczny ， 1992) 血小板相關生長因子 (Platelet-Derived Growth Factor ，PDGF) (Pech 等人，1989) 裘馨氏肌肉萎縮症（Duchenne Muscular Dystrophy) (Klamut 等人，1990 ; Klamut 等人，1996) 巨細胞病毒 (Cytomegalovirus，CMV) (Boshart 等人，1985 ; Dorsch-Hasler 等人，1985) 合成之肌肉特異性啟動子 (c5-12, cl_28) (Draghia-Akli 等人，1999 ; Draghia-Akli 等人，2002b ; Li 等人，1999)

54 表2 元件/誘發物元件誘發物 MT II 佛波酯（Phorbol Ester)(TFA)/ 重金屬 MMTV (鼠乳腺腫瘤病毒， mouse mammary tumor virus) 糖化皮質類固醇 β-干擾素 Poly(rI)x / Poly(rc) 腺病毒5 Ε2_ E1A 膠原酵素（Collagenase) 佛波酯（ΤΡΑ) 基質溶解酵素（Stromelysin) 佛波酯（ΤΡΑ) SV40 佛波酯（ΤΡΑ) 鼠科 MX基因（Murine MX 干擾素、新城疫病毒 Gene) (Newcastle Disease Virus) GRP78基因 A23187 α-2-巨球蛋白 (α-2-Macroglobulin) IL-6 波形蛋白（Vimentin) 血清 MHC I 型基因 H-2Kb (MHC Class I Gene H-2Kb) 干擾素 HSP70 E1A，SV40 Large T 抗原增生相關蛋白（Proliferin) 佛波酯-ΤΡΑ 腫瘤壞死因子oc (Tumor Necrosis Factor a) ΡΜΑ 促曱狀腺激素a基因甲狀腺激素 200424214 組織-特異性啟動子或元件之辨識以及區別其活性之分析方法係為熟於此技藝者所知悉。此領域之非限制性實例包含人類LIMK2基因（Nomoto等人，1999)、體抑素受體 2基因（Kraus等人，1998)、鼠附睪A酸·結合基因（Lareyre 等人，1999)、人類 CD4 (Zhao-Emonet 等人，1998)、鼠 α2 (XI)膠原（Liu 等人，2000 ; Tsumaki 等人，1998)、D1A 多 55 200424214 巴胺受體基因（Lee等人，1997)、類胰島素生長因子π (Dai 等人，2001 ; Wu等人，1997)、以及人類血小板内皮細胞黏附分子-1 (Almendro等人，1996)。車父佳具體實施例中，係使用合成之肌肉啟動子，例如 SPc5-12(Li等人，1999)，其含有得自骨骼肌肌動蛋白之近端血清反應元件（SRE)、數個MEF-2位置、MEF-1位置、以及TEF-1結合位置，且該啟動子之轉錄作用效力超越自然之肌生性啟動子。此等合成性啟動子之獨特性係顯著的超越，例如，已核准之關於肌生性啟動子及其利用之專利（美國專利案第5,374,544號）或核酸序列之肌生性表現系統之專利（美國專利案第5,298,422號）。較佳具體實施例中’本發明使用之啟動子不會因内生性細胞機制或因素而停止作用或降低活性。其他元件，包含反式-作用因子結合位置以及增強子，亦可用於本發明之相關具體實施例中。另一具體實施例中，係使用自然的肌生性啟動子，且熟於此技藝者應了解如何自資料庫中取得此等啟動子，該資料庫包含美國生物技術資料中心（National Center f()r Biotechnology Informati〇n，NCBI)i 基因庫（GenBank database)或NCBI PubMed網站。熟於此技藝者明瞭可自這些資料庫獲得與本發明相關之序列或相關文獻。 III·起始訊號以及内部核糖體結合位置為了使編碼序列進行有效的轉譯作用，亦需要特定的起始訊號。這些訊號包含ATG起始密碼子或相鄰序列。亦需提供外源性轉譯作用控制訊號（包含ATG起始密碼子）。 56 200424214 熟於此技藝者可輕易地決定起始訊號且提供所需之訊號。已知編碼序列之閱讀架必須具有起始密碼子，以確保該完整的插入序列可進行轉譯作用。外源性轉譯作用控制訊號及起始密碼子可為自然產生的或是合成的。表現作用之效力可經由加入適當的轉錄作用增強子元件予以加強。本發明之某些具體實施例中，利用核糖體内入位置 (internal ribosome entry sites，IRES)產生多基因 (multigene)、或多順反子（p〇iyCistr〇nie)信息。IRES 元件可省略5’甲基化帽依賴型轉譯作用（Cap dependent translation)之核糖體掃描模式而於内部位置開始進行轉譯 (Pelletier 及 Sonenberg，1988)。如同哺乳動物之 irES (Macejak及Sarnow，1991)信息，已經揭示小核糖核酸病毒（pic〇rnavirus)家族中之兩類成員（小兒麻痺及心肌炎病毋）之 IRES 元件（Pelletier 及 Sonenberg，1 988)。IRES 元件了連接至異種之開放閱讀架（heterologous open reading frames)。可同時轉錄多個以IRES分開之開放閱讀架，而產生多順反子信息。由於IRES元件之優點，核糖體可進入各開放閱讀架以有效進行轉譯作用。因此使用單一啟動子/ 增強子轉錄單一信息，即可有效表現多個基因（參見美國專利案第 5,925,565 及 5,935,819 號）。 IV·多重選殖位置（Multiple Cloning Sites) 載體可包含MCS，其係含有多個限制酶位置之核酸區域’任何MCS皆可結合標準重組技術來切割該載體（參見，例如 ’（Carbonelli 等人，1999 ; Cocea，1997，Levenson 57 200424214 等人1998) ’以參考資料合併於本文)。「限制酶切割」係 ‘核I刀子以酵素進行之催化性切割，該酵素僅作用於核酉夂刀子中之特疋位置。許多限制酶係市售可得者。熟於此技孩者自了解此等酵素之用》。通常，係使用限制酶將載體直線化或切成片段，該酵素會切開MCs，使外來的序列能接合至載體中。「接合」係指於兩核酸片段間形成磷酸二醋鍵（Ph〇sph〇diester bond)之作用，此兩片段彼此可相鄰或不相鄰。限制酶及接合反應所涉及之技術皆為熟於重組技術者所知悉。 V.限制酶本發明之某些具體實施例中，線形DNA片段係藉由將原DNA分子以限制酶切割而產生。本文中使用之之「限制酶切割」係指該DNA以酵素進行之催化性切割，該酵素僅作用於DNA中之某些位置。此等酵素稱為限制核酸内切酶（restriction endonucleases)，以及各酵素之特定切割位置稱為限制位置（restriction site)。本文中使用之各種限制酶係市售可得者且使用由供應商規定之反應條件、輔因子、及其他需求。限制酶通常係以一個個由大寫英文字母組成之縮寫表示’該縮寫表示發現該限制酶之微生物來源，接著的數字表示特定酵素。 k ’ 1微克之質體或DN A片段係使用存於約2 〇微升緩衝液中之約1至2單位的酵素。廠商會指明個別限制酶所適合之緩衝液以及受質之量。通常係於37〇c下培養約 58 200424214 1小時，但可隨廠商之操作指南而改變。培養後，經由酚乳仿萃取以去除蛋白質或胜肽，然後經切割之核酸係自乙醇沉澱之水層中回收。進行限制酶之切割作用後可利用細菌鹼性磷酸酶將5,端磷酸鹽水解，以防止dna片段之兩限制切割端形成「環化」或形成封閉式的環，其會阻礙於限制位置插入其他DNA片段。除非另有說明，不然質體經切割後不會進行5,端去磷酸化作用。去磷酸化之程序及試劑為此技藝中所習知者。 VI·剪接位置（Splicing Sites) 夕數經轉錄之真核細胞RNA分子會進行rnA煎接以自原始的轉錄物移除内子（intron)。含有基因體真核細胞序列之載體可能需要提供以及/或接受剪接位置，以確保可適當處理轉錄物進行蛋白質表現（參見，例如，（chandler等人，1997)，以參考資料合併於本文）。 VII·終止訊號（Termination Signals) 本發明之載體或構築體一般至少包含一個終止訊號。終止5fL號」或「終止子」係包含於dna序列中，其涉及經由RNA聚合酶之RNA轉錄物之特定終止作用。因此，某些具體實施例中終止訊號係用於結束RNA轉錄物之生產。活體内需要終止子來達成所欲之RNA的成熟程度。真核細胞系統中，終止子的區域亦包括特定DNA序列以允許新的轉錄物進行位置-特異性之切割·，俾暴露出聚腺苷酸位置。此終止子對特化的内生性聚合酶發出訊號，而於轉錄物之3’端加入約200個A殘基（p〇lyA)之延伸。經 59 200424214 ρ—Α尾端修飾過之RNA分子更加穩定且可更有效地進行轉澤作肖。目&，關於真核細胞之其他具體實施例，終止子較佳包括用於切割該RNA的訊號，以及更佳為該終止子几就可促進RNA之聚腺苦酸化作用。該終止子及/或聚腺普酸位置it件可用於增強RNA的成熟程度以及減少自該組合體掃描至其他序列。本發明所使用之終止子包含本文所述之轉錄作用中任何已知之終止子，或此技藝中已知之終止子，包含但非限於例如基因之終止序列，例如牛生長素終止子或病毒之馨、、’ς止序列，例如SV4〇終止子。由於序列之截斷，某些具體實施例中’可轉錄或可轉譯之序列並不含有終止訊號。 VIII·聚腺苷酸化訊號於表現系統中，特別係真核細胞表現系統，典型地會包含聚腺苷酸化訊號以使轉錄物產生適當的聚腺苷酸化作用。咸k，自然的聚腺苷酸化訊號係成功地實行本發明之重要條件，且可採用任何一種此等之序列。較佳具體實施例匕a SV40聚腺苷酸化訊號、骨路肌肌動蛋白3，uTR · 或者人類或牛生長素聚腺苷酸化訊號，其於各種標的細胞中皆為使用方便且功能已知者。聚腺普酸化作用可增加轉錄物之穩定度或者有助於轉錄物於細胞質之運送。 IX·複製之起點（〇rigins 〇f RepUcati〇n) 為了於宿主細胞中增殖載體，可於載體中包含一或多個複製位置起點（經常稱為〇ri)，其係特殊之核酸序列，於此處開始進打複製。此外，若宿主細胞係酵母菌時，亦可 60 200424214 採用自主複製序列（autonomously replicating sequence ’ ARS) 〇 χ·選擇性及篩選性標記本發明之某些具體實施例中，含有本發明核酸構築體之細胞可經由在表現載體中含有標記而於活體外或活體内進行鑑別。此等標記會授與該細胞一種可鑑別之改變，以輕易地鑑別含有該表現載體之細胞。通常，選擇性標記係提供一種用於選擇之性質。陽性選擇性標記係指應挑選該出現該標記者，然而陰性選擇性標記係指避免挑選該出現該標記者。陽性選擇性標記之實例為藥物抗性標記。通常，藥物選擇性標記係用於轉形物之選殖及鑑別。例如，對新黴素（neomycin)、嗓呤黴素（puromycin)、濕黴素（hygromycin)、DHFR、GPT、柔新（zeocin)、及組胺醇 (histidinol)具有抗性之基因係常用之選擇性標記。除了基於所執行之條件，標記可用於識別轉形物之表現型外，亦可考慮其他類型之標§己，包含篩選性標記，例如Gfp，其係一種根據比色之分析法。此外，亦可使用篩選性酵素例如單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶（tk)或氣黴素乙醯基轉移酶 (CAT)。熟於此技藝者了解如何使用免疫標記，可能係與 FACS分析法結合。使用何種標記並不重要，只要該標記可同時與編碼基因產物之核酸一起表現即可。選擇性及篩選性標記之其他實例皆為熟於此技藝者所知悉。 XI·電穿孔法本發明之某些具體實施例巾’係利用電法將核 200424214 引入至胞器、細胞、組織、或有機體内。電穿孔法係將細胞與DNA之懸浮液暴露於高壓放電環境下。於一些變異之電穿孔法中’採用某些細胞壁分解酵素，例如果膠-分解酵素，使標的之接受細胞對電穿孔法之轉形作用較未經處理之細胞更為敏感（美國專利案第5,384,253號，以參考資料合併於本文）。此外，接受細胞亦可經機械性傷害以及其他此技藝中已知之方法處理，俾於對轉形作用較為敏感。目刖已可非常成功地利用電穿孔法進行真核細胞之轉染作用。此方法已用於將鼠pre_B淋巴細胞以人類/c -免疫球蛋白基因進行轉染（Potter等人，1984)，以及將大鼠之肝細胞以氣黴素乙醯基轉移酶基因進行轉染（Tur_Kaspa等人，1984)。咸電穿孔之基本現象於所有例子中係相同的，但疋無法說明所得到之效果的確實機制。然而不欲受限於理論’將細胞暴露於電脈衝後，電穿孔法之明顯的效果係使細胞膜對大分子瞬間變得具有穿透性。細胞壁上具有穿透之導管，其於正常情形下經由雙向離子之移動來維持靜止之穿膜電位為約90 mV。然而不欲受限於理論，電穿孔法利用相同的結構，經由對這些結構施加高離子流而使導管打開或擴大。先前技藝中，係將金屬電極與組織接觸且施加預先決定之電2、電極間之距離比例。根據式五，其中五係電場、〆係施加之電壓、以及^係電極間之距離，電穿孔法所使用^ 規格係由所得之電場強度決定。先前技龜 ^ Ύ 為了將藥物 62 200424214 或巨分子送入受者之細胞，而規劃電穿孔法規格時，電場強度五係非常重要的。此外，亦可經由施加預先決定電壓之脈衝計算各種規格下之電場強度，其中電壓係與電極間之距離成比例。然而，應注意可於組織中以絕緣電極產生電場（亦即’離子流動非為創造電場所必須）。然而不欲受限於理論，成功的電穿孔法必須具有電流而非電場本身。進行電穿孔期間’電極間的阻抗、電流區、以及脈衝持續時間皆會產生熱。熱係於組織進行電穿孔期間所產生的且衍生為電極間之電流、電壓以及脈衝期間的產物。目别電穿孔法中說明之規格係由所得之電場強度五決定，電場強度係根據未知電流之短電壓脈衝。此外，無法決定於組織中產生之阻抗或熱，阻抗或熱會導致各種不同的成功，此等成功係以預先決定之電壓加上不同脈衝電壓之電穿孔規格而成。然而不欲受限於理論，欲產生之電壓脈衝係由組織本身、所選組織之大小、以及電極間之距離而決定。因此希望電屢脈衝盡可能均句且為正確的振幅。過量的電場強度會造成細胞破裂，而低電場強度則使電穿孔效率降低。某些電穿孔裝置係利用電極間的距離計算電場強度以及預先決定之電麼脈衝。依賴於知曉電極間之距離為設計電極之限制。由於程序柝斤控制之電流脈衝控制器會決定位於兩電極間之組織之體積 ,^ Y的阻抗，故電極間之距離並非決定適當電流脈衝之重要 _ 要因素。因此交替式針狀電極陣列设计係非-對稱者。此外，无、於此技藝之人士可料智丨何數目之適當的對稱及非_ [任稱針狀電極陣列。於陣列中以 63 200424214 及所欲組織中各電極之深度應隨相對之結果而異。此外，針狀電極陣列中可加入巨分子多重注射位置。限制電極間之細胞產生熱的能力可增加所施加之電穿孔法電壓脈衝規袼的效力。例如，先前技藝中揭示使用具有六個電極之陣列，且將預先決定之電壓脈衝施加在相對應之電極對上。此方法在進行電穿孔之區域中建立一種中心化模式，其中可發展全等及交叉重疊點。細胞及組織之過量的熱會沿著電穿孔通道將細胞殺死，且限制了電穿孔法之效力。然而，非對應對之對稱性排列之針狀電極於進馨行電穿孔之區域（其中無法發展出全等電穿孔重疊點）中可產生去中心化模式。較佳係於配置針電極之電穿孔法中使用電極系統，其中電穿孔脈衝係於二或多個電極間流動，使得任兩個電極間之直流電不會通過經注射之巨分子之中 ^此法可將未經處理之細胞數，亦即未經電穿孔之細胞數降至最低以及將過度處理之細胞數，亦即遭摧毀之細胞數降至最低’同時將位於電極間之細胞數增加至最大值，使該細胞經適當的處理，亦即經電穿孔處理。 · 控制電極間之電流可決定相對之細胞熱。因此，電流可決定之後所施加之任何脈衝規格的效力而非通過電極之電壓。預先決定之電壓並不會產生預先決定之電流，且此技術之優點有限並無決定確實之電流量的裝置。此問題可藉由使用持平-電流系統予以克服，該持平_電流系統係藉由精確地控制衝擊細胞膜上導管之離子流而有效地控制電極間遞送至細月包之電流量。持平_電流系統之優點係可防止 64 200424214 受到使細胞摧毀之振幅。於預先決定電壓系統中，電流可達到毁滅性之強度，且操作者無法防止其發生。於持平-電流系統中，電流係於預先設定在閾值電位（thresh〇ld level) ’此電位下不會發生細胞死亡。電流之精確設定係根據電極之配置，且必須依照經驗決定。然而，一旦決定適當的閾值電位，可於各實例中確保細胞存活。對組織施加之確實電流量可計算為電流水準、脈衝長度、及所傳送之脈衝數之乘積。這些因素可由操作者決定且不會隨著各實例中不同組織或電極阻抗之改變而異。因此，與預先決定馨之電壓脈衝相較下，將位於兩電極間之組織中之電流控制與維持在閾值電位下，可改變脈衝條件、減少細胞熱、減少細胞死亡、以及更有效地將巨分子併入細胞中。再者，由於持平·電㈣統固有之再現性，而可於電穿孔法中發展出有效的規格。 [實施例]

下列實施例係說明本發明之較佳具體實施例。熟於技藝之人士應明瞭’實施例中所揭示之技術係表示由發人發現可於實施本發料具有良好作用者，因此經考慮後作為實施本發明之較佳模式。然而，依照本發：熟於此技藝之人士應明瞭，』於已揭不之特定具體實施 :進行多種改變，且在μ離本發明之㈣及料下仍得到同樣或類似之結果。實施例1 動物受者《職載肖之構築及方法 65 200424214 為了利用質體中介之基因補充法以治療或預防腎衰竭及其併發症，首先必須設計數種GHRH構築體。簡言之，將含有肌肉特異性合成性啟動子SPc5_ 12 (Li等人，1999) 之質體附接至野生型或類似之豬的GHRH。類似GHRH之序列係由定點突變法（site directed mutagenesis)產生，如 (Draghia-Akli等人，1999)所揭示。將編碼GHRH或其類似物之核酸序列選殖至pSPc5_12質體之BamHI/ Hindlll位置，以產生pSP-GHRH。質體中所具有之其他元件包含生長素之3’端未轉譯區。第1圖顯示該構築體所使用之獨特的核酸序列。 DNA構築體：先前已說明該含有該肌肉特異性合成性啟動子SPc5-12 (SEQID No. : 7)之質體載體（Li等人， 1999)。野生型及經突變之豬的GHRH cDNA係經由將 GHRH cDNA (SEQID No. : 9)經定點突變而產生（於活體外突變系統中改變 Sites II，Promega，Madison，WI)，且將其選殖至pSPc5-12之BamHI/ Hind III位置，俾分別產生 pSP-wt-GHRH (SEQID No· ·· 15)，或 pSP-HV-GHRH (SEQID No. : 11)。至於老鼠實驗，將含有該SPc5-12合成性啟動子之360bp的SacI/BamHI片段之質體pSPc5-12插入至 pSK-GHRH 骨幹中之 SacI/BamHI 位置（Draghia-Akli 等人， 1997)。為了產生 pSP-hGHRH(l_40)，該人類 GHRH 之 cDNA 係將人類（l-44)OH GHRH cDNA經由定點突變修飾而產生，且選殖至pSP-GHRH之BamHI/Hind III位置，接著為 hGH基因之3’端未轉譯區以及poly (A)訊號（Draghia-Akli 66 200424214 寺人，1999)。對照組之質體，pSP-p-gal，於相同之肌肉· 特異性啟動子之控制下，含有大腸桿菌卜半乳糖苷酶基因。使質體生長於大腸桿菌DH5a，（GIBCO, Grand Island， NY)。將不含内毒素（Endotoxin)之質體（Qiagen Inc， Chatsworth，CA)製劑於無菌水中稀釋成2毫克/毫升且使用前儲存於-80QC。人類生長素之3’端未轉譯區（3'UTR)係經選殖至 GHRH cDNA之下游。所得之含有經突變之GHRH編碼區之質體，以及所得之胺基酸序列並非自然地存在於哺乳動物中。然不欲受限於理論，其於治療或預防腎衰竭及其併發症之效果上，最終係取決於循環中之激素的濃度。下列列舉數種不同的質體，其可編碼出不同突變之GHRH之胺基酸序列或其生物功能等同物： i-*- 編碼之胺基酸序列

h (1-40) GHRH Ϊ AD A I F T N S Y RK V L G QL S ARK L L Q D I MS RQ Q G E S N QE RG A _ 0 Η ( S E Q I D

No . :22)

W t- GHRH YADAiFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQEQGA-OH (SEQID

No . : 10 ) hv-ghrh

TV—GHRH

HVDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-〇H (SEQI D No . : 1 )

YIDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH (SEQID No . : 2 )

YVDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH (SEQID No . : 3 )

