TW200410708A - Trefoil domain-containing polypeptides and uses thereof - Google Patents
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200410708 玫、發明說明: v 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於上皮細胞損害的治療。 【先前技術】 上皮細胞包附身體與内臟表面,並用以保護其免受外部環境干擾。例 如、,皮膚的上皮細胞可防止或減少脫水以及紫外線的傷害,幫助溫度恆定, 且為抵抗化學物質、溫度傷害、以及致病微生物感染的第—線防護。然而, 由於上皮細胞位在外部環境及内臟的交界,亦提供方法來控制養分的移 動,以及廢物進出體内。例如,腸胃道的上皮組織(簡稱GI tract),保護j 被其下的_免於消化酵素、胃酸、以及食人之微生物的傷害。上皮細胞f 也提供攝入養分的吸收性表面。 上皮細胞的傷害或感染可能會危及其屏障與吸收功能。因此,許多上 心田胞族群都具有高度再生及修復能力。然而,許多病理狀況與環境傷害 可旎破壞上皮組織所具備之功能,進而導致組織整體的致命後果。因此, 維護健康的上皮組織對整體健康及個體有明顯益處。 【發明内容】 本發明之特徵為用以治療或預防哺乳類(如人類)之上皮損害的治療方 法與組合物,其係單獨地使用含三葉功能部位的多胜&(计aef〇ii (» domain-containing polypeptides,簡稱 TDCP)或是三葉胜狀 三葉治療),歧熟錢肇合制。树敗搬 佳地包含一或多個三葉功能部位,其具有實質上與序列識別號· 3—5中 序列相同之胺基酸序列。其中特別有用的三葉胜肽片段包含,例如, hITFl5-73 ^ hITF25-62 ^ hITF22-62 ^ hITF21-62 ^ hITF25-70 ^ hITF22-7〇 5 hITF2i-70 ^ hITF25 hITF㈣,hITF㈣,hITF25-73,hITF㈣,以及 是 EA-hITF^3。 本發明的三葉治療,可用於一種用以治療或預防消化道,包括口腔、 舌、食道、胃、小及大腸、以及遠端小腸;真皮或表皮;陰道或子官頸上 5 200410708 皮;啤吸道上皮;或角膜或結膜上皮之上皮損害的方法。 上消化道的損害包含,例如,黏膜炎及鶴口瘡,或是 化=療,化學、熱、或骑灼傷,牙齦炎,腿二 2、或真賊染。遠端小腸的損害包含,例如,黏膜炎、ϋ、 i隆^,與潰雜結腸炎,或是由下列方式引起:抗癌化學治療,化學、 射灼傷、生檢過程或手術介人,軸切除,以及 真囷感染。其它腸胃道損害包含胃潰瘍。 内嘗 真皮或上皮之損害包含,例如,疱雜損傷,痤瘡,褥瘡,渴瘡,牛
=或是由下列方式引起,例如,創傷,手術過程,過敏原,化學/、熱、 或幸田射灼傷,以及細菌、病毒、或真菌感染。 過敏,道ίί官頸上皮的損害,是由,例如,性傳染病,抗癌治療,創傷, 過程,化學、熱、或姉灼傷,及細菌、病毒、或真 国琢染。 输異I吸道上皮軸害疋由’例如’過敏反應,氣喘,化學性暴露,石 ’創傷’吸人煙霧或是顆粒,藥物導致的肺損傷,手術過程,插管 =知,慢性阻塞⑽臟疾病,高壓氧氣治療,以及細菌、真菌、或病毒 * ^用於本發明之方法及組合物的眼部疾病包含,例如,表面點狀角膜 ^角膜潰瘍’疱療病毒_病毒引起的角膜結膜炎,物理性創傷,眼部# =,化學性曝曬,紫外線曝€,錐性脑,結合膜,乾㈣膜結膜炎(乾· 又症),眼部發炎,瘢痕類天泡瘡,細菌或原蟲感染。 、,夕=㈣的TD㈣及三葉胜肽片段可職方為能以任何合適的方式來傳 拉鍵而治療受感染的組織。例如,TDCP以及三葉胜肽片段可以配製成 ^於靜脈内、肌肉内、皮下注射、或眼内注射,献漱口水、口喷劑、可 入液體’检劑、灌腸劑、子官栓劑'或是陰道洗劑,乾粉吸 霧 劑、眼藥水。 、二葉轉也可以與第二種治療藥劑合用。該第二種藥劑,可以與TDCP 以及三葉胜肽片段使_同或不同_學組合物,以及使肋同或不同的 6 200410708 路徑。此外,第二種治療藥劑不須要與三葉治療的頻率或療程相同。合適 的第二種藥劑包含,例如,止痛劑、抗病毒劑、抗細菌劑、抗真菌劑、抗 增生(即化學治療)劑、抗發炎劑、及類固醇。 於本發明之另一型態,其特徵為分離之核酸分子及載體,該載體包括 戎分離之核酸分子,其編碼含三葉功能部位的胜肽,宿主細胞(如大腸桿菌 (尤’巴斯德畢赤酵母(户· ,裂殖酵母菌,釀 酒酵母菌(5: ce/w/s/ae),乳酸菌),以及表現上 述核S文分子的植物細胞(例如單子葉綱,如米、小麥、玉米、大麥、及黑麥)。 本發明的TDCPs以及三葉胜肽片段,可以是單體、同源雙體、異源雙 體、或是多體。雙體可以是同源雙體或是異源雙體,而異源雙體可以包含 一全長三葉胜肽(如HITF),以及任何本發明之TDCPs或片段,或是任何 TDCPs及片段的組合。最佳地,雙體中的成員皆有生物活性。TDCp以及三 葉胜肽片段,可以經轉譯後修飾,不論是糖基化,雙肽加成,或是蛋白分 解。 「二葉胜是指所有人類解抽筋多胜肽(hSP;亦稱為TFj?2,基因銀 行登錄號NM_005423),人類pS2(亦稱為TFF1,基因銀行^錄號 XM_009779) ’人類腸三葉因子(hITF;亦稱為吓⑺)的同源基因。 " 哺乳類三葉胜肽發現於1982年。其中的人類腸三葉因子(hITF; TFF3),經最詳細定性,且記載於美國專利號6, 〇63, 755以及6 22ι ,’ 在此皆併人為參考文獻。其它二個已知的三葉峨是人_抽筋多 (hSP;TFF2)及pS2(TFF1)。腸三葉因子,⑽述於文獻(Sands ,版
Rev· PhysiolU53-273,1親),其表現於胃腸道,且有三環社構, 由保留性半脘胺酸殘基之間之鏈内雙硫鍵所組成)。這坻 = 以及用來_道病如祕·_與發義病。以人===基 因己在非人__频。所有蛋自家族,包括人類 此皆稱為三葉胜肽。 、卜财在 「三葉功能部位」是指與包括序列識別號:3—6中任一個 同的胜肽,其分別是hpS23〇, hSPl^,以及hITF24 64,且八 葉二級結構。上述四個人類三葉功能部位的峨序列比對顯示在第^圖二 200410708 目前己知其中六個保留性半胱胺酸的功能是授與該蛋白之三環結構。此環 狀結構形成鍵内雙硫鍵,包含有cysi-cys5 (相對應hITF之胺基酸殘基25 以及51;序列識別號:i),cyS2—cyS4 (相對應hITF之胺基酸殘基35以及 5〇;序列識別號:1),以及cysrcys6 (相對應hITF之胺基酸殘基45以及 62;序列識別號:1)。 針對三葉胜肽,所謂「片段」是指任何多胜肽,其全長與自然界存在 的二葉胜相同,並含有三葉功能部位。因此,hITF/hTFF3片段有72或更 少的胺基酸,hpS2/hTFFl (基因銀行登錄號NPJ303216)片段有83或更少的 胺基酸’ hSP/hTFF2 (基因銀行登錄號1909187A)片段有105或更少的胺基
其中,任一狀況的片段可以明顯小於全長的蛋白。例如,該片段可以 含有或小於65,含有或小於58,含有或小於52,或是與42個胺基酸一樣 少。WTF/TFF3中特別有用的片段包含,例如,獅15為麗25%,麗 hITF2l-62, hITFl-62, hITF25-70, hITF22-70, hITF2l-70, hITFl-70, hITF25-72, hITF22-72, hITF21-72, hITFi-72, hITF25-73,以及 hITF22-73,(第 1A 圖)。 「三葉功能部位胜肽」或是「」是指一胜肚,含有三葉功能部位, 从二ί與自然界的三葉胜肽不同。TDGPS可包括三葉胜肽片段,其共價性 個胜肽或是蛋白上,或者包括—胜肽接到三葉功能部位。第二 或 =可以給予其它的生物或治療活性,與线界所賦予三葉胜狀 固例ΐ ’三葉胜肽片段可共價性地接到N端,c端,或是鏈 7列如’藉由第二個胜肽内的半胱胺酸, — 。在後—個例子,三葉功能部位可以併入到-「載體」蛋ΐ ΐ白須㈣賴蛋㈣,可以依據 段單獨比較時,載體蛋活性(或缺乏以上者)。與搬或是片 白,可以增加TDCP的半衰期。“、又上,、彳貝性地接入一血清白蛋 曰片^二及三葉輯片段可以是單體、雙體、或是多體。單體的TDCp $ 疋仏’可以用_雙硫鍵來形成雙體,例如,itf單體可^在^^^ 8 200410708 位外的半胱胺酸形成鏈内雙硫鍵。例如,人類ITF位置71上的半脱胺酸可 以促進雙體形成。 胃8^&_^^〇^乳_源蛋白)的片段,或是非自然界的 夕胜肽。非自然界的TDCPs,其全長不會職與自然界的蛋白相同。但是, 非自然界的TDCP最佳地是與自然界存在的蛋白相同。 針對序列識別號-6時,「實質上相同」是指胺基酸序列僅有4,3,2, 或1個插入,取代或是刪除。 同一源雙體」疋才曰TDCP或二葉胜肽片段,與另一個胺基酸序列相同的 TOP或三葉胜肽片段,以鏈内共價(雙硫鍵)連結成雙體。「異源雙體」是 ,TDCP或三葉胜肽片段,與另一個胺基酸序列不相同的TDcp或片段,或 疋與任-個二葉胜肽,以鏈間共價方式連結成雙體。例如,異源雙體可以 含有-個ITF胜肽及任-個TDCP。