TW200303362A - Compositions and methods for determining the susceptibility of a pathogenic virus to protease inhibitors - Google Patents

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0) 200303362 玖、發明說明 (發明說明應敘明：發明所屬之技術領域、先前技術、内容、實施方式及圖式簡單說明) 1 ·枯術領域 本發明係關於判定病原性病毒對於抗-病毒化合物之感 受性的組合物及方法。該組合物和方法可用來確認治療病 毒感染之有效的藥物攝生法，並確認和判定有潛力之治療 化合物的生物學效力。 2.先前技術 從1980年代早期以來，已經有6千萬人感染了人類免疫 _ 缺陷病毒（"HIV”），後天免疫不全徵候群（"AIDS”）的病原。 參見 Lucas，2002, Lepr Rev· 73(1):64-71。現在，在撒哈拉沙漠 以南的非洲，HIV/AIDS是主要的死因，且在全世界為第四 大殺手。在2001年結束時，估計全球有4千萬人帶有HIV。 參見 Norris，2002，Radiol Technol. 73 (4):339-363 〇 現代的抗-HIV藥物瞄準HIV生活史的不同階段，以及HIV 複製及/或存活所需的各種酵素。在這些藥物中，到目前

為止已經批准用於AIDS治療的，是核苷逆轉錄酶抑制劑， 像是 AZT、ddl、ddC、d4T、3TC、濟而鋼（abacavir)，核嘗酸 逆轉錄酶抑制劑，像是泰諾福章（tenofovir)，非-核甞逆轉 錄酶抑制劑，像是奈維拉平（nevirapine)、希寧（efavirenz)、 地拉維定（delavirdine)，以及蛋白酶抑制劑，像是沙p奎納維 (saquinavir)、利托納維（ritonavir)、英地納維（indinavir)、娜 芙維亞（nelfinavir)、安普那韋（amprenavir)和囉匹那韋 (lopinavir) 〇 一種抗-病毒藥物的作用結果，是它可給病毒複製充份 200303362 (2) 發曰及說明續算 的選擇性壓力，而選擇藥物-抵抗力的突變種（Herrmann等 人，1977，Ann NY Acad Sci 284:632-637)。隨著增加藥物的接 觸，對正在複製之病毒族群的選擇性壓力增加，而促使藥 物抵抗力之突變種更快速地出現。 藥物抵抗力不可避免地出現，面對著有抵抗力的病毒族 群，必須設計最大效用的治療。很難確定促使藥物失敗的 藥物抵抗力，因為可能是患者發展出藥物抵抗力，亦可能 有其他造成不良預後的因素（Richman，1994，AIDS Res Hum Retroviruses 10:901-905)。此外’每個患者通常藏匿有多種 病毒突變品系的混合物，帶有不同的突變品系，其對抗-病毒藥物有不同的感受性。

可用來評估抗-病毒藥物之抵抗力的傳統工具是不適當 的；用來判定HIV對抗-病毒藥物之抵抗力的典型測試是一 種複雜、花時間、昂貴、可能有風險的，且不是為了特定 患者之治療量身定製的。參見Barre-Sinoussi等人，1983, Science 220:868-871; Popovic等人，1984，Science 224:497-500， 及其變化（參見，例如 Goedert等人，1987, JAMA 257:331-334;

Allain等人，1987, Ν· Engl. J· Med· 317:1114-1121; Piatak等人， 1993， Science 259:1749-1754; Urdea， 1993， Clin. Chem. 39:725-726; Kellam 和 Larder，1994, Antimicrobial Agents and

Chemo. 38:23-30)。 有兩種普通的方法，是目前用來測量對抗-病毒藥物之 抵抗力的方法。第一種稱為表現型測試，直接測量取自被 感染病毒者之病毒，對特定抗-病毒藥物的抵抗力。 200303362 (3) 發明說明續莧