15/27/28-GHRH YADAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH (SEQI D No . : 4 ) 一般，經編碼之GHRH或其生物功能等同物係具有下 67 200424214 式（SeqlD No· : 6):

-XpXrDAIFTNSYRKVL-Xs-QLSARKLLQDI-XcXyRQQG

E_X6-NQE-X7_GA_OH 其中：XHS胺基酸酪胺酸（“Y”）或組胺酸（“H”）之D-或 L-異構物；X2為胺基酸丙胺酸（“A”）'纈胺酸（“V”）、或異白胺酸（“I”）之D-或L-異構物；X3為胺基酸丙胺酸（“A”）或甘胺酸（“G”）之D-或L-異構物；X4為胺基酸甲硫胺酸（“μ”) 或白胺酸（“L”）之D-或L-異構物；X5為胺基酸絲胺酸（“s”) 或天冬醯胺酸（“N”）之D·或L-異構物；又6為胺基酸精胺酸 (“R”）或絲胺酸（“S”）之D-或L_異構物·，X7為胺基酸麩醯胺 (“Q”）或精胺酸（“R”）之D-或L_異構物；及其組合。其他所使用之質體包含PSP_SEAP構築體（SEQID No. : 16) ’ 其包含 SacI/ Hindlll SPc5-12 片段，SEAP 基因，以及付自 pSEAP-2 基礎載體（Basic Vector)之 SV40 3，UTR (Clontech Laboratories, Inc·; Palo Alto, CA)。上述之質體不含複接點（P〇lylinker)、JGU基因、骨路肌α-肌動蛋白啟動子或骨胳肌^ -肌動蛋白3，utr /NCR。再者，這些質體係經由肌肉注射，接著進行下述之活體内電穿孔而引入體内。至於「生物功能等同物」一詞，熟於此技藝者明瞭「生物功能等同物」蛋白質以及/或聚核苷酸之定義令所包含之觀念係指可有限制地於該分子所定義之部时進行改變，同時使f子維持可接受之相同程度的生物活性。本文中生物力*b等同物係、指具有選擇性經取代之胺基酸（或密碼子） 68 200424214 之蛋白質（與聚核苷酸）。具有GHRH之生物功能等同物的胜狀係一種多肽，該多肽係經生物工程製作而含有與 GHRH相較下同時具有相似或經改善生物活性之不同的胺

基酸序列。例如，GHRH之生物活性係於受者體内促進GH 分泌。研究：健康的狗：以4隻狗（2隻雄性以及 2雌性）作為對照組以及另外三組（每組8隻狗，4隻雄性以及4雖性）之狗係注射pSP-HV-GHRH系統。將此等狗注射載劑（對照組）或200微克、或600微克、或1000微克之 pSP_HV_GHRH，接著進行卡式電穿孔。使用30隻患有腎衰竭的狗進行GHrh研究。研究中所使用之動物其肌酸酐之值需至少為2·5毫克/ 公合（正常範圍：〇.4_18毫克/公合）以及血中尿素氮需至少為35毫克/公合（正常範圍：7_27毫克/公合）。研究中所使用之動物的平均年齡為12.6歲。將這些狗注射4〇〇微克之 pSP-HV-GHRH。此研究所含之條件為研究動物經注射後至少存活20天（此係為了使質體作用以及使ghrh自骨骼肌中表現），此時可進行第二次抽血。個時間點紀錄動物的體重以及抽血血。在治療前以及注射後數

治療之狗的一作用。飼主發現與注射前之狀態相較下，經般健康情形具有顯著的改善。 69 200424214 腎$竭H使用30隻患有腎衰竭的貓進行GHRH研究。研究中所使用之動物其肌酸酐之值需至少為3·5毫克/ 公合（正常範圍：0.8-2.3毫克/公合）以及血中尿素氮需至少為45毫克/公合（正常範圍：13·4-32·5毫克/公合）。研究中所使用之動物的平均年齡為13歲。將這些貓注射1〇〇微克之pSP-HV-GHRH。此研究所含之條件為研究動物經注射後至少存活20天（此係為了使質體作用以及使GHRH自骨絡肌中表現），此時可進行第二次抽血。在治療前以及注射後數個時間點紀錄動物的體重以及抽血。於各時間點上，經由相同的獨立實驗至（Antech Diagnostics, Irvine，CA)進行全血球計數（CBC)以及代謝分析。飼主可探視動物之健康狀况。經冶療之病患的生活品質提昇。飼主並未發現由治療法帶來的不良作用。飼主發現與注射前之狀態相較下，經治療之貓的一般健康情形具有顯著的改善。穿孔裝置：於實驗開始時使用BTX T820產生器 (BTX，division of Genetronics Inc.，CA)遞送方波脈衝 (square wave pulses)。所採用之電壓條件為15〇伏特/公分、5脈衝、每脈衝50毫秒。使用兩個針狀電極（btX，a division of Genetronics Inc·，C A)遞送活體内電脈衝。至於腎衰竭的貓與狗，係使用電動力裝置（electrokinetie device ，EKD，Advisys Inc_)，該裝置可遞送固定電流之方波。進行注射時，針頭係完全插入至肌肉内。於健康之犬科受者進行質體DNA之肌内注射：刹用四組健康之犬科（狗）受者進行生物-分布-毒理研究 70 200424214 (bio-distribution-toxicology studies)。將 28 隻狗（米格魯；

HarlanSprague-Dawley，Inc·)，約 2 歲雄性的體重約 1〇-18 公斤以及雌性的體重約7-13公斤，進行分組，其中一組有四隻動物（第I組，Group I)以及另外三組每組有八隻動物 (第II-IV組，Groups II-IV)。根據正常的生長、外觀、以及行為來選擇試驗用之健康動物。各動物於試驗前需經由實驗室之獸醫進行身體檢查。經由動物身上之記號以及籠子卡予以識別。於第93天對各組中半數的動物進行屍體檢驗（對照組2隻隻雄性（M)與一隻雌性（f)，以及於各實驗組中各取4隻經治療之動物-每組兩隻雄性與兩隻雌性）。於第1 80天對各組中另外一半的動物進行屍體檢驗（對照組 2隻-一隻雄性與一隻雌性，以及於各實驗組中各取4隻經治療之動物-每組兩隻雄性與兩隻雌性）。將不含内毒素（Endotoxin)之質體製劑於水中稀釋成2 宅克/宅升。將第II-IV組之動物以肌内注射之方式注射1X (總共0.2毫克之質體）、3X (總共0·6毫克之質體）、以及 5Χ (總共1毫克之質體）之pSP-HV-GHRH質體，接著在第〇天進行電穿孔。將第I組之動物以電穿孔處理但並未注射試驗物因而作為未處理之對照組。將狗以2毫升5〇··5〇之如右 y(Phoenix Scientific，Inc·，St· Joseph，ΜΟ)與 Κ 他命 (Abbott Laboratories，Inc·，North Chicago，IL)混合物經由肌内注射進行麻醉。所有動物在經規劃注射之區域上標明記號’俾能辨別動物以及區別該注射位置。以3/1〇 cc之胰島素庄射針筒以及 29G1/2 的針（Bee ton-Dickinson，Franklin 71 200424214

Lakes，NJ)直接將質體注射至半腱肌。注射後兩分鐘，使用 2-針電極裝置以及BTX-830電穿孔器（Genetronics，San Diego, C A)將該經注射之肌肉進行電穿孔（於第一方向給予 3脈衝，於與第一方向垂直之另一方向給予3脈衝，15〇伏特/公分，每脈衝50毫秒）。於麻醉恢復期間觀察該動物然後將動物送回籠中。垄!患有腎衰竭·之犬科或貓科受者進行皙艚DNA之齓射：_將不含内毒素之pSPc5-l2_HV_GHRH質體製劑於水中稀釋成2毫克/毫升，以及加入聚麵胺酸溶液使plg 之最終濃度為0.01毫克/毫升。此研究中之狗與貓係以異氟烷（isofluorane)麻醉（5%之濃度係用於誘導，2%之濃度係用於維持）。麻醉時，使用3/10ce之胰島素注射針筒以及 29G1/2” 的針（Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ)直接將質體注射至狗的半腱肌。注射後接著利用EKD裝置進行電穿孔。每次注射時針頭係完全插入肌肉中。待動物恢復後交還給飼主。對經楝入腫瘸之小鼠進行注射、電穿轧、以及實驗鋥座一動物需經由具有執照之獸醫或經註冊獸醫技術人員進行實驗前之身體檢查，以選擇用於進行試驗者。第_7天，紀錄所有動物的體重、抽血、以及隨機分配至實驗組與對照組（n=20/組，每種性別個1〇隻）。第_丨天，紀錄動物的體重、抽血、以及皮下注射3〇微升含2 5 χ i〇6 LL_2細胞之PBS。f 0天時以〇.5纟G.7毫升/公斤之劑量對小鼠投予麻醉劑之組合物：K他命（42·8毫克/毫升）、如若夢（82 72 200424214 毫克/毫升）、以及乙醯丙嗪（acepr〇mazine，〇 7毫克/毫升）。使用3/10 cc之注射針筒以及26孔徑的針將稀釋成最終體積為25微升之20微克質體注射至外側腓腸肌。注射後2 分鐘’使用如（Khan等人，2002)所述之BTX-T830電穿孔器以及2-針電極（BTX，San Diego，CA)將該經注射之肌肉進行電穿孔（3脈衝、150伏特/公分、50毫秒）。每週一次紀錄動物的體重以及抽血，且使用Pr〇inax NSK Electronic

Digital Calipers (Fred Fowler Co.，Newton，ΜΑ)以及 Gage Wedge for Sylvac Measuring Tools 軟體（TAL Technologies，馨

