TW200307129A - Compositions and methods for restoring immune responsiveness in patients with immunological defects - Google Patents

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0) 0)200307129 玖、發明說明 (發明說明應敘明··發明所屬之技術領域、先前技術、内容、實施方式及圖式簡單說 發明背景 技術領域 本發明大體係有關刺激τ細胞之方法，更特別的是有關增 加在丁細胞族群中表現的T細胞受體（TCRs)之多株性之方法， 藉此重建該T細胞之免疫潛力。本發明亦有關細胞組成份， 包括多株性增加之刺激過的T細胞及其用途。 先前技術 τ細胞之具有辨識與不同的癌症或感染性生物相關之普 遍的抗原之能力係因其T細胞抗原受體（TCR)，此係由一 α (alpha)鏈與一 β (beta)鏈，或由一 γ (gamma)與一 δ (delta)鏈二 者構成。组成這些鏈的蛋白質係由DNA編碼，其使用獨特 機制以產生極大多樣性之TCR。TCRa與β或γ與δ鏈係經雙硫 鍵連接（Janeway，Travers，Walport. Immunobiology.第 4版， 148-159. Elsevier Science Ltd/Garland Publishing· 1999)。該 α/β或 γ/δ異雙體與細胞膜之不變部份的CD3鏈形成複合物，且此複 合物能辨識與MHC分子結合之特定抗原肽；或是在γδ T細胞 情形，可辨識無關MHC限制之部份。TCR產生之極大多樣性 之專一性頗類似免疫球蛋白者，皆係經體細胞基因重排而 來。β鏈基因含超過50個可變區（V)、2個多樣區（D)、超過1〇 個連接（J)片段與2個經常區片段（C)。α鏈基因含約70個V片 段與超過60個J片段；但無D片段並有1個C片段。當Τ細胞於 胸腺發展時，β鏈會產生D對J之基因重組，隨之為V基因片 段重排至該DJ。此功能性VDJp表現序列會經轉譯與剪切以 與Cp連接。對該α鏈而言，有一個Va基因片段重排至一個 200307129 發明說明續頁 ⑺

Joe基因片段以產生功能性表現序列，然後轉譯並剪切至Ca。 V、D與J基因片段隨意結合之能力會將大片段之結合多樣 性導入TCR目錄。V、D與J片段連接之準確點會改變，使接 合點之局部胺基酸產生多樣性。接合位置之正確的核甞酸 會差異達10個殘基之多，造成核苷酸由V、D與j基因片段尾 端之消減’藉此在這些片段的接合點產生密碼子變化。當 非由基因編碼的額外核：¾:酸加入經接合的基因片段之接合 點時’會進一步增加重排過程之多樣性（經此過程產生之變 化稱為 區域多樣性 ’’。）（Janeway, Travers, Walport.

Immunobiology.第 4 版，98 與 150. Elsevier Science Ltd/Garland Publishing. 1999) 0 T細胞目錄之多樣性程度有部份可經由評估循環T細胞池 内個別T細胞使用之TCR νβ鏈，並藉插入該νβ基因隔壁之任 意核苷酸的數目來進行測定。通常，當循環Τ細胞池含表現 完全範圍之TCR νβ鏈，而且當這些個別之νβ鏈係衍生自使 用插入的核：y：酸之最大排列的基因重組時，該免疫系統之 該T細胞手臂有其辨識普遍潛在抗源之最大潛能。當循環τ 細胞池表現之TCR νβ鏈的範圍有限或減低時，而且當表現 之丁CRs利用有限的插入核：y：酸之重組基因編碼之鏈時，免 疫反應潛力之廣度相對地降低。其結果，係對廣泛的抗源 之反應能力降低，造成感染與癌症風險增加。 光谱型態分析係最近發展之測足丁 C R V β、v α、V γ或V δ基 因使用情形之方法，其係利用Τ細胞池與Τ細胞發展時之重組 過程中之核茹酸插入量來進行分析（如美國專利號碼 200307129 (3) 發明說明續頁 5,837,447所述）。光譜型態分析可用以測定T細胞免疫反應潛 力之寬度或窄度。 αβ TCR與結合於抗原呈現細胞（APC)之MHC分子的抗原肽 之結合，係Τ細胞活化之中心事件，此係在Τ細胞與APC間之 接觸點的免疫接合處發生。為維持Τ細胞活化，Τ淋巴球典 型的需要第二種共-刺激信號。對欲產生足量之誘使無性繁 殖擴張之胞動素的Τ幫助者細胞而言，典型地需要共_刺 激。Bretscher，Immunol. Today 13 ·· 74，1992 ; June等人，Immun〇l.

Today 15 : 321，1994。主要共-刺激信號係發生在活化之抗原 呈現細胞（APC)之B7家族配位體（CD80 (B7.1)或CD86 (B7.2)) 與丁細胞之CD28結合時。 刺激某些T細胞亞型擴展之方法有產生多種在免疫治療 有用之T細胞組成份的潛力。藉有效刺激增加τ細胞之多株 性、反應性與量有助免疫治療之成功。 不同之擴展人類τ細胞的技術主要有賴使用輔助細胞或 諸如間白素j (IL-2)之外源生長因子。IL-2通常與抗-CD3抗 起使用以刺激T細胞增生’主要是擴展T細胞之CD8+亞族 群我們認為，於再浸潤時，APC之兩種信號係最適之丁細 胞/舌化、擴展與長期存活所需。因APCs相當短命，需要^^只匕 配备\ APCs做辅助細胞時，便王現長期培養系統之明顯問 超。因而，在長期培養系統，必須有持續取得ApCs並再補 充之來源。需要重新補充輔助細胞對免疫不足之治療是有 問避的，因為其時輔助細胞亦受影響。此外，當治療病毒 感染時，若輔助細胞帶有病毒，在長期培養時該細胞會污 (4) (4)200307129 發明說明續頁 染整個T細胞族群。 此蟄先可可得之方法係利用抗-CD3與抗-CD28來擴展丁細 胞然而，沒些方法無一說明利用此種或類似方法來增加丁 細胞族群之多株性或其有利結果者。甚且，擴展之丁細胞的 應用僅限些疾病。而且，先前可得方法似乎進—步歪曲丁 ，肊族群〜典性繁殖性而非增加與/或維持τ細胞族群之多 株性。為使體内效果最大化，理論上體外或體内產生之活 化T細胞族群應為可激起對癌症、傳染病或其他病症最大之 免疫反應。本發明提供TCR表現多株性已增加之更高度活化 與更純T細胞之增加量的生產方法。 發明内容 本發明一万面提供由免疫妥協病患重建T細胞族群之TCR 表現^株f生的方法’其係用以重建病患免疫反應性，包括 提供其中至少其一部份包括T細胞之細胞族群，暴露該細胞 族群至某表面’其中該表面之上附著一或多種至少接合部 份T細胞之細胞表面部份的藥劑，並刺激至少該τ細胞之一部 份，以足夠時間培養該細胞至以丁⑶表現而言，至少增加一 個TCR νβ、να、νγ與/或vs家族之多株性，並藉此重建τ細 胞族群之多株性。 在本愈明個具體實施例，該重建包括，以νβ、Vot、νγ 與/或νδ光譜型態情形測定至少一種邪、w、^與/或…家 族基因時T、、、田胞妖群由單株性轉移至寡株性、由單株性轉 移至多株性或由寡株性轉移至多株性。在本文所提供方法 的一個具體實施例，該轉移包括表現至少一種νβ、Va、νγ 200307129 _ (5) 發明說明續頁 與/或νδ家族基因之多株T細胞增加至足供治療用途之數目。

本發明另一方面提供一種重建免疫妥協的個體免疫反應 性之方法，其中該個體之Τ細胞與非免疫妥協者比較，其TCR 表現之多株性降低；此包括由該個體取得其中至少一部份 包括Τ細胞之細胞族群；暴露該細胞族群至某表面，其中該 表面之上連接一或多種至少連接部份Τ細胞之細胞表面部 份的藥劑，並至少刺激部份之Τ細胞；以足夠時間培養該細 胞以增力口至少一個TCR νβ、να、νγ與/或νδ家族之多株性； 並將該刺激過之Τ細胞部份浸潤至免疫妥協的個體，藉此重 建該免疫妥協者之免疫反應性。在某些具體實施例，浸潤 的丁細胞之多株性於浸潤後在體内至少維持3至6個月至1年。

在一個具體實施例，該免疫妥協的個體有癌症。該癌症 得為下列之任一種：黑色素瘤、非-霍金森氏淋巴瘤、霍金 森氏病、白血病、漿細胞瘤、肉瘤、神經膠質瘤、胸腺瘤、 乳癌、前列腺癌、大腸直腸癌、腎te癌、腎細胞癌、騰臟 癌、鼻咽癌、食道癌、腦癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、 多發性骨髓瘤、肝細胞癌、急性淋巴胚細胞白血病（ALL)、 急性骨髓白血病（AML)、慢性骨髓白血病（CML)、大顆粒淋 巴球白血病（LGL)與慢性淋巴球白血病（CLL)。在一個較佳 具體實施例中，該癌症係B-細胞淋巴球白血病。 在另一個具體實施例，該免疫妥協的個體係受感染性生 物所感染。該感染性生物得包括病毒，諸如單股RNA病毒 或單股DNA病毒、人類免疫不足病毒（HIV)、A、B或C型肝 炎病毒、疱疹單純病毒（HSV)、人類乳突狀病毒（HPV)、巨 -10 - 200307129 發明說明續頁 (6) 細胞病毒（CMV)、伊波（Epstein-Barr)病毒（EBV)、寄生蟲、細 菌、肺結核菌（M· tuberculosis)、肺囊蟲（Pneumocystis carinii)、 念珠菌（Candida)或黃麴菌（Aspergillus)或其組合。 在另一個具體實施例，該免疫妥協的個體有諸如嚴重的 組合免疫不足（SCID)或一般可變的免疫不足（CVID)之先天 性遺傳病症。在某些具體實施例，該個體之免疫妥協係與 癌症有關之治療的結果。在某些具體實施例，該個體之免 疫妥協係與血液生成幹細胞移植、骨髓移植、臍帶血、同 種的、自體的或異種細胞之移植、化學療法、放射線療法、 細胞毒性藥劑療法、免疫壓抑藥劑療法（例如環胞素、皮質 類固醇及其類似物）等等有關之治療所致。在另一個具體實 施例，該免疫妥協的個體有免疫不足或自免疫疾病。在又 一個具體實施例，該免疫妥協的個體有影響腎臟、肝臟或 脾臟之慢性病。在一個特定具體實施例，該個體有糖尿病。 在一個具體實施例，該免疫妥協的個體係因年老而受影 響。在另一個具體實施例，該免疫妥協的個體涉及基因治 療，或涉及造成T細胞目錄歪曲之基因傳導的其他過程。 在另一個具體實施例，該免疫妥協的個體苦於因改變或 歪曲之T細胞目錄的相關疾病，包括但不限於類風濕性關節 炎、多發性硬化症、胰島素依賴型糖尿病、阿迪生氏症、 乳糜瀉、慢性疲勞徵候群、發炎性腸疾、潰瘍性結腸炎、 克隆氏症、肌纖維痛、紅斑性狼瘡、牛皮癬、修格連氏徵 候群、甲狀腺機能亢進/格瑞夫氏症、甲狀腺低能症/橋本氏 症、胰島素依賴型糖尿病（1型）、重症肌無力、子宮内膜易 發明說明續頁 200307129 ⑺ 位、硬皮症、惡性貧血、古德巴斯德徵候群、韋格那氏症、 腎絲球腎炎、再生不良性貧血、各種不同的血球缺乏症、 陣發性夜間血紅素尿症、骨髓異生徵候群、特發性血小板 低下性紫斑、自免疫溶血性貧血、遺傳性貧血、伊凡氏氏 徵候群、第VIII因子抑制劑徵候群、第IX因子抑制劑徵候 群、全身性血管炎、皮肌炎、多發性肌炎與風濕熱。本文 所述之方法與組合物可用以治療以低血球計數為特徵之血 液疾病。 在另一個具體實施例，該免疫妥協的人苦於T細胞目錄歪 曲相關之神經性疾病或心血管疾病。 1 ·在另一個具體實施例，本發明之細胞組合物係施於自 體免疫疾病的病患。本發明一個具體實施例提供重建免疫 妥協的人免疫反應性之方法’其中該免疫妥協者苦於自體 免疫疾病。在某些具體實施例，自體免疫疾病包括但不限 於類風濕性關節炎、多發性硬化症、胰島素依賴型糖尿病、 阿迪生氏症、乳糜瀉、慢性疲勞徵候群、發炎性腸疾、潰 瘍性結腸炎、克隆氏症、肌纖維痛、紅斑性狼瘡、牛皮癬、 修格連氏徵候群、甲狀腺機能亢進/格瑞夫氏症、甲狀腺低 能症/橋本氏症、胰島素依賴型糖尿病（1型）與重症肌無力。 在另一個具體實施例，該免疫妥協的個體係接受化療。在 另一個具體實施例，該免疫妥協的個體係接受細胞毒素藥 劑療法。在另一個具體實施例，該免疫妥協的個體係接受 免疫壓制藥劑療法。在另一個具體實施例，該免疫妥協的 個體係苦於與血球缺乏症相關之血液疾病，包括但不限於

-12- 200307129 ⑻ 發明說明續頁 再生不良性貧血、骨髓異生徵候群、遺傳性貧血、， 血小板低下性紫斑與自免疫溶血性貧血。Λ 、特發性 係根據 其係用 之τ細胞 本發明-万面提供包括Τ細胞族群，其中該多株性 本文所述方法重建與醫藥可接受賦形劑之組合物_ 以重建免疫妥協的個體之免疫反應性，其中該個體 多株性與非免疫妥協的個體做比較是降低的。 在某些具體貫施例，本發明之έ 又又組合物係施於若非接受, 如氟達拉濱、外波段放射治療（XRT)、環鱗醯胺，即是諸如 OKT3或C AMPATH抗體的化療藥劑之τ細胞去除治療的疒 患。在另一個具體實施例，本發明之組合物係施於接受諸 如與CD20反應之樂劑，例如仙似⑽之2_細胞去除治療之病 患。上述施用於病患的治療之劑量視欲治療之病情與治療 之接受者的正確情形而定。施用於人類之劑量規模得根據 此藝已知之方式進行。例如CAMPATH對成人之通常劑量為] 至約100毫克，通常每日施用達1-30天。雖然某些情形可使 用高達每日40毫克，較佳日劑量為每天卜10毫克，（美國專 利號碼6,120,766有所說明）。 本發明在一方面提供包括Τ細胞族群，其中該TCR表現之 多株性係根據本文所述方法重建與一種醫藥玎接雙賦形劑 之組合物；該細胞係用以重建免疫妥協的個體之兄疫反應 性，其中該個體之T細胞與非免疫妥協的人比較’其多株性 降低。 本發明在另一方面提供其中該表面係附著與丁細胞之第 一個細胞表面部份接合之第一個藥劑，而該相同或第二個 200307129 (9) 發明說明續頁

表面係附著與T細胞之第二個細胞表面部份接合之第二個 藥劑之方法；藉該第一與第二個藥劑之接合可誘發該T細胞 之增生。在一個具體實施例，該第一個藥劑包括抗-CD3抗 體，而該第二個藥劑包括結合於該T細胞表面之輔助分子的 配位體。在另一個具體實施例，該輔助分子為CD28。在另 一個具體實施例，該第一個藥劑包括抗-CD3抗體而該第二 個藥劑包括抗-CD28抗體。在另一個具體實施例，該第一與 第二個藥劑係經共價键而附著於該表面或該第二個表面。 在另一個具體實施例，該第一與第二個藥劑係藉直接附著 或間接附著而附著於該表面或該第二個表面。

本發明在另一方面提供其中該表面附著一或多種至少與 部份T細胞之細胞表面部份接合之藥劑，並至少刺激部份T 細胞之方法；其中該藉由一或多種藥劑接合之方法，可誘 發該T細胞之活化。在一個具體實施例，本發明使用一或多 種表面。在另一個具體實施例，不論順式或反式，有3或多 種藥劑附著於該表面。 實施方式 在設定本發明之前，應了解設定本文將使用之某些用詞 的定義可能係有幫助的。 本文所用之“生物相容性”之用語，意指對活細胞主要為 無毒性之性質。 本文所用之“刺激”之用語，意指經細胞表面部份接合所 诱發之初級反應。例如，就受體情形時，此類刺激意指受 體之接合與後續之信號傳遞事件。關於T細胞之刺激，這種 -14- 200307129 發明說明續頁 (ίο)

刺激意指在一個具體實施例之T細胞表面部份的接合，後續 誘發諸如結合TCR/CD3複合物之信號傳遞事件。甚且，該刺 激事件可活化一個細胞，並向上或向下調節諸如受體或吸 附分子之細胞表面分子之表現；或向上或向下調節，諸如 向下調節腫瘤生長因子β (TGF-β)分子之分泌。因此，細胞 表面分子之接合，即使在無直接細胞傳遞事件情形下，會 造成細胞肌結構之重新組織，或在合併細胞表面部份時， 每個皆可做為強化、修飾或改變後續細胞反應之用。