此外,_ TDCp異源雙體可以有一個TDCp, ,另=個非生物活性三葉胜肽或非三_肽形成雙硫鍵。鏈艘硫鍵最好 疋在二葉胜肽的第七個半胱胺酸,例如,hITF相對應的啊;然而,雙體 化可以疋任何的鏈間雙硫鍵結,但不破壞生物活性。「多體」是指·或 二葉胜肽片段,與另—個或多個TDCp或其它胜肽,形成—個或多個鍵間雙 t鍵1外,多體可以是非共價性的專一性作用。例如,itf同源或異源雙 體可以辯識以及專-性地結合到黏多糖上以形成多體。 「含複數三葉功能部位多胜肽」或「MTDCp」是非自然界的多胜月太,含 個或夕個二葉功能部位,藉由胜肽鍵連結,其中的三葉功能部位是由 大=2個胺基酸的連結序列分開。㈣pCs可以與本發明的任何⑽或三葉 胜肽片「段交換。製備嵌合膽PCs的方法已詳載於重組醜技術領域。 「三葉治療」係指—治療組合物或方法,包括或採用—或多個本發明 之TDCP及/或三葉胜肽片段。 「轉譯後修_」是指在胜肽、多胜肽、或蛋白上之共價性、酵素性、 =化Γ性的修飾。轉譯後修飾可以在專一性的胺基酸,或是在胜肽、多胜 舰白上特々的序壯。轉譯齡飾之例示包括在絲賴殘基之氧基 靜’在天門冬酸·上之胺基糖化,磷酸化(經由氧基為在職酸、經丁 及絡胺6sl ,經由胺基為在組胺酸、離胺酸、及精胺酸),羥基化,硫 200410708 化’乙醯化’醯基化’以及絲化m的轉譯後修飾之—是由 及非專-性的蛋白酶酶進行蛋白分解,以及經由非酵素性方法 風 水紙如酸水解,漠化氰料的甲硫胺酸分解)。專一性的 ; 白轉化酶⑽用在訊息序列,如α_因子分泌序列,絲胺二 乳酶 '胰蛋白酶),以及甲硫胺酸胺基胜肽酶。其它的蛋白酶包含彈性 酶,勝原蛋白酶,天Η冬纖,半胺天冬酶,以及金屬蛋白酶。轉= 飾也包含胺基酸及胜肽加入到蛋白。例如,離胺酸殘基可以進行泛激: 或蛋白的胺基端可以進行雙、三或多個胜肽加成。 “
於-較佳實施例,TDCP或片段係經轉譯後修飾以併人蛋白分解過程, 雙胜肽加成,以及糖化作用。一胜肽,多胜肽,或蛋白可包或一 譯後修倚作用。 「共配方」是指任何單一藥學組合物,含有二或更多的治療或生物活 性藥劑。 「藥學組合物」是指含有至少一治療或生物活性藥劑,且適於給予病 患。針對本發明目的,適於輸送藥劑到表皮表層的藥學組合物包含,但不 限於,口服錠劑及溶液,生物可分解片,黏吸咐劑,微球,乳油,乳劑, 眼藥水’吸入劑,栓劑,灌腸劑,及貼劑。上述配方可以用熟知及可接受 ^ ° Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000
反 Encyclopedia of Pha醜ceutical Technology,咖· L 及 J. C. Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York。 「治療有效劑量」是指足以提供療效的劑量。當依照本發明的方法給 予人類病患TDCPs或三葉胜肽片段時,治療有效劑量一般為約每劑量卜25〇〇 宅克活性三葉治療。治療有效劑量的範圍,少至每劑量1〇, 25, 50, 1〇〇, 2〇0 耄克,多至每劑量300,500,750,1〇〇,1500,或2000毫克。 「腸道」是指任何遠離幽門括約肌的消化系統部份,包含小腸及大腸 (包括遠端腸道)。 「遠端腸道」是指消化系統的部份,含升結腸、橫結腸、降結腸、及 乙狀結腸’直腸’及肛門括約肌。 10 200410708 「上消化道」綠H統㈣份,接近胃的賁門域•門 約肌)。專-性地’上消化道是指包括口腔,及 (、 下組織,硬及娜)及食道。 ^ ^ 「消化道」是包含上消化道,胃,腸道及結束於肛門括約肌。 「生物活性」,對於三葉糧、TDCp、或片段時,是指任 能展現其自·家射相_活性,输性常級小腸三荦峨。除了 此所述之活性證明,生物活性包含,例如,改變哺乳動物胃腸道活動能力, 黏多糖結合、黏膜之維持'及讀時黏膜完整的修復(請參見T卿h
Proc· Natl· Acad. Sci, USA, 97:799-804,1999)。 ·’ 「抗微生物劑」是指任何缺變細g或真g細胞,原蟲,或病毒生長 的化合物,其生長受止,穩定,或抑制,或此微生物被殺死。換言之, 抗微生物劑可以是殺菌劑或是微生物穩定劑。 「抗癌治療」是指絲治療癌細胞的任何療法。傳統上抗癌治療包 化學治療及放射線治療。 【實施方式】 本發明提供治療上皮細胞損害的方法與組合物。適合 =物,的損害,包含有真皮或表皮(皮膚)的上皮,消化道包含=:、 錢大腸(間括娜、直腸、及結腸、特殿乙狀結腸及降处 5傷??道(制是陰道、子官頸,及子宮),氣管,肺,鼻腔及眼i .月啊沾庙貝害使用本發明的膽或三葉胜肽片段(藉由三葉治療),做 治療藥劑結合,也可以藉由任何有助於傳送 藥學配方 消化道組合物 灌腸劑 體積送本發明三葉治療的灌腸劑是滯留劑,而非排淨劑。當使用的 時,、^以0mL時,可傳送到直腸及乙狀結腸。但若使用體積約150-250虬 以傳送到降、橫結腸,有些情形下可以到升結腸。 11 200410708 栓劑 上
治療潰瘍性結腸炎的含三葉灌腸劑 ITF21-73 750 mg 硫氮磺氨啶 3 grams 蒸鶴水 250 mL 適於冷凍用之大量灌腸懸浮劑 ITF21-73 5 g/L 5-胺柳酸 42 g/L 鱗酸二氫鈉 0. 4 g/L 磷酸氫鈉 4. 48 g/L 氣化鈉 9 g/L 抗壞血酸化鈉 0. 5 g/L 樹膠 4 g/L 對羥笨曱酸曱脂 2 g/L 對羥苯甲酸丙脂 0. 5 g/L 丙二醇 25 mL/L 蒸餾水 補充到1L 栓劑是固態形式,用來塞入直腸,傳送藥 ,塞入後’栓劑軟化、溶化、懸浮化、或溶解於腔液内。成=直= 劑通常約2-5克,在兩端錐形化。嬰賴栓劑—般是成人用體積的一半心 脂溶性或是水溶性/水可互溶性的栓劑基質,可以用於本發明的组人 物。合適的脂肪基質,例如,可可脂,可可油,脂化、氣化、甘油基丁化口, 以^高分子聚乙稀甘油化的植物油。持續性釋放以及/或長效性^接觸, 可藉由選擇合適的脂性栓劑基質來達成。可可脂,例如,在體溫下溶解迅 速,但與體液不互溶,導致脂溶性藥劑能長效,但傳送性低至感染位置。 另外,水/谷或水可互 >谷基質(聚乙稀甘油以及甘油介面活性物),可以溶解 或分散迅速,導致藥劑很快傳送到感染位置。 下列是一栓劑配方的例子。 含三葉栓劑藥片 12 200410708 ITp21·73 300 mg 聚乙稀甘油1000 96% 聚乙稀甘油4000 4% ”灰组口物熔點低,可能須要冷藏來維持_。因為而^及三葉胜狀片 =蛋白性,冷藏是較適當。配方的健離f,導致塞人後迅速融化, 1病人的舒韻。如果無法冷藏,賴要制熱成型技術,聚乙稀侧 的$可以增加,以達到配方之熱穩定性。 其它含三葉溶液的技術特徵,可經修飾以符合特殊藥學配方以及臨床 =症。· ’配謂pH及渗透壓可_整而賦予三葉胜臟定性,且能 減少腸胃道的刺激與敏感性。 口腔喷劑,灌洗以及乳射 得达樂_上消化道及呼吸道,侧,魏是制有效。合適的喷 ^包含壓力傳送及非壓細力_送系統。含三葉峨溶液以口腔喷劑 傳送’最好是水溶液;但有機與無機組合物,乳化劑,賦形劑,及 能性質(香劑與氣味劑)等試劑亦可併入。溶液最好可以含防腐劑以防止微 生物的生長(如對經苯曱酸甲脂)。雖然水本身可以包含所有的載體, 統上,液態喷劑配方含有共溶劑,例如,丙二醇,玉米糖漿,甘油 酵,介面活性劑,以及她物來輔助溶化及併人林溶物質。―㈣/、 本發明的組合物較佳地含有卜95% v/v,最佳地,約5_55% v/v的=容° ’ 患者傳統上每天自行個卜5次。噴_統正常地設計騎次傳送、^
W ’而、冶療可能須要每劑卜5次。喷劑配方的流變性經由最佳化 力及霧化絲成微滴、此外,喷⑽、祕由設計,形成 I 上消化道或呼吸道絲絲面。 適合口腔喷劑消化道的成份,也可配製成口腔清潔劑或漱口 此方式來舒TDCPs及三雜似段,—般是賴此組合物漱^用 口腔。最好是這此組合物可財人,提供此三葉_治_食道,:…包 及/或小腸。本方式對於患有小腸上皮相關疾病的病人特別有^^ ^以 受k癌化療的患者,除了口腔黏膜外’常在腸胃道發展遠端損宝 田接 腸的上皮損傷。目前已知三葉胜肽,特別是Hitf,在胃的pH下^定。及 200410708 服用設計來治療口腔黏的含三葉” 盆它含二葦:容液的皿;沩化道損傷(如胃及腸)。 、^二 # 技核,可經修飾以符合特殊藥學配方以及臨庆 正之治療。例如’配方的⑽及滲透壓,可經調整而^ : 性,且能減少腸胃道的刺激與敏感性。、σ予一葉胜肽L疋 軟膏,糊,及凝膠 因為創傷導致的口腔及食道上皮損傷,可以 :聰,方式的黏稠性質可以直細在受傷位;。=佳 收盍敷料,用來維持含三葉組合物,倾傷口免於創傷,以及/或吸