Philadelphia，PA)每週兩次評估腫瘤的體積。分別測量腫瘤之長度、寬度、以及深度然後計算腫瘤的體積。重複此實驗程序。雖然活體内電穿孔法為將核酸構築體遞送至受者之細胞中的較佳方法’而本發明用於胞器、細胞、組織、或器官之轉形作用之遞送核酸之適當方法，實際上包含任何可將核酸（例如DNA)引入胞器、細胞、組織、或器官中之方法，如本文中所述之方法或為熟於此技藝者所知悉之方# 法。此等方法包含，但非限於DNA之直接遞送，例如活體外基因治療轉染法（Nabel等人，1989; Wilson等人，1989); 經由注射（美國專利案第 5,994,624、5,981，274、5,945，100、 5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466、以及5,5 80,859號，各篇文獻皆以參考資料合併於本文），包含顯微微量注射（Harland及Weintraub，1985);美國專利案第5,789，215號，以參考資料合併於本文；經由電穿孔 73 200424214 (美國專利案第5,384,253號，以參考資料合併於本文； (Potter 等人，1984 ; Tur-Kaspa 等人，1986));經由磷酸鈣沉澱（Chen 及 Okayama，1987; Graham 及 van der Eb，1973 ; Rippe等人，1990);利用DEAE-葡萄聚糖接著利用聚乙二醇（Gopa卜1985);直接經由音波載荷（Fechheimer等人， 198 7);經由微脂粒中介之轉染作用（Hafez等人，2001 ; Hamm 等人，2002 ; Madry 等人，2001 ; Raghavachari 及 Fahl，2002 ; Wiethoff等人，2001)以及受體-中介之轉染作用（Wu及Wu，198 8a ; Wu及Wu，198 8b);經由粒子搶法 (PCT申請案wo 94/09699及95/06128 ;美國專利案第 5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,3 18、5,538,877、及5，538,880號，各篇文獻皆以參考資料合併於本文）；經由碳化石夕纖維之擾動（(Johnson等人，1992);美國專利案第 5，302,523與5，464,765號’以參考資料合併於本文）；經由農桿菌中介之轉形作用（美國專利案第5,591，616及 5，563,055號，以參考資料合併於本文）；經由peg-中介之原生質體轉形作用（Omirulleh等人，1993);美國專利案第 4,684,611及4,952,500號’以參考資料合併於本文）；經由乾燥/抑制作用（desiccation/inhibition)·中介之DNA攝入 (Potrykus等人，1985)，以及此等方法之組合。經由應用這些技術，胞器、細胞、組織、或器官可穩定地或瞬間進行轉形。缠,重數據··毒理學研究中，於執行注射/電穿孔程序前將狗稱重以及編號。注射前抽兩次血（於第-6及0天）， 74 200424214 且注射後抽六次血（於第28、56、90、120、157、及 180 天）。此研究中患有腎衰竭之動物（狗與貓）於注射質體前先稱重且在注射後數個時間點上使用相同的標準秤進行秤〇血液及尿液值：於注射質體前與前述注射質體後之時間點上收集血液及尿液樣本，且分析其生物化學、代謝及激素。將第-6及0天之平均CBC、生物化學及激素值作為每隻狗的參考基值。將全血收集於含有3.0毫克EDTA之 Monoject®紫色塞子的血液收集管中（Sherwood Medical，St. Louis，MO)且送交進行 CBC 分析（Antech Diagnostics， Irvine，CA)。將血清分成數份以進行放射免疫分析以及生化分析（Antech Diagnostics，Irvine，CA) 〇小鼠實驗之CBC及生化值：於上述研究中之屍體檢驗時，將全血收集於含有EDTA之Microtainer Brand微量採血管（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中進行 CBC 分析，以及收集於微量血清分離管（Microtainer Serum Separator，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中進行血清生化值分析。所有試驗由 IDEXX Contract Research Services (West Sacramento，CA)進行。生化分析所檢驗之參數係：ALT (丙胺酸轉胺酵素）、AST (天門冬胺酸轉胺酵素）、肌酸if激酶、白蛋白、總蛋白質、膽紅素、膽固醇、葡萄糖、鈣、磷酸鹽、重碳酸鹽、氯、鉀、以及鈉。血漿IGF-I : IGF-I濃度係由異質性人類放射免疫分析法（heterologous human radioimmunometric assay)戶斤測量 75 200424214 (Diagnostic System Lab·, Webster，TX)。此分析法之敏感性為0.8毫微克/毫升；分析内與分析間之變異分別為3.4%與 4.5%。於小鼠腫瘤植入研究中，將血清等分並使用小鼠 IGF-I 套組（Diagnostic Systems Laboratories，Inc·，Webster， TX)測量IGF-I。以相同分析法分析所有樣本，分析内之變異值為4.2%。經植入腫瘤之小鼠之屍體檢驗及組鐵病理學：於第19 天測量所有動物之體重然後使其吸入C02安樂死。取出器官（肺、心、肝、脾、腎、以及經注射之腓腸肌）、秤重、以及檢查病變程度。將腓腸肌及每一個具有肉眼可見之異常之經切下之器官於10%經緩衝之福馬林中固定一整夜，於PBS中清洗，以及轉移至70%乙醇中儲存。將腫瘤切下、秤重、於10%經緩衝之福馬林中固定一整夜、以及儲存於 70%乙醇。由領有執照之獸醫病理學家（IDEXX Laboratories， Inc·，West Sacramento，CA)對研究中之戶斤有動物（20隻經處理之動物以及20隻對照組動物）之内部器官（腦、心、肺、肝、脾、以及腎）、經注射之肌肉、以及腫瘤進行完整的組織病理檢驗。將組織包埋於石蠟以及切出5微米之中央矢狀切面。將這些切片以蘇木精/曙紅染色並以顯微鏡檢驗。解讀各動物之各個器官的一至三個切片且紀錄資料。統計資料：使用STATISTICA分析套組（StatSoft，Inc. Tulsa，OK)分析數據。於圖中顯示之數值係平均值土 s.e.m。顯著之P值係使用AN0VA比較所獲得。將P < 0.05視為統計學上具有顯著性。 76 200424214 實施例2 用於攝入DNA之低電壓電穿孔法以及於動物受者艘内之表現作用直接將質體DNA注射至骨骼肌後接著進行電穿孔係一種局部與控制質體DNA遞送的方法。其優點為可使用小量之質體（如低至0.1毫克），而非典型的被動遞送模式所需使用之大量質體。然而不欲受限於理論，藉由電穿孔法增加質體攝入之機制可能發生於新產生之細胞膜孔洞並可配合或者不配合蛋白質主動運輸。肌肉細胞之通透程度係根0 據電場強度、脈衝長度、電極之形狀與型態（Bureau等人， 2000)(Gilbert等人，1997)、以及細胞大小（Somiari等人， 2000)而定。傳統的電極型態，片狀或一對導線電極，於齧齒類中需間隔4毫米設置才有作用，但於大型_乳動物（例如豬或人）中’由於皮膚的阻抗增加、皮下脂肪組織之厚度、以及考慮到若成比例地增加電場強度對組織之傷害，而使此等型態之電極並不適用。豬或狗的肌肉纖維相當大因而較齧齒類之肌肉適合進行電通透作用參 (electropermeabilization)。此實施例顯示，於大型哺乳動物中單一注射各種劑量之GHRH或其核酸序列類似物後接著以肌肉内應用器進行電穿孔，係足以產生在生物上效果顯著之具有療效之血漿激素濃度，其可治療或預防腎衰竭、治療貧血、耗損、免疫功能障礙以及其他與腎衰竭相關之病症，並以增加慢性病患者之福利、生活品質、以及延長壽命為目的。 77 200424214 、u pSP HV-GHRH質體系統係經由活體内電穿孔法遞送至健康狗的半腱肌中。將一組(4隻狗，2隻雄性以及2 隻雌性）作為對照組以及對另外三組（每組8隻狗，4隻雄性以及4隻雌性）之狗注射pSp_HvGHRH系統與增加之全身性指標係血清中jGFj濃度的增加。因此，注射後14至18〇天，自僅注射載劑（對照組）之狗收集血清，以及自注射200微克、6〇〇微克、或1〇〇〇微克之 pSP HV_GHRH之狗收集血清，因而決定IGFq的濃度。相較於基值，將血清+ IGF-I濃度之增加視為質體GHRH作用之判斷基準（Aimaretti等人，1998; de B〇er等人，1996)。研究期間，經質體處理過之狗的IGF-I濃度增加，但由於動物間之變異並未出現顯著的不同。當各隻狗與其基值進行比較時（注射後之WF-I濃度—注射前之IGF-I濃度/注射刖之IGF-I濃度），以！毫克質體處理之組別其jgfj濃度在所有分析時間點上皆顯著的增加（第2及3圖）。於較低劑量之組別中，IGF-；[濃度之增加在注射56天後之某些試驗時間點上較為顯著。所有狗之ZGFq濃度係在正常範圍内0 相應於較高GHRH濃度而使IGF_i濃度增加係與其他利用重組之豬的GH(pGH)於狗中進行之研究結果一致。例如，於以PGH處理之狗中，與劑量相關之經增加的血清 IGF-I濃度（約2至10倍）係與昇高之血清GH濃度有關。然而不欲受限於理論，GHRH刺激腦下垂體前葉中GH 之產生及釋放，因而刺激肝及其他標的器官產生jGFq。因 78 200424214 此，增加之GHRH與GH之全身性指標係血清中igfj濃度之增加。實施例3 健康動物受者之艘重增加為了顯示濃度增加之GHRH或其生物功能等同物可改變健康之大型動物的代謝，因而測量動物之體重。研究期間，經質體-處理過之狗的體重增加，但由於動物間之變異並未出現顯著的不同。當各隻狗與其基值進行比較時（注射後之體重一注射前之體重/注射前之體重），所有經質體處理過之動物於所有時間點之分析上其體重皆顯著的增加（第4 及5圖）。這些結果指出，經注射PSP-HV-GHRH之狗的代謝改變係與注射劑量相關。此外，GHRH產量增加而造成之體重增加亦表示GH的濃度增加。此研究結果係與其他利用重組之豬的GH (pGH)於狗中進行之研究結果一致。其中一者’係對狗投予重組之PGH14星期。其中一者，係對狗投予重組之pGH達14星期。於投予中-及高-劑量之豬的之組別中，其體重分別增加2.8公斤及4.7公斤，相較於對照組及低-劑量組別，其體重分別增加0.4公斤及〇.8公斤。實施例4 以GHRH或生物等同物之處理不影響健康動物受者體内之葡萄糖代謝於Antech Diagnostic (Irvine，CA)實驗室分析前述之時間點上之生化及血液化學，亦即胰島素及促腎上腺皮層 79 200424214 激素（ACTH)之濃度。於注射前麻醉時以及第93與180天之屍體檢驗時’自各個動物收集尿液樣本且進行分析。所有數值經由實驗室之獸醫檢閱。並評估下列參數： i :澱粉酶、球蛋白、7 -麩胺醯轉化酶、總膽紅素、血液尿氮素、肌酸酐、總蛋白質、白蛋白、直接型膽紅素（direct bilirubin)、血清丙胺酸轉胺酵素、血清天門冬胺酸轉胺酵素、驗性麟酸酶、葡萄糖、無機鱗、氣、約、鈉與鉀、三酸甘油酯、以及膽固醇。立旋# :紅血球計數（RBC)、血溶比、血紅素、總白血球計數（WBC)與分化之白血球計數（嗜中性白血球、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性白血球以及嗜驗性白血球）、血小板。十數、MCV、MCH、MCHC、以及部分前凝血時間（partiai prothrombin time，PPT) 〇名漩分# :顏色、濃度、體積、葡萄糖、膽紅素、丙酮（乙醢乙酸）、比重、血液、pH、蛋白質、尿膽素原、亞硝酸鹽、白血球、以及構成要件之顯微鏡檢測。對含有8隻狗（4隻雄性以及4隻雌性）的組別分別注射 200微克、600微克以及1〇〇〇微克之pSP_HV_GHRH。對照組為含有4隻狗（2隻雄性以及2隻雌性）的組別。實驗組及對照組並未有統計上之差異性。重要地，實驗組及對照組之葡萄糖與空腹胰島素濃度皆在正常之範圍内，表示該以 pSP-HV-GHRH處理並不會損害葡萄糖代謝。實施例5 GHRH或生物等同物可增加正常健康之狗體内的紅血 200424214 球產量對含有8隻狗（4隻雄性以及4隻雌性）的組別分別注射 200微克、600微克以及1〇〇〇微克之pSp_HV-GHRH。對照組為含有4隻狗（2隻雄性以及2隻雌性）的組別。於處理後之不同時間點上’對照組與經處理之組別在數種參數上有顯著的差異。於所有經處理之動物中，其血紅素與血容比 (packed cell volume ’ PCV)顯著地增加，最小平方平均值 (least square mean)< 〇.〇5 (第6圖），但為狗之正常值。投予pSP-HV-GHRH質體後，未有狗顯示出紅血球過多症，亦即表示此種刺激GHRH/GH/IGF-I主軸之方法顧及血紅素與紅血球合成之正常生理標準。實施例6 GHRH或生物等同物之療法影饗骨骼重塑（b〇ne remodeling) 注射後180天内監測磷、鈣、以及鈣/填比。對含有8 隻狗（4隻雄性以及4隻雌性）的組別分別注射200微克、600 微克以及1000微克之PSP_HV-GHRH。對照組為含有4隻狗（2隻雄性以及2隻雌性）的組別。鈣對磷的比例為骨骼重塑之指標，於注射後180天，第IV組之狗（經1毫克GHRH-質體處理之組別）其鈣對磷的比例相對於對照組係顯著地增加（2.75 士 0.2 vs· 2.28 土 0.04, P < 0.045)。實施例7 GHRH或生物等同物之治療對與腎衰竭相關之貧血之影饗 81 200424214 於經注射之貓及狗中，早在注射質體後20天即發現貧血之改善。第7圖顯示患有慢性腎衰竭之貓經質體-中介之GHRH 治療後，其血溶比（PCV)、紅血球計數以及平均紅血球血紅素（mean red cell hemoglobin，MHC)之值。該結果係以平均士 SEM表示。經GHRH治療之貓的血溶比（PCV)分析結果為增加了 10%，*户< 0.0007，而紅血球增加了 9%，* P < 0.0006。經GHRH治療之貓的平均紅血球血紅素（MHC)增加了 2%，此反映出該循環中之鐵具有較佳利用性以及併入紅血球*户< 0.013。網狀紅血球含量顯著地增加了 200%，亦反映出造血作用受到刺激。第9圖顯示患有腎衰竭之狗經質體-中介之GHRH療法治療後血溶比（PCV)與血紅素之值。該結果係以平均土 SEM 表示。於20天之期間，經GHRH治療之狗的血溶比（PCV) 分析顯示血溶比增加了 7.8%，*尸< 0.06。於相同期間，經 GHRH治療之狗的血紅素增加了 12%，*尸< 0.05。至於以貓作為實驗動物之例中，網狀紅血球含量增加了 140%。於罹換癌症之狗的臨床前試驗中，發現早在注射質體兩星期後貧血即獲得改善。試驗開始時，病患之代謝係處於異化分解狀態（catabolic state)，其血紅素（Hb)、血溶比 (PCV)、以及紅血球（RJBC)之值顯著地低於正常的狗。注射質體後，該狗之代謝進入快速的反向狀態，且轉為生化上之合成代謝（anabolic)，以及如前述研究年輕大鼠之生長階段（生長素主軸及免疫功能）模擬快速生長過程。Hb、PVC、 82 200424214 及RBC之值增加了 1〇-25%，該數值於統計上具有顯著性，以及於治療開始後兩星期變得常態化。實驗方面之所有數值皆落於正常範圍内（RBC : 5.5-8.5百萬/毫升；血紅素： 12-18克/公合；血溶比：37_55%)。然不欲受限於理論， GHRH-GH_IGF_I為主軸之刺激作用可能於異化分解狀態中經由紅血球生成素、運鐵蛋白、以及其他相關分子刺激紅血球生成作用。當病患恢復至正常的合成代謝狀態時，該自然的GH作用會引發輕微的貧血。然而，對患有腎衰竭之病患’該疾病自然會使代謝朝向異化分解狀態發展。故應使病患之雙向代謝維持平衡。因此，應將Hb、PVC、以及RBC之值修正至正常值，但不超出正常值之上限。實施例8 GHRH或生物等同物之治療對與腎衰竭相關之耗損及異常蛋白質代謝之影蜜營養失調與耗損係決定患有慢性腎衰竭之洗腎病患發病及死亡的重要因素。即使病患具有相當輕微之慢性腎功能不足，仍會有瘦肉組織減少、骨礦物質含量降低、以及基礎能量消耗量降低等特徵（〇，Sullivail等人，2〇〇2)。第8 圖顯不患有慢性腎衰竭之貓經質體·中介之GHRH療法治療後其白蛋白以及總蛋白質之量。該結果係以平均土表示。注射後20天，經GHRH處理之貓的白蛋白分析（貓之正常值為2.4-3.5克/公合）顯示，白蛋白量增加了 14%，泞< o.ooool。同樣地，經GHRH處理之貓的總蛋白質分析（貓之正常值為5.3-8.5克/公合）顯示，總蛋白質增加了 83 200424214 9%，*户<〇·〇〇〇〇ι。治療20天後，經GHRH處理之狗亦顯示類似的結果：白蛋白量增加了 7 5%(狗之正常值為2 8_3 9 克/公合），以及總蛋白質增加了 56% (狗之正常值為57_7'6 克/公合）。這些變化皆與蛋白質代謝之改善有關，亦即病患之代謝由異化分解改變為合成代謝狀態。 ^ 實施例9 GHRH或生物等同物之治療對腎衰竭病患之腎功能的影響 c renal failure，治療人類與寵物之慢性腎衰竭（chr〇ni 任何可延緩病顯示慢性腎衰 CRF)之方法有限，通常為洗腎以及腎移植。患組織損害之辅助療法係十分重要。第1〇圖竭之狗經質體-中介之GHRH療法治療後，其血液尿素氣 (Mood urea nitrogen，BUN)以及肌酸酐之值（為腎功能之指標）。該結果係以平均：tSEM表示。經GHRH處理之狗的灰液尿素氮分析顯示，該BUN降低了 16%，以及肌酸酐濃度亦減少了 17.6%。腎小球濾'過率（肌酸肝之清除量降低血清中肌酸酐之量增加）之降低比例係、肖腎臟的存料高度相關。實施例10 GHRH或生物等同物之治療對腎衰竭病患之阶-工的影響及其結果患有慢性腎衰竭之貓與狗經質體_GHRH處理後，顯示其IGF·!濃度增加，避心為GHRH之下游作用子，此結果表示該療法對此等重病之動物係有效的。seq id : 24 84 200424214 指出猫之特異性（^刪’而犯㈣版⑺指出狗之特異性GHRH。第11圖顯示，於研究期間75%之猶與狗其胳工濃度顯著地增加，錄統計學上該增加係具有顯著性的d < 0.05)。不受限於理論，矯正此等動物之貧血之最有可能之機制並非增加之紅血球生成素(如詳述於利用生長素或其他重組蛋白質之公開文獻者)，而係增加之運鐵蛋白:、此發現係根據經治療之動物其循環鐵的濃度增加推論而得 (第12圖）。該結果係以平均土 SEM表示，〈〇 μ。實施例11 GHRH或生物等同物之治療可預防由原始疾病末期造成之腎衰竭於小鼠中投予質體GHRH可預防與腫瘤壞死晚期相關之腎功能不全。於經治療之動物中，腫瘤壞死進一步影響代謝功能。經治療之雄性與雌性動物，其血清中之bun以及肌酸酐值係落於正常範圍，而對照組之BUN以及肌酸酐值係增加的。於研究末期時，經GHRH處理之動物的血清 BUN與肌酸酐之平均濃度分別低於對照組中雄性小鼠之值之 15.0% (户 < 〇·〇4)以及 20·6% (户=〇〇25)。經 GHRH 處理之雄性動物的平均驗性磷酸酶較對照組小鼠之值低5丨. (P < 0.0002)。至於雌性小鼠，其平均血清肌酸酐，濃度較對照組之值減少26。/。。於屍體檢驗時，與經GHRH質體注射之動物相較下，對照組之雄性動物（已患有尿毒症）腎臟的重量顯著地較低。因此，具有大腫瘤之小鼠經GHRH處理後可長期保有正常之賢功能。 85 200424214 實施例12 GHRH或生物等同物之治療對腎衰竭病患之生活品質及福利之影響於Sm床研究以及病患之照顧中，逐漸重視健康相關之生活品質。許多報導係討論腎病末期之生活品質。由於貧血、耗損、免疫功能障礙、以及其他併發症，於健康相關之生活品質上之顯著的損傷為腎功能不足。由此等研究之結果指出目前臨床上著重於保存腎功能之重點可能可改善腎病對健康相關之生活品質的負面影響。飼主於每次探訪· 時會填寫生活品質問卷表。經治療之動物的活動物平均增加70%，同時食慾增加40〇/〇。實施例13 外生性GH之投予於正常動物受者造成之藥理及毒理作用由於豬的GH (pGH)於結構上與狗的gh相似，因此將 PGH用於狗以進行不同的研究。於此等研究之一者中係對狗投予PGH達14星期。豬的GH使動物的體重增加，於中φ -及高·劑量組分別為2·8公斤以及4·7公斤，相較於對照組則分別為0.4公斤與0.8公斤。於經pgh_治療之狗，發現其皮膚的厚度增加，組織學上係與皮膚膠原增加有關。並無明顯或組織形態上之證據證明水腫。於經pGH-治療之狗，其血清IGF-I濃度之增加（約2-1〇倍）係與劑量呈現相關性，而IGF-I濃度又與血清GH濃度之提昇有關。再者，於整個研究中’可見中等劑量組之動物其血清中胰島素濃 86 200424214 度之增加。於高劑量組之狗中，投予24小時後，胰島素仍維持高濃度。於經禁食之狗中，其血清葡萄糖濃度仍為控制之範圍内，且未發現與糖化血紅素濃度有關之慢性高血糖症。腎小球改變、由尿液比重降低造成顯著的多尿症、以及血清胰島素濃度增加皆顯示出該狗患有早期胰島素· 抗性糖尿病。pGH對狗之血清T3、Τ4、以及皮質醇濃度僅有微小的影響或在生物上並無顯著性的影響。於經pGH_ 處理之狗體内，其他的生化改變包含降低尿素氮與肌酸酐之值、以及增加鉀、膽固醇、以及三酸甘油酯。血清中鈣及磷&L的濃度顯著地增加且鹼性磷酸酶（骨之同功異構酶）活[生增加係與骨之組織學上的改變相關。於經處理之狗，發現正常血色素性（normochromic)貧血、正常血球性貧血非再生性貧血（nonregenemive anemia)係與劑量相關除了貧血外，上述之改變係與高劑量之GH造成之合成性代謝或異化分解性代謝有關（prahalada等人，1998)。實施例14 使用重組蛋白質形式之GHRH或其生物功能等同物治療或處理慢性腎衰竭使用重組蛋白質形式之GHRH或其生物功能等同物治療或處理慢性腎衰竭以及與此病症有關之受損之生長能力已有報導指出於慢性腎功能不足之病患中發現正常之 GHRH漢度下GH分泌之數種改變⑴心等人，19術）。通常隍丨生腎衰竭之兒童其GH主軸已改變，且此失衡之矯正作用必須達到使這些病患正常生長（Pasqualini等人， 87 200424214 1996)。使用GHRH胜肽即是用於達成此目的。crf病患中之貧血的矯正作用係由GHRH刺激後GH之較佳反應而來’進而加強生長（Cremagnani等人，1993a)。再者，亦顯示IGF-I，其為GHRH之下游作用子，可經由直接作用於腎小球血管（gl〇merular vasculature)以維持腎小球濾過作用’以及藉由於末端腎小管細胞中加強DNA合成俾加速腎小管再生（Hammerman，1999 ; Vijayan 等人，1999)。 GHRH或其生物功能等同物可直接投予至腎衰竭患者以治療腎衰竭及其併發症。將患有腎衰竭之小鼠分成兩組。處理組係對小鼠皮下注射或靜脈注射重組之GHrh胜肽。對照組係對小鼠注射載劑。注射後10天，相較於對照組，處理組之小鼠的GH濃度、體重以及體長皆增加，且腎功能亦較佳。因此，腎衰竭之小鼠經GHRH胜肽處理後顯示出其腎功能已經改善。然而，其限制條件為需要時常注射GHRH或其他重組蛋白質，典型地，病患（或病患之飼主）的服從性並不高。然不欲受限於理論’咸信增加GHRH可使GH濃度增加而足以治療腎衰竭、治療貧血、徹底改變耗損、治療免疫功能障礙以及延長腎功能不足之患者的壽命。激素（例如 GHRH與GH)經常具有複雜的回饋-調節途徑，而於慢性病症中（例如腎衰竭、癌症、或AIDS)更加複雜。於前述適當之電穿孔條件下將僅0· 1毫克之質體遞送至患者即可產生重要的生理影響而改善腎功能、治療盆血、徹底改變耗損、以及延長生病之貓或狗的壽命。此質體之數量較理論值或 88 齧齒類所使用之早b # π <十均值1耄克/公斤低100倍。不論遞送方法，腎衰竭及其併發症之治療作用係 GHRH分子存在於患者之循環系統中的結果。例如，可藉由傳統的重組蛋白質療法或核酸轉移，將適量的GHRH或其類似物遞送至患者體内而得到相同的結果。然而，將核酸序列遞送至患者之細胞中之方法係高度依據特定疾病以及該編碼基因而定。此外，成功的質體_中介之補充作用需要準確地將編碼序列遞送至患者之細胞中，使該基因表現之產物於適當濃度下可產生生物上之效果。治療的持續時間將根據疾病進程而延長，且可能持續下去。熟於此技藝者可輕易地明白本發明完全適用於實行本發明之目的且可得到結果以及前述之優點。本文所述之方法、過程、技術、以及套組係較佳具體實施例之代表，且係作為示例用並不限於本文所示例之範圍。熟於此技藝之人士對本發明進行之修飾及其他用法皆包含於本發明之精神或所界定之範疇下。 [圖式簡單說明] 本說明書中所包含之下列圖式係用於進一步說明本發明之某些觀點。可藉由參照一或多個此等圖式以及說明書中特定具體實施例之詳細說明而更佳了解本發明。第1圖顯示GHRH及其生物等同物之胺基酸序列。第2圖顯示經注射不同濃度之pSP-HV-GHRH質體之健康的狗體内之IGF-I濃度。第3圖顯示經質體-中介的GHRH療法處理過之正常健 200424214 康的狗，其血清中之IGF-Ι濃度。該結果係以平均值±SEM 表示。各組群及時間點中包含尸值與相對之IGF-I濃度。第4圖顯示經注射不同濃度之pSP-HV-GHRH質體之健康的狗，其體重之增加。第5圖顯示經質體-中介的GHRH療法處理過之正常健康的狗之體重（公斤）。該結果係以平均值±SEM表示。各組群及時間點中包含P值與相對之基值體重。第6圖顯示經質體-中介的GHRH療法處理過之正常健康的狗之血紅素及血球比容（PC V)。該結果係以平均值土 SEM表示。A圖中以0.2毫克處理之狗，其血紅素最小平方平均分析（Least square mean analysis)之 * 户<0.002，以〇·6毫克處理之狗#尸<0.0001，以及以1毫克處理之狗§ 尸<0.05。B圖中以0.2毫克處理之狗，其PCV最小平方平均分析之*尸<0.01，以0.6毫克處理之狗#尸<0·0001，以及以1毫克處理之狗§尸<〇·025。第7圖顯示患有慢性腎衰竭而經質體-中介的GHRH療法治療之貓的血球比容（PC V)、紅血球總數、以及平均紅血球血紅素（MCH)。該結果係以平均值±SEM表示。A圖中，關於經GHRH治療之貓的血球比容（PCV)之分析，其* Ρ<0·0007。B圖中，關於經GHRH治療之貓的紅血球之分析，其*户<0.0006。C圖中，關於經GHRH治療之貓的平均紅血球血紅素（MCH)之分析，其*尸<0.013。第8圖顯示患有慢性腎衰竭而經質體-中介的GHRH療法治療之貓的白蛋白及總蛋白質之值。該結果係以平均值土 90 200424214 SEM表示。A圖中，關於經GHRH治療之貓的白蛋白之分析，其*尸<0.00001。B圖中，關於經GHRH治療之貓的總蛋白質之分析，其* Ρ<〇.00001。第9圖顯示患有慢性腎衰竭而經質體·中介的GHRH療法治療之狗的血球比容（PCV)以及紅血球總數。該結果係以平均值土SEM表示。Α圖中，關於經GHRH治療之狗的血球比容（PCV)之分析，其*尸<0.06。B圖中，關於經GHRH 治療之狗的紅血球之分析，其*户<0.05。第1 〇圖顯示患有慢性腎衰竭而經質體-中介的GHRH 療法治療之狗的血液尿素氮（blood urea nitrogen)以及肌酸酐之值。該結果係以平均值土SEM表示。A圖中，關於經 GHRH治療之狗的血液尿素氮（BUN)之分析顯示，BUN降低了 1 6%。B圖中，關於經GHRH治療之狗的肌酸酐之分析顯示，肌酸酐濃度降低了 17.6%。第11圖顯示患有慢性腎衰竭而經質體-中介的GHRH 療法治療之貓與狗的IGF-I濃度。該結果係以平均值±SEM 表示。A圖中，有75%之經GHRH治療之貓於GHRH治療後之20至75天，其IGF-I的濃度增加（*户<0.05)。B圖中，有75%之經GHRH治療之狗於GHRH治療後之20至75天，其IGF-I的濃度增加（*户<0.05)。第1 2圖顯示患有慢性腎衰竭而經質體-中介的GHRH 療法治療之狗，其循環中之鐵的濃度。該結果係以平均值土 SEM表示。於經質體·中介的GHRH治療之狗，其循環中之鐵的濃度有顯著的改善（*户<〇.〇5)。 91 200424214 參考文獻以下參考文獻僅為本說明書的示範性補充，它們藉由參考方式被併入本案。美國專利文件 U.S. Patent No. 6,274,158 issued on August 14,2001 with Czeizler et al listed as inventors. U.S. Patent No. 6,177,554 issued on January 23, 2001 with Woo, et ah listed as inventors. U.S. Patent No. 5,994,624 issued on November 30,1999 with Trolinder 5 et al as inventors. U.S. Patent No. 5,981,274 issued on November 9? 1999 with Tyrrell ? et al as inventors. U.S. Patent No. 5,955,365 issued on September 21,1999 with Szoka5 et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,945,100 issued on August 3151999 with Fick as inventor. U.S. Patent No. 5,935,819 issued on August 10,1999 with Eichner, et al listed as inventors. U.S. Patent No. 5,928,906 issued on July 27,1999 with Koster, et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,925,565 issued on July 20,1999 with Berlioz, et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,847,066 issued on December 8,1998 with Coy et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,846,936 issued on December 8,1998 with Felix et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,846,528 issued on December 8, 1997 with Podsakoff et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,792,747 issued on August 115 1998 with Schally et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,789,215 issued on August 4,1998 with Bems, etal. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,780,448 issued on July 14,1998 with Davis as inventor. U.S. Patent No. 5,776,901 issued on July 75 1 998 with Bowers et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,736,524 issued on April 7,1998 with Content et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,704,908 issued on January 6,1998 with Hofinann et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,702,932 issued on December 30, 1997 with Hoy et al. listed as inventors. 92 200424214 U.S. Patent No. 5,696,089 issued on December 9,1997 with Felix et ah listed as inventors. U.S. Patent No. 5,656,610 issued on August 12,1997 with Shuler etaL listed as inventors. U.S. Patent No. 5,610,042 issued on March 11,1997 with Chang et ah listed as inventors. U.S. Patent No. 5,591,616 issued on January 7,1997 with Hiei et ah listed as inventors. U.S. Patent No. 5,589,466 issued on December 31, 1996 with Feigner et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,580,859 issued on December 3,1996 with Feigner et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,563,055 issued on October 8, 1996 with Townsend et al listed as inventors. U.S. Patent No. 5,550,318 issued on August 27,1996 with Adams et ah listed as inventors. U.S. Patent No. 5,538,880 issued on July 23,1996 with Lundquist et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,538,877 issued on July 23,1996 with Lundquist et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,486,505 issued on January 23,1996 with Bowers et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,464,765 issued on November 7? 1995 with Coffee et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,439,440 issued on August 8,1995 with Hofinann listed as inventor. U.S. Patent No. 5,384,253 issued on January 24,1995 with Krzyzek et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,374,544 issued on December 20, 1994 with Schwartz et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,322,783 issued on June 21,1994 with Tomes et al listed as inventors. U.S. Patent No. 5,302,523 issued on April 12,1994 with Coffee et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,298,422 issued on March 29,1994 with Schwartz et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,292,721 issued on March 8,1994 with Boyd et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,137,872 issued on August 11,1992 with Seely et al listed as inventors. U.S. Patent No. 5,134.120 issued on July 28,1992 with Boyd et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 5,084,442 issued on January 28,1992 with Felix et al. listed as inventors. 93 200424214 U.S. Patent No. 5,061?690 issued on October 29, 1991 with Kann et ah listed as inventors. U.S. Patent No. 5,036,045 issued on July 30,1991 with Thomer listed as the inventor. U.S. Patent No. 5,023,322 issued on June 1151991 with Kovacs et al listed as inventors. U.S. Patent No. 45956?288 issued on September 11,1990 with Barsoum listed as inventor. U.S. Patent No. 4,952,500 issued on August 28,1990 with Finnerty et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 4,839,344 issued on June 13,1989 with Bowers et al. listed as inventors.