本文所用之“活化”之用語，意指經充分之細胞表面部份 接合之後，誘發可觀的型態，基因與/或功能變化之細胞狀 態。就Τ細胞情形而言，此種活化可能係經充分刺激以誘使 細胞增生之Τ細胞的一種狀態。Τ細胞之活化亦可包括胞動素 產生與/或分泌，並向上或向下調節諸如受體或吸附分子之 細胞表面分子之表現；或向上或向下調節某些分子之分 泌，與進行調節或溶胞效應物功能。就其他細胞之情形， 此用語亦指向上或向下調節特定物理-化學過程。 本文所用之“目標細胞”之用語，意指將被細胞表面部份 接合刺激之任何細胞。 本文所用之“抗體”之用語，包括多株與單株抗體（mAb)、 初級化（例如人性化）、鼠類、小鼠-人、小鼠-靈長類與嵌合； 而且可能係完整分子、其片段（諸如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab' 與F(ab)’2片段）或多體或完整分子之聚集物與/或片段，而且 可為自然或經例如免疫注射、合成或遺傳工程產生者；如 本文所用之“抗體片段”意指衍生自或與抗體相關之片段， -15 - 200307129 發明說明續頁 (11) 其會結合抗原，在某些具體實施例，可經衍生以展現其促 進清除與吸收，例如併入半乳糖殘基，之結構特徵。此包 括例如F(ab)、F(ab)’2、scFv、可變區輕鏈（VL)、可變區重鏈 (VH)及其組合。

本文所用之“蛋白質”之用語，包括蛋白質、糖蛋白與其 他經細胞衍生之修飾蛋白、多肽與肽、而且可能係完整分 子、其片段或完整分子與/或片段之多體或聚合物，而且可 自然或經例如合成（包括化學與/或酶的）或遺傳工程產生。 本文所用之“藥劑”、“配位體”或“與細胞表面部份結合之 藥劑”之用語，意指與特定細胞族群結合之分子。該藥劑得 與任何細胞表面部份結合，諸如受體、抗原決定部份或其 他出現在目標細胞族群之結合位置。該藥劑得為蛋白質、 月大、抗體及其抗體之片段、融合蛋白、合成分子、有機分 子（例如小分子）或其類似物。在本專利說明書與T細胞刺激 之情形，抗體係做此種藥劑之原生型實例。

本文所用之“細胞表面部份”之用語，可意指細胞表面受 體、抗原決定基或任何其他出現在目標細胞族群之結合位 置。 本文所用之“結合細胞表面部份的藥劑”與“細胞表面部 份”之用語，應視為顯示特定結合，通常具相當高親合力之 一組互補/抗互補之分子。 本文所用之“共刺激信號”之用語，意指一種信號，其加 上一種諸如TCR/CD3接合之初級信號，造成T細胞增生與/或 活化。 -16- 200307129 發明說明續頁 (12) 本文所用分離”之用語，包括任何貫質上可將一種成分 與另一種成分純化出之方法（例如經過濾、親合力、浮力密 度或磁性吸引）。

本文所用之“表面，，之用語，意指任何能使一種藥劑附著 其上之表面，包括但不限於金屬、玻璃、塑膠、共聚物、 膠體、脂質、細胞表面及其類似物。實質上，任何能維持 藥劑與其結合與附著之表面皆屬之。

本文所用之“單株性，，之用語’就T細胞族群之情形而言， 意指經光瑨型態分析來定義時，具有單一專一性之τ細胞族 群（一種測定TCR νβ、να、Υγ或乂5鏈之高可變區目錄的方 法）。當特定TCR νβ、να、νγ與/或V3家族之νβ、Va、νγ與 /或νδ光譜型態情形具單一明顯波峰時，我們即認定該τ細 胞族群為單株者（或單專一性）（參照圖1)。光譜型式分析係 區別特定大小之重組可變基因而非序列。因此，我們了解 單一波峰表示表現任一有限數目之重組TCR可變基因（νβ、 Va、νγ或νδ)之τ細胞族群，包栝在連接區之4種潛在核：y：酸 (腺嘌呤（a)、鳥糞嘌呤、胞嘧啶（c)或胸腺嘧啶（t))之任一 種或該4種核苷酸之組合。在本發明之某些具體實施例，可 能需要選殖與定序特定帶，以決定在該帶中表示特定長度 之重組可變基因的序列。 本文所用之“寡株性，，之用語，就T細胞族群之情形而言， 意指經光譜型態分析定義時，具有多個但狹窄之抗原專一 性之T細胞族群（一種測定TCR β鏈之高可變區目錄的方 法）。當特定TCR Υβ家族之Υβ光譜型態情形具約2-約4個明顯 -17- 200307129 (13) 發明說明續頁 波峰時，我們即認定該T細胞族群為寡株者（泉077 \圖 1)。 尽又尸吓用 < 夕條Ί二〜…… I Α、卿肥族雜、>4, , 天拜 < 情形而言， 唁經光譜型態分析定義時’具有多個且皆h 及見廣之T細胞族群 種測定TCR β鏈之高可變區目錄的方法、 J °當特定TCR νβ 涘之νβ光譜型態情形具多個波峰時，血 ^地為5個或更多 且多數情形呈現高斯分布 ^的…< 4々 冲時，我們即認定 該Τ細胞狹群為多株（參照例如圖1、？ *，、 44 iW： ’’之用*吾’就T細胎^ I祆辟之情形而言 之明顯波蜂，而一 / M m γ 回所才 胞族群為多株（參照例如圖1、2與3)。 本文所用之“重建或增加多株性，，之 五 態 〖分析或諸如細胞流動計數或序列分心意指經光譜型 一個τ細胞族群之表現的TCR νβ、v y:二=’： 轉移至寡株性；或至多株情形(換言之，由單株性 m言之，由單株:：性)，或由寡株情形轉移至多㈣ 4 νδ豕狹發現由τ細胞 、口。 與/或νδ表現情形轉移至寡株 k早株νβ、να、νγ 體實施例’該轉移可在2、3 $夕3形。在本發明一個具 之某些具體實#如：、3 4或5 Μ家族看到。在本發明 到。在本發明另\美' 私可在6、7、8、9或：[〇 νβ家族看 另一個具體余、a μ 、、 或 ^ ^ 、 在本發明另一個且Μ余 在15-20 νβ家族看到。 ”岐貝她例，該轉移可 可在20-24 νβ家族看^本^明另個具體實施例，該轉移 ^ 在另一 Υ固且哲#奋、Α 全部νβ家族看到。重 "植貝她例，該轉移可在 義在該細胞族群免疫^二加Τ細胞*群之多株性的功能意 建或增加。在本發明之^或對全乾81抗原之反應的能力重 水些方面，在—族群内之某些Τ細脃 Η νβ家族看到。：％ 1 ’ m轉移可在11、12、13 15-20 νβ家族暑$丨 明另一個具體實施例，該轉移可 -18- 200307129 發明說明續頁 (14) 或許未有如本文所述方法使用之TCRs (例如具向下調節之 TCR表現之T細胞）。然而，因鄭接於經本文所述方法活化之 T細胞，及其所分泌之因子，這些T細胞可能反過來向上調節 其TCR表現，藉此造成該T細胞族群多株性之進一步增加。 本文所用之“動物”或“哺乳類”之用語，涵蓋所有哺乳 類，包括人類。本文之動物以人類病患較佳。

本文所用之“暴露”之用語，意指造成直接接近或接觸之 狀態或情況。 本文所用之“增生”之用語，意指藉產生新細胞而成長或 繁殖。 本文所用之“免疫反應或反應性”之用語，意指細胞免疫 系統之活化，包括但不限於T細胞，使得可誘發特定細胞之 效應物功能。效應物功能得包括但不限於增生、分泌胞動 素、分泌抗體、調節與或吸附分子之表現與謗發溶胞作用 之能力。

本文所用之“刺激免疫反應’’之用語，意指達成免疫系統 細胞之效應物功能的活化與誘發之任何刺激。 本文所用之“免疫反應功能障礙”之用語，意指免疫系統 細胞之不適當的活化與/或增生或缺少任何刺激；與/或胞動 素之不適當或缺少分泌與/或免疫系統細胞之其他效應物 功能之不適當或不足誘發，諸如調節、吸附與/或能識歸途 受體之表現與溶胞作用之誘發。 本文所用之“預防”或“抑制”癌症或癌細胞發展之用語， 意指該癌症之發生被預防或癌症之開始被延遲。 -19 - (15) (15)200307129 發明說明續頁 本文所用之“治療或減少癌症或癌細胞之存在，，或“治療 或減少腫瘤或腫瘤細胞之存在，，之用語，意指該癌症或腫瘤 4成長文抑制，其係由例如腫瘤體積或惡性化細胞之數目 來反應。欲決定癌症減小可利用任何此藝中之技術，包括 測定蛋白質、PCR為基礎之分析、rna與dna雜合分析或 原位PCR或雜合等等。欲決定腫瘤體積得利用不同已知程序 例如，以針盤測定器取得雙維之測定。 本文所用之“預防或抑制傳染病之發展，，之用語，意指傳 染病之發生受防止或傳染病之開始有所延遲，或存在的傳 染之散佈反轉或安定化。 本文所用之“改善，，之用語，定意為：變更好；改進（丁 he

American Heritage College Dictionary, 3rd Edition, Houghton Mifflin Company, 2000) 〇 本文所用之“顆粒”或“表面，，之用語，可以包括膠體顆 粒、微球體、毫微顆粒、珠子或其類似物。表面則可能為 能讓配位體結合於其上或整合入其中之任何表面，包括細 胞表面（例如K562細胞）與彼生物可相容者，亦即，實質上對 欲刺激之目標細胞無毒者。在不同之具體實施例中，可購 得之表面諸如，珠子或其他顆粒皆可用（例如Miltenyi Particles，Miltenyi Biotec，Germany ;瓊月旨膠珠子，Pharmacia Fine Chemicals，Sweden ； DYNABEADS™, Dynal Inc., New York ； PURABEADS™, Prometic Biosciences, Immunicon 之磁珠， Huntingdon Valley，PA，Bangs Laboratories之微球骨豊 ’ Inc·，Fishers, IN)。 -20- 200307129 (16) I發明說明續頁 本文所用之“超磁性顆粒”之用語，意指如上述定義之會 因反應磁場而侷限化之顆粒。

本文所用之·‘傳染病”之用語，意指由任何感染性生物所 造成之疾病。感染性生物得包括病毒（例如單股RNA病毒、 單股DNA病毒、人類免疫不足病毒（HIV)、A、B與C型肝炎 病毒、疱疹單純病毒（HSV)、巨細胞病毒（CMV)、Epstein-Barr 病毒（EBV)、人類乳突狀病毒（HPV))、寄生蟲（例如原生動物 與厚生動物病源體，諸如Plasmodia種類、利什曼原蟲 (Leishmania)種類、血吸蟲（Schistosoma)種類、錐原蟲