Petropoulos等人，2〇〇〇, Antimicrob. Agents Chemother. 44:920-928 和 Hertogs等人，1998，Antimicrob Agents Chemother 42(2):269-76 ’提供今天廣泛使用之表現型測定的說明。Gunthard等人， 1998，AIDS Res Hum Retroviruses 14:869-76，以及 Schuurman等 人，1999, J Clin Microbiol. 37:2291-96，討論目前流行的基因 型測定。Hirsch等人，2000，JAMA 283:2417-26，提供目前可 用來測試藥物感受性之測定的一般分析。 第二種方法，稱為基因型測定，檢測在病毒中影響藥物 感受性的突變作用，並可將特定的遺傳突變與藥物抵抗力 和藥物失敗結合。基因型測試檢查取自患者的病毒，尋找 與某些藥物抵抗力有關之特定遺傳突變的存在。基因型測 試具有少許勝過表現型測試的優點，最值得注意的是它在 進行測試時’相對上是較簡單和快速的。測試可花費少至 數天便完成’且因為它較不複雜，在進行時稍微便宜一些 。然而’基因型資料的判斷，依賴先前在特定突變與對藥 物感受性之改變之間的相互關係的知識。

Carrillo等人，1998, J· Virol. 72:7532-4卜描述在活體外選擇 已經對囉匹那韋降低了感受性的Hiv-i變體，並定出其特 徵。在8個胺基酸位置的9個不同突變，與對囉匹那韋的降 低感受性有關。後續的研究發現，在HIV蛋白酶之11個位 置處的23個不同突變，這與在活體外，在先前已經利用至 少一種蛋白酶抑制劑治療之感染-HIV患者的血漿試樣中 ，降低對囉匹那章的感受性有關連（Kempf等人，2001，J. Virol· 75:7462-69)。草率的演算法企圖使對囉匹那韋的表現 (4) (4)200303362 縈明說f績頁

型抵抗力與在11個已確認位置處觀察到 A π 3大變數目發生 關連，並因此假設預測囉匹那章治療的 .、〆力（Kempf等人 2000, Antiviral Therapy 5(附錄 3): 70，摘要 。 ’ j °根據該演算法 ’如果在其蛋白酶中，在這11個已確認位 置處有5個或更 少的哭變，則病毒易受到以囉匹那韋治療 ^ , 心普。如果在 這11個位置處的突變數目為6或更多個，偭從 U便預測該病毒對 囉匹那章之治療是有抵抗力的。同上。 到目前為止，使用降低感受性的基因型 、、 口主稍關物，來預測 抗-病毒藥物之效力的努力，尤其是 疋日田早對柷不斷-進化之 HIV的藥物，充其量也只是不完全 ^ 7 可較精確地預測特 足的抗，毒或藥物組合，在治療特定患者時是否將是有 效的演算法，藉著在投予患者之前先確認不可能成功的藥 物，將節省時間和金錢。更重要的是，藉著使他或她免於 使用有放毒素來治療’但結果不能改善他或她的HIV感染 的傷害’將可改善患者的生命品質。因此，迫切地需要出 現更精確的演算法，來預測特定的藥物對於治療特定的患 者是否將是有效的。此外，以基因型為基礎的測定，將比 表現型的測定更快速且更具成本效益。 3·登』内容 本申請案主張並宣稱2002年2月15日申請之美國臨時專 利申請案第60/357,171號，2002年2月22日申請之美國臨時 專利申請案第60/359,342號；以及2〇〇2年6月26日申請之美 國臨時專利申請案第60/392,377號之權利和優先權，將該 案之全郅内容以引用的方式併入本文中。 -9- 200303362 (5) 發明說明續頁 本發明提供發展和使用演算法，來判定抗-病毒治療和 組合療法之效力的方法和組合物。該演算法係以表現型臨 床截止值（在該點對治療的抵抗力開始，而敏感性結束）引 導之成對表現型和基因型資料的分析為基礎。該演算法藉 著精確地預測特定的抗-病毒藥物，在治療患者時是否是 有效的，明顯地改善了患者的生命品質，藉此使他或她免 於使用有效毒素來治療，但結果不能改善他或她的HIV感 染的傷害。 在一項觀點中，本發明提供演算法，容許藉著預測被感 染的個體，對使用抗-病毒製劑或製劑組合的治療是否會 產生反應，提供患者有效的治療攝生法，並藉此容許設計 有效的治療攝生法，而不使患者經歷不必要的副作用。再 者，藉著避免投予無效的藥物，而節省可觀的時間和金錢。 在另一項觀點中，本發明提供判定病毒對抗-病毒治療 感受性的方法，包括在病毒基因組或病毒酵素中，檢測與降 低對抗-病毒治療之感受性有關的突變的存在或缺乏。 在另一項觀點中，本發明提供判定以病毒感染之個體的 抗-病毒治療之效力的方法，包括在得自該個體之試樣中 ，檢測與降低對抗-病毒治療感受性有關的突變的存在或 缺乏。 本發明亦提供藉著判定相同或不同之抗-病毒治療的效 力，如同上述，在接受抗-病毒治療的個體中，監視病毒 感染之臨床進行的方法。 在一個具體實施例中，本發明提供包括在人類免疫缺陷 -10- 200303362 ⑹ 發明說明續貢.: 病母（HIV1’）的蛋白酶中，與降低對蛋白酶抑制劑之心 4雙性 有關之突變的核酸和多肽。該蛋白酶抑制劑的實例， 但不限於沙喳納維、利托納維、英地納維、娜芙維 & 晋那韋和囉匹那韋。在一個具體實施例中，該蛋白酶抑 劑是囉匹那韋。 制 在一項觀點中，本發明提供判定人類免疫缺陷病主，. 於利用蛋白酶抑制劑之治療，是否可能是有抵抗力 . 4易感 焚的方法，包括：在該HIV中，檢測一或多個在表7中