U.S. Patent No. 4,833,166 issued on May 23,1989 with Grosvenor et ah listed as inventors. U.S. Patent No. 4,684,611 issued on August 4? 1987 with Schilperoort et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 4,683,202 issued on July 28? 1987 with Mullis listed as inventor. U.S. Patent No. 4?410?512 issued on October 18? 1983 with Bowers et al. listed as inventors. U.S. Patent No. RE33,699 issued on September 24? 1991 with Drengler listed as the inventor. U.S. Patent No. 4,228,158 issued on October 14,1980 with Momany et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 4,228,156 issued on October 14, 1980 with Momany et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 4,226,857 issued on October 7,1980 with Momany et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 4,224,316 issued on September 23, 1980 with Momany et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 4,223,021 issued on September 16, 1980 with Momany et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 4,223,020 issued on September 16, 1980 with Momany et al. listed as inventors. U.S. Patent No. 4,223,019 issued on September 165 1980 with Momany et al listed as inventors. 94 200424214 文獻

Aihara, H. and J. Miyazaki. 1998. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nat. Biotechnol. 16:867-870.

Aimaretti, G., G. Cornell, P. Razzore, S. Bellone, C. BafFoni, J. Bellone, F. Camanni, and E. Ghigo. 1998. Usefulness of IGF-I assay for the diagnosis of GH deficiency in adults. J. Endocrinol. Invest 21:506-511.

A1 Suwaidi, J.? D. N. Reddan, K. Williams, K. S. Pieper, R. A. Harrington, R. M. Califf, C. B. Granger, E. M. Ohman, and D. R. Holmes, Jr. 2002. Prognostic implications of abnormalities in renal function in patients with acute coronary syndromes. Circulation 106:974-980.

Almendro, N.? T. Bellon, C. Rius, P. Lastres, C. Langa, A. Corbi, and C. Bemabeu. 1996. Cloning of the human platelet endothelial cell adhesion molecule-1 promoter and its tissue-specific expression. Structural and functional characterization. J. Immunol. 157:5411-5421.

Aratani, Y.5 R. Okazaki, and H. Koyama. 1992. End extension repair of introduced targeting

vectors mediated by homologous recombination in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 20:4795-4801.

Argente, J.5 J. Pozo, and J. A. Chowen. 1996. The growth hormone axis: control and effects. Hormone Research 45 Suppl 1:9-11.

Barber, M. D.5 J. A. Ross, and K. C. Fearon. 1999. Cancer cachexia. Surg. Oncol. 8:133-141. Bartlett, D. L.? S. Charland, and Μ. H. Torosian. 1994. Growth hormone, insulin, and somatostatin therapy of cancer cachexia. Cancer 73:1499-1504.

Bercu, B. B., R. F. Walker, 1997. Growth Hormone Secretagogues In Children With Altered Growth. Acta Paediatrica 86:102-106. 95 200424214

Bettan，M·，F. Emmanuel，R. Darteil，J. M. Caillaud，F. Soubrier，R Delaere，D. Branelec，A. Mahfoudi, N. Duverger, and D. Scherman. 2000. High-level protein secretion into blood circulation after electric pulse-mediated gene transfer into skeletal muscle. Mol. Ther. 2:204-210.

Blethen, S. L. 1995. Complications of growth hormone therapy in children. Curr. Opin.

Pediatr. 7:466-471.

Blethen, S. L. and Μ. H. MacGillivray. 1997. A risk-benefit assessment of growth hormone

use in children. Drug Saf 17:303-316.

Blethen, S. L. and A. C. Rundle. 1996. Slipped capital femoral epiphysis in children treated with growth hormone. A summary of the National Cooperative Growth Study experience.

Horm. Res. 46:113-116.

Bohlen，P·，F· Esch，P· Brazeau，N. Ling，and R. Guillemin. 1983. Isolation and characterization of the porcine hypothalamic growth hormone releasing factor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 116:726-734.

Boshart, M.5 F. Weber, G. Jahn? K. Dorsch-Hasler, B. Fleckenstein, and W. Schaffiier. 1985. A

very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell 41:521-530.

Braun, W. E. 2002. Update on kidney transplantation: increasing clinical success, expanding waiting lists. Cleve. Clin. J Med. 69:501-504.

Bureau, M. F.? J. Gehl, V. Deleuze, L. M. Mir, and D. Scherman. 2000? Importance of association between permeabilization and electrophoretic forces for intramuscular DNA electrotransfer. Biochim. Biophys. Acta 1474:353-359.

Carbonelli, D. L., E. Corley, M. Seigelchifer, and J. Zorzopulos. 1999. A plasmid vector for isolation of strong promoters in Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 177:75-82. 96 200424214

Chandler，S. D” A. Mayeda, J. M. Yeakley，A. R. Krainer，and X. D. Fu. 1997. RNA splicing specificity determined by the coordinated action of RNA recognition motifs in SR proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94:3596-3601.

Chen, C. and H. Okayama. 1987. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol. Cell Biol 7:2745-2752.

Chen, Y., F. C. Fervenza, and R. Rabkin. 2001. Growth factors in the treatment of wasting in kidney failure. J Ren Nutr. 11:62-66.

Chevalier, R. L., S. Goyal, A. Kim, A. Y. Chang, D. Landau, and D. LeRoith. 2000. Renal tubulointerstitial injury from ureteral obstruction in the neonatal rat is attenuated by IGF-1. Kidney Int. 57:882-890.

Christ，E. R·，Μ· H· Cummings，N. B· Westwood，B_ M· Sawyer，T· C· Pearson，P· H· Sonksen， and D. L. Russell-Jones. 1997. The importance of growth hormone in the regulation of erythropoiesis，red cell mass，and plasma volume in adults with growth hormone deficiency. J. Clin. Endocrinol. Metab 82:2985-2990.

Claustres, M.? P. Chatelain, and C. Sultan. 1987. Insulin-like growth factor I stimulates human erythroid colony formation in vitro. J Clin. Endocrinol. Metab 65:78-82.

Cocea, L. 1997. Duplication of a region in the multiple cloning site of a plasmid vector to enhance cloning-mediated addition of restriction sites to a DNA fragment. Biotechniques 23:814-816.

Corpas, E., S. M. Harman, M. A. Pineyro, R. Roberson, and M. R. Blackman. 1993.

Continuous subcutaneous infusions of growth hormone (GH) releasing hormone 1-44 for 14 days increase GH and insulin-like growth factor-I levels in old men. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 76:134-138.

Correa, P. N.5 D. Eskinazi, and A. A. Axelrad. 1994. Circulating erythroid progenitors in 97 200424214 polycythemia vera are hypersensitive to insulin-like growth factor-1 in vitro: studies in an improved serum-free medium. Blood 83:99-112.

Cremagnani, L.5 L. Cantalamessa, A. Orsatti, L. Vigna, F. Vallino, and G. Buccianti. 1993a. Recombinant human erythropoietin (rhEPO) treatment potentiates growth hormone (GH) response to growth hormone releasing hormone (GHRH) stimulation in hemodialysis patients [see comments]. Clinical Nephrology 39:282-286.

Cremagnani, L., L. Cantalamessa, A. Orsatti, L. Vigna, F. Vallino, and G. Buccianti. 1993b. Recombinant human erythropoietin (rhEPO) treatment potentiates growth hormone (GH) response to growth hormone releasing hormone (GHRH) stimulation in hemodialysis patients. Clin. Nephrol. 39:282-286.

Crook, E. D., D. O. Washington, and J. M. Flack. 2002. Screening and prevention of chronic kidney disease. J. Natl. Med. Assoc. 94:55S-62S.

Dai, B.? H. Wu5 E. Holthuizen, and P. Singh. 2001. Identification of a novel cis element required for cell density-dependent down-regulation of insulin-like growth factor-2 P3 promoter activity in Caco2 cells. J. Biol. Chem. 276:6937-6944.

Danko, I. and J. A. Wolff. 1994. Direct gene transfer into muscle. [Review]. Vaccine 12:1499-1502.

Darquet, A. Μ., B. Cameron, P. Wils5 D. Scherman, and J. Crouzet. 1997. Anew DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle. Gene Ther. 4:1341-1349.

Darquet, A. M.? R. Rangara, P. Kreiss, B. Schwartz, S. Naimi, P. Delaere, J. Crouzet, and D. Scherman. 1999. Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther. 6:209-218.

Davis, H. L.5 R. G. Whalen, and B. A. Demeneix. 1993. Direct gene transfer into skeletal muscle in vivo: factors affecting efficiency of transfer and stability of expression. Human 98 200424214

Gene Therapy 4:151-159.

Davis, M. P. and D. Dickerson. 2000. Cachexia and anorexia: cancer's covert killer. Support. Care Cancer 8:180-187. de Boer，H·，G. J. Blok，C. Popp-Snijders, L. Stuurman，R. C. Baxter，and d. Van，V· 1996. Monitoring of growth hormone replacement therapy in adults, based on measurement of serum markers. J. Clin. Endocrinol. Metab 81:1371-1377.

Diez, J.5 P. Iglesias, J. Sastre, J. Mendez, R. Selgas, and A. Gomez-Pan. 1996a. Growth hormone responses to growth hormone-releasing hormone and clonidine before and after erythropoietin therapy in CAPD patients. Nephron 74:548-554.

Diez, J.? P. Iglesias, J. Sastre, J. Mendez, R. Selgas, and A. Gomez-Pan. 1996b. Growth hormone responses to growth hormone-releasing hormone and clonidine before and after erythropoietin therapy in CAPD patients. Nephron 74:548-554.

Diez? J. J.? P. Iglesias, A. Aguilera, M. A. Bajo, and R. Selgas. 1999a. Effects of cholinergic muscarinic blockade on growth hormone responses to growth hormone-releasing hormone in uraemic patients. Nephrol. Dial. Transplant. 14:1704-1709.

Diez，J. J” P· Iglesias，J· Sastre，A. Aguilera，M. A. Bajo, J. Mendez，P· A· Gomez，and R. Selgas. 1999b. Long-term effects of recombinant human erythropoietin therapy on growth hormone secretion in uremic patients undergoing peritoneal dialysis. Metabolism 48:210-216.

Dolnik, V.5 M. Novotny, and J. Chmelik. 1993. Electromigration behavior of poly-(L-glutamate) conformers in concentrated polyacrylamide gels. Biopolymers 33:1299-1306.

Dorsch-Hasler，K.，G· M. Keil，F. Weber，M. Jasin，W. Schafiher，and U. H. Koszinowski. 1985. A long and complex enhancer activates transcription of the gene coding for the 99 200424214 highly abundant immediate early mRNA in murine cytomegalovirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 82:8325-8329.

Draghia-Akli? R.? M. L. Fiorotto, L. A. Hill, P. B. Malone, D. R. Deaver, and R. J. Schwartz. 1999. Myogenic expression of an injectable protease-resistant growth hormone-releasing hormone augments long-term growth in pigs. Nat. Biotechnol. 17:1179-1183. Draghia-Akli, R.? A. S. Khan? K. K. Cummings, D. Parghi, R. H. Carpenter, and P. A. Brown. 2002a. Electrical Enhancement of Formulated Plasmid Delivery in Animals. Technology in Cancer Research & Treatment 1:365-371.

Draghia-Akli? R.? X. G. Li? and R. J. Schwartz. 1997. Enhanced growth by ectopic expression of growth hormone releasing hormone using an injectable myogenic vector. Nat. Biotechnol. 15:1285-1289.

Draghia-Akli，R·，P. B. Malone，L. A. Hill，K. M. Ellis，R. J. Schwartz，and J· L· Nordstrom. 2002b· Enhanced animal growth via ligand-regulated GHRH myogenic-injectable vectors. FASEB J. 16:426-428.

Dubreuil，P·，D· Petitclerc，G· Pelletier，P. Gaudreau，C. Farmer，Mowles，TF，and P· Brazeau.

1990. Effect of dose and frequency of administration of a potent analog of human growth hormone-releasing factor on hormone secretion and growth in pigs. Journal of Animal

Science 68:1254-1268.

Duck, S. C., Η. P. Schwarz, G. Costin, R. Rapaport, S. Arslanian, A. Hayek, M. Connors, and J. Jaramillo. 1992. Subcutaneous growth hormone-releasing hormone therapy in growth hormone-deficient children: first year of therapy. Journal of Clinical Endocrinology &

Metabolism 75:1115-1120.

Elliott, J.? J. M. Rawlings, P. J. Markwell, and P. J. Barber. 2000. Survival of cats with naturally occurring chronic renal failure: effect of dietary management. J Small Anim 100 200424214

Pract. 41:235-242.

Esch，F. S.，P. Bohlen，N. C. Ling，P. E. Brazeau，W. B. Wehrenberg, Μ· 0· Thomer，M. J. Cronin, and R. Guillemin. 1982. Characterization of a 40 residue peptide from a human pancreatic tumor with growth hormone releasing activity. Biochemical & Biophysical Research Communications 109:152-158.

Evans, W. S., M. L. Vance, D. L. Kaiser, R. P. Sellers, J. L. Borges, T. R. Downs, L. A. Frohman, J. Rivier, W. Vale, and M. O. Thomer. 1985. Effects of intravenous, subcutaneous, and intranasal administration of growth hormone (GH)-releasing hormone-40 on serum GH concentrations in normal men. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 61:846-850.

Fechheimer, M.? J. F. Boylan, S. Parker, J. E. Sisken, G. L. Patel, and S. G. Zimmer. 1987. Transfection of mammalian cells with plasmid DNAby scrape loading and sonication loading. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 84:8463-8467.

Fervenza, F. C., Μ. M. Friedlaender, J. O. Ike5 and R. Rabkin. 1998. Insulin-like growth factor-I treatment to enhance renal function in advanced chronic renal failure. Ren Fail. 20:349-356.

Fewell，J· G·，F. MacLaughlin，V· Mehta，M· Gondo, F. Nicol，E. Wilson, and L· C· Smith. 2001. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Mol. Ther. 3:574-583.

Franssen, F. M.5 E. F. Wouters, and A. M. Schols. 2002. The contribution of starvation, deconditioning and ageing to the observed alterations in peripheral skeletal muscle in chronic organ diseases. Clin. Nutr. 21:1-14.

Frohman, L. A.5 T. R. Downs, E. P. Heimer, and A. M. Felix. 1989. Dipeptidylpeptidase IV and trypsin-like enzymatic degradation of human growth hormone-releasing hormone in 101 200424214 plasma. J. Clin. Invest. 83:1533-1540.

Frohman, L. A., J. L. Thominet, C. B. Webb, M. L. Vance, H. Uderman, J. Rivier, W. Vale, and M. O. Thomer. 1984. Metabolic clearance and plasma disappearance rates of human pancreatic tumor growth hormone releasing factor in man. J. Clin. Invest. 73:1304-1311.

Fryer, A. D. and D. B. Jacoby. 1993. Effect of inflammatory cell mediators on M2 muscarinic receptors in the lungs. Life Sci. 52:529-536.

Gehl, J.? T. Skovsgaard, and L. M. Mir. 1998. Enhancement of cytotoxicity by

electropermeabilization: an improved method for screening drugs. Anticancer Drugs 9:319-325.

Gehl, J.5 T. H. Sorensen, K. Nielsen, P. Raskmark, S. L. Nielsen, T. Skovsgaard, and L. M. Mir. 1999. In vivo electroporation of skeletal muscle: threshold, efficacy and relation to electric field distribution. Biochim. Biophys. Acta 1428:233-240.

German，M·，S. Ashcroft，K. Docherty，H. Edlund，T. Edlund，S. Goodison，H. Imura，G· Kennedy, O. Madsen, D. Melloul, and. 1995. The insulin gene promoter. A simplified nomenclature. Diabetes 44:1002-1004.

Gilbert, R. A., M. J. Jaroszeski, and R. Heller. 1997. Novel electrode designs for electrochemotherapy. Biochim. Biophys. Acta 1334:9-14.

Gopal, T. V. 1985. Gene transfer method for transient gene expression, stable transformation, and cotransformation of suspension cell cultures. Mol. Cell Biol. 5:1188-1190.

Graham, F. L. and A. J. van der Eb. 1973. Transformation of rat cells by DNA of human adenovirus 5. Virology 54:536-539.

Guillemin, R.5 P. Brazeau, P. Bohlen, F. Esch, N. Ling, and W. B. Wehrenberg. 1982. Growth hormone-releasing factor from a human pancreatic tumor that caused acromegaly·

Science 218:585-587. 102 200424214

Hafez, I. M.? N. Maurer, and P. R. Cullis. 2001. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Ther. 8:1188-1196.

Hamm, A., N. Krott, I. Breibach, R. Blindt, and A. K. Bosserhoff. 2002. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng 8:235-245.

Hammerman, M. R. 1999. The growth hormone-insulin-like growth factor axis in kidney re-revisited. Nephrol. Dial. Transplant. 14:1853-1860.

Hansen, R. D.? C. Raja, and B. J. Allen. 2000. Total body protein in chronic diseases and in aging. Ann. N. Y. Acad. Sci 904:345-52.:345-352.

Harland, R. and H. Weintraub. 1985. Translation of mRNA injected into Xenopus oocytes is specifically inhibited by antisense RNA. J. Cell Biol. 101:1094-1099.

Heller, R., M. J. Jaroszeski, L. F. Glass, J. L. Messina, D. P. Rapaport, R. C. DeConti, N. A. Fenske, R. A. Gilbert, L. M. Mir, and D. S. Reintgen. 1996. Phase I/II trial for the treatment of cutaneous and subcutaneous tumors using electrochemotherapy. Cancer 77:964-971.

Herzog, R. W.? J. D. Mount, V. R. Arruda, K. A. High, and C. D. Lothrop, Jr. 2001.

Muscle-directed gene transfer and transient immune suppression result in sustained partial correction of canine hemophilia B caused by a null mutation· Mol· Ther. 4:192-200.

Horlick, R. A. and P. A. Benfield. 1989. The upstream muscle-specific enhancer of the rat muscle creatine kinase gene is composed of multiple elements. Mol. Cell Biol. 9:2396-2413.

Hostetter, T. H. and M. Lising. 2002. National Kidney Disease Education Program. J. Natl. Med. Assoc. 94:72S-75S.

Hughes, K. L.5 M. R. Slater, S. Geller, W. J. Burkholder, and C. Fitzgerald. 2002. Diet and 103 200424214 lifestyle variables as risk factors for chronic renal failure in pet cats. Prev. Vet. Med. 55:1-15.

Inouye, C.5 P. Remondelli, M. Karin, and S. Elledge. 1994. Isolation of a cDNA encoding a metal response element bhding protein using a novel expression clodng procedm^e: one hybrid system. DNA Cell Biol. 13:731-742.

Inouye, S., A. Nakazawa, and T. Nakazawa. 1985. Determination of the transcription initiation site and identification of the protein product of the regulatory gene xylR for xyl operons

on the TOL plasmid. J. Bacteriol. 163:863-869.

Jacob，F.，D. J. Polzin，C. A. Osbome，T. A. Allen，C. A. Kirk，J. D. Neaton，C. Lekcharoensuk， and L. L. Swanson. 2002. Clinical evaluation of dietary modification for treatment of spontaneous chronic renal failure in dogs. J Am. Vet. Med. Assoc. 220:1163-1170.

Jardieu, P.5 R. Clark, D. Mortensen, and K. Dorshkind. 1994. In vivo administration of insulin-like growth factor-I stimulates primary B lymphopoiesis and enhances lymphocyte recovery after bone marrow transplantation. J Immunol. 152:4320-4327.

Jaynes，J· B·，J· E. Johnson，J. N. Buskin，C· L· Gartside，and S· D· Hauschka· 1988. The muscle creatine kinase gene is regulated by multiple upstream elements，including a

muscle-specific enhancer. Mol. Cell Biol. 8:62-70.

Johnson, N. F.? M. D. Hoover, D. G. Thomassen, Y. S. Cheng, A. Dailey, and A. L. Brooks. 1992. In vitro activity of silicon carbide whiskers in comparison to other industrial fibers using four cell culture systems. Am. J. Ind. Med. 21:807-823.

Kawamoto, T.? K. Makino, H. Niwa, H. Sugiyama, S. Kimura, M. Amemura, A. Nakata, and T.

Kakunaga. 1988. Identification of the human beta-actin enhancer and its binding factor. Mol. Cell Biol. 8:267-272.

Kawamoto, T.? K. Makino? S. Orita, A. Nakata, and T. Kakunaga. 1989. DNA bending and 104 200424214 binding factors of the human beta-actin promoter. Nucleic Acids Res. 17:523-537.

Khan，A. S.，M. L. Fiorotto, L. A. Hill，P. B. Malone，K. K. Cummings，D. Parghi，R. J. Schwartz, R. G. Smith, and R. Draghia-Akli. 2002. Nonhereditary enhancement of progeny growth. Endocrinology 143:3561-3567.