(Trypanosoma)種類）、細菌（例如分枝桿菌（Mycobacteria)特別 是肺結核菌（M. tuberculosis)、沙門氏菌（Salmonella)、鏈球菌 (Streptococci)、大腸桿菌（E. coli)、葡萄狀球菌（staphylococci)) 、真菌（例如念珠菌（Candida)種類、黃麴菌（Aspergiiius)種 類）、肺囊蟲（Pneumocystis carinii)與感染性蛋白（已知感染性 蛋白感染動物造成播疼症’綿羊與山羊之神經系統可轉移 的退化性疾病以及牛海綿狀腦病變（BSE)或“瘋牛症，，與雜 之猫 > 母·綿狀細病’fc )。已知有四種感染性蛋白疾病命影變人 分別為（1)古晉（kuru)、（2)庫賈氏病（CJD)、（ 3)格斯特曼集合 徵候群（Gerstmann-Straussler-Scheinker)病（GSS)及（句致命的家 族性失眠症（FFI)。本文所用之“感染性蛋白，，之用語，包括 全部型式之造成任何使用的動物之這些全部的或任何疾病 或其他疾病-特別是人類與家畜。 T細胞多株性之刺激、活化與重建 本發明之具增強的多株性之刺激過與活化過之τ細胞係 21 200307129 (17) I發明說明續頁 經由與會誘發活化之細胞表面部份接合而產生。該具增強 之多株性之刺激過與活化過之τ細胞係利用活化τ細胞族群 並以會與輔助分子結合之配位體，刺激τ細胞表面之輔助分 子而生成，其說明請參照例如，美國專利申請號碼 08/253,694、08/435,816、〇8/592,71 卜 09/ 183,055、09/350,202 與 09/252,150與專利號碼 6,352,694、5,858,358與 5,883,223。 通常’ T細胞活化與多株性之重建得經由細胞表面部份之 接合’諸如刺激T細胞受體（TCR)/CD3複合物或CD2表面蛋白 貝而元成。有些抗-人類C D 3抗體可講得，例如純種系b C 3 (XR-CD3，Fred Hutchinson Cancer Research Center，Seattle，WA)、 〇KT3、由美國式培養收集站取得之融合瘤細胞製成者與單 株抗體G19-4。同樣地，我們也知道抗_CD2抗體之刺激型式 並可取得。典型地，係利用至少兩種抗- CD2抗體之組合才 可達成以抗- CD2抗體之經CD2的刺激。抗- CD2抗體之刺激性 組合的說明請參照包括下列：ΤΠ.3抗體加上T11.1或τι ι·2抗 體（Meuer等人，Cell 36 : 897-906, 1984)與9.6抗體（其可辨識與 T11.1相同之抗原決定基）加上9_丨抗體（Yang等人，夂 137 : 1〇97-U〇〇,丨986)。亦可使用與上述之抗體結合於相同 抗原決定基之其他抗體。利用標準技術得製備並辨識另外 的抗體或抗體之組合。經由與超抗原（例如葡萄狀球菌 (Staphylococcus)腸毒素A(SEA)、葡萄狀球菌腸毒素B (SEB)、 毒素休克徵候群毒素1 (TSST-1))、内毒素或經由一些有絲分 裂原’包括但不限於植物血清凝集素（PHA)、巴豆醇乙酸十 四酯（PMA)與離子黴素、脂多糖（LPS)、τ細胞細胞分裂原與 -22- 200307129 (18) 發明說明續頁 IL-2接觸亦可達成刺激。 為進一步活化與增加T細胞族群之多株性，我們以會與輔 助分子結合之配位子刺激T細胞表面之共刺激或辅助分 子，諸如CD28。據此，具有此藝之一般技巧的人可確認， 任何藥劑之能交聯CD28分子，包括抗- Cd28抗體或其片段或 CD28之天然配位體皆可用來刺激τ細胞。可用於本發明+抗 -CD28抗體或其片段之貫例包括，單株抗體9 3 (IgG2^ (Bristol-Myers Squibb，Princeton，NJ)、單株抗體 KOLT-2 (IgGl)、 15E8 (IgGl)、248.23.2 (IgM)、純種系 B_T3 (xR_cD28，Diaclone, Besancon France)與 EX5.3D10 (IgG2a)(ATCC HB 1 1373)。天然配 位體之實例包括蛋白質之B7家族，諸如B7-1 (CD80)與B7-2 (CD86)(Freedman等人，J. Immunol· 137: 3260-3267, 1987; Freeman 等人，J. Immunol. 143 ·· 2714-2722，1989 ; Freeman等人，J. Exp Med. 174: 625-63 1, 1991; Freeman等人，Science 262: 909-91 1， 1993，Azuma等人，Nature 366 : 76-79，1993 ; Freeman等人，J. Exp. Med. 178 : 21 85-2 192，1993)。 其他位於T細胞表面，可被與本發明之輔助分子結合之配 位子刺激之說明性的輔助分子包括但不限於CD54、Ox-40、 LFA-1、ICOS、41-BB與 CD40。 此外’天然配位子之結合同系物，不管係原生或由化學 或重組技術合成者，都可根據本發明加以使用。其他藥劑 得包括夭然或合成配位體。藥劑得包括但不限於，其他抗 m或其片ί又 生長因子、胞動素、化學動素、可溶性受體、 類固醇、激素、細胞分裂原諸如ρΗΑ或其他超抗原。 200307129 發明說明續頁 (19) T細胞族群之擴展 本發明在一方面，得利用刺激其中至少其一部份包括T細 胞之細胞族群進行T細胞之體外擴展。在本發明一個具體實 施例，得以單一藥劑刺激該T細胞。在本發明另一個具體實 施例，該丁細胞係以兩種或更多的藥劑刺激，一種誘發初級 信號，而另一種則謗發一或多種共刺激信號。我們得採用 可溶型式、附於細胞表面或固定化於本文所述之細胞表面 之方式，使用具有刺激單一信號或刺激初級信號之配位 體，以及刺激第二級信號之輔助分子。連接於某種表面之 配位體或藥劑係做為“代理”之抗原呈現細胞（APC)。在一較 佳具體實施例，其將初級或二級藥劑共固定化於一個表 面。在一個具體實施例，提供初級活化信號之分子諸如CD3 配位體，與共刺激分子，諸如CD28配位體，係偶合於相同 表面，例如一種顆粒之上。甚且，如稍早所示，我們得將 一、二或更多種刺激分子使用於相同或不同的表面。 擴展之前我們由實驗對象取得T細胞來源。“實驗對象”之 用語係欲包括可以在其引起免疫反應之活的生物（例如哺 乳動物）。實驗對象的實例包括人類、狗、貓、小鼠、大鼠 及其基因轉植品種。我們得由一些來源取得T細胞，包括週 邊血液單核球細胞、骨髓、胸腺、組織檢體、腫瘤、淋巴 結組織、與淋巴組織相連之腸道、與淋巴組織相連之黏膜、 胰臟組織或任何其他淋巴組織與腫瘤。我們得由T細胞株或 自體或同種的來源取得T細胞。T細胞亦得取自異種基因來源 例如小鼠、大鼠、非人之靈長類與豬。在本發明某些具體 -24- 200307129 _ (20) 發明說明續頁 實施例，得利用任何熟諳此藝者已知之技術，諸如非可 (ficoll)分離，收集實驗對象之血液單位而取得T細胞。在-較佳具體實施例，我們利用血液分離術與白血球分離術由 人之循環血液取得細胞。血液分離術產物典型地包含淋巴 球，包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他有細胞核 的白血球、紅血球與血小板。在一個具體實施例，可清洗 利用血液分離術收集之細胞以去除血漿部份並將細胞放入 適當緩衝液或媒介中以供後續加工步驟。在本發明一個具 體實施例，我們係利用磷酸緩衝鹽液（PBS)清洗細胞。在另 一個具體實施例，該清洗液缺少鈣，而且可能缺少鎂，或 可能缺少即使非全部，也是很多的二價陽離子。具此藝之 一般技藝者很快可了解，清洗步驟可由熟諳此藝者已知之 方式完成，諸如，利用根據製造者說明之半自動“流過”離 心（例如Cobe 2991細胞處理器，Baxter)。清洗後得將該細胞 懸浮於多種生物相容性之緩衝液，其例諸如，無-Ca或無-Mg 之PBS。另外，可以去除我們不要的血液分離術成分，而且 可將細胞直接再懸浮於培養液。 在另一個具體實施例，其係藉融解或去除紅血球，並利 用例如PERC0LLTMi梯度離心去除單核球，自週邊血液淋巴 球分離出T細胞係。可進一步利用正向或負向選取技術，分 離特定之T細胞次族群諸如，CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+ 與CD45RO+ T細胞。例如，在一個具體實例，其係利用與諸 如 DYNABEADS® M_450 CD3/CD28 T之抗-CD3/抗-CD28 (亦即 3 X 28)-共軛結合的珠子保溫正向選取所需T細胞之時間以分 -25 - 200307129 (21) 發明說明績頁 離τ細胞。在一具體實施例，該時間為約3〇分鐘。在另一且 ，、 體實施例’該時間為自30分鐘至36小時或更長及其間之任 何整數。在另一具體實施例，該時間為至少1、2、3、4、5 或6小時。在另一具體實施例，該時間為ι〇〜24小時。在一較 佳具缸貝施例，孩時間為24小時。為由白血病的病患分離τ 、、’田也使用較長保溫時間諸如24小時，可增加細胞產率。在 T、’、田也人任何其他細胞型式比較為較少，諸如由腫瘤組織或 免疫安協的個體分離腫瘤滲透淋巴球（Ήί)時，可使用較長 保溫時間以分離Τ細胞。甚且，使用較長保溫時間可增加 CD8+ Τ細胞之捕捉效率。例如，得使用cD3/CD28共軛結合 珠子（例如，DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 TCell Expandei:)正 向選取CD3+，CD28+ T細胞。本發明一方面，係利用針對負 向選取細胞表面獨特之標示物的抗體組合，負向選取以強 化細胞族群。較佳方法為，使用針對負向選取細胞表面標 示物〜單株抗體混合物，經負向磁性免疫吸附或流式細胞 儀（細胞區分與/或選取。例如，為強化CD4+細胞之負向選 取。單株抗體混合物典型地包括CD14、CD20、CD1 lb、CD16、 I-ILA-DR與CD8之抗體。 本發明另一方面提供在擴展前已經消減或強化表現多種 標不物’諸如CD62L、CD45RA或CD45RO、胞動素（例如IL-2、 IFN-γ、IL_4、il-10)、胞動素受體（例如CD25)、穿孔素、吸 附分子（例如 VLA-1、VLA-2、VLA-4、LPAM-1、LFA-1)、與 / 或能識歸途分子（例如L-選擇素）之τ細胞族群或混合物。在 一個具體實施例，表現任何這些標示物之細胞係經消減或 -26- 200307129 (22) 發明說明續頁 經抗體或其他指向標識物之配位體/結合藥劑正向選取。一 般熟諳此藝者很容易即可辨識，多種特定之消減或正向選 取表現所需標示物樣本之方法。 關於上述單核球之消減，單核球族群（亦即CD 14+細胞）得 於利用/些方法行體外擴展前由血液製劑消減掉’包括抗 -CD 14塗覆之珠子或管柱或利用這些細胞之胞噬作用等。據 此，本發明在一具體實施例使用足供噬細胞單核球呑噬之 超磁性粒子。在某些具體實施例，該超磁性顆粒係可由市 面購得之珠子，例如Dynal AS生產商品名為DynabeadsTM者。 就此方面而吕’ DynabeadsTM之範例為M-280、M-450與M-500。 在一方面，我們利用‘‘不相關，，蛋白質塗覆該超磁性顆粒以 去除其他非專一性細胞。不相關蛋白質與抗體包括對欲擴 展之T細胞不具專一性之蛋白質抗體或其片段。在某些具體 實施例，該不相關之珠子包括，以绵羊抗小鼠抗體、山羊 抗小鼠抗體與人類血清白蛋白塗覆之珠子。 簡言之’此種消減單核球方式，係將使用非可由全血分 離出之PBMC或經血液分離術之週邊血液，與其量允許去除 單核球之一或多種不相關或非抗體偶合之超磁性顆粒（珠 子：細胞約20: 1比例）預保溫於22至37°C，約30分鐘至2小時， 隨之以磁性去除已呑噬或附著超磁性顆粒之細胞。預保溫 亦得於低達3至4 °C進行。這種分離得利用此藝之標準方 法。例如得使用任何磁性分離法，包括多種市售者（例如 DYNAL® Magnetic Particle Concentrator (DYNAL MPC⑯）。為確保 必要的分離，得利用多種一般熟諳此藝者已知之方法進行 -27 - 200307129 (23) I發明說明續頁 偵’’、]包括在咸消減别後CDI4正向細胞流式細胞儀分析。 清洗後，亦得冷康欲行刺激之T細胞，此不需去除單核球 步為避免理論上結合之可能’我們利用去除細胞族群 中之顆粒球及某種程度之單核球，以在冷凍與後續之解凍 步騍棱供更一致之產品。在去除血漿與血小板之清洗步驟 後’得漿細胞懸浮於冷凍用之溶液。儘管在此藝中已知， 亦將使用多種冷凍用之溶液與參數，有一種方法涉及使用 含20% DMSO與8%人類血清白蛋白之pBS，或其他適當之細 胞冷/東用媒介，然後以1。〇 /分鐘將細胞冷；東至-8〇〇c，並貯 存於液態氮貯存槽之蒸氣相中。 得採本文所述方法刺激細胞族群，諸如，令其與固定於 某表面 < 抗-CD3抗體或抗-CD2抗體接觸，或令其與連接鈣 離子載體之蛋白質激酶c活化劑（例如bryostatin)接觸。為共 刺激T細胞表面之輔助分子，我們使用會與該輔助分子結合 之配位體。例如’在適於刺激τ細胞增生之條件下，令CD4 + 族群與抗-CD3抗體及抗-CD28抗體接觸。同樣地，為剌激CD8 + T細胞族群之增生，我們得如其他此藝已知之方法般地使用 抗-CD3抗體及抗-CD28抗體 B-T3、XR-CD28 (Diaclone，Besancon ’ France)(Berg等人，Transplant Proc. 30( 8) : 3975-3977，1998; Haanen等人，J. Exp. Med· 190(9) : 13 19-1328，1999 ; Garland 等 人，J· Immunol Meth. 227( 1-2) : 53-63, 1999)。 我們得利用不同方法提供T細胞之初級刺激信號與共刺 激信號。例如，得將提供每種信號之藥劑製成溶液或偶合 於某表面。當偶合於某表面時，得將藥劑偶合於相同表面 -28 - 200307129 發明說明續頁 (24) (亦即“順”型式）或不同表面（亦即“反”型式）。另外，亦得將 一種藥劑偶合於表面，另一種則在溶液中。在一個具體時 施例，該提供共刺激信號之藥劑係與細胞表面結合；至於， 該提供初級信號之藥劑則係於溶液中或偶合至某表面。在 某些具體實例，二種藥劑皆在溶液中。在另一具體實施例， 該藥劑得為可溶型式並交聯於一表面，諸如表現FC受體之 細胞或抗體，或其他會與該藥劑結合之其他結合藥劑。在 一較佳具體實施例，該兩種藥劑係固定化於球體或半球體 表面，其原型實例為珠子或細胞，若非在相同珠子，亦即 “順”式，即是在不同珠子，亦即“反”式。以實例，該提供 初級活化信號之藥劑係抗-CD3抗體，而且，該提供共刺激 信號之藥劑為抗-CD28抗體；而且，二種藥劑皆以等分子莫 耳數固定化於相同珠子。在一個具體實施例，我們使用供T 細胞擴展與T細胞生長之1 : 1比例之個別與珠子結合之抗 體。在本發明之某些方面，我們使用與珠子結合的某種比 例之抗CD3 : CD28抗體，使得與使用1 : 1比例所觀察到之擴 展比較，其T細胞之擴展增加。在一特定具體實施例，與使 用1 : 1比例所觀察到之擴展比較，可觀察到T細胞之擴展增 加約0.5〜約3倍。在一具體實施例，與珠子結合之CD3 : CD28 抗體比例為由100 : 1〜1 : 100，及其間之任何整數值。本發 明在一方面，與抗-CD3抗體比較，有更多抗-CD28抗體與粒 子結合，亦即CD3 : CD28比值小於1。在本發明某些具體實 施例，與珠子結合之抗CD28抗體與抗CD3抗體之比例大於 2 : 1。在一特定具體實施例，其所使用之與珠子結合之CD3 : -29- 200307129 (25) 發明說明續頁 CD28抗體的比例為1 ·· 100。在另一具體實施例，其所使用 之與珠子結合之CD3 : CD28抗體的比例為b 75。在另一具 體實施例，其所使用之與珠子結合之CD3 ·· CD28抗體的比例 為1 · 50。在另一具體實施例，其所使用之與珠子結合之 CD3 : CD28抗體的比例為1 : 30。在一較佳具體實施例，其 所使用之興珠子結合之C D 3 · C D 2 8抗體的比例為1 : 1 〇。在 另一具體實施例，其所使用之與珠子結合之CD3 : CD28抗體 的比例為1 ·· 3。在又一具體貫施例，其所使用之與珠子結 合之CD3 : CD28抗體的比例為3 : 1。 為刺激T細胞或其他目標細胞，我們使用1 : 500〜500 : 1之 顆粒與細胞的比例，及其間之任何整數值。一般熟諳此藝 者很容易瞭解，顆粒與細胞之比例視相對於目標細胞之顆 粒大小而定。例如，小珠子僅能結合少數細胞，而較大的 珠子則能結合較多。在某些具體實施例，細胞與顆粒之比 例為由1 : 100〜100 : 1，及其間之任何整數值；而且，在另 一具體實施例，其比例包括1 : 9〜9 : 1，及其間之任何整數 值，亦得用以刺激T細胞。造成T細胞刺激之抗—CD3-與抗 -CD28-偶合之顆粒與T細胞之比例，如上述得有很大不同· 然而，某些較佳值至少包括1 : 5、1 : 4、1 : 3、1 : 2、1 : 1、 2 ·· 1、3 : 1、4 ·· 1〜6 : 1，有一較佳值為至少每個τ細胞1 :】 顆粒。在一具體實施例’我們使用1 : 1或更低之顆粒與細 胞比例。在另一具體貫施例’顆粒對細胞之比例視刺激之 天數而有所變化。例如，在一具體實施例，在第一天我們 使用1 : 1至10 : 1之顆粒與細胞比例；其後，每天或隔天添 200307129 發明說明續頁 (26)

加另外的珠子至10天，使終比例為由i : i至i : 10 (根據添加 曰之細胞數）。在一特定具體實施例，在刺激第一天我們使 用1 : 1之顆粒比細胞；並於刺激之第3天與第5夭調整至卜〕。 在另一具體實施例，添加之顆粒係根據每天或隔天之基礎 至第一天時終比例為1 :丨；並於刺激之第3天與第5天調榮至 1 : 5。在另一具體實施例，在刺激第一天我們使用2 : 1之顆 粒與細胞比例；並於刺激之第3天與第5天調整至1 : 1 〇。在 另一具體實施例，添加之顆粒係根據每天或隔天之基礎， 在刺激第一天我們使用1 ·· 1之終比例；並於刺激之第3天與 第5天調整至1 : 1 〇。熟諳此藝者會了解本發明得適用多種其 他的比例。特別是，其比例視顆粒大小與細胞大小及型態 而定。

在最初的活化及刺激之後，某些方法可能有利於維持T細 胞之長期刺激，其係利用刺激約12至約14天後分離τ細胞。 走期偵測丁細胞增生之比例（例如每天），例如利用大小之檢 查或利用諸如Coulter計數器測定τ細胞體積。就此方面而 石’休止時之T細胞平均直徑約6.8微米，在刺激配位體存在 之起始活化與刺激時，第四天T細胞之平均直徑增加至超過 12微米，而於第6天時開始減小。當平均τ細胞直徑縮小至8 微米時，得再活化或再刺激該T細胞以誘發T細胞之進一步增 生。另外，得分析活化之T細胞會受誘發之細胞表面分子， 諸如CD154、CD54、CD25、CD137、CD134來偵測T細胞增生之 速率與T細胞再刺激之時間。 為誘發CD4+與/或CD8+ T細胞族群之長期刺激，可能需以 -31- 200307129 發明說明續頁 (27) 諸如抗細抗骨皇及抗-CD28抗體（B-T3、XR-CD28 (Dlacl_ ’ 、、义鞏株抗體ES5.2D8刺激劑再活化與再刺激 Besancon^ France))^ ^ ^ ”你生成之CD4+或CD8+細胞族群之數量增加 該T細胞數次，以使王成 至最初丁細胞族群之約10至約1000倍。例如，在本發明一個 具體實施例，我們係如實例1所述般刺激丁細胞2〜3次。在另 一具體實施例，我們係如實例1所述般刺激T細胞4〜5次。利 用本法，與刺激前比較，欲完成丁細胞多株性由約100增加至 約10 0，0 0 0倍是可能的。甚且’利用本發明法擴展之τ細胞“ 於培養上澄液分泌相當量之胞動素（例如IL-2、IFN1、IL-4、 GM-CSF與TNF-α)。例如，與經刺激者比較’利用抗 及抗-CD28共刺激擴張之CD4+ T細胞，於培養上澄液分泌南 量之GM-CSF與TNF-α。我們得由培養上澄液純化這些胞動 素，或很方便地使用培養上澄液來維持培養中之細胞。同 樣地，可施用經本發明方法擴展之T細胞，加上培養上澄液 與胞動素以支持細胞之體内生長。 在一個具體實施例，我們係利用例如共固定化於珠子 (3x28珠子）之抗-CD3及抗-CD28抗體來進行足以令細胞回復 至靜止狀態（低度或未增生）之時程之T細胞刺激（約起始刺 激後8〜14天）。然後，由細胞去除該刺激信號，清洗細胞並 將該細胞浸潤回病患身上。於刺激相終了時之細胞已經被 本發明之方法賦予“超謗發性”，其證據在於實例之回應抗 原之能力與這些細胞表現類似記憶之基因型的能力。據 此，於外來之再刺激或浸潤後，抗原之體内刺激活化之T細 胞顯現很強的反應，其特徵為諸如，持續之CD 154表現、胞 -32- 200307129 (28) 發明說明續頁 動素生產增加等等之獨特的基因蜇性質。 在本發明另一個具體實施例，該諸如T細胞之細胞係與藥 劑塗覆或共輛結合的珠子結合，其後分離珠子與細胞，然 後培養細胞 在另一個具體貫施例’培養之前並未將細胞 與藥劑塗覆或共軛結合的珠子分離，而係一起培養。在另 一個具體實施例’首先利用力量將細胞與珠子濃縮，造成 細胞表面部份接合，藉此謗發細胞刺激與/或活化信號之極 以實例，當T細胞為目標細胞族群時，藉由允許 抗-CD28 (3x 28珠子）附著之超磁性珠子與製備之τ細胞接 觸，細胞表面#份可能會接合。在一個具體實施例，我們 壤細胞（例如10〜ίο τ細胞）與珠子（例如，DYNABEADS@ M_45〇 CD3/CD28 τ超磁性株比例1:丨）在一種以pBs較佳之緩衝劑 (無諸如躬、鎂之二價陽離予）中結合。再一次，此藝中具 一般技巧者很快可了解，這神 主侍使用任何細胞濃度。例如， 樣本中之目標細胞可能很稀 許太f十P 專’僅構成樣本之0.01%或整體 樣本（亦即100%)可能包括 本發明得、、、τ其杜/ 們感興趣之目標細胞。據此， 侍涵盍任何細胞數目 與細胞混合之體積明顯減少：在某些具體實施例’將顆粒 細胞與顆粒之最大接觸(亦即增加細胞濃度），以確保 實施例，我們使用2。億細：：有利的。例…-個具體 我們使用士、人〗泣 1升。在另一個具體實施例， ' U π州大於丨億細胞/亳升 使用1、丨s 0 0 。在另一個具體實施例，我們 2 、 2·5 、 3 、 3.5 、 4 、 另一個具髀舍、A Y, 、4·5或5千萬細胞/毫升。在 〜to貝她例，我們使 用 7.5、8、8.5、9、9.5 或 10千萬 200307129 (29) 發明說明續頁 細胞/毫升。在另一個具體實施例，得使用12.5或15千萬細 胞/毫升。使用高濃度可能造成增加之細胞產量、細胞活化 與細胞擴展。甚且，使用高細胞濃度允許更有效捕捉細胞； 其可能對表現我們感興趣之目標抗原太弱，諸如CD28-負T 細胞。這種細胞族群可能具治療價值，也是我們需要取得 的。例如，使用高細胞濃度允許我們能更有效選取，正常 情形其CD28表現較弱之CD8+ T細胞。 在一個相關之具體實施例，可能需要使用較低之細胞濃 度。藉明顯稀釋T細胞與顆粒之混合物，可將顆粒與細胞之 作用降至最低。此可選取表現高量之與顆粒結合所需的抗 原細胞。例如，CD4+ T細胞表現高量之CD28 ;而且，在稀釋 濃度時可比CD8+ T細胞受到更有效捕捉與刺激。在一個具體 實施例，所用之細胞濃度約5χ 106/毫升。在一個具體實施 例，所用之細胞濃度得為由約1 X 105毫升〜約1 X 106/毫升，及 其間之任何整數。 懸浮細胞之緩衝液得為任合適於該特定細胞型態者。當 使用某些細胞型態時，該緩衝液得包含其他在此過程中需 要維持細胞一致性之細胞成分，例如1 - 5 %血清。在另一個 具體實施例，得將細胞與珠子混合於細胞培養液中。細胞 與珠子之混合得為例如，旋轉攪動或任何混合方法，其時 間為1分鐘至數小時。然後，利用力量，諸如放在磁場中濃 縮珠子與細胞之容器。去除媒介與未結合之細胞並清洗附 著於珠子或其他表面之細胞，例如得經由蠕動幫浦，然後 懸浮於適於細胞培養之媒介中。 -34- 200307129 發明說明續頁 (30) 在本發明一個具體實施例中，該混合物得培養3 〇分鐘至 數小時（約3小時）至約14天或其間之任何小時或分的整數 值。在另一個具體實施例，該混合物得培養21天。在本發 明一個具體實施例，我們將珠子與T細胞培養約8天。另一個 具體實施例，我們將珠子與T細胞培養2-3天。如上述可能需