夕丨J舉 之HIV蛋白酶突變的存在或缺乏；按照在表7中提供的，對 每個突變指派加重因子，並將該加重因子相加，得到該個 體的總分，其中如果該總分等於或大於截止值分數，則兮 個體可能對蛋白_抑制劑之治療是有抵抗力的，而如果兮 總分小於該截止值分數，則該個體可能易感受蛋白酶抑制 劑的治療。在一個臭體實施例中，截止值是6。在另—個 具體實施例中，截土值為7。在另一個具體實施例中，截 止值是8。

在另一項觀點中，本發明提供判定人類免疫缺陷病毒， 是否在降低對利用蛋白酶抑制劑之治療的感受性上，有增 加之可能性的方法，包括：在該HIV中，檢測一或多個在 表7中列舉之HIV蛋白酶突變的存在或缺乏；按照在表7中 提供的，對每個突變指派加重因子，並將該加重因子相加 ，得到該HIV的總分，其中如果該總分等於或大於截止值 分數，則該HIV對於利用該蛋白酶抑制劑的治療，有增加 抵抗力的可能性。在一個具體實施例中，截止值是6，在 -11 - 200303362 發明說明續育 截止值為7。在另一個具體實施例 ⑺ 另一個具體實施例中 中，截止值是8。 項觀點中，本發明提供判定被人類免疫缺陷病毒 =個體，…能對利用蛋白酶抑制劑之治療是有抵 抗力或易感受的方法，包 * I括在仔自孩個體的試樣中，檢測 一或多個在表7中列舉之mv疋6 士士 HIV蛋白酉孝突變的存在或缺乏；按 照在表7中提供的，對每個 大夂$日派加重因子，並將該加 重因子相加，得到該個髀 、 4似紅的總分，其中如果該總分等於或 大於截止值分數，則該個體 、 了此對利用該蛋白酶抑制劑之 治療是有抵抗力的，而如罢今綸 如果邊總分小於截止值分數，則該 個體可能易感受利用蛋白醢抽 曰崎抑制劑的治療。在一個具體實 施例中，截止值是6，在另一個且w u/ /、肖豆貫犯例中，截止值為7 。在另一個具體實施例中，截止值是8。 在另一項觀點中，本發明提供判定mv是否在降低對利 用蛋白酶抑制劑治療的感受性上，有增加之可能性的方法 ，包括在戎HIV的蛋白酶中，或在該HIV之編碼蛋白酶的核 酸中，檢測在該蛋白酶之胺基酸序列的胺基酸位置2〇、h 、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76 、79、82、84或89處’與降低對利用該蛋白酶抑制劑治療 的感受性有關之突變的存在或缺乏，其中該突變的出現， 表示該HIV對於降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性 ，有增加的可能性，其限制條件為該突變不是Κ20Μ、K2〇R 、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、 V82T或I84V。在一個具體實施例中，在該HIV的蛋白_中 -12- 200303362 ⑻ 發明諱明讀頁. 檢測到突變。在另一個具體實施例中，在該HIV之編碼蛋 白酶的核酸中，檢測到突變。