上皮雜性是特別有用。黏稠的製備物也具 有局部阻㈣能,進喊少做與_。 頭祕/、 吸嘴藥片’菱形糖,以及糖果貯藏室 製備含三葉胜肽組合物㈣嚼藥片、菱形糖、或糖果貯藏室,如口香 置(口及食朴第二,使肢種配製法可以導致患者較高的配合度, 尤其給予三葉胜肽的對象是小孩子時。 吸嚼藥片的配製已是熟知的技藝’傳統上含有糖、殿粉或指質及 劑基質。其中一個範例如下。 含三葉咀嚼藥片配方(每片) ITF21-73 - 300 mg 甘露糖醇- 675 mg 1 微結晶纖維素-75mg 玉米殿粉-30 mg 硬脂鈉-22 mg 將藥劑併人且嚼藥片及其它糖果貯藏室已^熟知的技藝(美國專利號 5, 858, 391)。任何咀嚼或口服滯留組合物也可以含有香味劑,例如,糖精 鈉或薄荷油。 生殖泌尿道組合物 陰道沖洗劑 14 200410708 陰道冲洗劑或灌洗器’用來傳送腸三葉胜肽到陰道及子官頸的細胞 灌洗器的體積約50-300mL。 治療輕微陰道刺激用含三葉灌洗器 ITF21-73 500 mg 聚維酮碘片 0.30 %
蒸餾水 150 mL 陰道栓劑及子官托 检劑是固態形式,用來塞入直腸,傳送藥劑到直腸及乙狀結腸。傳統 ^,基入後’栓劑軟化、溶化、懸浮化、或溶解於腔液内。陰道检劑約卜7 f ’在兩端錐形化。脂溶性或是水溶性/水可互溶性的检劑基質,可以用於 本發明的組合物。合適的脂肪鋪,例如,可可脂,可可油,脂化、氣化、 ^由,丁化,以及高分子聚乙稀甘油化的植物油。持續性釋放以及/或長效 =樂别接觸’可藉由選擇合適的脂性栓劑基f來達成。可可脂,例如,在 溶解迅速,但與體液不互溶,較脂溶性_能長效,但傳送 ====劑及子官托的製備及舰是熟知的技藝。許多製備 陰道軟膏,糊,及膠 來傳生瘦器、周圍皮膚的損傷’可以用軟膏,糊,及凝膠 受傷位ΐ可式的黏祠性質可以直接應用在受傷位置。最佳地, 及/或吸收物At’丨It轉含三餘合物,紐傷口免於創傷,以 • m A 〃出物。由下列會提到,對於經創傷手術,如抽牙,組織切Η 上 除了賴。將,料、糊、及凝膠’ 述岭對於陰道感染與特定“染病;^有^微生物劑’如抗真菌劑 治療白色念珠菌的含三葉糊 ITF21'73 500 mg 200410708 嘻本乙味。坐 白色石蠟脂
述混合。這些聚合組合物可以含有分散劑, 300 mg (6.5°/〇) ,羥乙基纖維素,甲殼素,以及上 ί,如羧曱基鈉纖維素(〇. 5一5. 0%)。 ,、匕液祕合_之較佳_賦_,能以料液態形式給予組合^ 物’但組合物在體腔中或接觸到液體、分泌物時會形成膠狀,藉此提供生 物吸咐效應,將治賴劑保持在損傷區域,持續—段時間。陰離子聚糖類, 果膠以及結攔膠,是其中的例子,其組合物會在腔體液中形成雜。這類 的黏膠製備’對消化道,由其是上消化道及遠端小較特财用,因為其 相對較㊅濃度的陽離子。含有果膠或結娜的組合物,—般含有H2〇% w/v的果膠或結膠,在水或液態緩衝液系統。 其它能促進黏膠,以及能延長治療滯留在表面表皮細胞的有用組合 物,包含膠體懸浮體,含有2 - 50%膠體顆粒,如石夕職2氧化鈦。該組合物 形成一可漂浮液體,伴有低的黏稠度,如灌腸劑,但該顆粒與糖蛋白交互 作用,由其是黏蛋白,能轉化液體成黏稠職,提供有效的黏膠(美國專利· 號 5, 993, 846 以及 6, 319, 513)。 另一種組合物能將TDCP及/或其它治療劑包埋在生物可侵蝕的微球 内,而不是溶在水溶液組合物。許多種微膠囊化的藥劑傳送系統已被發展, 其中許多與生物可侵钱膜有相同的聚分子組合物。常用的聚分子微球包 含,例如,聚-ε-己内脂,聚己内脂-c〇-DL-乳酸,聚DL-乳酸,聚DL-乳 西夂C〇-甘Sf·®夂’以及5^- £ -己内月日C〇-乳酸。請參見?;[*(;1;打<9人,】.?11301·
Sci., 68:1534, 1979; Davis et al. Microsphere and Drug Therapy, Elsevier, 1984, Benoit et 3L Biodegraddble Microspheres: Advsnces 16 200410708 in Production Technologies, Chapter 3, Ed. Benita, S, Dekker, New
York, 1996; Microencapsulation and Related Drug Processes, Ed. Deasy, ^ Dekker’ 1984,New York; U.S. Patent No. 6,365,187)。較佳地,微球 是生物黏膠或含有生物黏膠的賦形劑。 生物可侵蝕膜傳送裝置
聚分子膜系統能提供-些利益,來將治療試劑送到口腔。不同於沖洗 液、糊、及其它可漂浮組合物,膜裝置可以在口腔内存在長的時間(數小時 至數天)’且能提供持續釋放。傳統上,膜是部份地或完全地生物可侵姓, 且含有黏膠層來強化膜到口腔黏膜上。膜裝置,除了用來傳送治療試劑外, 可防止受傷區的機械傷害或微生物感染。其物理上晴礙,對治療狀態為 黏膜炎或口腔炎時特別有益。此外,如下列指出,膜裝置可用來釋放TDcp, 直接地到黏膜底層,進入到口腔内腔,或是二者組合。 膜裝置至少含有二層:適於將膜接觸到口腔黏膜的黏膠層,以及含有 活性治療物的實體層。許多合適的黏膠己是熟知的技藝,且已詳述於上。 最佳地,一個或多個治療劑可以提供在黏膠層。 孩組合物傳送裝置的實體層,可以由一個或多個生物可侵餘聚分子材 料組合物。合適的聚分子包含,例如,澱粉,明膠,聚乙二醇,聚丙二醇, 5^環氧乙烧,環氧乙烧及環氧丙烧的共聚分子,聚乙二醇及聚丙二醇的共 聚分子,聚四曱二醇,聚乙驗胺基曱酸乙酯,經乙基纖維素,乙基纖維素, 羥丙基纖維素,羥丙基曱基纖維素,海藻酸,膠原蛋白,聚乳酸,聚乳酸修 -co-甘露酸(PLGA),聚碳芬鈣,聚乙基甲基丙烯酸,乙醯纖維素,丙二醇,泰 聚丙烯酸,偶合聚丙烯酸,羥乙基甲基乙烯酸/甲基甲基丙烯酸共聚分子, 石夕膠/乙基纖維素/聚乙二醇’胺基曱酸乙聚丙稀酸,苯乙稀,聚颯,聚 碳酸酯,聚正酯,聚酐,聚胺基酸,部分及完全水解的亞烷基乙烯乙醯共 聚分子,聚氯乙烯,聚乙烯乙醯聚合物,聚乙烯烷基醚,苯乙烯丙烯晴共 聚分子,聚對苯二酯乙酯,聚烷,聚乙烯咪唑,聚酯,以及上述聚分子二 個或以上的組合。 特別有用的實體層聚分子,由PLGA以及乙基纖維素組合物。PLGA是生 物可侵蝕,以及可以經由製備,而能分解在廣泛的狀況及速度。乙基纖維 17 200410708 素是水不溶的聚分子,當職_可做為pLGA _化子,但會在體液 蝕。由於其水不溶性,它可以影響膜膨脹的程度及速度。 ^二選紐第三層,使TDGP/#段不可穿透,也可以加人到W。較佳地, 該屏障是生物可舰。合適的障礙層聚分子,包含乙基纖維素,聚丙稀酸, 或其它聚電解質。其中—組合物障礙層放置在實體層的反面,相對於黏附 層’因此引導藥劑釋放到接觸的上皮,而不是在體液中稀釋。該組合物對 治療舌、舌下組織或頰黏膜分離性疾病(黏膜炎或口腔炎)特別有用:另一 替代的膜裝置組合物,其障礙層位於實縣絲附層間。該組合物引導藥 齊傳放到π腔,對於治療舌、口腔及食道,擴散性疾病特別有用。對於傳
=治療試劑制錢,這此湖在高濃度時有細胞毒效應,因為試劑會遮 蔽底層組織,防止治療用膜的直接接觸。 曰”' 皮虜用配方·軟膏,糊,乳劑,膠,沖洗液,及組織黏劑 因為創傷或發炎導致的皮膚上皮損傷,可以用軟膏,糊,及凝膠來傳 送三葉治療。這此方式的黏稠性質可以直接應用在受傷位置。最佳地,受 傷位置可以覆蓋敷料,躲維持含三葉組合物,保護傷口免於創傷,以及/ 或吸收滲出物。由下列會提到,對於經創傷手術,如皮膚切片,上述方法 對恢復上皮完整性是特別有用。黏稠的製備物也具有局部阻檔功能,進而 減少刺激與疼痛。另外,黏性試劑,如前面所述,可以併入軟膏,乳劑,
糊,凝膠,及本發明的油。該黏劑可以延長本發明的三葉組合物,在損傷 區的時間。 、 —生物黏劑及生物可侵蝕聚分子,是另一種傷口縫合的方法,可以用於 藥物傳送。生物黏劑對老年族群的傷口縫合特別有效,該傷口尤其脆弱。 任何己知的生物黏劑或聚分子,能有用於與TDCps及三葉胜肽片段合用,(美 國專利號 5, 990,194, 6,159, 498,以及 6, 284, 235)。TDCPs 及片段,可以藉 任何合適方法,與其它試劑併入黏劑或聚分子。該特定方法依賴產品的化 學組合物及製造過程。 此外’TDCPs及片段也可以存在於己知的手術用沖洗液中(〇. 9%食塩水 或林格氏溶液)。 缝合材料以及傷口敷料 18 200410708 縫合材料,無菌傷口敷料,生物可侵蝕聚分子,以及組織黏劑可以浸 入TD^Ps及三葉胜肽片段,用於傷口位置以促進真皮與表皮的瘉合。 這些配方可以依據已知,以及傳統製備方法。例如,由單層膜製備的 縫合材料:可以在使用前,將·或片段注人其聚分子溶液。縫合材料, 也可以用三葉溶液,重複地浸泡/麵循環來注人。姆數依黯泡液中, TDCP/片段的濃度,以及齡材概含有的濃度。浸泡對編織縫線材料的注 入特別有效,因為TDCP/片段存在於表面。 傷口用及烫傷用無菌敷料及紗布,浸泡在含TDCp或三葉胜狀片段,也 可用標準方法製備。傳統上,TDCP/片段存在於黏滯膠(如水合膠),藉由一 透氣布料,與皮膚傷口分離,該布料會黏在傷口上。 /曰 治療眼部腈疾病 角膜上皮的損傷,導致迅速形成由細胞組合物賴層 角膜表面,防止_與視力喪失。”後,表皮細胞會在數辦 设,導致移動性前緣的生成。受傷區邊緣的細胞,會在36小時後進行舒、 的細胞分裂。 $ 本發明揭露三葉治療方法’來治療患者的眼部腈疾病(包含瘡傷及 害)。眼部腈疾病可能影響眼腈的任何雜,如角膜,鞏膜,視網膜,社膜 目^大體,後眼腔,或前眼腔。在-較佳的實施例中,眼部疾病影響角膜、, 角膜上皮’或是結膜,部疾病包含但不限於表面星狀賴炎、角膜 疱療病毒舰賴炎、雜眼炎、祕細結駭、錐赫、 ,合膜、乾性賴賴炎(舰)、眼部發炎、結膜瘡、及類天泡瘋痕。θ| π疾病可以由_多因素導致,如病毒(腺病4,疱療病毒),眼 =砂眼,練卜«,料線騎(銲接,太細,_ ’ 全身性用藥(腺嗓呤阿拉伯贿),外敷„, _,原蟲, Τ