要數個循環之刺激，使T細胞之培養時間能達60天或更長。 適於T細胞培養之條件包括，可能含增升與可生存性所需之 適當因子，包括血清（例如胎牛或人類血清）或間白素-2 (IL-2)、胰島素或任何熟諳此藝者已知之其他供生長之添加 物之媒介（例如 Minimal Essential Media 或 RPMI Media 1640 或 X-vivo 15，（BioWhittaker))。媒介得包括 RPMI 1640、AIM-V、 DMEM、MEM、α-ΜΕΜ、F-12、X-Vivo 15與 X-Vivo 20並添加胺

基酸與維生素，若非無血清即是補充以適當量之血清（或血 漿），或一組固定的激素與/或足供T細胞生長與擴展之胞動 素。抗生素，例如青黴素與鏈黴素僅在實驗培養中才使用， 對欲浸潤入實驗對象之細胞的培養中並不添加。將目標細 胞維持在支持生長所需之條件，例如適當溫度（例如37^ ) 與壓力（例如空氣加5% C〇2)。 在另一個具體實施例，得修正或剪裁暴露於刺激藥劑諸 如抗-CD3/抗-CD28 (亦即3x28)_塗覆之珠子之時間’俾取得所 需之T細胞基因型。另外，在刺激前得利用任何選取技術來 選取所需之τ細胞族群。有人可能需要較大之幫助者τ細胞族 群（Τη)，典型地為CD4+以對抗CD8+細胞毒性或調節者丁細 胞，因為TH細胞擴展會改善或重建整體免疫反應性。儘管， -35- (31) (31)200307129 發明說明續頁 很多具專一性之免疫反應係由CD8+浐 仇原專一性T細胞媒 介，因其可直接融解或殺死目標細胞， ^ 大邵份免疫反應需 CD4+ T細胞之幫助，其可表現重要之免 〜W即分子，其例諸 如 GM-CSF、CD40L與 IL-2。在較需要 CD4 1 %介之幫助時，如 本文所述之保存或增強CD4 : CD8比例去7 u . J肴可能有顯著利益。 CD4+ T細胞增加之數目得增加導入 ^八两患之細胞-表現的 CD40L量，潛在改善目標細胞之能見户 月匕兄& (改吾APC功能）。增 加表現GM-CSF或IL-2之浸潤的細腧夕私 t <數目亦可見類似效 果，其全部主要係由CD4+ T細胞所表壬目 。另外，在較不需要 CD4幫助者，而需要較多量CD8+ T細胎咕 胞時，亦可使用本文所 述XCELLERATE™之方法（參照實例n ’ ’例如，於刺激與/或 培養前藉選定CD8+細胞行之。在增及、 里< IFN-γ或增加之目標 細胞的細胞融解係較佳時，會有這海^ ^ 乂種情形。我們亦得修正 暴露於刺激藥劑之時間與型態，以妒：p 和展具所需TCR目錄，例 如表現所需之νβ家族基因之T細胞。 為有效分離不同之Τ細胞族群，可抑行s不、λ7 J改變暴露於粒子之時 間。例如，在一較佳具體實施例，游 我們以與3 X 2 8珠子，諸 如Dynabeads M-450保溫足以正向選取所需τ細胞之時間，以 分離T細胞。在一個具體實施例，該時間為約3〇分鐘。在另 一個具體實施例，該時間至少為1、2、3、4、5或6小時。在 又一個具體實施例，該時間至少為1〇〜24小時或更多。在一 較佳具體實施例，該保溫時間為24 ,丨、咕 —小時。為由癌症病患分 離出T細胞，使用較長保溫時間，諸4 帝如24小時可增加細胞產 率〇 -36- 200307129 發明說明續頁 (32)

在某些具體實施例，刺激與/或擴展時間得為10週或更 少，8週或更少，4週或更少，2週或更少，10天或更少，或8 天或更少（4週或更少，包括所有時間範圍，由4週低至1天（24 小時）或任何其間之數值）。在某些具體實施例，可能希望 利用例如有限稀釋或細胞分選以無性繁殖T細胞，則會需要 較長的刺激時間。在某些具體實施例，刺激與擴展可能需 要6天或更少，4天或更少，2天或更少，在其他具體實施例 中，可低達24小時或更少以4〜6小時或更少（這些範圍得為其 間之任何整數值）較佳。當T細胞之刺激時段較短時，T細胞 之族群數目不會劇烈增加；但該族群得提供更強及更健康 之活化T細胞可以繼續在體内增生，並更類似天然效應物之 T細胞庫。當T細胞幫助之可利用性通常為抗體對蛋白質抗原 反應之限制因子時，將T細胞之富含CD4+的族群選擇性地擴 展與選擇性浸潤入一實驗對象係很有益的。這種豐富性族 群之進一步好處非常清楚，因為由B淋巴球呈現之辨識抗原 之活化幫助者T細胞產生兩種形式之刺激，即物理接觸與胞 動素生產，此會造成B細胞之增生與分化。 在不同具體實施例中，具此藝之一般技術者會了解，由 細胞去除刺激信號係視所用表面型態而定。例如，若使用 超磁性珠子時，磁性分離係可行方案。在超磁性珠子製造 商之說明書中有分離技術之詳細說明（例如DYNAL Inc.， Oslo，Norway)。甚且，若所用表面係大到足以與細胞分離 之珠子時，得加以過濾。此外，亦可買到多種注入〉慮器包 括20微米與80微米之注入濾器（Baxter)。據此，只要珠子係 -37- 200307129 發明說明續頁 (33) 大於濾器之網目時，這種過濾即很有效率。在一相關具體 實施例，該珠子得通過濾器而細胞卻留下此即可分離。在 一特定具體實施例，該生物相容性之表面於培養中之暴露 期時會降解（亦即生物可分解）。

儘管，本文所述方法所用之載體很容易由公共來源，諸 如ATCC取得，對T細胞附帶分子與CD3複合物之抗體卻可用 標準技術生產。生產供本發明方法所用之抗體的方法係此 藝所熟知，並將於本文詳係討論。 將配位體固定化在某表面

如上述，本發明方法以使用與某種表面結合之配位體較 佳。該表面得為任何能讓配位體結合其上或與其整合之表 面，且具生物相容性，亦即實質上對欲刺激之細胞無毒性。 該生物相容性表面得為生物可分解或非生物可分解者。該 表面得為天然或合成者，至於合成者得為聚合物。該表面 得包括膠原蛋白、純化蛋白質、純化肽、多醣、葡萄糖胺 聚糖、胞外基質成分、脂質體或細胞。多赌得包括，例如 纖維素、瓊脂、葡聚糖、基丁聚醣、玻尿酸或藻酸鹽。其 他聚合物得包括聚酯、聚醚、聚酸酐、聚烷基氰基丙烯酸 酉旨、聚丙烯 S&胺、聚原酸酯、聚偶罐氮、聚晞乙乙酸酷、 塊狀共聚物、聚丙晞、聚四氟乙烯（PTFE)或聚氨酯。該聚 合物得為乳酸或共聚物。聚合物得包括乳酸與乙醇酸 (PLGA)。非生物可分解表面得包括聚合物諸如聚（二甲基矽 氧烷）與聚（乙烯-烯乙乙酸酯）。生物相容性表面包括例如玻 璃（生物玻璃）、膠原蛋白、幾T質、金屬、經礙灰石、銘酸 -38- (34) 200307129 鹽、生物陶瓷材料，玻尿酸聚合物、藻酸鹽、丙烯酸酯苹 合物、乳酸聚合物、乙醇酸聚合物、乳酸/乙醇酸聚合物、 純化蛋白質、純化肽或胞外基質成分。其他聚合物包括， 玻璃、矽土、矽膠、羥磷灰石、水凝膠、膠原蛋白、丙婦 酸、聚丙烯醯胺、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍或任何塑膠或 合成之有機聚合物或其類似物。該表面包括諸如脂質體或 細胞表面之生物結構。該表面得為脂質、平盤、袋子、丸 片、纖維、網目或顆粒。顆粒得包括膠體顆粒、微球體、 毫微顆粒、珠子或類似物。在不同具體實施例中，市售表 面諸如珠子或其他顆粒皆可用（例如Miltenyi Particles， Miltenyi Biotec ’ Germany ;瓊脂膠，Pharmacia Fine Chemicals， Sweden; DYNABEADStm，Dynal Inc·，New York; PURABEADSiM， Prometic Biosciences) ° 當使用珠子時，該珠子得為任何大小之能執行目標細胞 之刺激者。在一個具體實施例，珠子大小以由約5毫微米至 約500微米較佳。據此，選取之珠子大小視其所欲之特殊用 途而定。例如，若使用珠子以消減單核球時，我們使用小 顆粒（例如2.8微米與4.5微米直徑，或任何能被呑噬之大小， 諸如毫微米大小）以促進單核球之攝入；然而，當需要過濾 分離珠子時，所用的珠子大小典型地不小於50微米。甚且， 當使用超磁性珠子時’珠子大小典型地為由約2.8微米至約 500微米；由約2. 8微米至約50微米更佳。最後，我們得選用 可能小至約10毫微米之超磁性毫微珠子。據此，由上述討 論可清楚可用任何大小之顆粒。 -39- 200307129 發明說明續頁 (35) 利用多種此藝已知或可得之方法，得將藥劑附著或偶合 或整合入某種表面。該藥劑得為天然配位體、蛋白質配位 體或合成配位體。該附著得為共價或非共價、靜電或厭水 性；而且，其完成得利用多種附著方式，例如，包括化學、 機械、酵素、靜電或其他方法；藉此配位體即得刺激細胞。 藥劑之附著得為直接或間接（例如繫纜）。例如，配位體之 抗體須先附著於某種表面（直接附著）或抗生物素蛋白或抗 生物蛋白鏈菌素；或結合第一種之第二種抗體得附著於將 與生物素化配位體結合之表面（間接附著）◦配位體之抗體 得經抗-遺傳型式抗體附著於表面。另一個實例包括，使用 蛋白質A或蛋白質G或其他非專一性之抗體結合分子附著於 表面以結合蛋白質。另外，該配位體得利用化學方法附著 於表面，諸如利用市售交聯劑（Pierce，Rockford，IL)或其他 方法交聯於表面。在某些具體實施例，配位體係與表面共 價結合。甚且，在一個具體實施例，我們將市售之甲苯磺 酸-活化的DYNABEADS™或具有環氧樹脂表面反應基之甲 苯磺酸-活化的DYNABEADSTM，根據製造商說明與我們感興 趣之多肽鏈一起保溫。簡言之，這種情形典型地涉及於4〜37 °C之pH 4〜pH 9.5的磷酸鹽緩衝液中保溫。 在一方面，該藥劑諸如某種配位體，得為單一或多種來 源，且得為抗體或其片段；然而，在另一方面當使用T細胞 時，該共刺激配位體為B7分子（例如，B7-1，B7-2)。這些配 位體係利用上面討論之任何不同的方式偶合於該表面◦偶 合於表面之B7分子得由表現共刺激分子之細胞分離出，或 -40- 200307129 發明說明續頁 (36)

使用允許生產與分離本文所述之共刺激分子之標準重組 DNA技術與表現系統以取得。亦得使用當偶合於細胞表面 時，能維持其制約T細胞共刺激信號能力之B7的片段、突變 體或變體。甚且，具此藝之一般技術者會了解，任何得用 以活化與誘發一亞組之T細胞增生的配位體，亦得固定化於 珠子或培養容器表面或任何表面上。此外，儘管配位體與 表面之共價結合係較佳方法，亦得使用利用第二種單株抗 體之吸附或捕捉方式。很容易決定附著於某表面之特定配 位子的量，若該表面係珠子者，則利用流式細胞儀分析決 定；若該表面係例如，組織培養皿、網目、纖維、袋子則 以酵素連接免疫吸附分析（ELISA)來決定。

在一特定具體實施例，B7分子之刺激型式，或抗-CD28抗 體或其片段係與刺激TCR/CD3複合物之藥劑，諸如抗-CD3抗 體般，附著於相同固相表面。除抗-CD3抗體外，亦得使用 其他與擬似抗原信號之受體結合之抗體。例如，得將珠子 或其他表面塗覆抗-CD2抗體與B7分子，特別是抗-CD3抗體 與抗-CD28抗體之組合物。 當偶合於某表面時，得將藥劑偶合於相同（亦即“順”式） 或不同（亦即“反”式）表面。另外，亦得讓一種藥劑偶合於表 面，另一種則在溶液中。在一個具體實施例，提供共刺激 信號之藥劑係結合於細胞表面；而該提供初級活化信號之 藥劑，係在溶液中或偶合於細胞表面。在一較佳具體實施 例，兩種藥劑皆固定化於珠子，若非相同，亦即“順”式； 即是不同，亦即“反”式珠子。經由實例，提供初級活化信 41 200307129 發明說明續頁 號之藥劑係抗.⑶抗體；％提供共刺激信號之藥劑係抗 -CD28抗體，兩種藥劑係以等莫耳分子數共固定化於相同珠 子在個具體貫施例，其使用供CD4+ T細胞擴展與τ細胞 生長（與表面結合之1 : 1比例的兩種抗體。在本發明之某 些方面，其使用與珠子結合之某比例之抗⑶3: CD28抗體， 使我們可U到興利用1 ·丨比例觀測到者比較，丁細胞擴展 有所增加。在一特定具體實施例，與利用丨：丨比例觀測到 者比較，我們可觀測到增加約〇.5至約3倍。在一個具體實施 例’與珠子結合之CM: CD28抗體之比例範圍為由丨〇〇:丨一： 100及其間义全部整數值。本發明在一方面，與抗_CD3抗體 比較，有更多抗-CD28抗體與顆粒結合，亦即cD3 : CD28 的比值小於1。在本發明某些具體實施例中，與珠子結合之 抗CD28抗體與抗CD3抗體之比例大於2 : i。在一特定具體實 施例’其所使用之與珠子結合之CD3 : CD28抗體的比例為1 : 100。在另一具體實施例，其所使用之與珠子結合之CD3 : CD28抗體的比例為1 : 75。在另一具體實施例，其所使用之 與珠子結合之CD3 : CD28抗體的比例為1 : 50。在另一具體 實施例，其所使用之與珠子結合之CD3 : CD28抗體的比例為 1 : 30。在一較佳具體實施例，其所使用之與珠子結合之 CD3 : CD28抗體的比例為1 : 10。在另一具體實施例，其所 使用之與珠子結合之CD3 : CD28抗體的比例為1 : 3。在又一 具體實施例，其所使用之與珠子結合之CD3 : CD28抗體的比 例為3 : 1。 藥劑 -42- 200307129 _ (38) 發明說明續頁 本發明所涵蓋之藥劑包括蛋白質配位體、天然配位體與 合成配位體。能與細胞表面部份結合之藥劑與某種情形下 造成接合與聚集之產生信號傳遞者，包括但不限於，親醣 蛋白（例如植物凝集素（PHA)、扁豆親醣蛋白、洋刀豆血球 凝集素A)、抗體、抗體片段、肽、多肽、糖肽、受體、B 細胞受體與T細胞受體配位體、胞外基質成分、類固醇、激 素（例如生長激素、皮質酮類固醇、前列腺素、四碘甲狀腺 原胺酸）、細菌部份（諸如脂多醋）、有絲分裂原、超抗原及 其衍生物、生長因子、胞動素、附著分子（諸如L-選擇素、 LFA-3、CD54、LFA-1)、化學動素與小分子。藥劑得分離自 諸如細胞、血液產物與組織之天然來源或自體外增殖之細 胞分離出，經重組、化學合成或利用其他熟諳此藝者熟知 之方法製備。 本發明在一方面，當需要刺激T細胞時，有用的藥劑包括 能結合CD3/TCR複合物、CD2與/或CD28之配位體；其能分別 起始活化或增生作用。據此，配位子之用語包括細胞表面 蛋白質之天然配位體的蛋白質，諸如對CD28之B7分子；以 及，諸如針對細胞表面蛋白質之抗體的人工配位子。這種 配位子及其片段，得根據傳統技術生產，諸如，融合瘤方 法與重組DNA及蛋白質表現技術。有用之抗體及片段得由 任何物種衍生出，包括人類，或得使用超過一種物種之序 列以形成嵌合蛋白。 得使用此藝熟知之方法生產對配位體具專一性之抗體、 多株抗血清或單株抗血清。抗體亦得設計成所需性質之遺 -43 - 200307129 發明說明續頁 (39) 傳工程的免疫球蛋白（Ig)或Ig片段之型式生產。例如，利用 說明而非限制抗體，得包括重組IgG，其係至少具有一個來 自第一種哺乳類之可變區（V)功能部位，與來自第二種哺乳 類之至少一個固定區域功能部位之嵌合融合蛋白。最常見 者’嵌合蛋白具鼠類可變區序列與人類固定區序列。藉由 將來自鼠類抗體之賦予抗原結合專一性之互補決定區 (CDRs)移植入人類衍生之V區骨架區域與人類衍生之固定 區’得將此種鼠/人嵌合免疫球蛋白“人性化”。亦得混合含 不同專一性CDRs之抗體以生成多專一性（二或三專一性等 等）抗體。得利用蛋白質分解、消化，或視情形，經蛋白分 解消化，隨之溫和還原雙硫鍵或烷基化，或利用重組之遺 傳工程技術產生這些分子片段。 若抗體與抗原專一性結合之親合力常數之Ka大於或等於 ΙΟ4 ΝΓ1 ’即定義其具免疫專一性；以大於或等於1〇5 M·1較 佳，大於或等於106 M_1更佳，大於或等於1 〇7 ΜΓ 1特佳。很容 易利用傳統技術決定結合合夥或抗體之親和力，例如參照