Klamut, H. J.5 L. O. Bosnoyan-Collins, R. G. Worton, P. N. Ray, and H. L. Davis. 1996. Identification of a transcriptional enhancer within muscle intron 1 of the human dystrophin gene. Hum. Mol. Genet. 5:1599-1606.

Klamut, H. J.5 S. B. Gangopadhyay, R. G. Worton, and P. N. Ray. 1990. Molecular and functional analysis of the muscle-specific promoter region of the Duchenne musciilar dystrophy gene. Mol. Cell Biol. 10:193-205.

Kraus，J” M. Woltje，N· Schonwetter，and V. Hollt· 1998· Alternative promoter usage and tissue specific expression of the mouse somatostatin receptor 2 gene. FEBS Lett. 428:165-170.

Kurtz, A.? W. Jelkmann, and C. Bauer. 1982. A new candidate for the regulation of erythropoiesis. Insulin-like growth factor I. FEBS Lett. 149:105-108.

Kurtz, A.? R. Matter, K. U. Eckardt, and J. Zapf. 1990. Erythropoiesis, serum erythropoietin, and serum IGF-I in rats during accelerated growth. Acta Endocrinol. (Copenh) 122:323-328.

Lareyre，J. J.，T. Z. Thomas，W. L. Zheng，S· Kasper，D. E. Ong，M. C. Orgebin-Crist，and R. J. Matusik. 1999. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. J. Biol. Chem. 274:8282-8290.

Larsen, P. R.? J. W. Hamey, and D. D. Moore. 1986. Sequences required for cell-type specific 200424214 thyroid hormone regulation of rat growth hormone promoter activity. J. Biol. Chem. 261:14373-14376.

LeBrun, C. J.? L. F. Diehl, K. C. Abbott, P. G. Welch, and C. M. Yuan. 2000. Life expectancy benefits of cancer screening in the end-stage renal disease population. Am. J. Kidney Dis. 35:237-243.

Lee? S. H.? W. Wang, S. Yajima, P. A. Jose, and Μ. M. Mouradian. 1997. Tissue-specific promoter usage in the D1A dopamine receptor gene in brain and kidney. DNA Cell Biol. 16:1267-1275.

Lesbordes, J. C.5 T. Bordet, G. Haase, L. Castelnau-Ptakhine, S. Rouhani, H. Gilgenkrantz, and A. Kahn. 2002. In vivo electrotransfer of the cardiotrophin-1 gene into skeletal muscle slows down progression of motor neuron degeneration in pmn mice. Hum. Mol. Genet. 11:1615-1625.

Levenson, V. V.? E. D. Transue, and I. B. Roninson. 1998. Internal ribosomal entry site-containing retroviral vectors with green fluorescent protein and drug resistance markers. Hum. Gene Ther. 9:1233-1236.

Levin, A. 2001. Identification of patients and risk factors in chronic kidney disease-evaluating risk factors and therapeutic strategies. Nephrol. Dial. Transplant. 16 Suppl 7:57-60.:57-60.

Li, C.5 S. Ke5 Q. P. Wu? W. Tansey, N. Hunter, L. M. Buchmiller, L. Milas, C. Chamsangavej, and S. Wallace. 2000. Tumor irradiation enhances the tumor-specific distribution of poly(L-glutamic acid)-conjugated paclitaxel and its antitumor efficacy. Clin. Cancer Res. 6:2829-2834.

Li, X., E. M. Eastman, R. J. Schwartz, and R. Draghia-Akli. 1999. Synthetic muscle promoters: activities exceeding naturally occurring regulatory sequences. Nat. 106 200424214

Biotechnol. 17:241-245.

Lin, Η., K. E. Yutzey, and S. F. Konieczny. 1991. Muscle-specific expression of the troponin I gene requires interactions between helix-loop-helix muscle regulatory factors and ubiquitous transcription factors. Mol. Cell Biol. 11:267-280.

Liu, Y.5 H. Li? K. Tanaka, N. Tsumaki, and Y. Yamada. 2000. Identification of an enhancer sequence within the first intron required for cartilage-specific transcription of the alpha2(XI) collagen gene. J. Biol. Chem. 275:12712-12718.

Lucas, M. L.? L. Heller, D. Coppola, and R. Heller. 2002. IL-12 plasmid delivery by in vivo electroporation for the successful treatment of established subcutaneous B16.F10 melanoma. Mol. Ther. 5:668-675.

Lucas, M. L.? M. J. Jaroszeski, R. Gilbert, and R. Heller. 2001. In vivo electroporation using an exponentially enhanced pulse: a new waveform. DNA Cell Biol. 20:183-188.

Macejak, D. G. and P. Samow. 1991. Internal initiation of translation mediated by the 5* leader of a cellular mRNA. Nature 353:90-94.

Madry, H.? R. Reszka, J. Bohlender, and J. Wagner. 2001. Efficacy of cationic liposome-mediated gene transfer to mesangial cells in vitro and in vivo. J. Mol. Med.

79:184-189.

Makis, A. C.5 N. Chaliasos, E. C. Hatzimichael, and K. L. Bourantas. 2001. Recombinant human erytlm)poietin therapy in a 1x姐sfUsion-dependent beta_Aalassemia major patient. Ann. Hematol. 80:492-495.

Mathews, K. A.? D. L. Holmberg, and C. W. Miller. 2000. Kidney transplantation in dogs with naturally occurring end-stage renal disease. J Am. Anim Hosp. Assoc. 36:294-301. Matsubara，H·，Y· Gunji，T· Maeda，K. Tasaki，Y. Koide，T· Asano, T. Ochiai，S· Sakiyama，and M. Tagawa. 2001. Electroporation-mediated transfer of cytokine genes into human 107 200424214 esophageal tumors produces anti-tumor effects in mice. Anticancer Res. 21:2501-2503.

Matsuo, A.? I. Tooyama, S. Isobe, Y. Oomura, I. AJkiguchi, K. Hanai? J. Kimura, and H. Kimura. 1994. Immunohistochemical localization in the rat brain of an epitope corresponding to the fibroblast growth factor receptor-1. Neuroscience 60:49-66.

McNally，M. A.，J. S. Lebkowski，T. B. Okarma，and L. B. Lerch. 1988. Optimizing electroporation parameters for a variety of human hematopoietic cell lines.

Biotechniques 6:882-886.

Miklavcic, D., K. Beravs, D. Semrov, M. Cemazar, F. Demsar, and G. Sersa. 1998. The importance of electric field distribution for effective in vivo electroporation of tissues. Biophys.J 74:2152-2158.

Miller, S. B. and R. Rabkin. 1997. The use of growth factors to increase glomerular filtration rate in chronic renal failure patients. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 6:401-404.

Mirza, A. M.? S. Ezzat, and A. A. Axelrad. 1997. Insulin-like growth factor binding protein-1 is elevated in patients with polycythemia vera and stimulates erythroid burst formation in vitro. Blood 89:1862-1869.

Mumper, R. J., J. Wang, S. L. Klakamp, H. Nitta, K. Anwer, F. Tagliafeni, and A. P. Rolland. 1998. Protective interactive noncondensing (PINC) polymers for enhanced plasmid distribution and expression in rat skeletal muscle. J. Control Release 52:191-203.

Muramatsu，T·，S. Arakawa，K· Fukazawa，Y_ Fujiwara，T. Yoshida，R· Sasaki，S. Masuda，and Η. M. Park. 2001. In vivo gene electroporation in skeletal muscle with special reference to the duration of gene expression. Int. J Mol. Med. 7:37-42.

Murray, R. D. and S. M. Shalet. 2000. Growth hormone: current and future therapeutic applications. Expert. Opin. Pharmacother. 1:975-990.

Nabel，E· G·，G. Plautz，F· M. Boyce，J· C· Stanley，and G. J. Nabel· 1989. Recombinant gene 108 200424214 expression in vivo within endothelial cells of the arterial wall. Science 244:1342-1344. Naim, R. S., G. M. Adair, T. Porter, S. L. Pennington, D. G. Smith, J. H. Wilson, and Μ. M. Seidman. 1993. Targeting vector configuration and method of gene transfer influence targeted correction of the APRT gene in Chinese hamster ovary cells. Somat. Cell Mol. Genet. 19:363-375.

Nampoory, M. R.? K. V. Johny, J. N. Costandi, R. K. Gupta, M. P. Nair, M. Samhan, I. A. al Muzairai, and M. al Mousawi. 2002. Inferior long-term outcome of renal transplantation in patients with diabetes mellitus. Med. Princ. Pract. 11:29-34.

Narum, D. L., S. Kiunar, W. O. Rogers, S. R. Fuhrmann, H. Liang, M. Oakley, A. Taye, B. K. Sim, and S. L. Hoffinan. 2001. Codon optimization of gene fragments encoding Plasmodium falciparum merzoite proteins enhances DNA vaccine protein expression and immunogenicity in mice. Infect. Immun. 69:7250-7253.

Nelson, K. A. 2001. Modem management of the cancer anorexia-cachexia syndrome. Curr. Pain Headache Rep. 5:250-256.

Neumann, E.5 M. Schaefer-Ridder, Y. Wang? and P. H. Hofschneider. 1982. Gene transfer into

mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1:841-845. Nomoto, S.，Y· Tatematsu，T· Takahashi，and H· Osada. 1999. Cloning and characterization of the alternative promoter regions of the hmnan LIMK2 gene responsible for alternative transcripts with tissue-specific expression. Gene 236:259-271. O'Sullivan, A. J.? J. A. Lawson, M. Chan, and J. J. Kelly. 2002. Body composition and energy metabolism in chronic renal insufficiency· Am. J Kidney Dis· 39:369-375·

Ohlsson, H.5 S. Thor, and T. Edlund. 1991. Novel insulin promoter- and enhancer-binding proteins that discriminate between pancreatic alpha- and beta-cells. Mol. Endocrinol. 5:897-904. 109 200424214

Omirulleh, S., M. Abraham, M. Golovkin, I. Stefanov, Μ. K. Karabaev, L. Mustardy, S. Morocz，and D. Dudits. 1993. Activity of a chimeric promoter with the doubled CaMV 35S enhancer element in protoplast-derived cells and transgenic plants in maize. Plant Mol. Biol. 21:415-428.

Otani, Y.5 Y. Tabata, and Y. Ikada. 1996. Rapidly curable biological glue composed of gelatin and poly(L-glutamic acid). Biomaterials 17:1387-1391.

Otani, Y, Y. Tabata, and Y. Ikada. 1998. Hemostatic capability of rapidly curable glues from

gelatin, poly(L-glutamic acid), and carbodiimide. Biomaterials 19:2091-2098. Papassotiriou, I., E. Voskaridou, A. Stamoulakatou, and D. Loukopoulos. 2000. Increased erythropoietin level induced by hydroxyurea treatment of sickle cell patients. Hematol. J. 1:295-300.

Pasqualini, T.5 J. Ferraris, P. Fainstein-Day, A. A. Eymann, C. S. Moyano, S. Ruiz, J. Ramirez, and R. Gutman. 1996. Growth acceleration in children with chronic renal failure treated with growth-hormone-releasing hormone (GHRH). Medicina (B Aires) 56:241-246.

Payen, E.? M. Bettan, P. Rouyer-Fessard, Y. Beuzard, and D. Scherman. 2001. Improvement

of mouse beta-thalassemia by electrotransfer of erythropoietin cDNA. Exp. Hematol. 29:295-300.

Pech, M., C. D. Rao, K. C. Robbins, and S. A. Aaronson. 1989. Functional identification of regulatory elements within the promoter region of platelet-derived growth factor 2. Mol. Cell Biol. 9:396-405.

Pelletier, J. and N. Sonenberg. 1988. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature 334:320-325.

Pinkert, C. A.? D. M. Omitz, R. L. Brinster, and R. D. Palmiter. 1987. An albumin enhancer located 10 kb upstream functions along with its promoter to direct efficient, liver-specific 110 200424214 expression in transgenic mice. Genes Dev. 1:268-276.

Polzin, D. J.? C. A. Osborne, S. Ross, and F. Jacob. 2000. Dietary management of feline chronic renal failure: where are we now? In what direction are we headed? J Feline. Med.

Surg. 2:75-82.

Potrykus, 1., J. Paszkowski, M. W. Saul, J. Petruska, and R. D. Shillito. 1985. Molecular and general genetics of a hybrid foreign gene introduced into tobacco by direct gene transfer. Mol. Gen. Genet. 199:169-177.

Potter，H.，L· Weir，and P. Leder· 1984· Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 81:7161-7165.

Prahalada，S.，L. G. Stabinski，Η. Y. Chen，R. E. Morrissey，G. De Burlet，D. Holder, D. H. Patrick, C. P. Peter, and M. J. van Zwieten. 1998. Pharmacological and toxicological effects of chronic porcine growth hormone administration in dogs [see comments]. Toxicol. Pathol· 26:185-200.

Prentice, H.5 R. A. Kloner, T. Prigozy, T. Christensen, L. Newman, Y. Li, and L. Kedes. 1994.

Tissue restricted gene expression assayed by direct DNA injection into cardiac and skeletal muscle. Journal of Molecular & Cellular Cardiology 26:1393-1401.

Raghavachari, N. and W. E. Fahl. 2002. Targeted gene delivery to skin cells in vivo: a comparative study of liposomes and polymers as delivery vehicles. J. Pharm. Sci. 91:615-622.

Rao5 V. K. 2002. Kidney transplantation in older patients: benefits and risks. Drugs Aging 19:79-84.

Rippe, R. A.? D. A. Brenner, and H. L. Leffert. 1990. DNA-mediated gene transfer into adult rat hepatocytes in primary culture. Mol. Cell Biol. 10:689-695. ill 200424214

Robbins, K.? S. McCabe, T. Schemer, J. Strasser, R. Clark, and P. Jardieu. 1994.

Immunological effects of insulin-like growth factor-I—enhancement of immunoglobulin synthesis. Clin. Exp. Immunol. 95:337-342.

Sakhuja，V.，V. Jha，S. Varma，K· Joshi，K. L. Gupta，K. Sud，and H. S. Kohli. 2000. Renal involvement in multiple myeloma: a 10-year study. Ren Fail. 22:465-477.

Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Satozawa, N.5 K. Takezawa, T. Miwa, S. Takahashi, M. Hayakawa, and H. Ooka. 2000. Differences in the effects of 20 K- and 22 K-hGH on water retention in rats [In Process Citation]. Growth Horm. IGF. Res. 10:187-192.

Skroch, P.5 C. Buchman, and M. Karin. 1993. Regulation of human and yeast metallothionein gene transcription by heavy metal ions. Prog. Clin. Biol. Res. 380:113-28.:113-128.

Smith, L. C. and J. L. Nordstrom. 2000. Advances in plasmid gene delivery and expression in skeletal muscle. Curr. Opin. Mol. Ther. 2:150-154.

Sohmiya, M. and Y. Kato. 2000. Effect of long-term treatment with recombinant human growth hormone on erythropoietin secretion in an anemic patient with panhypopituitarism. J Endocrinol. Invest 23:31-36.

Somiari, S.5 J. Glasspool-Malone, J. J. Drabick, R. A. Gilbert, R. Heller, M. J. Jaroszeski, and R. W. Malone. 2000. Theory and in vivo application of electroporative gene delivery.

Mol. Ther. 2:178-187.

Song, S.5 J. Embury, P. J. Laipis, K. I. Bems, J. M. Crawford, and T. R. Flotte. 2001. Stable therapeutic serum levels of human alpha-1 antitrypsin (AAT) after portal vein injection of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Ther. 8:1299-1306.

Soubrier, F.? B. Cameron, B. Manse, S. Somarriba, C. Dubertret, G. Jaslin, G. Jung, C. L. Caer, 200424214 D. Dang，J. M. Mouvault，D. Scherman，J. F. Mayaux，and J. Crouzet. 1999. pCOR: a new design of plasmid vectors for nonviral gene therapy. Gene Ther. 6:1482-1488. Sowade, B.5 O. Sowade, J. Mocks, W. Franke, and H. Wamke. 1998. The safety of treatment with recombinant human erythropoietin in clinical use: a review of controlled studies. Int. J. Mol. Med. 1:303-314.

Sun, W.5 L. Wang, Z. Zhang, M. Chen, and X. Wang. 2003. Intramuscular transfer of naked calcitonin gene-related peptide gene prevents autoimmune diabetes induced by multiple

low-dose streptozotocin in C57BL mice. Eur. J Immunol. 33:233-242.

Tanaka, T.? N. Ichimaru, S. Takahara, K. Yazawa, M. Hatori, K. Suzuki, Y. Isaka, T. Moriyama, E. Imai, H. Azuma, T. Nakamura, A. Okuyama, and H. Yamanaka. 2002. In vivo gene 姐sfer of hepatocyte growA factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy. Am. J. Transplant. 2:828-836.

Terada, Y.? H. Tanaka, T. Okado, S. Inoshita, M. Kuwahara, T. Akiba, S. Sasaki, and F.

Marumo. 2001. Efficient and ligand-dependent regulated erythropoietin production by naked dna injection and in vivo electroporation. Am. J Kidney Dis. 38:S50-S53.

Thomer，M. 0·，L· A. Frohman，D. A. Leong，J· Thominet，T. Downs，P· Hellmann，J· Chitwood, J. M. Vaughan, and W. Vale. 1984. Extrahypothalamic growth-hormone-releasing factor (GRF) secretion is a rare cause of acromegaly: plasma GRF levels in 177 acromegalic patients. Journal of Clinical Endocrinology &

Metabolism 59:846-849.

Thomer, Μ. 0.5 M. L. Hartman, M. L. Vance, S. S. Pezzoli, and E. J. Ampleford. 1995. Neuroendocrine regulation of growth hormone secretion. [Review]. Neuroscience & Biobehavioral Reviews 19:465-468.

Thomer, M. 0.5 M. L. Vance, W. S. Evans, A. D. Rogol, J. Rivier, W. Vale, Blizzard, and RM. 113 200424214 1986. Clinical Studies With GHRH In Man. Hormone Research 24:91-98.

Toneguzzo, F.? A. Keating, S. Glynn, and K. McDonald. 1988. Electric field-mediated gene transfer: characterization of DNA transfer and patterns of integration in lymphoid cells. Nucleic Acids Res. 16:5515-5532.

Tripathy, S. K., E. C. Svensson, Η. B. Black, E. Goldwasser, M. Margalith, Hobart, PM, and J. M. Leiden. 1996. Long-term expression of erythropoietin in the systemic circulation of mice after intramuscular injection of a plasmid DNA vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10876-10880.

Tronche, F.? A. Rollier, I. Bach, M. C. Weiss, and M. Yaniv. 1989. The rat albumin promoter: cooperation with upstream elements is required when binding of APF/HNF1 to the proximal element is partially impaired by mutation or bacterial methylation. Mol. Cell Biol. 9:4759-4766.

Tronche, F.? A. Rollier, P. Herbomel, I. Bach, S. Cereghini, M. Weiss, and M. Yaniv. 1990. Anatomy of the rat albumin promoter. Mol. Biol. Med. 7:173-185.

Trudel, M. and F. Costantini. 1987. A 3* enhancer contributes to the stage-specific expression of the human beta-globin gene. Genes Dev. 1:954-961.

Tsumaki, N., T. Kimura, K. Tanaka, J. H. Kimura, T. Ochi, and Y. Yamada. 1998. Modular arrangement of cartilage- and neural tissue-specific cis-elements in the mouse alpha2(XI) collagen promoter. J. Biol. Chem. 273:22861-22864.

Tsunekawa，B·，M. Wada，M. Ikeda，H· Uchida，N. Naito, and M· Honjo· 1999· The 20-kilodalton (kDa) human growth hormone (hGH) differs from the 22-kDa hGH in the effect on the human prolactin receptor. Endocrinology 140:3909-3918.

Tsurumi, Y.? S. Takeshita, D. Chen, M. Kearney, S. T. Rossow, J. Passeri, J. R. Horowitz, J. F. Symes, and J. M. Isner. 1996. Direct intramuscular gene transfer of naked DNA encoding 114 200424214 vascular endothelial growth factor augments collateral development and tissue perfusion. Circulation 94:3281-3290.

Tur-Kaspa，R·，L· Teicher，B. J· Levine，A. I· Skoultchi，and D. A. Shafritz. 1986· Use of electroporation to introduce biologically active foreign genes into primary rat hepatocytes. Mol. Cell Biol. 6:716-718.

Urena, P., A. Bonnardeaux, K. U. Eckardt, A. Kurtz, and T. B. Drueke. 1992. Insulin-like growth factor I: a modulator of erythropoiesis in uraemic patients? Nephrol. Dial·

Transplant. 7:40-44.

Valerio, G., S. Di Maio, M. Salerno, A. Argenziano, R. Badolato, and A. Tenore. 1997.

Assessment of red blood cell indices in growth-hormone-treated children. Horm. Res. 47:62-66.

Vance，M. L. 1990. Growth-hormone-releasing hormone· [Review] [52 refs]· Clinical Chemistry 36:415-420.

Vance, M. L.5 D. L. Kaiser, W. S. Evans, R. Furlanetto, W. Vale, J. Rivier, and M. O. Thomer. 1985. Pulsatile growth hormone secretion in normal man during a continuous 24-hour infusion of human growth hormone releasing factor (1-40). Evidence for intermittent

somatostatin secretion. J. Clin. Invest. 75:1584-1590.

Vansteenkiste，J·，R· Pirker，B· Massuti，F· Barata，A. Font，M. Fiegl，S· Siena，J. Gateley，D. Tomita，A· B· Colowick，and J. Musil. 2002. Double-blind，placebo-controlled， randomized phase ΠΙ trial of darbepoetin alfa in lung cancer patients receiving chemotherapy. J. Natl. Cancer Inst. 94:1211-1220.