知、未知的抗原過敏反應。 〃 TC 物理性眼部瘡傷也會導致眼疾。其包含角膜磨損(由外來物) 孔(由衝擊導致膜完整性破壞),或是化學燒傷(使用氫氧化 = 则膜移植以及眼内注射)。眼疾-般導致眼部功能或結 眼疾可能會導致膜上皮撕裂,角膜壞死,祕瘡或轉瘡雜= 200410708 疾病可以由三葉治療方式來治療。 治療試劑 含三葉功能部位的胜肽及胜肽片段 TDCPs以及三葉胜肽片段的給予,每劑丨―5〇〇〇mg,較佳地每劑 5-2500呢,更佳地每劑10—1500mg,依據損害的性質與狀況,治療的期望頻 率與時間,給藥方式’以及給予三葉治療_學組合物。三葉治療一般是 每天1-5次。 特別有效的TDCPs及二葉胜肽片段,維持生物活性,包含有第μ圖中, 相對於胺基酸序列15-73 (hITFw3)的胜肽。其它有用的片段包含WTF2i73, hlTF^73,以及hlTF^3。生物活性的ITF胜肽片段,經c端笨丙胺酸切除 形成(即 hITFi-72, hlTFw2,hlTF^,以及 hITF22-72,以及 hITF25-72),在次 未半胱胺酸切除或結束ae. hITFw,hlTFw2,以及hITF2㈣,以及 hITF25-62),在最後一個半胱胺酸前切除或結束(i e·,hITF㈣,hITFi57〇, hITF21-7G,以及 hITF22-7G,hITF25-70)。 本發明的TDCPs以及片段可以用任何適當方法生成。例如,能轉譯欲 求的TDCP蛋白的cDNA,可用已知的任何方法來生成重組蛋白。其實施方法 於此提供。所有的TDCPs及三葉胜肽片段,尤其是hITFl5_73以及hITF2i 73 , 可以用畢赤酶母菌表現系統,送入能表現三葉胜肽片段的cDNA,如全長的 hITF或ITF”-73,當發酵培養液維持在PH 5. 0。 抗增生藥劑 可以與本發明的組合物合併使用,特別有效的抗增生劑是微管束抑制 劑,拓樸酶抑制劑,鉑,烷基化試劑,抗代謝試劑。抗增生劑之例子包括 太平洋紫杉醇(paclitaxel),21-去氧-21,21-二氣胞嘧啶(Gemcitabine), 阿黴素基 (doxorubicin),長春新鹼(Vinblastine),依託泊苷 (etoposide),氟尿素(5-fluorouracil),卡麵(carboplatin),六曱蜜胺 (altretamine),氣格魯米特(aminoglutethimide),安d丫σ定(amsacrine), 安美達旋(anastrozole),阿札胞脊(azacitidine),平陽徽素 (bleomycin),白消安(busulfan),卡莫司汀(carmustine),笨丁酸氮芥 (chlorambucil),2 氣去氧腺脊(2-chlorodeoxyadenosine),順在白 200410708 (cisplatin),秋水仙驗(colchicine),環填醜胺(cyclophosphamide), 阿糖胞脊(cytarabine),cytoxan,達卡巴嗪(dacarbazine),達叮黴素 (dactinomycin),柔紅黴素(daunorubicin),docetaxel,雌莫司汀 (estramustine phosphate),氟尿喊°定脫氧核替(floxuridine),氟達拉濱 (fludarabine),gentuzumab,六曱基蜜胺樹脂(hexamethylmelamine),羥 尿素(hydroxyurea),宜佛期酰胺(ifosfamide),依麥替尼布(imatinib), 干擾素(interferon),依立替康(irinotecan),洛莫斯汀(lomustine), 二氣曱基二乙酸(mechlorethamine),美法侖(melphalen),魏嗓呤 (6-mercaptopurine),曱氨喋昤(methotrexate),裂黴素(mitomycin), 氣苯二氣乙烧(mitotane),米托蒽醌(mitoxantrone),喷司他丁 (pentostatin),丙卡巴肼(procarbazine),銳突西莫(rituximab),鏈脲 黴素(streptozocin),它莫西酚(tamoxifen),替英唑胺(temozolomide), 替尼伯苷(teniposide),6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine),拓樸吸坑 (topotecan),搓杜滋美(trastuzumab),長春新驗(vincristine),長春 地辛(vindesine),以及長春瑞賓(vinorelbine)。 本發明的藥物組合,對治療癌細胞有幫助。組合治療可以單獨或與其 它治療方法合用(手術,輻射性,化療,生物治療)。另外,若患者有發展 成癌細胞的危險(遺傳上或病史上有過經驗),可以接受預防性治療來抑制 或延緩癌症形成時間。組合治療的期限,依賴疾病的型態,患者的年齡與 性別,患者疾病的階段與型態,以及患者對治療之反應。 組合治療各成份的劑量、頻率、及給藥模式,皆可以獨立控制。例如, 一化合物(如pyridinone)可以外敷地每天給予三次,第二藥劑(如抗增生藥) 可以每天口服地給予一次。組合治療可以間歇性地給予,包含休息的時段, 如此使患者的身體内尚未看到的副作用,能有恢復的時間。化合物可以包 裝在一起,利用同一傳送試劑給予二個藥物。 抗發炎藥劑 任何發炎藥劑可以配方與三葉胜肽一起,用本發明的方式使用。合適 的抗發炎藥劑包含’但不限於非__抗發炎義(如柳滅衍生物,美 洒辛(Ind⑽thacin),布洛芬(Ib_fen),他克莫s1(ta㈤limus),乙 21 200410708 醯基氨基苯(Acetaminophen)) ’環氧酵素-2-專一'丨生的抑制劑如羅費克昔布 (rofecoxib) (Vioxx®),布樂克昔布(ceiecoxib) (Celebrex⑧,etQd〇lac, 以及nimesulide),局部糖皮質素以及專一性細胞激素以作用於τ淋巴球 功月b。亦可使用已知對直腸給予的抗發炎藥》農度。例如,布洛芬(ibUpr〇fen) 可以在成份中’濃度達每天25-800mg,傳送到損害區。皮質醇 (corticosteroids)可以與三葉胜肽共同製備,濃度達區域性直腸使用。 抗微生物劑 任何己知的抗微生物劑,在合適的濃度下,可以與三葉胜肽配方而用 於本發明方法。抗微生物劑包含抗細菌’抗真菌,抗原蟲,以及抗病毒劑。 抗細菌劑(抗生素)之例子包含有青黴素(如青徽素G,安必西林,二曱 苯青黴素(methicillin),苯唑青黴素(oxacnlin),安蒙西尼 (amoxicillin)) ’ 枯草囷素(Bacitracin),頭孢子菌素類(Cephalosporins) (如頭孢羥氨T (Cefadroxil),頭孢拉定(cephradine),頭孢噻肟 (cefotaxime),以及頭孢曲松(ceftriaxone)),四環素類(如去氧强脛四環 素(doxycycline),美諾四環素(minocycline),以及四環素),胺基配糖體 (aminoglycosides)(如阿米卡星(amikacin),建它黴素(gentamicin),康 徽素(kanamycin),新黴素(neomycin),鍊黴素(streptomycin),以及妥布 黴素(tobramycin))巨環内酯(macrolides)(如阿爾奇黴素(azithromycin), 克拉黴素(clarithromycin),以及紅黴素(erythromycin)),氟化奎林酮類 (Fluoroquinolones)(如環丙沙星(ciprofloxacin),洛梅沙星 (lomefloxacin),以及諾氟沙星(norfloxacin)),以及其它的抗生素有氣 黴素(Chloramphenicol),克林達徽素(clindamycin),環絲胺酸 (cycloserine),異煙肼(isoniazid),利福平(rifampin),以及萬古黴素 (vancomycin) 〇 抗病毒藥劑是能夠破壞或抑制病毒之複製的物質。抗病毒藥劑之例子 包含 1,-D-卩夫喃核糖基-1, 2, 4-三。坐-3-叛酷胺 (1,-D-ribofuranosyl-1,2, 4-triazole-3 carboxamide),9-2-經基-乙氧 基曱基鳥嘌呤(9-2-hydroxy-ethoxy methylguanine),金剛烧胺 (adamantanamine),5-峨-2,-去氧尿哲,三氟胸腺嘴咬 22 200410708 (trifluorothymidine),干擾素(interferon),腺苷阿拉伯糖(adenine arabinoside),蛋白酶抑制劑,胸腺苷激酶抑制劑,糖或糖蛋白合成抑制 ’ 劑,結構蛋白合成抑制劑,吸附及吸收抑制劑以及核酸苷類似物,如阿昔 洛韋(acyclovir),喷昔洛韋(pencici〇vir),泛拉洛韋(vaiacycl〇vir), 以及干昔洛韋(ganciclovir)。 