Scatchard等人所述（Ann. N.Y· Acad. Sci USA 51 : 660，1949)或 利用表面漿體共振（BIAcore，Biosensor，Piscataway，NJ)參照 例如，Wolff等人，Cancer Res.，53 ·· 2560-2565，1993)。 抗體通常係由一般熟諳此藝者以已知之任何多種技術之 一製備（參照例如 Harlow等人，Antibodies : A Laboratory Manual, 1988，Cold Spring Harbor Laboratory)。在一種此類技術中，我 們以配位體為抗原，對動物免疫注射以生成多株抗血清。 適當之動物包括兔、、纟帛羊、山羊、豬、牛而且得包括較小 “44- 200307129 (4〇) 發明說明續頁 之哺乳動物諸如小鼠、大鼠與倉鼠。本發明之抗體亦得如 美國專利號碼所述般產生：6，150,584、6，13〇,364、、 5,833,985、6,071，517、5,756,096、5,736，137與 5,837,243 ° 免疫原得包括表現配位體之細胞、純化或部份純化之配 位體多肽或其變體或片段或配位體肽。配位體肽得利用蛋 白質分解切斷或化學合成生成。免役注射之肽得根據熟諳 此藝者已知之方法，利用初級、二級、三級結構之分析來 選用’以決定更可能在宿主動物產生抗原反應之胺基酸序 列（例如參照 Novotny，Mol. Immunol. 28 : 201-207，1991 ; Berzoksky，Science 229 : 932-40，1985)。 免疫原之製備得包括配位體多肽或其變體或片段，或另 一種免疫原蛋白質之肽諸如血氰蛋白或胎牛血清白蛋白之 共價偶合。此外，得將該肽、多肽或細胞於佐劑中乳化（參 照 Harlow等人，Antibodies·· A Laboratory Manual，1988, Cold Spring Harbor Laboratory)。通常，首次注射後根據為該動物品種之 時程，令該動物接受一或多次之追加注射。對動物定期抽 血、分離血清、並以諸如Ouchterlony分析之免疫分析法，分 析血清，評估特定抗體滴定度，以追蹤免疫反應。一旦抗 體之滴定度建立，即可定期將動物放血以累積多株抗血 清。然後，得利用例如，使用蛋白質A之親合力色析法，或 偶合於適當固體支持物之配位體多肽或肽由此種抗血清純 化與抗原多肽或肽具結合專一性之多株抗體。 得利用例如 Kohler與Milstein(Nature，256:495,497，1975，Eur· J· Immunol. 6 : 51 1-519, 1976)及其改進方式，製備與配位體多 -45 - 200307129

發明說明續頁 肽或其片段或其變體具結合專一性之單株抗體。得 合瘤，其為不死之真核細胞株，以生產對配位體多 片段或其變體具所需專一性之抗體。以上述製備之 免疫原免疫注射一種例如，大鼠、倉鼠或小鼠較佳 物。利用其與藥物敏感之骨髓瘤細胞融合夥伴之融 與免疫注射之動物同源較佳；亦得使取自免疫注射 最常見為脾臟之淋巴細胞不死者。得將該脾臟細胞 瘤細胞以膜融合促進劑，諸如，聚乙二醇或非離子 混合數分鐘，然後以低密度置入支持融合瘤細胞生 不支持骨髓瘤細胞生長之選擇性培養基中。較佳之 養易為HAT(黃螵呤、胺蝶呤、胸腺嘧啶）。經充分時 通常為約1〜2週可觀測到細胞群落。分離單一群落， 試細胞生產之抗體對配位體多肽或其片段或其變體 活性。較佳之融合瘤係生產對配位體抗原具高親合 一性之抗體者。本發明涵蓋，生產對配位體多肽， 段或其變體，具結合專一性之單株抗體的融合瘤。 得由融合瘤培養上澄液分離出單株抗體。另外一 鼠類單株抗體之方法為，將融合瘤細胞注射入同源 腹腔。小鼠生產之腹水液含單株抗體。利用諸如色 膠過濾、沉澱或萃取之傳統技術，得自抗體去除污 得利用多種技術生成人類卓株抗體。方法包括但 人類週邊血液細胞之伊波病毒（EBV)轉型（參照美國 碼4,464,456)、人類B細胞之體外免疫注射（例如參照 等人，J Immunol. 147 : 86-95, 1991)、帶人類免疫球蛋 產生融 肽或其 配位體 ，之動 合，以 動物， 與骨髓 清潔劑 長，但 選擇培 「間後， 並侍測 之結合 力與專 或其片 種生產 小鼠之 析法、 然物。 不限於 專利號 Boerner 白基因 -46 - 200307129 發明說明續頁 (42) 之免疫注射的基因轉殖鼠之脾臟融合物與帶插入之酵母人 工染色體（YAC)之免疫球蛋白基因之免疫注射的基因轉殖 鼠之脾臟融合物（例如參照美國專利號碼5,877,397 ; Bruggemann等人，Curr. Opin. Biotechnol. 8 : 455-58，1997 ; Jakobovits等人，Ann. N. Y. Acad. Sci. 764 : 525-35，1995)或分離 自人類免疫球蛋白V區域之噬菌體圖庫。 得生產供本發明使用之嵌合蛋白與人性化蛋白。嵌合抗 體至少有一個衍生自第一種哺乳類之固定區功能部位與至 少有一個衍生自第二種不同的哺乳類之可變區功能部位 (例如參照 Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA，81 : 685 1-55, 1984)。最常見為，利用將編碼至少一個來自非人類之單株 抗體，諸如鼠類、大鼠、倉鼠之單株抗體的可變區域之聚 核苷酸序列，選殖入含編碼至少一種人類固定區域的序列 之載體而建構礙合抗體（例如參照Shin等人，Methods Enzymol. 178 : 459-76，1989 ; Walls等人，Nucleic Acids Res. 21 : 2921-29, 1993)。所選之人類固定區域視特定抗體所需之效應物功能 而定。另一此藝熟知之產生嵌合抗體之方法為同系物重組 (美國專利號碼5,482,856)。較佳者是，將載體轉感染入供嵌 合抗體穩定表現之真核細胞。 得進一部將非人類/人類嵌合抗體進行遺傳工程俾創造 “人性化”抗體。此種抗體具多個衍生自非人類的哺乳類物 種之免疫球蛋白CDRs，至少一個人類可變骨架區域與至少 一個人類免疫球蛋白固定區域。人性化可能會產生一種與 非人類單株抗體或嵌合抗體比較時，較少之結合親和力的 -47- 200307129 (43) I發明說明續ϊ 抗體。因而’熟諳此藝者得使用一或多種策略以設計人性 化抗體。 在某些具體實施例，使用抗體之抗原結合片段可能較 佳。此種片段包括pab片段或F(ab，）2片段，其得分別利用木 瓜酶或胃蛋白酶之蛋白分解消化來製備。抗原結合片段得

利用親合力色析由FC片段分離出，例如，利用固定化蛋白A 或固定化配位體多肽或其變體或片段。另外之生成Fab片段 之方法包括，溫和還原以&13，）2片段隨之烷基化（例如參照

Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific，Boston)。 任何上述Ig分子之非人類、人類或人性化重鏈與輕鏈之 可變區域皆得見構成單鏈Fv(sFv)片段（單鏈抗體）。例如，參 照 Bird等人，Science 242 : 423-426, 1988 ; Huston等人，Proc· Natl· Acad· Sci· USA 85 : 5879-5883, 1988。利用連接編碼 sFv在正位 骨架之聚核甞酸序列與編碼不同效應物蛋白之聚核：y：酸序 列’或可產生多功能融合蛋白。這些方法係此藝所熟知， 且揭示在例如EP-B1-03 18554、美國專利號碼5，132,405、美國 專利號碼5,091，513與美國專利號碼5,476,786。 利用噬菌體得顯示，選取與配位體多肽或其變體或其片 段具結合專一性之抗體的另外方法（例如參照Winter等人 Annul. Rev. Immunol. 12: 433-55，1994; Burton等人，Adv. Immunol. 57 : 191-280, 1994)。人類或鼠類免疫球蛋白可變區域基因組 合圖庫，得在噬菌體載體中創造，其可篩選與配位體多肽 或其變體或片段具專一性結合之（例如參照美國專利號碼 -48 - 200307129 (44) 發明 5,223,409 ; Huse等人，Science 246: 1275-81, 1989 ; Kang等人 5 Pr〇c

Natl· Acad· Sci. USA 88: 4363-66，1991; Hoogenboom等人，J. M〇iec

Biol. 227 ： 381-388, 1992 ; Schlebusch等人，Hybridoma 16 : 47,59 1997及其中所引用之參考資料）Ig片段（Fab、Fv、sFv或其多 體）。 使用方法 除了上述方法，以本文所述方法刺激與/或活化細胞在很 多方面皆得利用。本發明之具增加的多株性之T細胞，得浸 潤入任何受到懷疑或觀測到具歪曲T細胞目錄之情形的 人。本發明之具增加的多株性之T細胞，得浸潤入捐贈者以 提供寬廣及強力之免疫保護。在本發明的情況下，得使用 本文所述之組合物與方法治療免疫妥協的人，例如，具免 疫缺陷之個體或如本文所述之歪曲的T細胞目錄情形（不論 係自然發生或因藥物或治療所謗發）。 在某些具體實施例，該免疫妥協的個體之免疫妥協係自 然的，亦即因自然發生之原因，諸如任何因本文所述之疾 病或病症。在其他具體實施例中，個體係因謗發而造成免 疫妥協的，例如任何本文所述疾病之治療的結果。在本文 情形下，一個體可能因為典型地施用於器官移植、細胞毒 素藥劑、免疫壓抑藥劑，或任何其他造成本文所述之T細胞 目錄改變或歪曲的治療之化學治療，而致免疫妥協，或換 言之，有免疫缺陷或歪曲的τ細胞目錄。在某些具體實施 例，一個體係因化療或放射線治療或以諸如環孢素、硫。坐 嘌呤、甲氨蝶蛉、霉酚酸酯、與FK506、抗體、或其他免疫 • 49 - (45) (45)200307129 發明說明續頁 去除藥劑，諸如CAMPATH、抗-CD3抗體、胞毒素、氣達拉 濱、％胞素、FK506、斥消靈、霉酚酸酯、類固醇、叹外Da 與放射線等藥劑治療而致免疫妥協。這些藥物若非抑制舞 依賴形去磷酸酶（環胞素與FK506)即是抑制對生長因子誘發 之信號傳遞很重要之P70S6激酶（斥消靈）。（Uu等人，cdi ^ : 807-815, 1991 ; Hendersori等人，Inmun. 73 : 316-321，1991 ; 等人，Cum Opin. Immun· 5 : 763-773, 1993 ; Is〇niemi (同上））。 自然發生之免疫反應排除一些對任何特定抗原具免疫優 勢之抗原決定基，而且將對這些抗原決定基具專一性之丁細 胞活化、擴展並促進其免疫反應。不 个巧地’很多其他潛在 之抗原決定基無法與此細胞内之T細朐一 ®，古化過程競爭，致在 該免疫反應中仍屬非·活化/非-參與 t 、 稭此增加免疫監督受 到病源菌/腫瘤壓倒之可能。藉活化盥 、力口知助者τ細胞之多 株性’這些較無優勢之具有能對目標抗原反應之咖、的τ 細m進至反應性改善之情形，以成為免疫反應之 潛在芩與者。此係利用不同專一性 、 Λ挑我任何免疫入侵， 進而擴大Τ細胞免疫系統之武裝。因此 Μ此，此作法有助保護當 作用模式為較窄之免疫反應時免之逃避形變體。 可用本文所述方法選擇性擴展⑶28+、=4+、⑶8+、 CD45RA+與/或CD45RO+ Τ細胞之族群，wΛ 丄、 十以増加以TCR表現用語 而言之多株性；俾用於治療傳染病、 ^ 目肢兄疫疾病、許多 癌症、血液疾病（例如血球缺乏症）、 7 Η組織移植同時發生（例 如紅血球生成幹細胞之移植）或任 、 U兄疫不足之狀態或病 ^並用於免疫治療。結果，我們可 Λ玍压有關其抗原反應 -50- 200307129 發明說明續頁 性《TCRS表現為多株，但相關於CD4+或CD8+實質上係均皙 性的T細胞族群。此外，該方法允許丁細胞族群擴展至可以重 組一個人的總CD4+或CDP T細胞族群之數目（一個體的淋巴 球族群約5χΐ〇ιι)。生成之τ細胞族群亦得進行遺傳轉導並用 於基因治療或得用於傳染病原體之體外分析方法。例如， 得由罹患癌症之人取得腫瘤滲透淋巴球，並刺激該丁細胞增 生至充分數量。將生成之Τ細胞族群進行遺傳轉導以表現腫 瘤壞死因子（TNF)或其他蛋白質（例如大量的胞動素、細胞 调亡《抑制劑（例如Bcl_2)、保護細胞免於HIV感染之基因諸 如Rev M10或胞内動素即其類似物、目標分子、附著與/或能 識歸途分子及任何種類抗體或其片段（例如Scfv))並給予該 人0 本發明之CD4+ T細胞之一種特別用途，係治療個體之hiv 感染。長期的HIV感染事實上造成CD4+ T淋巴球之數量明顯 減少。這種減少反過來造成深遠之免疫不足狀態，使病患 易受威脅生命之整列的逢機傳染所侵襲。增補CD4+ T細胞之 數目至正常量，預期會明顯程度地重建免疫功能。因此， 本文所述方法提供增加多株性與擴展CD4+ T細胞至相當數 量以使HIV感染的病患能重組此族群。在長期刺激時，避免 感染該T細胞可能亦是需要的或，可能需要給予T細胞對HIV 感染之永久抵抗性。得利用一些技術以增加T細胞對HIV感 染之抗性或在將感染的人T細胞重建之前使其無法產生病 毒。例如，擴展前得利用一或多種抗病毒藥劑與CD4+ T細胞 —起培養以抑制HIV複製或病毒產生（例如針對反轉錄酶的 -51 - 200307129 (47) 發明說明績頁 樂劑與/或病毒機制之其他成分，例如參照Ci10W等人Nature 361 : 650-653， 1993)。 有數種方法得用來遺傳轉導T細胞以產生抑制mv感染或 複製之分子。例如，在不同之具體實施例中，得將τ細胞遺 傳轉導以產生傳導優勢之抑制劑“分子誘餌”、反義分子或 毒素。這種方法之詳細說明請參照，美國專利申請號碼 08/253,75 1、08/253,964與 PCT公告號碼 w〇 95/33823。 在一個具體實施例’可治療細胞惡化諸如非哈金森氏症 (NHL)與B-細胞慢性淋巴球白血病（B-CLL)。儘管我們已利用 擴展之T細胞在NHL進行起始研究之測試（參照Lieb〇witz等人， Cum Opin· One· 10 : 533-541，1998)，本發明之T細胞族群提供 增加之多株抗體特性’其會劇烈影響免疫治療與反應性之 成功與否。如圖3所示，有B-CLL之病患，在其數種γβ家族 之τ細胞族群表現單株或寡株之TCRs。經12天之 xcellerate1m過程，這些丁細胞族群會重建TCR表現之多株 性。此外，有B-CLL之病患有特殊困難，包括在其週邊血液 具高度白血病細胞負擔之低相對之τ細胞數目；伴隨全身性 之Τ細胞免疫壓制。本發明之該τ細胞族群在治療這些疾病 時，得提供強烈改善效率，尤其當其係與幹細胞（CD34+)移 殖治療結合時。據此，以抗-CD3x抗-CD28共固定化珠子來 增加T細胞功能與抗-CLL T細胞活性係有益的。 本發明亦挺供預防、抑制或減少動物之癌症或惡性化細 胞存在之組合物與方法’包括施予動物本活化的抗-癌有效 量多株T細胞。 -52- 200307129 發明說明續頁 (48)