Verhelst, J.3 R. Abs, M. Vandeweghe, J. Mockel, J. J. Legros, G. Copinschi, C. Mahler, B. Velkeniers, L. Vanhaelst, A. Van Aelst, D. De Rijdt, A. Stevenaert, and A. Beckers. 1997. Two years of replacement therapy in adults with growth hormone deficiency. Clin. 115 200424214

Endocrinol. (Oxf) 47:485-494.

Vijayan, A., S. C. Franklin, T. Behrend, M. R. Hammerman, and S. B. Miller. 1999.

Insulin-like growth factor I improves renal function in patients with end-stage chronic renal failure. Am. J Physiol 276:R929-R934.

Vilquin, J. T.? P. F. Kennel, M. Patumeau-Jouas, P. Chapdelaine, N. Boissel, P. Delaere, J. P. Tremblay, D. Scherman, Μ. Y. Fiszman, and K. Schwartz. 2001. Electrotransfer of naked DNA in the skeletal muscles of animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 8:1097-1107.

Vittone, J.? M. R. Blackman, J. Busby-Whitehead, C. Tsiao, K. J. Stewart, J. Tobin, T. Stevens, M. F. Bellantoni, M. A. Rogers, G. Baumann, J. Roth, S. M. Harman, and R. G. S.

Spencer. 1997· Effects of single nightly injections of growth hormone-releasing hormone (GHRH 1-29) in healthy elderly men. Metabolism: Clinical and Experimental 46:89-96. Wada，M·，H· Uchida，M· Ikeda，B· Tsunekawa，N. Naito, S· Banba，E· Tanaka，Y· Hashimoto, and M. Honjo. 1998. The 20-kilodalton (kDa) human growth hormone (hGH) differs from the 22-kDa hGH in the complex formation with cell surface hGH receptor and

hGH-binding protein circulating in human plasma. Mol. Endocrinol. 12:146-156. Weinroth, S. E., D. M. Parenti, and G. L. Simon. 1995. Wasting syndrome in AIDS: pathophysiologic mechanisms and therapeutic approaches. Infect. Agents Dis. 4:76-94. Welle, S. 1998. Growth hormone and insulin-like growth factor-I as anabolic agents. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab Care 1:257-262.

Wells, K. E.5 J. Maule, R. Kingston, K. Foster, J. McMahon, E. Damien, A. Poole, and D. J.

Wells. 1997· Immune responses，not promoter inactivation，are responsible for decreased long-term expression following plasmid gene transfer into skeletal muscle. FEBS Lett. 407:164-168. 116 200424214

Wiethoff，C. Μ.，J. G. Smith，G· S. Koe，and C· R· Middaugh. 2001· The potential role of proteoglycans in cationic lipid-mediated gene delivery. Studies of the interaction of cationic lipid-DNA complexes with model glycosaminoglycans· J· Biol· Chem. 276:32806-32813.

Wilson, J. M.5 L. K. Birinyi, R. N. Salomon, P. Libby, A. D. Callow, and R. C. Mulligan. 1989. Implantation of vascular grafts lined with genetically modified endothelial cells. Science 244:1344-1346.

Wolff, J· A.，R. W. Malone，R Williams，W· Chong，G· Acsadi，A· Jani，Feigner，and PL· 1990. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247:1465-1468.

Wu5 G. Y. and C. H. Wu. 1988a. Evidence for targeted gene delivery to Hep G2 hepatoma cells in vitro. Biochemistry 27:887-892.

Wu? G. Y. and C. H. Wu. 1988b. Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo. J. Biol. Chem. 263:14621-14624.

Wu? H. K.5 J. A. Squire, Q. Song, and R. Weksberg. 1997. Promoter-dependent tissue-specific expressive nature of imprinting gene3 insulin-like growth factor Π, in human tissues. Biochem. Biophys. Res. Commim. 233:221-226.

Wuhl, E. and F. Schaefer. 2002. Effects of growth hormone in patients with chronic renal failure: experience in children and adults. Horm. Res. 58 Suppl 3:35-8.:35-38.

Xie? T. D. and T. Y. Tsong. 1993. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. V. Effects of DNA topology on surface binding, cell uptake, expression, and integration into host chromosomes of DNA in the mammalif/n cell. Biophys. J. 65:1684-1689.

Yasui, A.5 K. Oda, H. Usunomiya, K. Kakudo, T. Suzuki, T. Yoshida, Η. M. Park, K. Fukazawa, and T. Muramatsu. 2001. Elevated gastrin secretion by in vivo gene 117 200424214 electroporation in skeletal muscle. Int. J Mol. Med. 8:489-494.

Yin, D. and J. G. Tang. 2001. Gene therapy for streptozotocin-induced diabetic mice by electroporational transfer of naked human insulin precursor DNA into skeletal muscle in vivo. FEBS Lett. 495:16-20.

Yorifuji, T. and H. Mikawa. 1990. Co-transfer of restriction endonucleases and plasmid DNA into mammalian cells by electroporation: effects on stable transformation. Mutat. Res. 243:121-126.

Yutzey, K. E. and S. F. Konieczny. 1992. Different E-box regulatory sequences are functionally distinct when placed within the context of the troponin I enhancer. Nucleic Acids Res. 20:5105-5113.

Zhao-Emonet, J. C.? O. Boyer, J. L. Cohen, and D. Klatzmann. 1998. Deletional and mutational analyses of the human CD4 gene promoter: characterization of a minimal tissue-specific promoter. Biochim. Biophys. Acta 1442:109-119.

Ziegler，T· R·，J· M. Lazarus，L· S· Young，R· Hakim，and D· W. Wilmore. 1991· Effects of recombinant human growth hormone in adults receiving maintenance hemodialysis. J Am. Soc. Nephrol 2:1130-1135.

118

Claims

200424214 申請專利範圍 1 · 一種於患者中治療或預防慢性腎衰竭之方法，包括··將經單離之核酸表現構築體遞送至患者之細胞，該核酸表現構築體可編碼出生長釋素 (growth-hormone_releasing-hormone，GHRH)，因此經編碼之GHRH的表現量可有效減緩或防止慢性腎衰竭之症狀。 2.如申請專利範圍第1項之方法，復包括使患者之組織進行電穿孔，而將該經單離之核酸表現構築體遞送至患者之細胞中之方法。 3·如申請專利範圍第2項之方法，其中，使組織進行電穿孔之方法包括： a·以數個針狀電極使患者之組織具有穿透性，其中該數個針狀電極係呈間隔關係設置以及患者之組織包括肌肉細 b·將約0.1至5毫克之經單離之核酸表現構築體引入至位於數個針狀電極間之組織中；以及

單離之核酸表現構築體穿過肌肉細胞之細胞膜之細胞膜。

之間隔約為1秒。

域上將針插入至肌肉組織，万法’復包括於完整的皮膚區其中該針之口徑約為21以及長 119 200424214 度約1英吋。 6.如申請專利範圍帛1項之方法，其中，該經單離之核酸表現構築體復包括轉染作用-促進多肽或帶電荷之多肽。 7·如申請專利範圍第6項之方法 ^ . 万去，其中，該轉染作用_促進多肽或帶電荷之多肽包括聚_L_麵胺酸。 8·如申請專利範圍第1項之方法， _ ^ ^ ^ 只〜々忒，其中，該核酸表現構築體係調配於0.01%之聚-L-麵胺酸溶液。 ” 9·如申請專利範圍第1項之方法，A由 _ . ^ ^ π〜其中，該核酸表現構築體與選自由 SeqlD Νο. : U、SeqID Nq : 12、Seqm Nq ^ 13>SeqID No.： 14^SeqID No.: ly^SeqlD No.： IS^SeqlD N〇.M9、SeqIDN〇.: 20、以及 SeqIDN〇 : 21 所成組群之序列具有至少90。/❶之相似性。 10.如申請專利範圍第1項之方法，其中，該經編碼之ghrh 的表現里有助於患者體内生長素（gr〇wth h〇rmone ，GH) 之分泌。 11 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中，該經編碼之ghrh 的表現量有助於患者體内類胰島素生長因子q (insulin-like growth factor-I，IGF-I)之分泌。 12.如申請專利範圍第1項之方法，其中，慢性腎衰竭之症狀包括血清肌酸Sf之值南於基值（baseline value)。 13 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中，該經編碼之GHRH 之序列與下式SeqlD No· : 6之序列間具有至少90%之相似性： 120 200424214 E-X6-NQE-X7_GA-〇H 其中該式具有下列特徵·· X!係胺基酸赂胺酸（‘‘γ，，）或組胺酸（“H”）之為胺基酸丙胺酸(“A”)、纈胺酸 =L異構物，· 之D-或L_異構物，· 3 、白胺酸（“Γ，) 或異構物； D•或L-異構 X3為胺基酸丙胺酸（“Α”）或甘胺酸（“G，，）之D X4為胺基酸甲硫胺酸（“Μ，，）或白胺酸（“l，，）之物；

Xs為胺基酸絲胺酸（“s”）或天冬醢胺酸（“n 物； D-或L-異構 D-或L-異構物；队或L-異構物； X6為胺基酸精胺酸（“R”）或絲胺酸（“s”）之 X7為胺基酸麩醯胺（“Q”）或精胺酸（“R”）之或其組合。 14 · 一種於患者中治療或預防慢性腎衰蝎之方法勺重組生長釋素（GHRH)遞送至患者體内，目而適量H且將 GHRH可有效減緩或防止慢性腎衰竭之症狀。立 15·如申請專利範圍第14項之方法，其中，該重組ghrh 之序列與下式序列間具有至少90%之相似性： -X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQG E-X6_NQE-X7-GA-OH 其中該式具有下列特徵： Χι係胺基酸酪胺酸（“Y”）或組胺酸（“H”）之D-或L-異構物； X2為胺基酸丙胺酸（“A”）、纈胺酸（“v”）、或異白胺酸（“I”）之D-或L-異構物； 121 200424214 X3為胺基酸丙胺酸（“A”）或甘胺酸c‘G”）之D-或^異構物； X4為胺基酉文甲硫胺酸（M，’）或白胺酸（“l”）之D-或L-異構物； X5為胺基酸絲胺酸（“S”）或天冬醯胺酸〇_或L_異構物； X6為胺基酸精胺酸（“R”）或絲胺酸（“8，，）之〇_或^異構物； X7為胺基酸麩醯胺（“Q”）或精胺酸（“R，，）之〇_或^異構物；或其組合。 16·如申請專利範圍第14項之方法，其中，該重組Ghrh 可幫助患者體内生長素（GH)之分泌。 17·如申請專利範圍第14項之方法，其中，該重組ghrh 可幫助患者體内類胰島素生長因子q 之分泌。 18.如申請專利範圍第14項之方法，其中，慢性腎衰竭之症狀包括血清肌酸酐之值高於基值。 19·一種於慢性腎衰竭之患者中治療貧血之方法，包括：將經單離之核酸表現構築體遞送至患者之細胞，該核酸表現構築體可編碼出生長釋素（GHRH)，因此經編碼之卵紐的表現量可有效減緩或防止貧血之症狀。 20:如申請專利範圍第19項之方法’復包括使患者之組織進仃電穿1，而將該經單離之核酸表現構築體遞送至患者之細胞中之方法。其中，使組織進行電 21·如申請專利範圍第2〇項之方法，穿孔之方法包括： a·以數個針狀電極使患者之組織具有穿透性，其中該數 122 200424214 個針狀電極係呈間胞；隔關係設置以及患者之組織包括肌肉細位於：:約Μ i 5 *克之經單離之核酸表現構築體引入至 4於數個針狀電極間之組織中；以及 C ·對數個針狀電極至少施加一使該經單離之核酸表現構筚體穿==其中該電脈衝凡傅未m牙過肌肉細胞之細胞膜。 =請專利範圍第21項之方法，其中，對數個針狀電