抗真囷劑包含术又真囷劑及真產抑制劑,例如,兩性徽素B(aiDphotericin B),羥基苯甲酸丁酯(butylparaben),克林達黴素(clindamycin),乙康 那索(econaxole),氟康唑(fluconazole),氟半胱胺酸(flucyt〇sine), 灰頁黴素(griseofulvin),利黴菌素(nystatin),環喲酮胺(cici〇pirox), 以及酮康嗤(ketoconazole)。 抗原蟲試劑用來治療原蟲感染。抗原蟲化學治療劑之例子包含殺阿米f 巴劑(amebicides)(二氣尼特糠酸酯(diloxanide furoate),雙破_啉 (iodoquinol),巴羅姆黴素(paromomycin),去氫依米丁 (dehydroemetine),美口坐奈口坐(metronidizole),tinidizole 以及奥琐 唑氣化鈉(ornidazole))常用來治療阿米巴病,梨形蟲病,以及毛滴蟲陰 道炎。 止痛劑與麻醉劑 任何常用的局部性止痛劑可以與本發明的治療組合使用。止痛劑的含 里’疋&供退端小腸損害1. 5-5%的利都卡因(5-50mg/mL予每劑20-40mL液 體内)。常用的麻醉劑例如,普魯卡因,利都卡因,丁卡因,地布,苯佐卡鲁 因,胺苯甲酸2-2乙胺基乙基酯氫氣化塩,卡波卡因,皮珀羅卡因,以及® 達克羅達寧。 其它的止痛劑包含鴉片,例如,馬菲,可待因氫可酮,第莫洛,羥可 酮。任何上述的止痛劑可以與具有止痛或抗發炎的化合物共配製,如乙醯 基氨基苯,阿斯匹靈,布洛芬。 類固醇 類固醇可以用來治療遠端腸的損害。例如,潰瘍性結腸炎可以用曲安 奈德(0· 1%),氫皮質酮,氟替卡松,布地奈德,或倍氣米松的糊來治療。 5-胺基水揚酸衍生物 23 200410708 5胺基水揚酸(5-ASA)衍生物,已知能治療發炎性腸疾,如 與潰瘍性結腸炎。特別有效的5韻包含,例如,錢項氨咬,美沙拉秦,· 奥沙秦,以及巴沙拉秦。硫氨確氨口定傳統上給予抓灌腸劑,或口服地 500-l_mg。美沙拉秦正常地給予i克灌腸劑,每日使用3一6周,或_ 检劑,每天2-3次,維持3-6周。相似的組合物可以適用任何5—脱衍生 物。 眼用抗微生物劑 眼部的感染在臨床上很常見。其中的例子與抗微生物化療的模式如 下。淚囊炎(淚囊感染),驗板腺炎與眼臉炎(眼驗感染),結膜炎與角膜炎, 都是常受微生物感染,例如,疱瘡性病毒,帶狀疱療病毒,腺病毒,葡萄癱 珠蛰iStaPhyl〇coccus aureus),蜗癌逡珠蛰⑶f p厕歷撕)’嗜血桿菌⑽細以及奈瑟氏菌(射獅^卿)。局 部眼用抗生素,抗真菌劑,以及膏藥可以用下列方式製備,通常介於〇•卜弧 (w/v= 容液來治療細菌抗原。抗病毒溶液的碘去氧尿苷,三氟尿苷,以及阿 糖^甘膏或溶液’製備於〇·卜1% w/v,膦甲酸,阿昔洛韋(ac_vir),更 洛韋:福泌凡森(音譯f0rmivirsen),以及兮朵福凡(Cid0f0rvir)以口服 式、靜脈内、局部性給予至眼,或經由靜脈注射。 生產TDCPs以及三葉胜肽片段 TDCPs以及三葉胜肽片段,可以用已知的重組蛋白表現方法來生產。編 ^所需f胜肽的核酸可以送入各種細胞或無細胞系統來表現,以提供小籲 里,大罝或商用級的產量,純化及患者治療。 痛| 併使用真核及原核的表現系、统’將表現TDCP或三葉胜肽片段的序列殖入 f體或其城體,再麟轉形人活細胞内。構祕將含有完整開放讀碼區 或生物活性片段的三葉胜肽C腿方向正確地插入一表現質體可用於表現 蛋=。真核及原核的表現系統可以讓融合蛋白表現及恢復,其中TDC以片段 共仏性地接於-標記分子之N端或c端,以促進鑑定及/或純化。可作為俨 記^例子包含六組胺酸,HA,FLAG,以及㈡ye抗原決定位。在三葉胜^ 及標記分子間可引人酵素或化學切割位置,藉此標記分子可以在純化後移 1^" 〇 24 200410708 減了ί絲現韻含有促進子,其可糾導職_人腸三葉胜肽核酸 於載X貝體之細胞中合成大量的mRNA。其亦包括原核或真核的複製序列起 始位以便在宿主内自動複製,編碼基因特徵之序列以在其它有毒藥物之存 在下選擇含細_胞,以及可提昇所合成之謹哺譯效率的序列。移 ^效的顏可關鮮元鱗複製,例如,病糾病毒 土因體之〇rip序列)。細胞株也可將載體併入其基因體職内以便連續性 生基因產物。表現贈或片段的穩定細胞株可能只有-組或多組含有 欲求二葉胜肽序列的載體。編碼三葉胜肽的核酸序列可以利用己知的技藝 以原位增加數量,例如,甲氨σ票呤挑選。 ,細射’如大腸㈣’表現外來序列時,需要將腸三葉峨核酸插 入細困的表現載體。該質體載體含有數個單元,时在細軸增瘦質體, 1及表現插人質體的DNA。含有f體的細菌之複製係依賴可挑選轉譯標記序 可以使細®在毒賴物存在下生長。f_含有轉錄促進子,能夠由 貝^的基關產生大量mRNA。促進子可以是(但不_定必要)可誘導的在 導後啟動轉錄。質體最佳地含有—聚合接子以簡化將基因植入載體 内正確方向的步驟。 伯田2麵__亦可用來複製及/或表現腸三葉胜肽及片段,相似於 3大°例如’乳酸桿菌可以表現·Ps/片段,不論是可溶性胞内 益/聽合融合蛋白’其内含有訊息胜肽,引導蛋白到細胞周質,到 用田ί=ΐ ’或是細g體外。乳酸㈣可絲表現外來蛋白,於製備消費, 用艮物產品,如製造優酪或它日常用品。 ( 哺乳類細胞亦可时表現三葉胜肽。穩定或暫時的細胞株 ,可以用腸 來製造水雜三細織裂且標記的㈣)。可用的細 已株fCOS,HEK293T,CH0,以及 NIH 細胞系列,如 nih_3T3。 適的表現她^構後,可㈣型技術將其狀齡細胞,包含 引導、曰法’電穿孔法,麟法,微注射法,原生質體融合,樹狀分子 不限於大吏用本發明的載體來轉染的宿主細胞’包含但 J 或,、匕細菌,酵母菌,真菌,昆蟲細胞(例如桿狀病毒載 SF9故細胞),或是自老鼠、人類、或其它動物。試管外表現 25 200410708 轉殖DMA所轉譯的三葉胜肽,融合或聚胜肽片段亦可使用。熟悉分子生物 學的人士,可以了解很多表現系統及純化系統,用來產生重組三葉胜肽及 片段,例如無細胞小麥胚芽萃取液,兔視網細胞萃取液,HeLa細胞萃取液, 克氐細胞萃取液,及大腸桿菌萃取液是常用來無細胞試管外轉譯。上述系 灰故遂於’例如 ’(ixxsxibel et al· QCurrent Protocols in Molecular 公·ο/〇§7,John Wiley & Sons, New York,NY 2000)。 基因轉殖植物,植物細胞,及藻類亦可用於產生重組TDQPs及三葉胜 肽片段,用於本發明的方法與組合物。例如,表現三葉胜肽的轉殖菸草植 物或培養的細胞,可以用熟知的技藝來製造(請參見美國專利號2〇2, 422 及6,140, 075)。轉殖海藻表現系統可用來產生重組蛋白(例如,chen打3/., _
Curr_ Genet. 39:365-370,2001)。轉殖食品作物,能表現重組TDCps或馨 片段,可以被製造且產生額外的效益,純化蛋白是不必要的。較佳地,轉 殖植物是單子葉植物,更佳地,單子葉是玉米,大麥,小麥,燕麥,裸麥, 米,以及高梁。轉殖單子葉表現系統已是熟知的技藝(美國專利號 5, 850, 018, 5, 866, 793, 5, 888, 789, 5, 889,189, 6, 365, 807, 6, 399, 861,以及6, 403, 862;在此併入參考文獻)。 在一較佳的實施例,TDCPs及片段表現在酵母菌内;較佳地在麵包酵母 菌(Saccanmyces cerevisiae),裂後酵母嵐{Schiz〇saccar〇myces
’或巴斯德畢赤酵母菌更佳地,在嗜曱基酵母 ’巴斯德畢赤酵母菌表現更好。巴斯德畢赤酵母菌能利用甲醇作為碳源。 傳統上,TDCP/片段序列殖入畢赤酵母菌表現載體,含有5,以3,促進子 與甲醇誘導調控序列,酒精氧化酶(A0X1)基因,能提供標定性併入畢赤酵 母菌基因體内,以及甲醇誘導的高蛋白表現。多胜肽可以表現為可溶性胞 漿蛋白,或是與分泌性訊息胜肽融合,表現為分泌重組多胜肽。較佳地, 分泌訊息可依據A或α-因子分泌訊息。曱醇誘導後,重組嵌合蛋白含有A或 α-因子分泌訊息會被送出細胞外,在培養液内收集後進一步純化(例如, 美國專利號 4, 808, 537,4, 837,148,4, 879, 231,4, 882, 279,4, 818, 700, 4, 895, 800,以及 4, 812, 405, 5, 032, 516, 5,122, 465, 5, 268, 273;在此併 入參考文獻)。 26 200410708 檢定酵母菌表現系統内的TDCPs 我們發現在畢赤酵母菌内三葉胜肽的產生導致轉譯後事件,包含蛋白 分解與雙胜肽加成。ITFw聚胜肽片段切割已被證實,發生在N端的leU20 及ser。之間,及C端的thr?2及phe73之間。此產物(第1A圖内的胺基酸 21-72;後稱ITF^-m已在發酵過程中證實,以及依賴時間與pH。我們研究顥 不發酵時間愈長,hlTFm產量愈多。我們也發現最佳的產量在pH〜5。因為 全長蛋白(ITF^73及ITFm)的pi是5.1以及6.9,二者可用離子交換層 析分離。 另外,TDCPs 的產生,如 hITF25-62, hITF22-62, hITF”' hITF25' hITF22-73, 及hlTFm,可以將相對應的核酸接於起始甲硫胺酸(AUG)。轉譯mRM於真 核或原核主内,會由甲硫胺酸胺基酶(MetAP)切割起始曱硫胺酸。已被詳細f 研究,發現若在第二個胺基酸(位於曱硫胺酸後)是甘胺酸,丙胺酸,絲胺 酉文’蘇胺酸’脯胺酸’半脫胺酸,頭胺酸,MetAP會切割起始曱硫胺酸(紅衍此 etal, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7714-7718, 1995; Bradshaw ei aL , Trends Biochem. Sci., 23:263-267, 1998; Lowther and Matthews,