在另一個具體實施例中，與降低對利用該蛋白酶抑制劑 治療的感受性有關的突變，是在該蛋白酶之胺基酸序列的 胺基酸位置 20、33、34、46、50、54、63、66、73、74、76 、79、82、84或89處，其限制條件為該突變不是K20M、K20R 、L33F、L33M、K43T、M46I、M46L、I50V、I54A、I54L、I54M 、I54S、I54T、I54V、L63P、G73A、G73S、G73T、T74S、V82A φ 、V82F、V82I、V82S、V82T或 I84V。 在另一個具體實施例中，與降低對利用該蛋白酶抑制劑 治療的感受性有關的突變，是在該蛋白酶之胺基酸序列的 胺基酸位置10、11、32、47、53、71或95處，其限制條件 為該突變不是V32I也不是I47V。在一個具體實施例中，與 降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性有關的突變，係 選自由：L10F、F53L和A71L所組成之群。

在另一個具體實施例中，與降低對利用該蛋白酶抑制劑 治療的感受性有關的突變，係選自由Κ20Ι、M46V、I50L、 Ι54Α、Ι54Μ、I54S、L63T、V82S、Ι84Α、I84L、L33F、L33I 、L33V、E34D、Ε34Κ、E34Q、Κ43Τ、G48V、I50L、I50V、 K55R、Q58E、G73C、G73T、Τ74Α、Τ74Ρ、T74S、L76V、Ρ79Α 、P79D、Ρ79Ε、L89I和L89M所組成之群。在另一個具體實 施例中，該突變係選自由Κ20Ι、M46V、I50L、L63T、Ι84Α 、I84L、L33I、L33V、E34D、Ε34Κ、E34Q、I50V、Ι54Μ、G73C 、Τ74Α、Τ74Ρ、L76V、Ρ79Α、P79D、Ρ79Ε、L89I和 L89M所 -13- 200303362 發明說明讀貢 組成之群。在另一個具體實施例中，該突變係選自由K20I 、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K 、E34Q、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、 L89I和L89M所組成之群。 在另一項觀點中，本發明提供判定被HIV感染的個體， 是否在降低對利用蛋白酶抑制劑治療的感受性上，有增加 之可能性的方法，包括在得自該個體的試樣中，檢測在 HIV之蛋白酶的胺基酸序列之胺基酸位置20、33、34、43 、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82 、84或89處，與降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性 有關之突變的存在或缺乏；其中該突變的出現，表示該個 體對於降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性，有增加 的可能性，其限制條件為該突變不是Κ20Μ、K20R、Μ46Ι 、M46L、I54L、Ι54Τ、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或 I84V 。在一個具體實施例中，在該HIV之蛋白酶中，檢測到突 變。在另一個具體實施例中，在該HIV之編碼蛋白酶的核 酸中，檢測到突變。 在另一個具體實施例中，與降低對利用該蛋白酶抑制劑 治療的感受性有關的突變，是在HIV之蛋白酶的胺基酸序 列之胺基酸位置 20、33、34、46、50、54、63、66、73、74 、76、79、82、84或89處，其限制條件為該突變不是K20M 、K20R、L33F、L33M、K43T、M46I、M46L、I50V、I54A、 I54L、I54M、I54S、I54T、I54V、L63P、G73A、G73S、G73T 、T74S、V82A、V82F、V82I、V82S、V82T或 I84V ° -14- 200303362 (ίο) 發明說明續頁 在另一個具體實施例中，與降低對利用該蛋白酶抑制劑 治療的感受性有關的突變，是在HIV之蛋白酶的胺基酸序 列之胺基酸位置10、11、32、47、53、71或95處，其限制 條件為該突變不是V32I也不是I47V。在一個具體實施例中 ，與降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性有關的突變 ，係選自由：L10F、F53L和A71L所組成之群。