本發明所涵蓋之癌症，即免疫反應誘發以對抗者，或預 防、抑制或減少其存在者，得包括但不限於黑色素瘤、非_ 霍金森氏淋巴瘤、霍金森氏病、白血病、漿細胞瘤、肉瘤、 神經膠質瘤、胸腺瘤、乳癌、前列腺癌、大腸直腸癌、腎 臟癌、腎細胞癌、膜臟癌、鼻咽癌、食道癌、腦癌、肺癌、 卵巢癌、子宮頸癌、多發性骨髓瘤、肝細胞癌、急性淋巴 胚細胞白血病（ALL)、急性骨髓白血病（AML)、慢性骨髓白 血病（CML)、大顆粒淋巴球白血病（LGL)與慢性淋巴球白血 病（CLL)。在一個較佳具體實施例中，該癌症係B-細胞淋巴 球白血病。

本發明之組合物與方法亦得用以重建進行化療、細胞毒 性藥劑或任何如本文所述與熟諳此藝者熟知之免疫壓制藥 劑治療之個體的免疫反應性。在另一個具體實施例，本發 明之組合物與方法得用以治療（亦即重建免疫反應）進行紅 血球生成幹細胞移植之個體。在某些具體實施例，欲以本 發明組合物治療之個體已接受臍帶血、同種的、自體的或 異種細胞移植。 在另一個具體實施例，本發明之組合物與方法得用以重 建進行基因治療或任何涉及造成T細胞目錄歪曲之基因轉 導過程之人的免疫反應性。更特定地，逆轉病毒媒介之在 初級T淋巴球的基因轉移會謗發基因修飾細胞之活化與轉 導/選取-依賴型TCR νβ之歪曲。然而，利用本文所述方法之 基因修飾後之細胞的活化與刺激（例如如本文所述之 CD3/CD28共刺激）防止在CD4與CD8 Τ細胞亞組之TCR Υβ目錄 -53 - 200307129 之改變（歪曲）。

在某些具體&、A 或改善任何邀:、:“列’本發明之組合物與方法得用以重建 變之人的免庐、支力犯障％相關 < 病症，包括丁細胞目錄改 類風濕性關:穴二f广二疾雨包括’但不限於疾病諸如 阿迪生氏症、，“二毛性硬化症、胰島素依賴型糖尿病、 瘍性結腸炎、J履馮、慢性疲勞徵候群、發炎性腸疾、清 修格連氏徵候2氏症、肌纖維痛、紅斑性狼瘡、牛皮癖、 厶匕、 甲狀腺機能尤進/格瑞去氏卢 此痖/橋本氏症 ^ ^夫氏症、甲狀腺低 J2. ^ , 夷島素依賴型糖尿病（1型）、舌、 子呂内膜易位、滿士 、 重症肌無力、 早格那氏症、腎“ “巴斯德徵候群、 血球缺 < 、 糸球腎炎、再生不良性貧血、夂蘇 特ρ…陣發性夜間血紅素尿症、骨骨“：不同的 特發性血小板 /正3峨井生徵候群、 血、伊凡氏氏^紫斑、自免疫溶血性貧血、遗傳性貧 子抑制劑徵it候群、第因子抑制劑徵候群^ m ^ f、全身性血管炎、皮肌炎、彡％ \ 風俄熱。本文所't、 人夕發性肌炎與 數為特徵之血“療以低血球計 病 〇 在某些具體& * τ. ^ Κ她例’本發明之組合物盥太、'土〜 興Τ細胞目綠不、乩α ，、万去得用以治療 闲士、 " 相關之病症。在另外的且骨藝每, 用本又所迷之印八4 、把焉施例，係使 ^ 、、’且3物治療心血管疾病。 件如本文所、、 主 述刺激與擴展τ細胞，以誘發< # 母（例如人類癸浪 、 化對諸如病 體之反應性。病二足病母)、細固、奇生蟲與真菌之病源 感染性生 ^包括任何由感染性生物造成之疾病。 t匕括病毒（例如單股RNA病毒、_ 早股DNA病 -54 - (50)200307129 發明說明續頁

毒、人類免疫不足病毒（HIV)、A、B與C型肝炎病毒、疱疹 單純病毒（HSV)、巨細胞病毒（CMV)、EPstein_Barr病毒（EBV)、 人類乳突狀病毒（HPV))、寄生蟲（例如原生動物與厚生動物 病源體，諸如Plasmodia種類、利什曼原蟲（Leishmania)種類、 血吸蟲（Schistosoma)種類、錐原蟲（Trypanosoma)種類）、細菌 (例如分枝桿菌（Mycobacteria)特別是肺結核菌（M. tuberculosis)、沙門氏菌（Salmonella)、鏈球菌（Streptococci)、大 腸桿菌（E. coli)、葡萄狀球菌（Staphylococci))、真菌（例如念珠 菌（Candida)種類、黃麴菌（Aspergillus)種類）、肺囊蟲 (Pneumocystis cadnii)與感染性蛋白（已知感染性蛋白感染動 物造成搔癢症，綿羊與山羊之神經系統可轉移的退化性疾 病以及牛海綿狀腦病變（BSE)或“瘋牛症，，與貓之貓海綿狀 腦病變）。已知有四種感染性蛋白疾病會影響人分別為古魯 (kuru)、庫賈氏病（CJD)、格斯特曼集合徵候群（Gerstmann_ Straussler-Scheinker)病（GSS)與致命的家族性失眠症（FFI)。本

又所用之“感染性蛋白，，之用語，包括全部型式之造成任何 使用的動物4這些全部的或任何疾病或其他疾病_特別是 人類與家畜。 得如本文所述般刺激與擴展 ^ ^ ^ I、展T細胞，以誘發或強化免疫妥 協的個體，例如，有諸如嚴奮八仅、、 獻里合併足免疫不足（SCID)或普通 可變的免疫不足（CVID)之天&、主爲、 、 八生m傳疾病的個體之反應性。 在一個具體貧施例’得如本女邮 I所逑般刺激與擴展τ細胞，以 誘發或強化與骨髓移植、仆政 1 療、放射療法或其他癌症治療 相關之治療的免疫妥協的個Μ to足反應性。一個具體實施 -55 - 200307129

發明說明續頁 例’得如本文所述般刺激與擴展τ細胞，以誘發或強化免产 不足或自免疫疾病的免痕妥協的個體之反應性。在另—個 具體實施例，得如本文所述般刺激與擴展τ細胞，以誘發咬 強化有影響腎肝或胰臟之慢性疾病之免疫妥協的個體之及 應性。在一個特定具體實施例’本發明之T細胞係用以謗發 或強化糖尿病個體之反應性。在另一個具體實施例，本發 明之T細胞係用以誘發或強化因年老影響的個體之反應性 本發明進一步提供由混合T細胞族群選擇性擴展τ細胞特 定亞族群之方法。特定的是，本發明提供專一性強化之丁細 胞’其有較高CD4+與CD8+比例之雙正向τ細胞。 在本發明另一個具體實施例’其提供由CD4+ T細胞族群選 擇性擴展Thi細胞族群之方法。在此方法中，CD4+ T細胞係與 抗-CD28抗體共刺激，諸如單株抗體9·3，包括τ⑴_專一性胞 動素’包括IFN-γ之分泌，造成Tm細胞強化超過τΗ2細胞。 本發明進一步提供由CD4+ τ細胞族群選擇性擴展Τι_ΐ2細胞 肤群之方法。在此方法中，將CD4+ 丁細胞與抗_CD28抗體共 刺激’使得單株抗體Β_ΤΧ3、XR-CD28，包括τ.專一性胞動 方之刀泌，造成TH2細胞之強化超過τΗ卜細胞（例如參照F〇wier 等人，Blood 1994 Nov 15 ; 84( 10) ·· 354〇·9 ; c〇hen等人，ciba F〇und

Symp 1994 ; 187 : 179-93)。 本發明進一步提供選擇性擴展表現特定之νβ、να、νγ或 νδ基因的Τ細胞族群之方法。例如，在此方法中’表現特定 足νβ、να、νγ或νδ基因的丁細胞係經正或負向選取，然後進 一步根據本發明又万法擴展/刺激。另外，表現特定之我們 -56 - 200307129 (52) 發明說明續頁 感興趣之V β、V α、νγ或Vδ基因的T細胞之刺激與擴展，得經 正或負向選取，然後進一步刺激與擴展。

在另一個實例，血係由病患直接抽入單一之拋棄式、含 兩個或以上之固定化抗體（抗-CD3與抗-CD28)或其他於細胞 施予實驗對象前刺激Τ細胞活化所需的受體之成分的裝置 (例如固定化於塑膠表面或可分離之微顆粒上）。在本發明 一個具體實施，例該拋棄式裝置得包括容器（例如塑膠袋或 燒瓶）加上適當之與注射筒與無菌接合裝置組/接合之管線 裝置。此裝置將包含固定固體表面之Τ細胞活化成分（例如抗 -CD3與抗-CD28抗體），這些得為容器本身之表面或插入器， 且典型地是扁平平面、蝕刻之扁平平面、不規則表面、多 孔貼片、纖維、臨床可接受/安全之鐵流體、珠子等等）。 另外，當使用單一裝置，實驗對象仍然可與裝置相連，或 該裝置得與病患分離。甚且，利用可攜式保溫器，得於室 溫使用該裝置或保溫於生理溫度。

因收集與處理血液與血液產品之裝置與方法係熟知的， 熟諳此藝者很容易瞭解給予本文提供之教導時，很容易設 計多種滿足上述需要之裝置或得透過修改現成者。據此， 本文之特定具體實施例並未限制這種裝置與方法，但將包 括任何能維持無菌且維持血液於流體型式之裝置與方法； 其中其補體活化度減低，且其中Τ細胞活化所需成分（例如抗 -CD3與抗-CD28抗體或其配位體）得固定化或於施予實驗對 象前由血液或血液產物分離出。甚且，就一般熟諳此藝者 很容易明白得使用多種血液產物，加上本文所述裝置與方 -57- 200307129 發明說明續頁 (53)

法。例如，該方法與裝置得用來提供快速地將超低溫冷凍 保存之全血、周邊血液單核球、其他超低溫保存之血液衍 生細胞、或超低溫保存之T細胞株於冷凍及施予實驗對象前 的T細胞活化。在另一個實例，得使用該裝置與方法於促進 先前體外擴展之T細胞產物或的T細胞活性，於施予實驗對象 前因此提供高度活化之T細胞產物。最後，很容易瞭解的是 上述方法與裝置得同時用以實驗對象與捐贈者之自體的或 同種的細胞治療。

本發明之方法亦得與疫苗一起使用，以增強抗原反應性 並強化體内效果。甚且，只要經本發明擴展之T細胞在體内 有相對較長半衰期，這些細胞即得做為基因治療之完美載 體，其係帶我們感興趣之核酸序列，並有潛力地能識歸途 到癌症、疾病或感染之位置。據此，得將本發明擴展之細 胞合併疫苗、一或多種胞動素、一或多種治療抗體等等， 傳送與病患。實質上，任何因更強壯之T細胞族群皆可得利 之治療皆屬本文所用方法之情形。 本發明提供具增加之TCR表現的多株性之T細胞之組合物 與方法，以預防、抑制或減少癌症之存在，諸如但不限於， 黑色素瘤、非-霍金森氏淋巴瘤、霍金森氏病、鼻咽癌、白 血病、漿細胞瘤、肉瘤、神經膠質瘤、胸腺瘤、乳癌、前 列腺癌、大腸直腸癌、腎臟癌、腎細胞癌、胰臟癌、食道 癌、腦癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、多發性骨髓瘤、肝 細胞癌、急性淋巴胚細胞白血病（ALL)、急性骨髓白血病 (AML)、慢性骨髓白血病（CML)與慢性淋巴球白血病（CLL)、 -58- 200307129 (54) I發明說明ίΐ 大顆粒淋巴球白血病（LGL)及其他此藝熟知之腫瘤。 另外’本文所述之多株T細胞組合物得用來謗發或強化對 感染性生物之反應性。感染性生物得包括病毒，諸如單股 RNA病毒或單股DNA病毒、人類免疫不足病毒（HIV)、a、b

或c型肝炎病毒、疱疹單純病毒（HSV)、人類乳突狀病毒 (HPV)巨、、、田胞病毒（CMV)、伊波（Epstein-Barr)病毒（EBV)、 寄生蟲、細菌、肺結核菌（M. tubercul〇sis)、肺囊蟲（pneu_cystjs carinii)志珠菌（Candida)或黃麴菌（ASpergiUus)或其組合。

在本毛明另一個具體實施例，本文所述之多株τ細胞組合 物仔用來誘發或強化反應性，以修正先天遺傳病症或免癌 不足病症，諸如嚴重合併之免疫不足（SCID)或普通可變的突 疫不足(CVID)。在某些具體實施例，本文所述之多株丁細报 、且口物得用來4發或強化反應性’以修正與骨髓移植、化 療放射治療或其他癌症治療相關之治療結果的免疫不 足在另_具體貫施例，纟文所述之多株τ細胞組合物得 用㈣發或強化反應性，以修正免疫以或自免疫疾病。 ::-個具體實施例’纟文所述之多株T細胞組合物得用來 誘發或強化反應性以修 r又性疾病之影響腎、肝或胰臟 君。在本發明另一個且體备1 A A ^〶她例，本文所述之多株T細胞組 :、:侍用來诱發或強化治療糖尿病之反應性。在一個具體 :、她例纟又所述^多株下細胞組合物得用來誘發或強化反 應性，以修正與老化相關之免疫不足。 在另一個具體f施例，甚 /、 _不本發明之TCR表現多株性的Ί 細胞組合物得並用立他值 ’、 无用以治療這種傳染病與癌症之 〇9> 200307129 發明說明續頁 (55) 其他療法。 醫藥組合物 本發明之T細胞族群得單獨施用或做為合併稀釋劑與/或 其他諸如IL-2或其他胞動素或細胞族群之組合物施用。簡言 之，本發明之醫藥組合物得包刮本文所述之目標細胞族 群，加上一或多種醫藥或生理可接受載體、稀釋劑或賦型 劑。這種組合物得包括中和緩衝鹽液、稱酸缓衝鹽液及其 類似物；諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚醣、甘露醇之 醣類，蛋白質、多肽或胺基酸諸如甘胺酸、抗氧化物、諸 如EDTA或榖胱甘肽之螯合劑、佐劑（例如氫氧化鋁）與防腐 劑。本發明之組合物以處方成靜脈施用型式較佳。 本發明之醫藥組合物得以適於欲治療（或預防）之疾病的 方式施用。儘管適當之量得以臨床試驗決定，施用之量與 頻率係因諸如病患情況、病患疾病之型態與嚴重性而定。 施予本發明之組合物所誘發之動物的免疫反應可能包括 細胞毒性T細胞媒介之細胞免疫反應、能殺死腫瘤與受感染 細胞與幫助者T細胞反應。主要由幫助者T細胞媒介，能活化 B細胞，因此會致使產生抗體之體液免疫反應亦可能受誘 發。多種技術可用以分析由本發明組合物重建或誘發之免 疫反應型態，其在此亦有詳細說明，例如Coligan等人，Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. ( 1994) o 當點出所謂的“免疫有效量”、“抗腫瘤有效量”、“腫瘤抑 制有效量”或“治療量”時所施用之本發明組合物的準確量 得由醫師考慮個人差異以決定，包括年齡、體重、腫瘤大 -60- 200307129 發明說明續頁 (56)

小、感染程度或轉移與病患病情。典型地，在採用之免疫 治療研究時，我們以約2χ 107〜2χ 1011細胞來施用活化之抗原 專一性Τ細胞（例如參照美國專利號碼5,057,423)。在本發明之 某些方面，特別在使用同種的或異種細胞時，得使用範圍 為106/公斤（每個病患106〜1011)之低細胞數目。在本發明一個 具體實施例，其以約1 χ 108 Τ細胞施予病患。在這些劑量範圍 内，得多次施予該Τ細胞組合物。活化之Τ細胞得與治療之病 患為自體或異體者。必要時，治療得包括施予如本文所述 之有絲分裂原（例如ΡΗΑ)或淋巴動素、胞動素與/或化學動 素（例如，GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、ΜΙΡΙα 等 等）以增強免疫反應之謗發。