Biochim· Biophys· Acta,1477:157-167,2000)。 雙胜肽加成不會影響TDCP的生物活性。更常見地,麩胺酸—丙胺酸 (EA)-N-端加成被觀察到,且在畢赤酵母菌表現系統中,另外的訊息序列修 飾位置中。如後再述,EA—N端加成發生在ITFiM3,導致61個胺基產物 EA-hITFm3,其被偵測到單體,同源雙體,以及與ITFi5 ”組合的異源雙體。_ 处已知TDCPs及二葉胜肽片段的表現,在真核表現系統内有另外的好處,_ :有a適的細胞胞器來進行轉譯後修飾。例如,Tj)cps的糖基化可以在分泌 月1J予内貝網或向基氏體進行。分泌的蛋白可以經細胞膜外的蛋白酶進行 蛋白分解過程,如原蛋白轉換酶(pCs)。 ^ 一旦重組蛋白表現後,它可以經溶胞純化,若蛋白是在胞漿内,或是 養液内,若蛋白是會被分泌的。純化技術如離子交換,膠體過濾,親 合官,層=’可用來將腸三葉胜肽從其它細胞内的蛋白巾純化。—旦純化 後若有而要,重組蛋白可以經高壓液相層析(Ηρα)進一步純化(Ηρα;參 先 Fisher,Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular 27 200410708 价WorkandBurdon,Eds.,Elsevier,198〇)。 本發明之TDCPs及三葉胜肽片段可以由化學合成生成 , 合成,液相合成,或二者組合(例如,咖 Synthes^ 2nd ed., 1984, The Pierce Che.ical Co., R〇ckford, IL) o 另外,TDCPs再經由標準胜肽結合化學縮合。 $ Hi及二葉峨可以用合適的方式產生,前導藥物,原藥物, 或疋含有二#功能雜的前導分子。可以職地,這樣的分子—旦進 ,,=以更進-步進行修飾。例如,TDCp或片段在N或C端含有額外的胺 基酸序列,可錢行蛋_絲產生潍的物舰行三葉治f此過程可 由細胞内蛋_促進’例如,胰凝讎,胃蛋白酶,以及胰蛋白酶。 劑量 用於本發明局部組合物的所有治療試劑,包含三葉組合物,可以用已 知且在使用的劑量。下列的範例’做為本發明有效成份組合物的劑量範圍。 不同的TDCP/#段或其它試劑的劑量,依據臨床病患的情況,治療目的(户 療或預防),以及期待療程或嚴重程度來考量。額外的劑量考量包含病^ 學’年齡(幼年,成年,老年)’ 一般健康及共同發病率。 ’、 下列的範例用來闡述本發明的原理與狀況,當三葉胜狀治療在使用 %。實施例並不用來限制本發明。 實施例1 :使用酵母菌來產生hITF重組片段
冷束的巴斯德畢赤酵母菌(尸施你咖㈣280),編碼一穩定 插入的hITF重組片段(hITFl5_73),融合到㈣子分泌訊息,及受皿^ 醇反應性促進子調節,塗抹在卿洋菜膠盤上,且在默生長2天。每一 菌落可做為接獅以在H) mL的YPD賴培養社長,以及在⑽紐於 養箱進一步生長。製備及生長如下所述。 口 培養液配方及重組酵母菌之生長 製備s有16 g/L甘油的1 L基本i:嚴/微量塩,是在Fern]3ach容器(pisher 製備且接種1G mL的卿培養液。基本塩溶液(2觀;有或沒 有甘油)在接辦前加人。誠合液在3(rc下顧搖動2天。二天後, 態培養液取出’在_0 rpm下離心1()分鐘。將上清液棄置,重新將沉殿 28 200410708 物懸浮在1/5體積的基本塩/微量塩,外加丨· 5% (w/v)甲醇。此步驟 甘油。Fembach容器用起司紗布包袠,在3(rc下,劇烈搖動48^、=加入 48小時後,將液態培養液取出,在9〇〇〇 rpm下離心15分鐘。了。 含有5 mg/L的ITF&73。 里培養液 έ亥培養液用二次蒸餾水透析好幾次。透析後的液體經冷;東乾燥 在4°C等候使用。由40-6〇公升培養液冷凍乾燥來的ITFl5—73 ,緩=收隹保存 新懸浮在50-100虬,20 mM甲酸緩衝液(pH 4.0),透析予甲酴集’重 mM pH 4. 0; 2次更換)。 欠螓衝液(20 基本塩 1 Liter Supplier 1 硫酸碳·2Η2〇 0.93 g Sigma 07411 2 硫酸鉀 18.2 g Sigma P-4167 3 硫酸鎂 14.9 g Sigma M7774 4 氫氧化鉀 4.13 g Fisher P250-1 5 磷酸(85%) 16. 7 mL Fisher A242-212 6 氫氧化氨 23. 7 mL Fisher A6695-212 微量塩
Salt /Liter 硫酸銅_ 5H2〇 2·〇 g 磁化納 0. 08 g 硫酸錳· H2〇 3· 0 g 姐化納_ H20 g 硼酸 0.02 g 氣化鈷 0· 5 g 氣化鋅 g 硫磺鐵· 7 H2〇 22.0 g 生物素 --- 。 濃硫酸 1. 0 mL 基本塩溶液由劇烈的攪拌,再經由高溫高壓滅菌。若有甘、、由,其在美 29 200410708 本塩溶液為16 g/L。若無甘油,體積由加入5mL氫氧化氨來組合物。 畢赤酵母菌之培養液在基本塩溶液生長,補充正碟酸(〇P)或偏鱗酸 (HMP)緩衝液,用以維持合適的pH值生長。分析下列表1的特定生長 條件。 表1·發酵液内的pH及生長條件 輪次 培養液 PH值 溫度 (C) 甲醇 誘導之量 (g/L) 最終甲醇 供給率 (g/min) 16 L - 1 0P 5.0 30 200 8 16 L - 2 0P 5.0 30 150 7 16 L - 3 0P 5.0 30 150 10· 9 16 L ~ 4 0P 5.0 30 150 10.9 16 L - 5 0P 5.0 30 250 15 16 L - 6 0P 5.0 26 250 10.9 16 L - 7 HMP 5.0 30 250 10.9 16 L - 9 HMP 6.0 30 250 10.9 16 L - 10 HMP 5.5 30 250 10.9 100 L - 1 0P 5· 0-6· 0 27 - 30 250 10.9 經甲酵绣導後’在 T。— T24hrs,T3ehrs,T48hrs,T72hrs,以及 T%hrs 時間點, 10毫升的樣本取出後分析。樣本離心後,去除上清液,冷柬待往後使用。 實施例2:發酵液内之重組hITF的分析 樣本製備 經由純化且製備於水浴性〇· 1%三氟醋酸(Tfa)的重組hiTFi5-73,用來做 為質譜儀分析的標準品。在範例1中冷凍的發酵液樣本經解凍後,加入1〇 # L的0· 1% (v/v) TFA到90 //L樣本等待分析。樣本經振盪混合後在室溫下 使用9000 rpm離心5分鐘。上清液移除後置於已清洗(3〇〇 乙腈/〇1〇/〇 30 200410708 TFA)且平衡(500 以 l 〇· 1% TFA)的 C18 Trap cartridge(Michrom
BioResources,CA,Part No. 004/25109/02)。裝載好的 Trap cartridge, 利用1 mL 0·1’Α清洗且接合其中的物質可用100 的2〇%乙腈/〇1% TFA浴洗。樣本在氮氣下乾燥或用冷凍乾燥後,懸浮於5〇_1〇〇 〇. 1% TFA’再一次予9000 Π®離心5分鐘。液態層析質譜儀(LC-MS)使用10 //L 上清液樣本(第2圖)。 液態層析質譜儀(LC-MS)
在研九分析的過程,數個層析系統會被使用。最成功的分析條件如下: 溶劑 A: 〇· 1% 液態(v/v) TFA 溶劑B·· 含0.1% TFA的乙腈 梯度: 起使予10% B,維持2分鐘 增加到40% B持續30分鐘 ⑼l 速: 〇. 3 mL/minute 管柱: Vydac C18 (2· 1x150mm)
溫度: 35°C 偵測方式:UV214nm