極所施加之電脈衝包括約〜4至i安培範圍之安培_強度電場，具有約3至5個脈衝，約52毫秒/脈衝，以及電脈衝間之間隔約為1秒。 23.如申請專利_ 21項之方法，復包括於完整的皮膚區域上將針插人至肌肉組織，其中該針之口極約為21以及長度約1英叫·。 24·如申請專利範圍第19項之方法，其中，該經單離之核酸表現構築體復包括轉染作用_促進多肽或帶電荷之多肽。 25·如申請專利範圍第24項之方法，其中，該轉染作用-促進多肽或帶電荷之多肽包括聚-乙_麵胺酸。 26·如申請專利範圍第19項之方法，其中，該核酸表現構築體係調配於0.01%之聚—L-麩胺酸溶液。 27·如申請專利範圍第19項之方法，其中，該經單離之核酸表現構築體與選自由SeqlD No. : 11、SeqlD No. : 12、 SeqlD No. : 13、SeqlD No· : 14、SeqlD No· : 17、SeqlD No· ·· 18、SeqlD No. : 19、SeqlD No· : 20、以及 SeqlD No. : 21所成組群之序列具有至少9〇。/❶之相似性。 123 200424214 28.如申請專利範圍第19項之方法，其中，該經編碼之 GHRH的表現量有助於患者體内生長素（gh)之分泌。 29.如申請專利範圍第19項之方法，直〃中該經編碼之 GHRH的表現量有助於患者體内類騰島素生長因子工 (IGF-I)之分泌。 30·如申請專利範圍第19項之方法，i 成再中，貧血之症狀包括紅血球質量減少至低於基值。貧血之症狀包 31·如申請專利範圍第19項之方法，其中括循環中之鐵的濃度減少至低於基值。法，其中，該經編碼之 6之序列間具有至少90% 3 2 ·如申請專利範圍第19項之方 GHRH之序列與下式SeqID N〇.: 之相似性： -QLSARKLLQDI-X4.Xs.Rqqg -X1-X2-DAIFTNS YRKVL-X3 E-X6-NQE-X7_GA-〇H 其中該式具有下列特徵： X』胺基酸酿胺酸（“Y”）或組胺酸（“H”）之D-或l_異構物. X2為胺基酸丙胺酸(“A”)、織胺酸(“v，，)、或異白，、之D-或L_異構物；；胺酸（“G”）之D·或L_異構物；白胺酸（“L”）之D-或L_異構 X3為胺基酸丙胺酸（“A”）或甘 X4為胺基酸甲硫胺酸（“ Μ，，丨咬物 X5為胺基酸絲胺酸（“s，，、洗工^ ^ 、5 )或天冬醯胺酸（“N，，）i 〇_或L_異構物； ' X6為胺基酸精胺酸^ 月妝Μ Κ )或絲胺酸（“s”）之D-或^異構物； 124 200424214 X?為胺基酸麩醯胺（“Q”）或精胺酸（“R”）之D-或L _g 赤1細人. 、、構物 33. —種於慢性腎衰蝎之患者中治療貧血之方法，勹. 將重組生長釋素(GHRH)遞送至患者體内，因而適旦：：： GHRH可有效減緩或防止貧血之症狀。 ^ GHRH 34.如申請專利範圍第33項之方法其中，該重組之序列與下式序列間具有至少90%之相似性： -x1-x2-daiftnsyrkvl-x3.qlsarkllqdi-x4.X5.r E-X6-NQE-X7-GA-〇H 其中該式具有下列特徵： D-或L-異構物；或異白胺酸（“P，) Xi係胺基酸酪胺酸（“Y”）或組胺酸（“H”）之 X2為胺基酸丙胺酸（“A”）、纈胺酸（“V”）、之D-或L-異構物； X3為胺基酸丙胺酸(“A”)或甘胺酸(“G”)之D-或L_異構物； X4為胺基酸甲硫胺酸（“M’，）或白胺酸（“L”）之〇_或l_異構物； ^ XS為絲酸絲胺酸(“S”)或天冬醯胺酸(“N”)之D-Sl L_異構物； 1為胺基酸精胺酸（“R”）或絲胺酸（“『)之D或l異構物； X7為胺基酸楚酿胺（“Q”）或精胺酸（“R”）之D-或L-異構物；或其組合。 35. 如申請專利範圍第33ϊ§夕士、^ ^ ^ 礼®w項之方法，其中，該重組gjjrh 可幫助患者體内生長素（GH)之分泌。 36. 如申請專利範圍第33項之方法，其中，該重組GHRH 125 200424214 可幫助患者體内類胰島素生長因子GGFd)之分泌。 37·如申請專利範圍第33項之方法，其中，貧血之症狀包括紅血球質量減少至低於基值。 38· —種於慢性腎衰竭之患者中改變耗損之方法，包括··將經單離之核酸表現構築體遞送至患者之細胞，該核酸表現構築體可編碼出生長釋素（GHRH)，因此經編碼之ghrh的表現量可有效減緩或防止耗損之症狀。 39·如申請專利範圍第38項之方法，<复包括使患者之組織進仃電穿孔，而將該經單離之核酸表現構築體遞送至患者f 之細胞中之方法。 4〇.如申請專利範圍第39項之方法’其中，使組織進行電穿孔之方法包括： a·以數個針狀電極使患者之組織具有穿透性，其中該數個針狀電極係呈間隔關係設置以及患者之組織包括肌肉細胞；等、、、勺0 · 1至5毫克之經單離之核酸表現構築體引入至位於數個針狀電極間之組織中；以及 e·對數個針狀電極至少施加一次電脈衝，其中該電脈衝使該經單離之核酸表現構築體穿過肌肉細胞之細胞膜。 41·如申請專利範圍第4〇項之方法，其中，對數個針狀電極所施加之電脈衝包括、約0·4至1安培範圍之安培-強度電用^有約3至5個脈衝，約52毫秒/脈衝，以及電脈衝間之間隔約為1秒。 126 200424214 42·如申請專利範圍第4〇頊之太、土作l ^ 、固罘40項之方法，復包括於完整的皮膚區域上將針插入至肌肉挺織，盆中 u、、且辦关〒該針之口徑約為2 1以及長度約1英忖。 43. 如申請專利範圍第38項之方法，其中，該經單離之核酸表現構築體復包括轉染作用·促進多肽或帶電荷之多肽。 44. 如申請專利範圍第43項之方法，其中，該轉染作用促進多肽或帶電荷之多肽包括聚麵胺酸。 45. 如申請專利錢第38項之方法，丨中，該核酸表現構築體係調配於0.01 %之聚_L•麩胺酸溶液。 46·如申明專利範圍第38項之方法’其中，該經單離之核酸表現構築體與選自由SeqID N〇 : U、Seqm Nq : 12、 SeqlD No. ： 13 ^ SeqlD No. ： 14 . SeqlD No. ： 17 ^ SeqlD No. : 18、SeqID No. : 19、Seqm N〇 : 2〇、以及 No. . 2 1所成組群之序列具有至少9〇%之相似性。 47. 如申請專利範圍第38項之方法’其中，該經編碼之 GHRH的表現量有助於患者體内生長素（GH)之分泌。 48. 如申請專利範圍第38項之方法，其中，該經編碼之 GHRH的表現量有助於患者體内類胰島素生長因子—工 (IGF-I)之分泌。 49·如申請專利範圍第38項之方法，其中，耗損之症狀包括體重減少達低於個體之最小理想體重之至少5至1〇%，其特徵為脂肪組織與肌肉質量兩者有顯著的損失。 50.如申請專利範圍第38項之方法，其中，該經編碼之 GHRH之序列與下式SeqlD No. : 6之序列間具有至少90% 127 200424214 之相似性： -Xi-X2-DAIFTNSYRKVL-X3.QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQG E_X6_NQE-X7-GA_OH 其中該式具有下列特徵： Χι係胺基酸酿胺酸（“Y”）或組胺酸（“H”）之D-或異構物； X2為胺基酸丙胺酸（“A”）、纈胺酸（“V”）、或異白胺酸（“Γ，) 之D_或L·異構物； X3為胺基酸丙胺酸（“A”）或甘胺酸（“G”）之D-或L-異構物； X4為胺基酸曱硫胺酸或白胺酸（“L”）之〇-或異構物， Xs為胺基酸絲胺酸（“S”）或天冬醯胺酸(“N，，）i 〇_或L_異構物； X6為胺基酸精胺酸（“R”）或絲胺酸（“s”）之D_或^異構物； X7為胺基酸麵醢胺（“Q”）或精胺酸（“R”）之D-或異構物；或其組合。 5 1 · —種於慢性腎衰竭之患者中改變耗損之方法，包括··將重組生長釋素（GHRH)遞送至患者體内，因而適量之重組 GHRH可有效減緩或防止耗損之症狀。 52·如申請專利範圍第51項之方法，其中，該重組gHRH 之序列與下式序列間具有至少9 〇 %之相似性： •Xi-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQG E_X6_NQE-X7_GA-〇H 其中該式具有下列特徵： Χι係胺基酸絡胺酸（“γ”）或組胺酸（“H”）之D_或L-異構物； 128 200424214 X2為胺基酸丙胺酸（“A”）、纈胺酸（“v”）、或異白胺酸（ui，,) 之D-或L·異構物； &為胺基酸丙胺酸（“A”）或甘胺酸（“G”）之〇_或1異構物； X4為胺基酸曱硫胺酸（“M，，）或白胺酸〇_或L_異構物； X5為胺基酸絲胺酸（“S”）或天冬醯胺酸（“Ν，，）< D_或卜異構物； X6為胺基酸精胺酸（“R”）或絲胺酸（“s，，）之〇_或匕異構物； X7為胺基酸麩醯胺（“Q”）或精胺酸（“R，，）2 或匕異構物；或其組合。 53·如申請專利範圍第51項之方法，其中，該重組ghrh 可幫助患者體内生長素（GH)之分泌。 54·如申請專利範圍第51項之方法，其中，該重組ghrh 可幫助患者體内類胰島素生長因子d Ggfj)之分泌。 55·如申請專利範圍第51項之方法，其中，耗損之症狀包括體重減少達低於個體之最小理想體重之至少5至丨，其特徵為脂肪組織與肌肉質量兩者有顯著的損失。 5 6·種於慢性腎衣竭之患者中治療免疫功能障礙之方法，包括：將經單離之核酸表現構築體遞送至患者之細胞，該核酸表現構築體可編碼出生長釋素（GHRH)，因此經編碼之GHRH的表現量可有效減緩或防止免疫功能障礙之症狀。 57·如申請專利範圍第56項之方法，復包括使患者之組織進行電穿孔，而將該經單離之核酸表現構築體遞送至患者 129 200424214 之細胞中之方法。 58.如申請專利範圍第57項之方法，其中，使組織進行電穿孔之方法包括： a·以數個針狀電極使患者之組織具有穿透性，其中該數個針狀電極係呈間隔關係設置以及患者之組織包括肌肉細胞； b. 將約0.1 i 5毫克之經單離之核酸表現構築體引入至位於數個針狀電極間之組織中；以及 c. 對數個針狀電極至少施加—次電脈衝，其中該電脈衝使該經單離之核酸表現構築體穿過肌肉細胞之細胞膜。 59·如申請專利範圍第58項之方法，其中，對數個針狀電極所施加之電脈衝包括約0.4至i安培範圍之安培-強度電場，具有約3至5個脈衝，約52毫秒/脈衝，以及電脈衝間之間隔約為1秒。 60·如申請專利範圍第58項之方法，復包括於完整的皮膚區域上將針插人至肌肉組織’其中該針之口徑約為21以及長度約1英忖。 6i.如申請專利範圍第56項之方法，其中，該經單離之才酸表現構築體復包括轉染作用·促進多肽或帶電荷之多狀 62·如申請專利範圍第61項之方沐 ^ , 币孭心万去，其中，該轉染作甩4 進多肽或帶電荷之多肽包括聚_L•麵胺酸。該核酸表現^ 63·如申請專利範圍第56項之方法，其中築體係調配於0.01%之聚-L-麩胺酸溶液。該經單離之 64·如申請專利範圍第56項之方法，其中 130 200424214 酸表現構築體與選自由SeqlD No· : 11、SeqlD No. : 12、 SeqlD No· : 13、SeqlD No. : 14、SeqlD No· : 17、SeqlD No·: 18、SeqlD No. : 19、SeqlD No· : 20、以及 SeqlD No· : 21 所成組群之序列具有至少90%之相似性。 65·如申請專利範圍第56項之方法，其中，該經編碼之 GHRH的表現量有助於患者體内生長素（GH)之分泌。 66·如申請專利範圍第56項之方法，其中，該經編碼之 GHRH的表現量有助於患者體内類胰島素生長因子 (IGF-I)之分泌。 67. 如申請專利範圍第56項之方法，其中’免疫功能障礙之症狀包括受者體内之IGF-I濃度低於基值。 68. 如申請專利範圍第56項之方法，其中，該經編碼之 GHRH之序列與下式SeqIDN。.： 6之序列間具有至少_ 之相似性： ^ UDAIFTNSYRKVL-XpQlsarkllqj^h e_x6-nqe_x7-ga-oh QQ 其中該式具有下列特徵： Χι係胺基酸酪胺酸（“Y”）或組胺酸C‘H”）之D-或^異構物· 為胺基酸丙胺酸（“A”）、_酸（“V”）、或異白胺酸”; 之D-或L-異構物；） I為胺基酸丙胺酸（“A”）或甘胺酸（“G，，）2 〇_或l•異構物； X4為胺基酸甲硫胺酸（“M”）或白胺酸（“L”）之d_或I異構，物； ' 為胺基酸絲胺酸（“s”）或天冬醯胺酸（“N”）之〇_或^異構 131 200424214 物； p胺基I精胺酸（“R’，）或絲胺酸（“S”）之或L-異構物； X7為胺基酸麵酿胺（“Q”）或精胺酸（“R”）之D”戈L-異構物；或其組合。法勺種於梃性腎衰竭之患者中治療免疫功能障凝之方法匕括·將重組生長釋素（GHRH)遞送至患者體内，因而適量之重組G H R H可有效減緩或防止免疫功能障礙之症狀。 70’如申叫專利|&圍第69項之方法，其中，該重組ghrh | 之序列與下式序列間具有至少9〇%之相似性： -XrXrDAIFTNSYRKVLUsARKLLQDI-XrXs -RQQG E_X6-NQE-X7-GA_〇H 其中該式具有下列特徵： Χι係胺基酸酪胺酸（“Y”）或組胺酸之〇_或L-異構物； X2為胺基酸丙胺酸（“A”）、纈胺酸（“V”）、或異白胺酸（“Γ，）之D-或L_異構物； X3為胺基酸丙胺酸（“A”）或甘胺酸（“G”）之〇_或L-異構物；f X4為胺基酸甲硫胺酸（“μ，，）或白胺酸（“L，，）i d—或異構物； Xs為胺基酸絲胺酸（“S”）或天冬醯胺酸（“ν，，）2 〇_或L_異構物； X6為胺基酸精胺酸（“R”）或絲胺酸（“s”）之D-或L-異構物； X：7為胺基酸麩醯胺（“Q”）或精胺酸（“R”）之〇_或^異構物；或其組合。 132 200424214 71.如申請專利範圍第69項之方法，其中，該重組ghrh 可幫助患者體内生長素（GH)之分泌。如申請專利範圍第69項之方法，其中，㈣组GHRH 可幫助患者體内類胰島素生長因子(IGF_I}之分泌。 73.如申請專利範圍第69項之方法，其中，免疫功能障礙之症狀包括患者體内之IGF-I濃度低於基值。 74· —種延長患有慢性腎衰竭之慢性病患者之平均壽命之方法，包括：將經單離之核酸表現構築體遞送至患者之細胞，該核酸表現構築體可編碼出生長釋素（GHRH)，因此經編碼之GHRH的表現量可有效延長患有慢性腎衰竭之慢性病患者之平均壽命。 75·如申請專利範圍第74項之方法，復包括使患者之組織進行電穿孔，而將該經單離之核酸表現構築體遞送至患者之細胞中之方法。 76.如申請專利範圍第75項之方法，其中，使組織進行電穿孔之方法包括： a·以數個針狀電極使患者之組織具有穿透性，其中該數個針狀電極係呈間隔關係設置以及患者之組織包括肌肉細胞； b.將約0.1至5毫克之經單離之核酸表現構築體引入至位於數個針狀電極間之組織中；以及 C •對數個針狀電極至少施加一次電脈衝’其中該電脈衝使該經單離之核酸表現構築體穿過肌肉細胞之細胞膜。 77·如申請專利範圍第76項之方法，其中，對數個針狀電 133 200424214 至1安培範圍之安培-強度電 52毫秒/脈衝，以及電脈衝極所施加之電脈衝包括約0.4 場’具有約3至5個脈衝，約間之間隔約為丨秒。 78·如申請專利範圍第76項區域上將針插入至肌肉組織長度約1英#。之方法，復包括於完整的皮膚其中該針之口徑約為21以及 7 9 ·如申請專利範圍第7 4項之方沐 ^ j, 万去，其中，該經單離之核酸表現構築體復包括轉染作用·促進多肽或帶電荷之多肽。 80.如申請專利範圍第79項之方法，其巾，該轉染作用-促進多肽或帶電荷之多肽包括聚_L_麩胺酸。 81·如申請專利範圍第74項之方法，其中，該核酸表現構築體係調配於0.01%之聚麩胺酸溶液。 82·如申請專利範圍第74項之方法，其中，該經單離之核酸表現構築體與選自由SeqlD No. : 11、SeqlD No. : 12、 SeqlD No· · 13、SeqlD No· : 14、SeqlD No· : 1 7、SeqlD No·: 18、SeqlD No. : 19、SeqlD No· : 20、以尽 SeqlD No· : 21 所成組群之序列具有至少90%之相似性。 83·如申請專利範圍第74項之方法，其中，該經編碼之 GHRH的表現量有助於患者體内生長素（GH)之分泌。 84·如申請專利範圍第74項之方法，其中，該經編碼之 GHRH的表現量有助於患者體内類胰島素生長因子_；[ (IGF-I)之分泌。 85 _如申請專利範圍第74項之方法，其中，該經編碼之 GHRH之序列與下式SeqlD No. ·· 6之序列間具有至少90% 134 200424214 之相似性： -Xi-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4.X”RQQG e-x6_nqe-x7-ga_oh 其中該式具有下列特徵： χι係胺基酸酪胺酸（“Y”）或組胺酸C‘H”）之D-或L_異構物，· Xa為胺基酸丙胺酸（“A”）、纈胺酸（“V”）、或異白胺酸d，) 之或L-異構物； X3為胺基酸丙胺酸（“A”）或甘胺酸（“G”）之D·或^異構物； X4為胺基酸甲硫胺酸（“M”）或白胺酸（“l”）之d-或^異物； ’ xs為胺基酸絲胺酸（“s”）或天冬醯胺酸（“N”）之〇_或L_異構物； X6為胺基酸精胺酸（“R”）或絲胺酸（“s”）之〇_或L_異構物. X7為胺基酸麩醯胺（“Q”）或精胺酸（“R”）之D-或L_異構物或其組合。 86· —種延長患有慢性腎衰竭之慢性病患者之平均壽命之方去’包括·將重組生長釋素（GHRH)遞送至患者體内，因而適量之重組GHRH可有效延長患有慢性腎衰竭之慢性病患者之平均壽命。 87·如申請專利範圍第86項之方法，其中，該重組qhrH 之序列與下式序列間具有至少9〇%之相似性： -Xi-X2-DAIFTNSYRKVL-X3.QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQG E_X6-NQE-X7-GA-OH 其中該式具有下列特徵： 200424214 又“系胺基酸路胺酸^”或組胺酸^化”之卜或^異構物； X2為胺基酸丙胺酸（“A”）、纈胺酸（“V”）、或異白胺酸（“Γ，）之D-或L·異構物； X3為胺基酸丙胺酸（“Α”）或甘胺酸（“G”）之〇_或L-異構物； X4為胺基酸甲硫胺酸（“M”）或白胺酸（“L，，）2 〇_或L-異構物； Xs為胺基酸絲胺酸（“S”）或天冬醯胺酸（“N”）之〇_或L-異構物，為胺基酸精胺酸（“R”）或絲胺酸（“s”）之〇_或卩異構物； X7為胺基酸麵醯胺（“Q”）或精胺酸（“R”）之D-或L-異構物；或其組合。 88·如申請專利範圍第86項之方法，其中，該重組ghrh 可幫助患者體内生長素（GH)之分泌。 89·如申請專利範圍第86項之方法，其中，該重組GHRH 可幫助患者體内類膜島素生長因子之分泌。 9 0 · —種改善患有慢性腎哀竭之慢性病患者之生活品質之方法，包括：將經單離之核酸表現構築體遞送至患者之細胞’該核酸表現構築體可編碼出生長釋素（GHrh)，因此經編碼之GHRH的表現量可有效改善患有慢性腎衰竭之慢性病患者之生活品質。 91·如申請專利範圍第90項之方法，復包括使患者之組織進行電穿孔，而將該經單離之核酸表現構築體遞送至患者之細胞中之方法。 92·如申請專利範圍第91項之方法，其中，使組織進行電 136 200424214 穿孔之方法包括： a·以數個針狀電極使患者之組織具有穿透性，盆個針狀電極係呈間隔關係設置 ^ μ 胞；及患者之組織包括肌肉細 b ·將約〇 · 1至5毫券夕經蛋魅r 、、、早離之核酸表現構築體引入至位於數個針狀電極間之組織中；以及 c·對數個針狀電極至少施加一 ^ 人電脈衝，其中該電脈衝使該、左単離之核酸表現構築體穿 ―肌岡細胞之細胞膜。 93. 如申請專利範圍第92項之方法去其中，對數個針狀電極所施加之電脈衝包括約〇_4 思女培乾圍之安培-強度電場，具有約3至5個脈衝，約52奎 ‘宅秒/脈衝，以及電脈衝間之間隔約為1秒。 94. 如申請專利範圍第92項之方沬乐孭二万法，復包括於完整的皮膚區域上將針插入至肌肉組織，其 ^ /、T該針之口徑約為21以及長度約1英吋。 95. 如申請專利範圍第9〇項之方法’其中該經單離之核酸表現構築體復包括轉染作用.促進多狀或帶電荷之多狀。 96. 如申請專利範圍第95項之方法，其中，該轉染作用-促進多肽或帶電荷之多肽包括聚礼_麩胺酸。 97. 如申請專利範圍第9〇項之方法，其中，該核酸表現構築體係調配於〇·01%之聚麩胺酸溶液。 98·如申請專利範圍第9〇項之方法，其中，該經單離之核酸表現構築體與選自由SeqID Ν〇· ·· u、SeqiD n〇_ ·· 12、 SeqlD No· : 13、SeqlD No·: 14、SeqlD No·: 17、SeqlD No·: 137 200424214 18、SeqlD No· : 19、SeqlD No. : 20、以及 SeqlD No· : 2i 所成組群之序列具有至少90%之相似性。 99. 如申請專利範圍第90項之方法，其中，該經編碼之 GHRH的表現量有助於患者體内生長素（GH)之分泌。 100. 如申請專利範圍第90項之方法，其中，該經編竭之 GHRH的表現量有助於患者體内類胰島素生長因子-工 (IGF-I)之分泌。 101. 如申請專利範圍第90項之方法，其中，該經編瑪之 GHRH之序列與下式SeqmNo. : 6之序列間具有至少_ f 之相似性： -X1-X2-DAIFTNSYRKVL.X3-QLSARKLLQDI-X4.x5.R〇〇r e-x6-nqe-x7-ga-oh 其中該式具有下列特徵： Xl係胺基酸酪胺酸(“Y”)或組胺酸(“H”)之D_或L_異構物· X2為胺基酸丙胺酸（“A”）、㈣酸（“V”）、或異白胺酸（“【，，’）之D-或L·異構物； X3為胺基酸丙胺酸（“A”）或甘胺酸（“G”)之13_或L_異構物.# X4為胺基酸甲硫胺酸（“M’，）或白胺酸（“l”）之物；共構 XS為胺基酸絲胺酸（“S”）或天冬醯胺酸（“N”)之D·或u異構乂6為fee基酸精胺酸（“R”）或 X*7為胺基酸麵酿胺（“Q”）咬或其組合。絲胺酸（“S”）之D·或L_異構物精胺酸（“R”）之D-或L_異構物 138 200424214 102·—種改善患有，慢性腎衰竭之慢性病患者之生活品質之方法，包括：將重組生長釋素（GHRH)遞送至患者體内，因此經編碼之GHRH的表現量可有效改善患有慢性腎衰竭之慢性病患者之生活品質。 103 ·如申請專利範圍第102項之方法，其中，該重組GHRH 之序列與下式序列間具有至少90%之相似性： -X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQG e_x6-nqe_x7_ga-oh 其中該式具有下列特徵： Χι係胺基酸酪胺酸（“Y”）或組胺酸之D—或L-異構物； X2為胺基酸丙胺酸（“A”）、纈胺酸（“v”）、或異白胺酸（“p，）之D-或L-異構物； X3為胺基酸丙胺酸（“A”）或甘胺酸（“g”）之或L-異構物； X4為胺基酸曱硫胺酸（“M”）或白胺酸（“l”）之D-或L-異構物； X5為胺基酸絲胺酸（“S”）或天冬醢胺酸（“n”）之D-或L-異構物； X6為胺基酸精胺酸（“R”）或絲胺酸（“S”）之或L-異構物； X7為胺基酸麩醯胺（“Q”）或精胺酸（“R”）之d—或L-異構物；或其組合。 104.如申請專利範圍第1〇2項之方法，其中，該重組GHRH 可幫助患者體内生長素（GH)之分泌。 1 〇5·如申請專利範圍第ι〇2項之方法，其中，該重組ghRH 可幫助患者體内類胰島素生長因子q qGfj)之分泌。 139 200424214 序列表 <110〉愛德維西斯股份有限公司 <120〉用於腎衰竭的質體中介的GHRH補充 <130> 108328.00175 - AVSI-0037 <140> TW093110884 <141> 2004-4-19 <150> US 60/464,266 <151> 2003-04-21 <160> 24 <170> Patentln version 3· 1 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> GHRH之類似物 <400> 1 His Val Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gin 15 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys 20

Leu Leu Gin Asp 工le Leu Asn Arg Gin Gin Gly 25 30 Glu Arg Asn Gin Glu Gin Gly Ala

<210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223〉 GHRH之類似物 <400> 2 Tyr 工le Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gin 15 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Leu Asn Arg Gin Gin Gly 20 25 30 3600744vl Page 1 of 1 200424214 Glu Arg Asn Gin Glu Gin Gly Ala 35 40 <210> 3 <211> 40 <212> PRT <213> 人造序列 <220〉 <223> GHRH之類似物 <400> 3 Tyr Val Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gin 1 5 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Leu Asn Arg Gin Gin Gly 20 25 30 Glu Arg Asn Gin Glu Gin Gly Ala 35 40 <210〉 4 <211> 40 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> GHRH之類似物 <400> 4 Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gin 15 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Leu Asn Arg Gin Gin Gly 20 25 30 Glu Arg Asn Gin Glu Gin Gly Ala 35 40 <210> 5 <211> 44 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223> GHRH之類似物 <400> 5 3600744vl Page 2 of2 200424214 Thr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin 1 5 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp He Met Ser Arg Gin Gin Gly 20 25 30 Glu Ser Asn Gin Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu 35 40 <210> 6 <211> 40 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> GHRH之類似物 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1).7(1) <223> 位置1之Xaa可為酪胺酸或組胺酸 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (2).7(2) <223〉位置2之Xaa可為丙胺酸、纈胺酸、或異白胺酸 <220> <221> MIS C_FEAT URE <222> (15)7.(15) <223〉位置15之Xaa可為丙胺酸、纈胺酸、或異白胺酸 <220> <2 21 > MI SC_FEATURE <222> (27)7.(27) <223〉位置27之Xaa可為曱硫安酸或白胺酸 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (28)7.(28) <223〉位置28之Xaa可為絲胺酸或天門冬醯胺酸 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (34)7.(34) <223〉位置34之Xaa可為精胺酸或絲胺酸 <220> 3600744vl Page 3 of 3 200424214 <221> MISC_FEATURE <222> (38)7.(38) <223〉位置38之Xaa可為麩酿胺酸或精胺酸 <400〉 6 Xaa Xaa Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Xaa Gin 15 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Xaa Xaa Arg Gin Gin Gly 20 25 30 Glu Xaa Asn Gin Glu Xaa Gly Ala 35 40 <210> 7 <211> 323 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉啟動子C5-12之核酸序列 <400> 7 cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg gtgaggaatg 60 gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt tggcgctcta 120 aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca aatatggcga 180 cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg cattcctggg 240 ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg cggcccacga 300 gctacccgga ggagcgggag gcg 323 <210> 8 <211> 190 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223> hGH <400> 8 gggtggcatc gtgcccacca ttctataata acctgtaggg
31 -UTR之核酸序列 cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 60 120 180 3600744vl Page 4 of 4 190 200424214 <210> 9 <211> 219 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223> 豬的 GHRH 之 cDNA· <400> 9 atggtgctct gggtgttctt ctttgtgatc ctcaccctca gcaacagctc ccactgctcc ccacctcccc ctttgaccct caggatgcgg cggcacgtag atgccatctt caccaacagc taccggaagg tgctggccca gctgtccgcc cgcaagctgc tccaggacat cctgaacagg cagcagggag agaggaacca agagcaagga gcataatga 60 120 180 219 >>>> 0 12 3 1111 2 2 2 2 V < < < 10 40 PRT 人造序列 <220> <223〉豬的GHRH之胺基酸序列· <400> 10 Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin 15 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp 工le Met Ser Arg Gin Gin Gly 20 25 30 Glu Arg Asn Gin Glu Gin Gly Ala 35 40