在本發明之某些方面，施予之Τ細胞在施用後至少2週與1 年間仍維持其體内之多株性。在另一個具體實施例，施予 之 Τ細胞在施用 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19或20週後仍維持其多株性。在更一個具 體實施例，施予之Τ細胞在施用後至少5、5.5、6、6.5、7、7 5、 8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12個月或更長時間仍 維持多株性。 欲施予本發明之實驗對象醫藥組合物得採任何方便的方 式，包括氣溶膠、吸入、注射、口服、浸潤、植入或移植。 本發明之組合物得經皮下、皮内、肌内、靜脈（i.v.)注射、 腫瘤内或腹膜内施用。本發明之T細胞組合物若係i v.注射施 用較佳。該活化之T細胞組合物得直接注射入腫瘤或淋巴

-61 - 200307129 (57) 發明說明續頁 在又一個具體實施例，該醫藥組合物得經控制釋放系統 傳送。在一個具體實施例，得使用幫浦（參照Langer，1990, Science 249 * 1527-1533 ； Sefton 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 : 20 1 ; Buchwald等人，1980 ; Surgery 88 : 507 ; Saudek等人，1 989, N. Engl. J· Med. 321 : 574)。在另一個具體實施例，得使用聚 合物（參照 Medical Applications of Controlled Release, 1974·

Langer與 Wise (編者），CRC Pres.，Boca Raton，Fla. ; Controlled Drug

Bioavailability, Drug Product Design and Performance, 1984，Smolen 與 Ball (編者），Wiley，New York ; Ranger與 Peppas，1983;J. Macromol. Sci· Rev. Macromol. Chem. 23 : 61 ;亦參照 Levy等人， 1985, Science 228 : 190 ; During等人，1989, Ann. Neurol. 25 : 35 1 ; Howard等人，1989, J. Neurosurg. 71 : 105)。在本發明另一個具 體實施例，控制釋放系統得放置於治療目標旁邊，因此僅 需全身焚彳量之部份（參照例如Medical Applications of Controlled

Release，1984, Langer與 Wise (編者），CRC Pres·，Boca Raton，Fla , 第 2冊，115-138頁）。 本發明之醫藥組合物得使用任何基質施用。在組織工程 情开;^下已使用基質多年（參照例如principles 〇f Tissue

Engineering (Lanza，Langer與 Chick (編者），W97)。本發明使用 之基質，係在做為人工淋巴器官以支持、維持或調節免疫 系統，典型地係經由T細胞碉節之新的情形。據此，本發明 得利用這些已顯現組織工程用途之基質組合物與處方。據 此’本發明的組合物、裝置與方法得使用之基質型態，實 貝上係典限地’且待以包括生物與合成基質。在一特定實 -62- 200307129 發明說明續頁 例中，我們使用美國專利 5,980,889、5,913,998、5,902,745、 5,843,069、5,787,900與5,626,561所用之組合物與裝置。基質之 特性一般包括，當施用於哺乳類宿主時須與生物相容性相 關。基質得由天然或合成材料形成。當需要留在動物體時， 基質可能為非生物可分解者；或者，若其為動物體内之可 移除結構，諸如植入物時，即是生物可分解。基質型式得 為海綿、植入物、管子泰發貼片、纖維、空心纖維、冷凍 乾燥成分、膠、粉末、孔洞組成份、脂質體、細胞或非顆 粒。此外，基質得設計成允許植入細胞持續釋放或生產胞 動素或其他活性劑者。在某些具體實施例，本發明之基質 係伸縮有彈性的；而且，可說其係半固體平台，允許無機 鹽、水性流體與溶解之氣相劑包括氧之滲透。 本文所用之基質係做為生物相容性物質之實例。然而， 本發明不限於基質；因此，不論基質之用語出現在何處， 皆包括裝置及其他允許細胞維持或細胞穿越之物質，且係 生物相容性；並允許大分子穿越，此若非該物質本身即是 半滲透膜而直接經由該物質穿過，即是合併半滲透膜物質 施用。 本文引述之所有參考文獻皆全文並列供參考。甚且，很 清楚地本文所用之數目範圍包括此範圍中之全部整數值； 至於，在本範圍選定特定數值，視特定用途而定，皆涵蓋 在内。甚且，下列實例係供說明而非限制之用。 實例1 T細胞刺激 -63 - 200307129 (59) 發明說明續頁 在本文所述之某些實驗係使用名為XCELLERATEtm之方 法。簡言之，在此方法中，我們係由周邊血液單核細胞 (PBMC)血液分離術產物製造XCELLERATED T細胞。由診斷位 置自病患收集後，清洗血液分離之PBMC ;然後，與“未塗 覆”之DYNABEADS® M-450環氧樹脂一起保溫。此期間諸如 單核球之吞嗟細胞會吸入珠子。保溫後，經MaxSep Magnetic Separator處理細胞與珠子，俾去除珠子及任何附著於珠子之 單核球/呑噬細胞。經此消減單核球步驟後，取總數含5 X 108 CD3+ T細胞之體積並設定以1.5χ 109 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander 以起始 XCELLERATEtm 之方法（珠 子：丁細胞約 3 : 1)。然後，將 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander保溫8天於37°C，5% C02，以產生供首次浸潤 之XCELLERATE T細胞。冷康保存剩餘之經單核球-消減 PBMC之細胞至第二次或進一部之細胞產物擴展時（約21天 後），此時將其解凍、清洗，然後取總數含5χ 108 CD3+ T細胞 之體積並安排 1.5xl09DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander以起始XCELLERATEtm之方法供第二次浸潤。於約8 天之37°C，5% C〇2保溫期間，活化並擴展CD3+ T細胞。由Fred Hutchinson Cancer Research Center，Seattle，WA 取得抗-CD3 mAb (純種系 BC3; XR-CD3)並由 Diaclone (Besancon，France)取得 CD28 mAb (純種系 Β·Τ3 ; XR-CD28)。 將上述方法加上未有分開之單核球消減步驟的一些修 正，其名為XCELLERATE Π「Μ方法；而且，在某些方法該細 胞在其最初與珠子接觸前先冷康，且進行進一步濃縮與刺 -64- 200307129 (60) 發明說明續頁 激。在此方法之一版本，T細胞係經血液分離術取自病患或 捐血者之懸環血液。血液分離術產物之成分通常包括淋巴 球、單核球、顆粒球、B細胞、其他有核細胞（白血球）、紅 血球與血小板。典型的血液分離術產物含1〜2 X 101Q有核細 胞。以無妈、無鎂之磷酸緩衝鹽液洗該細胞，以去除血漿 蛋白與血小板。進行清洗步驟時，離心細胞、去除上澄液， 然後以PBS取代。該法之完成係利用半自動“流過”離心 (COBE 2991 System，Gambro BCT, Lakewood，C〇）。處理時，維 持細胞於封閉系統。 得消減包括單核球之非結合細胞（為活化細胞之強化）， 而進一步處理該細胞，然後繼續刺激。另外，得將洗過的 細胞冷凍、貯存並於稍後處理，本文顯示此係在增加增生 之強壯性與消減顆粒球。在一個實例中，為冷凍細胞，其 係將35毫生細胞懸浮液放入250毫升Cryocyte™冷凍袋 (Baxter)加上35毫升冷康溶液。該35毫升細胞懸浮液典型地 含溶於PBS之3·5χ 109〜5·〇χ 109之細胞。添力π等量冷凍溶液（20% DMSO與8%人類血清白蛋白之PBS)。細胞終濃度為5〇χ 106細 胞/毫升。Cryocyte袋體積得含30〜70毫升範圍，而細胞濃度 為10〜20〇χ 106細胞/毫升。一旦Cryocyte袋充滿細胞與冷凍溶 液時，將其放入控制溫度之冷凍庫，然後以1°C /分鐘速率， 冷凍至-80°C。然後，將冷凍細胞置於液態氮貯存系統備用。 由液態氮貯存系統取出細胞並於37 °C解凍。為去除 DMS0，然後在C0BE 2991 System以無鈣、無鎂之PBS洗解凍 之細胞。然後，令解凍之細胞通過80微米網目濾器。 -65 - 200307129 (61) 發明說明續頁 將約0.5χ 109CD3+細胞之解凍的細胞，置於塑膠之1升之含 100毫升無鈣、無鎂PBS之Lifecell袋中。該PBS含1%〜5%人類 血清。亦將 1.5χ 109 3x 28珠子（Dynabeads M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)與細胞一起置於袋中（3 : 1 DYNABEADS M-450 CD3/ CD28 T Cell Expander : CD3+ T細胞）。將珠子與細胞於室溫1 RPM (末端對末端旋轉）混合30分鐘。將含珠子與細胞之袋子 置於 MaxSep Magnetic Separator (Nexell Therapeutics, Irvine, CA)。在袋子與MaxSep間放置塑膠隔離物（約6毫米厚）。（為 增加磁力強度得移去隔離物）。珠子與附著於細胞之珠子保 存於磁性物上而PBS與未結合細胞則由幫浦抽走。 以細胞培養液潤濕3 X 28珠子與結合於珠子之濃縮細胞（1 升含X-Vivo 15，BioWhittaker ;力口上50毫升熱抑制收集之人類 血清、20毫升1莫耳濃度Hepes、10毫升200毫莫耳濃度之L-麵:胺胺’加或不加100,000 I.U. IL-2)加入3升Lifecell培養袋 中。將該3 X 28珠子轉移且將細胞正向選取入Lifecell袋中 後’將培養液加入袋中至其含1000毫升為止。將含細胞的 袋子放入保溫箱（37°C及5% C02)及任細胞擴展，必要時並分 裝細胞。 丁細胞之活化與增生係在培養後3天與8天，收取細胞時測 定。丁細胞之活化係測量細胞大小、細胞表面標示物表現之 量，特別係在培養第三天時由CD25與CD1 54之表現來評估。 第8天時，讓細胞於重力下流動（約1 5〇毫升/分鐘）通過MaxSep 磁性物以去除磁性顆粒並洗細胞，即利用上述之COBE裝置 濃縮並再懸浮於適於靜脈内施用之經平衡的電解質溶液， -66- 200307129 (62) 發明說明續頁 諸如 Plasma-Lyte A® (Baxter-Healthcare)。此時，亦得將細胞冷 凍於適當冷凍溶液。 如所述，XCELLERATE ΙτΜ參考類似上述之方法，但無刺 激與濃縮步驟，且單核球消減係在刺激前進行。 以 3 X 28 偶合的珠子（Dynabeads M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)刺激由4位捐血人取得之單核球-消減的PBMC。以 ELISA決定懸浮液中IL-2、IL-4、TNF-α與IFN-γ之濃度。於第 12 天，經以新的 Dynabeads M-450 CD3/CD28 T Cell Expander再 接種細胞後（再刺激），亦測定IL-4、TNF-α與IFN-γ之濃度。 如表1、表2與表3所示，IFN-γ、IL-4與TNF-α之濃度係在 XCELLERATEtm與再刺激期間之不同天時，以ELISA測定。 表1 :於XCELLERATEtm方法第3天與XCELLERATEtm活化之T 細胞再刺激第3天時，T細胞生產之干擾素-γ XCELLERATEtm 方法 第2天時[IFN-γ]毫微克/毫升 再刺激第2天時 [IFN-γ]毫微克/毫升 平均數 13.61 31.59 範圍 7.99-27.1 1 10.8-95.5 標準差 5.64 22.98 中數 11 95 26.4 N 24 24 以偶合於 Dynabeads M-450 環氧樹脂（Dynabeads CD3/CD28 T Cell Expander)(XCELLERATETM)的 ^充 CD3與 ^元-CD28刺激由 3位 捐血人取得之噬細胞·消減的PMBC。於第2天時，利用ELISA 定上澄液中IFN-γ之濃度。於第12天時，以偶合於Dynabeads M-450環氧樹脂之抗-CD3與抗-CD28再接種細胞（再刺激），並 -67- 200307129 發明說明續頁 (63) 於2天後測定IFN-γ之濃度。 表2 :於XCELLERATEtm方法第2天與XCELLERATEtm活化之T 細胞再刺激第2天時，T細胞生產之IL-4 XCELLERATEtm 方法 第2天時[IL-4]微微克/毫升 再刺激第2天時 [IL-4]微微克/毫升 平均數 310 274 範圍 170-460 50-500 標準差 143 224 中數 297 268 N 3 3 以偶合於 Dynabeads M-450環氧樹脂（XCELLERATEtm)的抗 CD3 與抗-CD28刺激由3位捐血人取得之噬細胞-消減的PMBC。於 第2與第4天時，利用ELISA定上澄液中IL-4之濃度。於第12 天時，以偶合於Dynabeads M-450環氧樹脂之抗-CD3與抗-CD28 再接種細胞（再刺激），並於2天後測定IL-4之濃度。 表3:於XCELLERATEtm方法第2與4天以及XCELLERATEtm活化 之T細胞再刺激第2與4天時，T細胞生產之TNF-a 第2天 第4天 XCELLERATE™ 再刺激 XCELLERATE™ 再刺激 [TNF-a] [TNF-a] [TNF-a] [TNF-a] 毫微克/毫升 毫微克/毫升 毫微克/毫升 毫微克/毫升 平均數 1 710 0.594 1 635 0 252 範圍 1.11-2.81 0.299-0.782 1.09-2.5 0.21-0.288 標準差 0.762 0.211 0 534 0 036 中數 1.460 0.647 1 55 0 255 N 4 4 4 4 -68- 200307129 _ (64) 發明說明續頁 以偶合於Dynabeads M-450環氧樹脂的抗-CD3與抗-CD28刺激 由4位捐血人取得之噬細胞-消減的PMBC。於第2與第4天 時，利用ELISA定上澄液中TNF-α之濃度。於第12天時，以偶 合於Dynabeads M-450環氧樹脂之抗-CD3與抗-CD28再接種細 胞（再刺激），並於2與4天後測定TNF-α之濃度。 以流式細胞儀分析 CDwl37 (41BB)、CD154 (CD40L)與 CD25 在Xcellerated T細胞之表現量，並畫出平均螢光強度。 CDwl37 (41BB)之表現增力口並於第4天達高峰，然後漸減。再 刺激後，CDwl37之表現快速增加。CD154之表現漸增至約第 7天，然後漸減。然而，再刺激後C D15 4的量快速增加且比 起始刺激時高更多。CD25的量增加至約第3天然後漸減直至 弟8天（分析最後時點）。 實例2 T細胞之光譜型態分析 此實例說明使用光譜型態分析以決定經XCELLERATEtm* 法刺激前後T細胞族群之表現的TCRs之無性繁殖性。本文所 述為重排之νβ基因的分析。熟練的技術人員很容易瞭解， Voc、νγ與νδ TCR基因皆可能以類似方式進行分析。 光譜型態分析實質上係如美國專利號碼5,837,447與C. Ferrand,等人（C. Ferrand, E. Robinet，Emmanuel Contassot，J-M Certoux，Annick Lim，P. Herve與 P. Tiberghien. Human Gene Therapy 1 1 : 1 151-1 164, 2000)所述進行。簡言之，起始之細胞懸浮液 係來自PBMCs、細胞株、PBMC消減之CD8+細胞與/或· XCELLERATED T細胞。總 RNA係利用 Trizol (Gibco-BRL)分離， -69- 200307129 (65) I"發明說 並以標準CDNA合成反應利用逢機之六體（Pharmacia Biotech) 逆轉錄2微克。 如前述每個TCr BV片段皆以能辨識TCr之β鏈的兩個固定 區CP1與C02之Μ個TCR BV亞家族專一性引子之一與cp引子 進行放大。（puisieux，等人，1994, J. Immun〇l. 153, 2807-2818 ; Pannetier等人，W95, Immunol· Today 16 : 176-181)。將 Οβ 引子與 6-Fam螢光染料（Gibco_BRL)偶合。為定量分析，令cDNAs與内 在標準（PTZ-5CD3質體）共同放大。 在熱循環機中，以24個TCRBV寡核：y：酸之一與未標定之C(3 引子在25微升反應中放大等量之cDna合成反應。 TCRBV轉錄子大小型式之PCR放大。在熱循環機 (PTC-200 ; MJ Research，Watertown，MA)中，以 24個 TCRBV寡核 甞酸之一與未標定之Cp引子在25微升反應中放大等量之 cDNA合成反應（相當於總RNA之85毫微克）。每個反應含 lx Taq聚合酶緩衝液（Promega，Charbonniere，France)、1.5毫莫耳 濃度MgCl2、0.2微莫耳濃度之個別的dNTP、0.5微莫耳濃度之 個別的引子與〇·5 U Taq聚合酶（Promega)。PCR以飽和進行， 利用下列程式：94°C、3分鐘預變性，40循環的變性（94°C、 25秒），黏接（60°C、45秒），與聚合（72°C、45秒）隨之為終延 長72°C、5分鐘。於2%瓊脂膠進行一些TCRBV/CpPCR產物之 膠電泳，而且分析中包括負控制（無cDNA)，以便檢查放大 與可能之污染。除了 螢光引子之終濃度為0.1微莫耳濃度 共10微升之外，於相同條件下，將各個24 TCRBV/C(3-40循環 之PCR產物2微升進行2循環的延長反應（跑完）。 -70- 200307129 _ (66) 發明說明續頁 TCRBV亞家族在細月包族群代表性之定量