MS with ESI-MS 結果 #使用前述標準品重組hITFl5_73來最佳tLC_MS。其結果管柱圖譜顯示在 第2圖,顯示數個主要成份,包含溶析於17.40分鐘,17.87分鐘,以及 91 1 的LC-MS結果摘要 滯留時間 預測質量 ^J分鐘) (Da) 16.69 12884 -—-—__ 9682 12998 '__17. 40 13470 •分鐘。若有可能,ESI-MS光譜可以從觀察到的成份得到。從質譜光譜 特徵得到的解旋資料,摘要於下表2。 31 200410708
…,發酵液樣本(第16 L - 5鈐nu e 3 =第3圖的uv層析圖譜。如預期顯示,:現-複雜t見表υ經由 部份分析物溶析於空白區域及22分鐘之間。仔細檢^八:特徵,其中大 料,仍然無法證明任何_㈣的存在。 仏驗刀析中的ESI-MS資 雖」如此’在分析中一蛋白被伯測 位置15·?分鐘為(參見第 析=11764 Da,LC-MS溶析 示,該蛋白可二 為,以及_的高含量顯 J月hlTFis-73相關。因此,在之後的研宑 原試劑_加熱(3rc 2小時),以除去 酵液加入強效還 4 彳⑶、 雙硫鍵。其層析圖譜結果如第 顯現在22 、於「\析峰消失,而之前不存在的一些成份,則開始 =^-26分舰域。檢敝·分機來的Es卜MS光譜顯示這些有 攀:,化蛋白的單體。特別的,位於25. 7分鐘的溶析峰,與画Da -、早體有強烈一致性。表3提供來自層析區域中22—26分鐘,質级資 料的摘要。 刀。里貝°曰貝 一—_間(分鐘) 預測質量(Da) 5535 22. 48 5639 5741 70 5537 23. 05 5640 --————_ __5742 — 23. 24 5885 --—_____ 6213 -~~—--~~--- 32 ^0410708
冉—:-—-U____D06y_ hiTF,5-^^ ^
— /、hITF 蛋白 LeU2。及 Ser21 (如 hITF21_73)之間的 N J日士赫丨發酵液樣本(昏5;參見表U利用LC—MS分析。如預期^ /J、k的發酵時間,產^ 刀何如預期地,〇 雜性隨㈣進;r㈣Γ 層析圖譜特徵(第5A目)。層析圖譜的複 乃小==^=於第Λ5(:圖’其顯示G小時,22小時,以及 +時或91小日#|二.自.小時發酵樣本的貧料,顯示—些微量產物,在0 在一广έ偵測到。9卜】、時顯示,含有斷裂的11764 Da註據。
分析。自,9 (表υ發酵液中,數個時間點經由LC-MS 地顯示;fi /,4小日守,72小時,以及%小時的層析圖譜,個別 加圖一著名的成份侧於18.5分鐘,其隨著發酵進行而增 加第10Α以及10Β圖提供18 5分鐘溶析峰 相同。其中並無斷㈣hITF㈣形式有靡,卜,、預调耐㈣ 4,Γ有Lit的f料’辨域的測量由層析圖譜而來,其結果顯示在表 寸有hITF》辰度估计值,依據外在參考值與hiTj?標準品 4 ώ/r h TTP^^t ct i nr /1,令、丄 0 ND 47.5 440 0.13 72 11518 3. 33 96 18930 5. 48 hITF 15-73 Standard 3458 1.00 杯贫叩s,上述頁料湓叨川trs及三葉胜肽片段的製備,以及特 hITFw3聚胜肽(片段及異形同體),會受到特定生長條件的影塑。巴斯德 赤酵母菌的生長及受甲醇誘導表現hITFw3,在pH5正磷酸緩&液或piJ 構酸緩衝液,導致斷裂hITF聚胜肽的囤積。特別地,這些生長狀況會仿 hlTFi5-73被切割於Leu2。及Seni (hlTF。73)之間。但是,同樣的酵母菌生 在pH6的正磷酸緩衝液或偏磷酸緩衝液,並不會促進這個切割事件,導 33 200410708 hlTF^3囤積。若有必要,片段可以彼此分離,藉由傳統方法,如Ηριχ,膠 體過濾,或是離子管柱層析。 雖然後述_子,以巴斯德畢鱗母菌而言,特徵在轉譯_穩定插入 的重組hITF!5-73,该酵母菌株可以改造,轉譯一個或多個或三葉胜肽 片段。進一步而5,持續培養條件的最佳化,與本發明原則一致,可用來 增加欲求的TDCP或片段,以及轉譯後化學與酵素的修飾。 實施例3 :來自重組hITFl5_73TDCPs的生物活性 重組二葉峨#段的生物活性,赋管外傷…軸分析侧量,詳述 於Dig_ ei a/· (/·㈣· /騰对· 94:376—383 (1994))。簡言之,初 代小腸表皮細胞,IEC-6 (交替到第17代),生長在無菌·⑽,s
Modified Eagle Medium (DMEM),補充 5% FCS (ν/ν),5 μ//ζ1 胰島素, 10祕盤尼西靈/鏈酶素/L—麵胺酸(PSG)。細胞生長在濕潤箱内抓及放 C〇2,生長到飽滿。 實行生物效性分析前,將培養液取出,用〇. 1% FCS/dmem清洗2次, 在0.1% FCS/DMEM ’ 3rc以及5% c〇2,缺乏血清下隔一夜。每一懈養孔用 刮翻刀製造兩個傷π。細胞再用〇· 1% FCS/_清洗—次。腳㈣及 樣t用㈣德畢赤酵母菌產生,且用前述方式純化。混合 二,母一片段1⑼在―毫升的〇.1%Ι?(:δ/Ι)ΜΕΜ。正控制組 使用已知裂殖原,轉形生長因子一沒⑽―石),濃度為2〇 ,負 組使用0. l%FCS/_,用於後續分析。細胞培養%小時"在24小時^, 清洗’使用冷的議固定。每—盤藉由計算橫越傷口的細 hITF㈣片段及異形同體⑽Ps)由下列方式製備。s ^harmacia)^ 200^^ 〇 j 〇> 0 J ^ 3 2 Μ腿’再用5 cv的20碰pH 3. 7甲酸 ^,J SP FastFlow raL/min) 〇 ! cv ^ 2^ f ^ 清洗,再用1 cv的〇· 11 M NaCl在20壤甲辦y u Q -疒P 3. 7 的20 mM果酸pH 6.0溶析。收集pH 4 4 用2 cv Ο-豐富物質。收集的管數集中且在2〇 _ Τι^.邱^集透I’其相對應於 200410708 若有需要,第2個管柱層析步驟可以進行。找細⑽管柱 (Pha臟ia)用20〇mL的樹脂充填。樹脂用含有5 M _的〇· 2 製, 備,再經5 cv的20 mM Tris ρΗ 7· 5。由sp 管柱的透析峰填充 至含Q-Sepha騰管柱,速度為〜2 „L/min。管柱用2〇祕㈣ρΗ 7· 5清 洗2官柱體積。hlTFi”3及其片段及異形同體,用2cv含〇1Μ·,2〇祕 Tris pH 7· 5溶析。此步驟會溶析大部份單體。進一步用2 cv含〇· 15 M _, 20 mM Tris pH 7· 5,促進雙體溶析。 欲進行生物效性分析,第三個層析管柱可以併入。從Q—Se細遞管 柱收集齡體在二次驗水下(持續更換)透析。透析後的溶液,經由冷束 萆=燥,懸浮於二次瘵餾水,用HPLC級水去離子,且用yMC酚基充填12〇a ^ 官柱的逆相HPLC純化。溶析的管體,相對應於主要峰,收集後用前述試管鲁 内傷口修復分析來做生物效性實驗。 表5摘錄了用於第11圖,生物效性測試樣本的分子量。表6摘錄了依 擄分子量檢定的hlTF^3 (片段及異形同體)。在第n圖中,丨號盤使用2〇 11居/111轉形生長因子-召〇^?-/3)。2號盤顯示1£(:-6細胞在〇!^111/0.1〇/〇 FBS(負控制組)的效應。3號盤顯示重組…吓㈣標準品在1〇〇 ^/虬(正控 制組)的效應。4號盤顯示hITF片段及收集自巴斯德畢赤酵母菌所產生的 hITF^-73異形同體,其轉移移效應。 自產生hITF巴斯德畢赤酵母菌(pichia pastoris)中所收 Plate Number (參見圖表11) 分子量 (Da) 主要成份滯留時間 (分鐘) 4 12884 6.4 5 12884 6.7 6 9682,13146,13346 9.6, 21.3 7 13146, 13346 21.0 — 8 13470,13672,13870 19.6 — 9 13146, 13346 21.1 10 13146, 13346 21.1 表6. hITFi5-73分子量鑑定 集的樣本 35 200410708 分子量(Da) hITF片段之鑑定 13870 hITF㈣雙體 + (Glu, Ala) + (Hexose)2 13672 hITFiw雙體 + (Glu,Ala) + (Hexose)2 13470 hITFV73 雙體 + (Hexose)2 13346 hITF15-73 雙體 + (Glu,Ala) 13146 hITFl5-73 雙體 12998 由hITFi5-73雙體刪除一 Phe 12884 i.由雙體刪除一 Phe及一 Asn 或 ii·由雙體刪除二Met殘基di腿er 9706 未鑑定 9682 未鑑定 7080 E(l) F(59) - S - S - E(56) F(59) 八匕凋夏11〇^生物活性及三葉胜肽片段的方法可以,只q。六丫巴言 例如,TaupineiW· (Proc· Natl· Acad· Sci· USA,97:79卜8〇4)。 實施例4 :來自重組hITF15-73的TDCPs生物活性比較 如前述方式,重組hITFV73由巴斯德畢赤酵母生。發_物由兩《 步驟純化,包含擴絲f管減析及厭核互個管柱層析。重組的抓 經極限過脑與透析過濾法純化,再冷絲燥。先前的分析證實隱& 雙體,EA-hITF15-73雙體及hITFWEA-hITF㈣異源雙體的存在。 IX 及離子_析純化’每—個分流管的檢定^ LC-略(瞧and N咖卿)。