<210> 11 <211> 3534 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223> HV-GHRH 質體 <400> 11 gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca 60 120 180 3600744vl Page 5 of 5 240 200424214 aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg 300 cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg 360 cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa 420 ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct 480 ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc 540 ccctttgacc ctcaggatgc ggcggcacgt agatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa 600 ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg 660 agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg 720 ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 780 tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 840 tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 900 cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 960 tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 1020 tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 1080 gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 1140 ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga 1200 ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg 1260 cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca 1320 ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct 1380 tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 1440 ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 1500 gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 1560 ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 1620 ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1680 cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1740 cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1800 accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1860 acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1920 cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1980 acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2040 3600744vl Page 6 of 6 200424214 atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2100 agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2160 acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2220 gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2280 gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2340 gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2400 gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga 2460 actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 2520 gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 2580 acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 2640 agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 2700 cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 2760 gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 2820 gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 2880 gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 2940 ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 3000 cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 3060 cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 3120 cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 3180 catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 3240 caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 3300 agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 3360 agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca 3420 actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 3480 gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac 3534 <210〉 12 <211> 3534 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223> 3600744vl Page 7 of7 200424214 <400> 12 gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc 60 accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg 120 gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt 180 tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca 240 aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg 300 cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg 360 cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa 420 ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct 480 ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc 540 ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatat cgatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa 600 ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg 660 agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg 720 ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 780 tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 840 tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 900 cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 960 tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 1020 tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 1080 gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 1140 ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga 1200 ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg 1260 cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca 1320 ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct 1380 tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 1440 ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 1500 gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 1560 ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 1620 ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1680 cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1740 3600744vl Page 8 of 8 200424214 cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1800 accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1860 acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1920 cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1980 acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2040 atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2100 agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2160 acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2220 gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2280 gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2340 gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2400 gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga 2460 actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 2520 gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 2580 acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 2640 agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 2700 cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 2760 gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 2820 gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 2880 gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 2940 ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 3000 cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 3060 cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 3120 cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 3180 catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 3240 caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 3300 agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 3360 agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca 3420 actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 3480 3600744vl Page 9 of 9 200424214 gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac 3534 <210> 13 <211> 3534 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223> TV-GHRH 質體 <400> 13 gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc 60 accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg 120 gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt 180 tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca 240 aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg 300 cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg 360 cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa 420 ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct 480 ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc 540 ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatgt agatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa 600 ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg 660 agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg 720 ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 780 tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 840 tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 900 cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 960 tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 1020 tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 1080 gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 1140 ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga 1200 ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg 1260 cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca 1320 ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct 1380 tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 1440 3600744vl Page 10 of 10 200424214 ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 1500 gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 1560 ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 1620 ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1680 cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1740 cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1800 accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1860 acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agdtsccagg 1920 cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1980 acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2040 atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2100 agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2160 acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2220 gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2280 gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2340 gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2400 gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga 2460 actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 2520 gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 2580 acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 2640 agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 2700 cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 2760 gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 2820 gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 2880 gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 2940 ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 3000 cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 3060 cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 3120 cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 3180 3600744vl Page 11 of 11 200424214 catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 3240 caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 3300 agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 3360 agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca 3420 actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 3480 gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac 3534 <210> 14 <211> 3534 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223> 15/27/28 GHRH 質體 <400> 14 gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc 60 accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg 120 gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt 180 tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca 240 aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg 300 cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg 360 cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa 420 ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct 480 ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc 540 ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatat cgatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa 600 ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg 660 agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg 720 ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 780 tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 840 tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 900 cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 960 tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 1020 tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 1080 gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 1140 3600744vl Page 12 of 12 200424214 ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga 1200 ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg 1260 cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca 1320 ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct 1380 tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 1440 ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 1500 gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 1560 ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 1620 ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1680 cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1740 cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1800 accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc I860 acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1920 cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1980 acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2040 atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2100 agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2160 acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2220 gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2280 gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2340 gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2400 gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga 2460 actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 2520 gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 2580 acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 2640 agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 2700 cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaaeag ttcggctggc gcgagcccct 2760 gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 2820 gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 2880 3600744vl Page 13 of 13 3600744vl 200424214 gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac <210> 15 <211〉 3534 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 野生型GHRH之質體序列 <400> 15 gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatgc agatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa ggtgctgggc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcatgagca ggcagcaggg agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct Page 14 of 14 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3534 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 7 80 840 200424214 tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 900 cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 960 tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 1020 tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 1080 gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 1140 ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga 1200 ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg 1260 cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca 1320 ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct 1380 tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 1440 ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 1500 gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 1560 ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 1620 ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1680 cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1740 cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1800 accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1860 acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1920 cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1980 acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2040 atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2100 agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2160 acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2220 gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2280 gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2340 gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2400 gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga 2460 actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 2520 gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 2580 3600744vl Page 15 of 15 3600744vl 200424214 acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac <210> 16 <211> 4260 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223> pSP-SEAP cDNA 構築體 <400> 16 ] ggccgtccgc cttcggcacc atcctcacga cacccaaata tggcgacggg tgaggaatgg tggggagtta tttttagagc ggtgaggaag gtgggcaggc agcaggtgtt ggcgctctaa aaataactcc cgggagttat ttttagagcg gaggaatggt ggacacccaa atatggcgac ggttcctcac ccgtcgccat atttgggtgt ccgccctcgg ccggggccgc attcctgggg gccgggcggt gctcccgccc gcctcgataa aaggctccgg ggccggcggc ggcccacgag ctacccggag gagcgggagg cgccaagctc tagaactagt ggatcccccg ggctgcagga attcgatatc aagcttcgaa tcgcgaattc gcccaccatg ctgctgctgc tgctgctgct gggcctgagg ctacagctct ccctgggcat catcccagtt gaggaggaga acccggactt ctggaaccgc gaggcagccg aggccctggg tgccgccaag aagctgcagc ctgcacagac Page 16 of 16 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3534 60 120 180 240 300 360 420 480 540 200424214 agccgccaag aacctcatca tcttcctggg cgatgggatg ggggtgtcta cggtgacagc 600 tgccaggatc ctaaaagggc agaagaagga caaactgggg cctgagatac ccctggccat 660 ggaccgcttc ccatatgtgg ctctgtccaa gacatacaat gtagacaaac atgtgccaga 720 cagtggagcc acagccacgg cctacctgtg cggggtcaag ggcaacttcc agaccattgg 780 cttgagtgca gccgcccgct ttaaccagtg caacacgaca cgcggcaacg aggtcatctc 840 cgtgatgaat cgggccaaga aagcagggaa gtcagtggga gtggtaacca ccacacgagt 900 gcagcacgcc tcgccagccg gcacctacgc ccacacggtg aaccgcaact ggtactcgga 960 cgccgacgtg cctgcctcgg cccgccagga ggggtgccag gacatcgcta cgcagctcat 1020 ctccaacatg gacattgacg tgatcctagg tggaggccga aagtacatgt ttcgcatggg 1080 aaccccagac cctgagtacc cagatgacta cagccaaggt gggaccaggc tggacgggaa 1140 gaatctggtg caggaatggc tggcgaagcg ccagggtgcc cggtatgtgt ggaaccgcac 1200 tgagctcatg caggcttccc tggacccgtc tgtgacccat ctcatgggtc tctttgagcc 1260 tggagacatg aaatacgaga tccaccgaga ctccacactg gacccctccc tgatggagat 1320 gacagaggct gccctgcgcc tgctgagcag gaacccccgc ggcttcttcc tcttcgtgga 1380 gggtggtcgc atcgaccatg gtcatcatga aagcagggct taccgggcac tgactgagac 1440 gatcatgttc gacgacgcca ttgagagggc gggccagctc accagcgagg aggacacgct 1500 gagcctcgtc actgccgacc actcccacgt cttctccttc ggaggctacc ccctgcgagg 1560 gagctccatc ttcgggctgg cccctggcaa ggcccgggac aggaaggcct acacggtcct 1620 cctatacgga aacggtccag gctatgtgct caaggacggc gcccggccgg atgttaccga 1680 gagcgagagc gggagccccg agtatcggca gcagtcagca gtgcccctgg acgaagagac 1740 ccacgcaggc gaggacgtgg cggtgttcgc gcgcggcccg caggcgcacc tggttcacgg 1800 cgtgcaggag cagaccttca tagcgcacgt catggccttc gccgcctgcc tggagcccta 1860 caccgcctgc gacctggcgc cccccgccgg caccaccgac gccgcgcacc cgggttactc 1920 tagagtcggg gcggccggcc gcttcgagca gacatgataa gatacattga tgagtttgga 1980 caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt 2040 gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat 2100 tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac 2160 aaatgtggta aaatcgataa ggatccgtcg accgatgccc ttgagagcct tcaacccagt 2220 cagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac tatcgtcgcc gcacttatga ctgtcttctt 2280 3600744vl Page 17 of 17 200424214 tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgccggc agcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 2340 cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 2400 ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 2460 aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggegttttt ccataggctc cgcccccctg 2520 acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 2580 gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 2640 ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 2700 gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 2760 cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 2820 taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 2880 atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 2940 cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 3000 cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 3060 ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 3120 ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 3180 tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 3240 aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 3300 tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 3360 gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 3420 atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 3480 tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 3540 ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 3600 ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 3660 tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 3720 ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 3780 ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 3840 tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 3900 gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 3960 taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 4020 cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 4080 3600744vl Page 18 of 18 200424214 agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 4140 gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 4200 ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gcgccctgta 4260 <210> 17 <211> 2710 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉小鼠之密碼子經最適化之GHRH質體 <400> 17 tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct 60 cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt 120 ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg 180 gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg 240 tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct 300 cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag 360 cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac 420 agctcaccta gctgccatgg tgctctgggt gctctttgtg atcctcatcc tcaccagcgg 480 cagccactgc agcctgcctc ccagccctcc cttcaggatg cagaggcacg tggacgccat 540 cttcaccacc aactacagga agctgctgag ccagctgtac gccaggaagg tgatccagga 600 catcatgaac aagcagggcg agaggatcca ggagcagagg gccaggctga gctgataagc 660 ttatcggggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc 720 actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag 780 gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg 840 aagacaacct gtagggctcg agggggggcc cggtaccagc ttttgttccc tttagtgagg 900 gttaatttcg agcttggtct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 960 ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 1020 gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 1080 aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 1140 gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 1200 ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 1260 3600744vl Page 19 of 19 1320 1320 3600744vl 200424214 cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggctagc gcttagaaga actcatccag cagacggtag aatgcaatac gttgagagtc tggagctgca ataccataca gaaccaggaa acggtcagcc cattcaccac ccagttcctc tgcaatgtca cgggtagcca gtgcaatgtc ctggtaacgg tctgcaacac ccagacgacc acagtcaatg aaaccagaga aacgaccatt ctcaaccatg atgttcggca ggcatgcatc accatgagta actaccaggt cctcaccatc cggcatacga gctttcagac gtgcaaacag ttcagccggt gccagaccct gatgttcctc atccaggtca tcfitggtcaa ccagacctgc ttccatacgg gtacgagcac gttcaatacg atgttttgcc tggtggtcaa acggacaggt agctgggtcc agggtgtgca gacgacgcat tgcatcagcc atgatagaaa ctttctctgc cggagccagg tgagaagaca gcaggtcctg acccggaact tcacccagca gcagccagtc acgaccagct tcagtaacta catccagaac tgcagcacac ggaacaccag tggttgccag ccaagacaga cgagctgctt catcctgcag ttcattcaga gcaccagaca ggtcagtttt aacaaacaga actggacgac cctgtgcaga cagacggaaa acagctgcat cagagcaacc aatggtctgc tgtgcccagt cataaccaaa cagacgttca acccaggctg ccggagaacc tgcatgcaga ccatcctgtt caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca actgttggga agggcgatcg <210〉 18 <211> 2713 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉大鼠之密碼子經最適化之GHRH質體 Page 20 of 20 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2710 200424214 <400> 18 tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct 60 cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt 120 ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg 180 gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg 240 tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct 300 cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag 360 cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac 420 agctcaccta gctgccatgg ccctgtgggt gttcttcgtg ctgctgaccc tgaccagcgg 480 aagccactgc agcctgcctc ccagccctcc cttcagggtg cgccggcacg ccgacgccat 540 cttcaccagc agctacagga ggatcctggg ccagctgtac gctaggaagc tcctgcacga 600 gatcatgaac aggcagcagg gcgagaggaa ccaggagcag aggagcaggt tcaactgata 660 agcttatcgg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt 720 gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac 780 taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt 840 gggaagacaa cctgtagggc tcgagggggg gcccggtacc agcttttgtt ccctttagtg 900 agggttaatt tcgagcttgg tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 960 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 1020 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 1080 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 1140 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 1200 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 1260 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 1320 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 1380 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 1440 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 1500 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 1560 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 1620 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 1680 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggct agcgcttaga agaactcatc 1740 3600744vl Page 21 of 21 3600744vl 200424214 cagcagacgg tagaatgcaa tacgttgaga gtctggagct gcaataccat acagaaccag gaaacggtca gcccattcac cacccagttc ctctgcaatg tcacgggtag ccagtgcaat gtcctggtaa cggtctgcaa cacccagacg accacagtca atgaaaccag agaaacgacc attctcaacc atgatgttcg gcaggcatgc atcaccatga gtaactacca ggtcctcacc atccggcata cgagctttca gacgtgcaaa cagttcagcc ggtgccagac cctgatgttc ctcatccagg tcatcctggt caaccagacc tgcttccata cgggtacgag cacgttcaat acgatgtttt gcctggtggt caaacggaca ggtagctggg tccagggtgt gcagacgacg cattgcatca gccatgatag aaactttctc tgccggagcc aggtgagaag acagcaggtc ctgacccgga acttcaccca gcagcagcca gtcacgacca gcttcagtaa ctacatccag aactgcagca cacggaacac cagtggttgc cagccaagac agacgagctg cttcatcctg cagttcattc agagcaccag acaggtcagt tttaacaaac agaactggac gaccctgtgc agacagacgg aaaacagctg catcagagca accaatggtc tgctgtgccc agtcataacc aaacagacgt tcaacccagg ctgccggaga acctgcatgc agaccatcct gttcaatcat gcgaaacgat cctcatcctg tctcttgatc agatcttgat cccctgcgcc atcagatcct tggcggcaag aaagccatcc agtttacttt gcagggcttc ccaaccttac cagagggcgc cccagctggc aattccggtt cgcttgctgt ccataaaacc gcccagtcta gcaactgttg ggaagggcga teg <210> 19 <211〉 2716 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223〉牛之密碼子經最適化之GHRH質體 <400> 19 ccaccgcggt ggcggccgtc cgccctcggc accatcctca cgacacccaa atatggegae gggtgaggaa tggtggggag ttatttttag agcggtgagg aaggtgggca ggcagcaggt gttggcgctc taaaaataac tcccgggagt tatttttaga geggaggaat ggtggacacc caaatatggc gacggttcct cacccgtcgc catatttggg tgtccgccct cggccggggc cgcattcctg ggggccgggc ggtgctcccg cccgcctcga taaaaggctc cggggccggc ggcggcccac gagctacccg gaggageggg aggcgccaag cggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct gtgggtgttc ttcctggtga ccctgaccct gageagegga agccacggca gcctgcccag ccagcccctg Page 22 of 22 1800 I860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2713 60 120 180 240 300 360 420 480 200424214 aggatcccta ggtacgccga cgccatcttc accaacagct acaggaagat cctgggccag 540 ctgagcgcta ggaagctcct gcaggacatc atgaacaggc agcagggcga gaggaaccag 600 gagcagggcg cctgataagc ttatcggggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc 660 tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt 720 gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat 780 ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct gtagggctcg agggggggcc cggtaccagc 840 ttttgttccc tttagtgagg gttaatttcg agcttggtct tccgcttcct cgctcactga 900 ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 960 acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 1020 aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 1080 tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 1140 aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 1200 gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 1260 acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 1320 accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 1380 ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 1440 gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 1500 aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 1560 ctcttgatcc gacaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 1620 gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 1680 cgctcagcta gcgctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa 1740 tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct 1800 tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg I860 ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg caagcaggca 1920 tcgccatgag tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac 1980 agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg 2040 gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag 2100 gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga tactttctcg 2160 gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag 2220 3600744vl Page 23 of 23 200424214 tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc 2280 agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc agttcattca gggcaccgga caggtcggtc 2340 ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga acacggcggc atcagagcag 2400 ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa 2460 cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatg cgaaacgatc ctcatcctgt ctcttgatca 2520 gatcttgatc ccctgcgcca tcagatcctt ggcggcaaga aagccatcca gtttactttg 2580 cagggcttcc caaccttacc agagggcgcc ccagctggca attccggttc gcttgctgtc 2640 cataaaaccg cccagtctag caactgttgg gaagggcgat cgtgtaatac gactcactat 2700 agggcgaatt ggagct 2716 <210〉 20 <211> 2716 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223〉羊之密碼子經最適化之GHRH質體 <400> 20 ccaccgcggt ggcggccgtc cgccctcggc accatcctca cgacacccaa atatggcgac 60 gggtgaggaa tggtggggag ttatttttag agcggtgagg aaggtgggca ggcagcaggt 120 gttggcgctc taaaaataac tcccgggagt tatttttaga gcggaggaat ggtggacacc 180 caaatatggc gacggttcct cacccgtcgc catatttggg tgtccgccct cggccggggc 240 cgcattcctg ggggccgggc ggtgctcccg cccgcctcga taaaaggctc cggggccggc 300 ggcggcccac gagctacccg gaggagcggg aggcgccaag cggatcccaa ggcccaactc 360 cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct gtgggtgttc 420 ttcctggtga ccctgaccct gagcagcgga agccacggca gcctgcccag ccagcccctg 480 aggatcccta ggtacgccga cgccatcttc accaacagct acaggaagat cctgggccag 540 ctgagcgcta ggaagctcct gcaggacatc atgaacaggc agcagggcga gaggaaccag 600 gagcagggcg cctgataagc ttatcggggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc 660 tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt 720 gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat 780 ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct gtagggctcg agggggggcc cggtaccagc 840 ttttgttccc tttagtgagg gttaatttcg agcttggtct tccgcttcct cgctcactga 900 ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 960 3600744vl Page 24 of 24

200424214 acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 1020 aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 1080 tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 1140 aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 1200 gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 1260 acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 1320 accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 1380 ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 1440 gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 1500 aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 1560 ctcttgatcc gacaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 1620 gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 1680 cgctcagcta gcgctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa 1740 tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct 1800 tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg 1860 ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg caagcaggca 1920 tcgccatgag tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac 1980 agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg 2040 gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag 2100 gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga tactttctcg 2160 gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag 2220 tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc 2280 agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc agttcattca gggcaccgga caggtcggtc 2340 ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga acacggcggc atcagagcag 2400 ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa 2460 cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatg cgaaacgatc ctcatcctgt ctcttgatca 2520 gatcttgatc ccctgcgcca tcagatcctt ggcggcaaga aagccatcca gtttactttg 2580 cagggcttcc caaccttacc agagggcgcc ccagctggca attccggttc gcttgctgtc 2640 cataaaaccg cccagtctag caactgttgg gaagggcgat cgtgtaatac gactcactat 2700 3600744vl Page 25 of 25 200424214 3600744vl agggcgaatt ggagct <210> 21 <211> 2713 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223> 雞之密碼子經最適化之GHRH質體 <400> 21 tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac agctcaccta gctgccatgg ccctgtgggt gttctttgtg ctgctgaccc tgacctccgg aagccactgc agcctgccac ccagcccacc cttccgcgtc aggcgccacg ccgacggcat cttcagcaag gcctaccgca agctcctggg ccagctgagc gcacgcaact acctgcacag cctgatggcc aagcgcgtgg gcagcggact gggagacgag gccgagcccc tgagctgata agcttatcgg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa cctgtagggc tcgagggggg gcccggtacc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt tcgagcttgg tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat Page 26 of 26 2716 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1500 3600744vl 200424214 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggct agcgcttaga agaactcatc cagcagacgg tagaatgcaa tacgttgaga gtctggagct gcaataccat acagaaccag gaaacggtca gcccattcac cacccagttc ctctgcaatg tcacgggtag ccagtgcaat gtcctggtaa cggtctgcaa cacccagacg accacagtca atgaaaccag agaaacgacc attctcaacc atgatgttcg gcaggcatgc atcaccatga gtaactacca ggtcctcacc atccggcata cgagctttca gacgtgcaaa cagttcagcc ggtgccagac cctgatgttc ctcatccagg tcatcctggt caaccagacc tgcttccata cgggtacgag cacgttcaat acgatgtttt gcctggtggt caaacggaca ggtagctggg tccagggtgt gcagacgacg cattgcatca gccatgatag aaactttctc tgccggagcc aggtgagaag acagcaggtc ctgacccgga acttcaccca gcagcagcca gtcacgacca gcttcagtaa ctacatccag aactgcagca cacggaacac cagtggttgc cagccaagac agacgagctg cttcatcctg cagttcattc agagcaccag acaggtcagt tttaacaaac agaactggac gaccctgtgc agacagacgg aaaacagctg catcagagca accaatggtc tgctgtgccc agtcataacc aaacagacgt tcaacccagg ctgccggaga acctgcatgc agaccatcct gttcaatcat gcgaaacgat cctcatcctg tctcttgatc agatcttgat cccctgcgcc atcagatcct tggcggcaag aaagccatcc agtttacttt gcagggcttc ccaaccttac cagagggcgc cccagctggc aattccggtt cgcttgctgt ccataaaacc gcccagtcta gcaactgttg ggaagggcga teg <210〉 22 <211> 40 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223〉GHRH之經修飾之AA序列 <400〉 22 Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin 15 10 15 Page 27 of 27 1560 1620 1680 1740 1800 I860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2713 200424214 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Met Ser Arg Gin Gin Gly 20 25 30 Glu Ser Asn Gin Glu Arg Gly Ala 35 40 <210> 23 <211> 40 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 狗-GHRH之胺基酸序列 <400> 23 Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin 15 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Met Ser Arg Gin Gin Gly 20 25 30 Glu Arg Asn Arg Glu Gin Gly Ala 35 40 <210> 24 <211〉 40 <212> PRT <213> 人造序列 <220〉 <223〉貓-GHRH之胺基酸序列 <400> 24 Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin 15 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Met Ser Arg Gin Gin Gly 20 25 30 Glu Arg Asn Gin Glu Gin Gly Ala 35 40 3600744vl Page 28 of 28