競爭性δ C D 3 P C R。對每個樣本，利用添加系列稀釋之定 量的DNA質體（4鹼對-消減之5CD3鏈）範圍由1011〜1〇7個數之 競爭者（Garderet等人，1998)放大合成的cDNAs。最適滴定點之 定義為PCR產物產生與標準及原生cDNA相當強度之信號的 標準之濃度。簡言之，5CD3 PCR係以lxTaq聚合酶緩衝液 (Promega)、1.5毫莫耳濃度MgCl2、0.2微莫耳濃度之個別的 dNTP、0.5微莫耳濃度之個別的引子與0.5 U Taq聚合酶 (Promega)於25微升進行反應。PCR係以飽和進行，利用下列 程式：94°C、3分鐘預變性，40循環的變性（94°C、1分鐘）黏 接（60°C、1分鐘），與聚合（72°C、45秒）隨之為終延長72°C、

5分鐘。除了 y 3CD3螢光引子之終濃度為0.1微莫耳濃度、1〇 微升體積之外，於相同條件下，將初次PCR產物2微升進行2 循環的延長時染色。以6%變性丙晞gf胺膠分離勞光PCR產 物，並於自動DNA序歹ij分析儀以Genescan 1.2· 1版（Applied Biosystems，Foster City，CA)分析軟體進行分析。 TCRBV/C卩PCR之定量。為定量TCRBV亞家族全目錄之表 現，除了使用0.1微莫耳濃度之各TCRBV亞家族引子之Cp螢 光引子之外，於類似所述之40個放大循環條件下，進行線 性相的PCR (26-28循環）之cDNA (相當於5χ 1〇7複製數之5CD3 RNA)的24 TCRBV/Cp反應（15微升）。為了解TCRBv全目錄表現 情形’我們以TCRBV亞家族全部波峰之總數除以全部tCRBV 亞永族數目’计异母個TCRBV亞家族之相對百分比。因為 全邰TCRBV PCRs之5CD3複製數之起始數目相當，全部樣本 -71 . 200307129 (67) 發明說明續頁 接彼此相當。 電泳與CDR3片段大小分析。40循環與26〜28循環之PCR放 大之反應與等體積（分別為10或15微升）之20毫莫耳濃度 EDTA-去離子甲醯胺混合，以Rox-1000大小標準做分子量標 示物（Applied Biosystems)。將該混合物2.5微升放入24-公分6% 丙晞醯安定序膠，並以自動之373A DNA定序儀（Applied Biosystems)經Immunoscope軟體定大小與勞光強度。 使用此技術之聚合酶鏈反應（PCR)產物的長度，反映輸入 之TCR RNA之CDR3長度；其係與連接（J)與多樣化（D)基因片 段之用法，以及外核酸酶活性與經由終端移轉酶於連接區 域之N核茹酸加成的平衡有關。偵測相當於正位骨架之轉錄 子的波峰。出現明顯波峰時，意味具有寡株或有株性之T細 胞族群；然而，若無波峰，甚或整個光譜型態亞家族皆無， 意味分別無設定CDR3長度或νβ亞家族之T細胞；或者T細胞 無具生產性TCR基因重排之TCR轉錄子。 如圖2所示，當與利用OKT3/IL-2活化之Τ細胞所見之目錄歪 曲比較，Τ細胞目錄係利用XCELLERATEtm方法維持。於該 XCELLERATETM方法活化前後，分析B-CLL病患之T細胞。如 圖3 (特別是第4排之評量，νβ 4、9、15與22)所示，B-CLL之 病患顯示歪曲之Τ細胞目錄，亦即表現無數νβ家族基因，包 括νβ 4、9、11、13、14、1 5與22之Τ細胞多株性降低。於 XCELLERATEtm*法之第12天時，Τ細胞之光譜型態分析顯示 這些T細胞重建之多株性。 圖 4 利用 Gorochov 分析（G. Gorochov，等人，Nat. Med, 4 : -72- 200307129 發明說明續頁 (68) 215-221，1998)以尋找能總結每位捐助者經XCELLERATEtm* 法擴展前後“干擾”目錄總量的值。圖4a反映經小規模 XCELLERATE™方法擴展前後，由8位不同的B-CLL捐助者所 得的值；至於圖4b反映經臨床XCELLERATEW方法擴展前 後，由5位不同捐助者所得的值。除了 一位，其已經歪曲之 目錄更歪曲外，其他全部有歪曲情形者皆趨向正常化（呈高 斯分布）。13個分析中的8個，由高程度歪曲回復正常程度。 13個中有1個干擾減少，但非正常程度；至於3位開始時未 有歪曲情形者之樣本，經擴展後維持正常分布。 我們亦經由流式細胞儀，利用標準技術，使用對不同νβ 家族成員具專一性之抗體，分析不同TCR νβ家族之表面表 現的TCR νβ用途。如圖5a與5b所示，我們定出在其表面表 現代表性 TCR νβ 家族蛋白（Vp's 1、2、5、8、14、17與 21.3) 之CD4 T細胞與CD8 T細胞之百分比。分析來自2位正常捐助者 之T細胞與2位CLL捐助者之T細胞。在B-CLL樣本情形，該圖 反映XCELLERATE™前後之型態。由這些資料，很明顯地每 個B-CLL樣本接顯示，特定的νβ家族接有高過與不足情形， 特別係在CD8族群。例如，於活化與擴展前後，特別係在CD8 Τ細胞族群之間；CLL捐助者1有相當高百分比之表現νβ 2與 乂021.3之丁細胞，至於〇1^捐助者2有相當高百分比之表現¥0 14的Τ細胞。對照之下，此相同之2位捐助者，在捐助者1顯 示極低百分比之νβ 5、8、14表現情形；而捐助者2顯示極低 百分比之νβ 1、2、8表現情形。光譜型態研究亦觀察到類 似情形，經XCELLERATEtm方法擴展後，這些百分比更趨向 -73 - 200307129 (69) 發明說明續頁 正常量，而過度表現者之百分比下降；至於低度表現之νβ 的百分比上升。 為進一步評估對白血病Β細胞具專一性之Τ細胞的頻率， 利用混合XCELLERATE™ Τ細胞與自體白血病Β細胞目標，以 進行迦碼干擾素（IFNy) ELI SPOT分析。如表4所示，具腫瘤 專一性之T細胞於1 : 167至1 : 2,500範圍係可偵測到的。於前 -XCELLERATETMi頻率為< 1 : 1 〇,〇〇〇(靈敏度極限），意味具 腫瘤專一性之T細胞數目已經過選擇性放大，或者更可能的 是具腫瘤專一性T細胞於擴展之前係不敏感的，而 XCELLERATEtm方法重建其反應性。所報告之腫瘤反應性T 細胞的頻率反映，在無CLL刺激細胞時，IFNy正向細胞之背 景頻率減除情形。 表4 : XCELLERATE™擴張後腫瘤反應性T細胞之頻率 實驗 規模 捐助者 ELISP0T測定之腫瘤反應性 T細胞頻率（IFNy) CLL-3 小規模 OHSU-10 1 :256 CLL-4 小規模 0HSU-11 1 ：556 CLL-5 小規模 0HSU-12 1 ：333 CLL-6 小規模 0HSU-17 1 :681 0H-CL- CLL-7 小規模 101B 1 :284 0H-CL- CLL-8 小規模 103B 1 ：850 CLL-18 小規模 RCLL-1 1 ： 1667 0H-CL- CLL-20 小規模 105L 1 ：200 -74- 200307129 發明說明續頁 CLL-23 小規模 OHSU-16 1 ：2500 CLL-30 小規模 RCLL-7 1 ：1111 CLL-3 1 小規模 RCLL-14 1 ：1000 CLL-32 小規模 RCLL-14 1 ：909 CLL-33 小規模 RCLL-8 1 ：1111 CLL-34 小規模 RCLL-7 1 ：555 CPDCLL-12 波 RCLL-8 1 ：167 CPDCLL-13 波 RCLL-7 1 ：833 平均值（N=16) 1 ：813 表4.利用ELISPOT評估 ，由14個小 規模與2個 大規模 擴展之 13/16 Xcellerated T細胞， 抗腫瘤專· 一性T細胞之頻率。 組織係 取自13位不同 的捐助者 0 因此，如本 文所示， 不僅降低之TCR表現與對抗源之反應 性重建，連免疫反應之廣度亦因個體T細胞之體外Xcelleration 而加大。可使用XCELLERATEtm*法重建或維持T細胞之多株 性。本發明之增加的Xcellerated T細胞，可做預防措施或治療 現存疾病，諸如B-CLL使用。用此方法活化與擴展之T細胞， 因此得做為重建免疫妥協的個體免疫反應性之用。 實例3 XCELLERA丁E方法改善骨骨遗瘤移植病患之淋巴球重建情形 病患 此實例說明，由多發性骨髓瘤病患之預備的臨床實驗資 料指出XCELLERATED T細胞改善骨髓瘤移植病患之重建情 形。 XCELLERATE II方法實質上係如實例1所述般，由臨床實 -75 - 200307129 (71) 發明說明續頁 驗登記後，幹細胞收集前之病患，收集其經白血球分離術 分離之細胞來進行。XCELLERATED T細胞係於幹細胞浸潤 後第3天浸潤。如圖6所示，該XCELLERATEtm方法改善骨髓 瘤移植病患之淋巴球重建情形。此夕卜，經XCELLERATED T 細胞浸潤後，CD4與CD8 T細胞皆增加。 因此，此臨床資料顯示XCELLERATED 丁細胞改善骨髓瘤 移植病患之淋巴球重建情形，並支持本文所述，T細胞組合 物得浸潤入捐助者以提供寬廣與強力之免疫反應之觀念。 圖式簡單說明 圖1係TCR νβ鏈光譜型態分析之表示圖，其說明典型τ細 胞族群之多株、寡株與單株之光譜活性情形。 圖2顯示未經活化之τ細胞、經ΟΚΤ3與IL-2活化之Τ細胞與經 XCELLERATE™方法活化之Τ細胞經光譜型態分析之Τ細胞目 錄比較。 圖3係病患經XCELLERATEtm*法活化前後之B-CLL病患之 T細胞的光譜型態分析，並顯示該XCELLERATE™方法可修玉 對病患所觀測之T細胞赤字。 圖 4係說明利用 Goroshov Perturbation Index (Gorochov，G.，

Neumann，A. U_，Kereveur，A·，Parizot，C.，Li，T.，Katlama，C·，

Karmochkine，M·，Raguin，G·，Autran，B.，與 Debre，P Nat. Med-4 : 215-221，1998)之8個捐贈者之總T細胞目錄“擾亂”量之圖。 圖5a與圖5b之柱狀圖顯示與來自2個B-CLL捐贈者之未處 理與XCELLERATEDtm CD4+與CD8+ T細胞比較，數種νβ家族 之TCR Υβ細胞表面表現對來自2個正常捐贈者之未處理的 -76- 200307129 發明說明續頁 (72) CD4 +與CD8+ T細胞之流式細胞儀分析。該圖形顯示在其表面 表現代表性TCR νβ家族蛋白之CD8 (5a)與CD4 (5b)細胞之百 分比。 圖6之線圖顯示XCELLERATEtm方法改善骨髓瘤移植病患 之淋巴球回復。 •77-

Claims (1)

1. 200307129 拾、申請專利範圍 1. 一種重建τ細胞族群多株性之方法，包括 (a) 提供一細胞族群，其中其至少一部份包括T細胞； (b) 暴露該細胞族群於一或多種藥劑，其接合至少一部 份T細胞之細胞表面部份並刺激至少一部份T細胞， 其中，該等細胞暴露於一或多種藥劑之時間足以使多 株性增加； 藉此重建該T細胞族群之多株性。 2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該重建包括選自由 下列所組成之群之轉移 (a) 由單株至寡株之轉移； (b) 由單株至多株之轉移；及 (c) 由寡株至多株之轉移； 其中該轉移包括測定至少一種νβ、Va、νγ或νδ家族基 因之νβ、Va、νγ或νδ光譜型態情形之Τ細胞族群之轉移。 3·根據申請專利範圍第2項之方法，其中該轉移包括表現至 少一種νβ、Va、νγ或νδ家族基因至足以用於治療之數目 的多株Τ細胞之增加。 4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該一或多種藥劑係 附著於一表面。 5. 根據申請專利範圍第4項之方法，其中該表面上附著有接 合Τ細胞之第一個細胞表面部份的第一種藥劑；而相同或 第二個表面上則附著有接合該Τ細胞之第二個部份的第 二種藥劑，其中該第一與第二種藥劑之接合會謗發該τ 細胞之增生。 200307129 申請專利範圍續頁 6. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中該第一種藥劑包括 一種抗-CD3抗體，而該第二種藥劑包括一種結合該T細胞 表面之輔助分子的配位體。 7. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中該輔助分子為 CD28。 8. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中該第一種藥劑包括 一種抗-CD3抗體，而該第二種藥劑包括一種抗-CD28抗 體。 9. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中該第一與第二種藥 劑係利用共價附著而附著於該表面或該第二個表面。 10. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中該第一與第二種藥 劑係利用直接附著而附著於該表面或該第二個表面。 11. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中該第一與第二種藥 劑係利用間接附著而附著於該表面或該第二個表面。 12. —種重建免疫妥協個體之免疫反應性之方法，包括 (a)自該個體得到細胞族群，其中其至少一部份包括T 細胞； (c) 暴露該細胞族群於一或多種藥劑，其接合至少一部 份T細胞之細胞表面部份並刺激至少一部份T細胞，其 中，該等細胞暴露於一或多種藥劑之時間足以使多株性 增力口； (d) 將該經刺’激之T細胞部份施予免疫妥協個體； 藉此重建該免疫妥協個體之免疫反應性。 13.根據申請專利範圍第12項之方法，其中該一或多種藥劑 200307129 申請專利範圍續頁 係附著於一表面。 14·根據申請專利範圍第13項之方法，其中該表面上附著有 接合T細胞之第一個細胞表面部份的第一種藥劑；而相同 或第二個表面上則附著有接合該T細胞之第二個部份的 第二種藥劑，其中該第一與第二種藥劑之接合會誘發該T 細胞之增生。 15. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該施用之T細胞的 多株性於施用後在體内維持至少3個月。 16. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該施用之T細胞的 多株性於施用後在體内維持至少6個月。 17. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該施用之T細胞的 多株性於施用後在體内維持至少1年。 18. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該免疫妥協個體 有癌症。 19. 根據申請專利範圍第18項之方法，其中該癌症係選自由 下列所組成之群：黑色素瘤、非-霍金森氏淋巴瘤、霍金 森氏病、鼻咽癌、白血病、漿細胞瘤、肉瘤、神經膠質 瘤、胸腺瘤、乳癌、前列腺癌、大腸直腸癌、腎臟癌、 腎細胞癌、胰臟癌、食道癌、腦癌、肺癌、卵巢癌、子 宮頸癌、多發性骨髓瘤、肝細胞癌、急性淋巴胚細胞白 血病（ALL)、急性骨髓白血病（AML)、慢性骨髓白血病 (CML)、大顆粒淋巴球白血病（LGL)與慢性淋巴球白血病 (CLL)。 20.根據申請專利範圍第18項之方法，其中該癌症係B-細胞 200307129 申請專利範圍續頁 慢性淋巴白血病。 21. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該免疫妥協個體 受到病毒感染。 22. 根據申請專利範圍第21項之方法，其中該病毒係選自由 下列所組成之群：單股RNA病毒、單股DNA病毒、人類免 疫不足病毒（HIV)、A、B或C型肝炎病毒、疱疹單純病毒 (HSV)、人類乳突狀病毒（HPV)、巨細胞病毒（CMV)與伊波 病毒（EBV)。 23. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該免疫妥協個體 有先天性遺傳性疾病。 24. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該免疫妥協個體 有影響腎、肝或騰臟之慢性疾病。 25. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該免疫妥協個體 有與老化相關之免疫不足。 26. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該免疫妥協個體 患有自體免疫疾病。 27. 根據申請專利範圍第26項之方法，其中該自體免疫疾病 係選自由下列所組成之群：類風濕性關節炎、多發性硬 化症、胰島素依賴型糖尿病、阿迪生氏症、乳糜瀉、慢 性疲勞徵候群、發炎性腸疾、潰瘍性結腸炎、克隆氏症、 肌纖維痛、紅斑性狼瘡、牛皮癬、修格連氏徵候群、甲 狀腺機能亢進/格瑞夫氏症、甲狀腺低能症/橋本氏症、 胰島素依賴型糖尿病（1型）與重症肌無力 28.根據申請專利範圍第12項之方法，其中該免疫妥協個體 200307129 申請專利範圍續頁 接受過化療。 29. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該免疫妥協個體 接受過細胞毒性藥劑治療。 30. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該免疫妥協個體 接受過免疫壓制藥劑治療。 31. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該免疫妥協個體 患有血球缺乏症相關之血液疾病。 32. 根據申請專利範圍第3 1項之方法，其中該疾病係選自由 下列所組成之群：再生不良性貧血、骨髓異生徵候群、 遺傳性貧血、特發性血小板低下性紫斑與自體免疫溶血 性貧血。 33. —種用於重建免疫妥協個體之免疫反應性之組合物，其 中該個體與非免疫妥協個體相較其T細胞具有降低之多 株性，該組合物包括一多株性已根據申請專利範圍第1 項重建之T細胞族群及醫藥上可接受之賦形劑。