_相分析 乾燥’存於鐵躲後制娜雙飾则於表7 f 7·重組hITFi5-73雙體雙定 6 hlTFl5-73同源雙體_ JllTFl5-73/EA-hITFl5-73 36 200410708 異源雙體 11 13547 31.8 24.1 EA-hITF15-73同源雙體 生物活性測驗是由前述試管内IEC-6傷口/細胞移動實驗,附加下列的 修飾。IEC-6細胞培養在24-well多槽盤,且用真管在每一個槽產生4-5inmx 1 cm傷口。細胞清洗後維持在無血清的培養液,有或沒有人類菌落糖蛋白 (hCGP; 2 mg/ml),存有前述3種重組hITF雙體之1,19個小時。牛血清白蛋 白(0.1-1.〇11^/1111)替代1111?雙體加入。傷口修復是由1〇(^光學顯微鏡 (inverted Nikon Diaphor TMS,Nikon N6006 camera),計算IEC-6細胞橫 越傷口交界的數目。 、 相較於BSA控制組,重組hlTFiwa,如範例2所製備,IEC-6細胞橫越 傷口交界的數目約為3倍(第12圖>hITF㈣同源雙體,hITiWEA一hITFi5_73 異源雙體’及EA-hITFi5-73同源雙體的相對活性為1〇〇%,以及85 3%。 其它實施例 ’ 上述所提任何的發表與專利併入於參考文獻中,就如同每一個別的發 表與專利將併入於參考文獻。雖然本發明已以較佳實施例揭露,任何熟悉 此技藝者,在不脫離本發明之精神和範圍内,當可作各種之更動與潤飾。 【圖式簡單說明】 第1A-1C圖是三葉胜肽的胺基酸及核酸序列。第ία及ΐβ圖是人類小 腸二葉因子的胺基酸序列(登錄號ΒΑΑ95531;序列識別號:1),以及cdna序 列(基因銀行登錄號NM-003226;序列識別號:2)。第1C圖是源自人類 PS2/TFF1,SP/TFF2,以及ITF/TFF3之三葉功能部位的多序列比對。χ代表 任何胺基酸殘基。在四種三葉功能部位中,相同的胺基酸以粗體字代表。 第2圖是含有純化的hlTFis-73重組標準品之液態層析質譜儀特徵。 第3圖是來自巴斯德畢赤酵母(戶(run亂_5)所產生 hITFl5-73的發酵液,經由曱醇誘導及生長在pH5,30°C之培養液後的液態層 析質譜儀特徵。 第4圖是來自巴斯德畢赤酵母(戶(run 16L_5)所產生 hITFl5-73的發酵液,經由甲醇誘導及生長在pH5,30°C之培養液後的液態層 37 200410708 析質譜儀特徵。樣本在雙 第5A-5C圖是來ΐ ⑽)内另輕微加熱2個小時。 產生hITF㈣的發酵液,衫:畢f酵母(run 16L-5)所 態層析質譜儀特徵,且二解及生長在pH5 ’啊之轉液後的液 不同時間點k (第二酵;^的·性係對培養時間而增加。樣本在 第6圖是來取自τθ,ι弟犯圖)’以及T?lhrs (第5C圖)萃取出。 所產生腳1573_^ 稍畢赤酵母(咖_你咖(而16L-5) 液,經由甲醇誘導及生長在—培養液後的 (run 16L-5) 液態層析質譜顯徵^甲輯導及生長在_ ’啊之培養液後的 Ϊ SlT來取自T72hrs’巴斯德畢赤酵母(制_伽厂如(run 16別 液態層析質=1酵液’經由曱賴導及生長在pH6,3(rc之培養液後的 第囷疋末取自T96hrs’巴斯德畢赤酵母(/Vc/z/a/jaslor/s·) (run 16L-5) 的發酵液’經由憎誘導及生長在pH6,默之培養液後的 液悲層析質谱儀特徵。 第10A及10B圖,是取自第6—9圖中18·5分鐘的分離液,亦是巴斯德 畢赤酵母(咖/a ρ她咖(run 16L-5)所產生hITF㈣的發酵液,經由 甲醇誘導及生長在pH6,3(rc之培養液後的液態層析質譜儀特徵。第皿圖 是質譜特徵,代表質量與電價的比例,第⑽圖是以原子f量為單位的返 回特徵(deconvoluted profile)。 第11圖是ITF及其胜肽片段,在初代腸表皮細胞iEC_6上生物活性的 柱狀圖。肖b動性分析是在含〇1%胎牛血清的dmem中測試。1號盤是以 20ng/mL之已知裂殖原,轉形生長因子-点處理。2號盤顯示iEC_6在 DMEM/0· 1%胎牛血清下的效果。3號盤顯示重組純化hlTFiw在i〇〇#g/mL 下的效應。4-10號盤證實hITFl5_73片段的能動性效應(於i〇〇//g/mL劑量 下),樣品係收集自巴斯德畢赤酵母(/Vdk调对…。)所產hITF。 第12A圖是依實施例4處理之飽滿狀態的IEC-6細胞的顯微照片。下 38 200410708 圖顯示t=0小時的受傷邊緣。上圖顯示經1 mg/mL之hITF㈣處理19小時 後的受傷邊緣。第12B圖是一柱狀圖,其定量IEC-6細胞在19個小時下, 經lmg/mL之牛血清白蛋白(BSA ;白柱),或lmg/mL之hITFis-73 (hITF;黑 柱)處理後,橫越過受傷邊緣的數量。 39
Claims (1)
- 200410708 拾、申請專利範圍: 給予含,葉功能部㈣峨(TDCp)或是三葉胜肽的片段。 擇自2下ί 3專t1範圍第1項所述的方法,其中該™^或三葉_段係 ΜΤρΓ Μ : : ^ hIT^ hITF2- hITF- hITF- hlTF,, hITF^ hITF^ hITF-^EA-hITF„3〇 項所述的方法,其中該三葉胜肽片段是編。 1專彳㈣f 1柄频枝,射該TD 人-擎__ 1項所述財法,物道P或三_大片段包 含二葉功能部位’其絲酸序列與 肪片= 6·如申請專利_丨項所述的方法二=;Jp 目同° 以同源雙方法,其中該TDCP或三她段是 損害8。·如中請專利範圍第!項所述的方法,其中該上皮損害是上消化道的 it起、。食道損害、胃—食道逆流症造成之損害、或是由貝赛特氏 的傷如巾請補細第i項騎的枝,其巾該上絲害是真皮或上皮 U·如申請專利範圍第10項所述的方法, 傷、褥瘡、濕疹、接觸性皮膚炎、牛皮癖疼損中^ ^損害^創傷、t 主12.如申請專利範圍第10項所述的方法痕^害今或;^刺: 病毒或真菌感染而來。、宁掀“害疋由細菌、 子官1 _述咐法,料虹皮損料錄陰道、 病毒13綱触紋,其巾处扣害是由細菌、 40 200410708 从應1如申#專利範圍第1項所述的方法,其中該上皮損害是腸胃道上皮 印J1脅吾。 16.如巾請專概_丨_述的方法,其巾該上皮财是遠端腸 揚害。 17·如申請專利範圍第16項所述的方法,其中該損害是腸炎、直腸炎、 或是由克隆氏病與結腸炎所引起。 18·如申請專概圍第1賴賴方法,其巾該上皮損害是呼吸道上皮。 a 19、如申請專利範圍第18項所述的方法’其中該損害是由過敏反應、 氣喘、’fe性阻塞性肺臟疾,病、或是吸入轉,顆粒或是化學物質所引起。 20.如申請專利範圍第丨項所述的方法,其中該上皮損害是角膜的上皮。 21·如申請專利細第2Q項所述的方法,其中該損害是星狀角膜炎、 角膜潰瘍、疱疹病毒或腺病毒引起的角膜結膜炎、泡性角膜結膜炎、錐性 角膜病變、結麵、祕細舰炎(乾眼)、眼部發炎、誠泡瘡瘋痕、 細菌或原蟲感染。 22. 如申請專利範圍第丨項所述的方法,其中該損害是由抗癌化學治療 或抗癌放射線治療所引起。 23. —種藥學組合物,其包含一含三葉功能部位之多胜狀(TDCp)或三葉 胜月太片段,以及一藥學上可接受載體。 24·如申請專利範圍第23項所述的組合物,其中該TDCP或三葉胜肽片 段係擇自下列群組:hITF25-62, hlTF22-62, hlTFM2, hITF25-7。,hlTF22, hITF21-70, hITF25-72, hITF22-72, hITF㈣,hITF25-73, hITF22% ^ 25·如申請專利範圍第23項所述的藥學組合物,其中該三葉胜肽片段 是 ITFl5-73。 26·如申請專利範圍第23項所述的藥學組合物,其中該TDCP包含 ITFl5-73。 27·如申請專利範圍第23項所述的藥學組合物,其中該TDCP或三葉胜 肽片段包含三葉功能部位,其胺基酸序列與序列識別號:3-5中任一序列實 質上相同。 28·如申請專利範圍第23項所述的藥學組合物,其中該TDCP或三葉胜 41 200410708 肽片段包含三葉功能部位,其胺基酸序列與序列識別號·· 6序列實質上相同。 29. 如申請專利範圍第23項所述的藥學組合物,其中該TDCP或三葉胜 肽片段是同源雙體或異源雙體。 ^ 30. 如申請專利範圍第23項所述的藥學組合物,其中該組合物適於靜 脈内、肌肉内、或皮下注射。 31. 如屮請專利範圍第23項所述的藥學組合物,其中該組合物配製成 漱口水、口喷劑、或可攝取液體。 32·如申ό月專利範圍第23項所述的藥學組合物,其中該組合物配製成 栓劑、灌腸劑、子官栓劑、或是陰道洗劑。 33·如申請專利範圍第23項所述的藥學組合物,其中該組合物配製成 吸入式。 34·如申請專利範圍第23項所述的藥學組合物,其中該組合物配製成 眼部使用劑。 ^丄「〕·如申請專利範圍第23項所述的藥學組合物,其中該組合物包含一 弟—治療樂劑() θ 36·如申請專利範圍第35項所述的藥學組合物,其中該第二治療藥劑 疋止痛劑、抗病毒劑、抗細菌劑、抗真菌劑、抗增生劑、抗發炎劑、或是 類固醇。 42
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