在另一個具體實施例中，與降低對利用該蛋白酶抑制劑 治療的感受性有關的突變，係選自由K20I、M46V、I50L、 I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I

、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、 K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A 、P79D、P79E、L89I和L89M所組成之群。在另一個具體實 施例中，該突變係選自由K20I、M46V、I50L、L63T、I84A 、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50V、I54M、G73C 、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和 L89M所 組成之群。在另一個具體實施例中，該突變係選自由K20I 、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K 、E34Q、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、 L89I和L89M所組成之群。 在另一個具體實施例中，該人類免疫缺陷病毒為人類免 疫缺陷病毒第1型（nHIV-ln)。 在另一項觀點中，本發明提供在HI V中編碼蛋白酶之經 過分離的寡核甞酸，其在該人類免疫缺陷病毒中，在該蛋 白酶之胺基酸序列的胺基酸位置20、33、34、43、46、48 -15- 200303362 (11) 發明說明續頁 、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或 89

處包括突變，其中該突變與降低對蛋白酶抑制劑的感受性 有關，其限制條件為該突變不是K20M、K20R、M46I、M46L 、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或 I84V。在 一個具體實施例中，該寡核苷酸的長度是在大約10到大約 100個核苷酸之間。在另一個具體實施例中，該寡核甞酸 的長度是在大約10到大約90個核甞酸之間。在另一個具體 實施例中，該寡核甞酸的長度是在大約10到大約80個核苷 酸之間。在另一個具體實施例中，該寡核甞酸的長度是在 大約10到大約70個核苷酸之間。在另一個具體實施例中， 該寡核铝酸的長度是在大約10到大約60個核苷酸之間。在 另一個具體實施例中，該寡核甞酸的長度是在大約10到大 約50個核甞酸之間。在另一個具體實施例中，該寡核苷酸 的長度是在大約10到大約40個核芬酸之間。在另一個具體 實施例中，該寡核茹酸的長度是在大約10到大約30個核苷 酸之間。在另一個具體實施例中，該寡核苷酸的長度是在 大約10到大約20個核苷酸之間。 在另一個具體實施例中，該經過分離的寡核苷酸，在該 HIV中，在該蛋白酶之胺基酸序列的胺基酸位置20、33、 34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、 79、82、84或89處，包括與降低對蛋白酶抑制劑之感受性 有關的突變，其限制條件為該突變不是K20M、K20R、L33F 、L33M、K43T、M46I、M46L、I50V、I54A、I54L、I54M、I54S 、I54T、I54V、L63P、G73A、G73S、G73T、T74S、V82A、 -16- 200303362 (12) 發明説明讀頁 - - V82F、V82I、V82S、V82T或I84V。該寡核楚酸的長度可以 是在大約10到大約100個核甞酸之間，在大約1〇到大約90 個核甞酸之間，在大約10到大約80個核：y：酸之間，在大約 10到大約70個核甞酸之間，在大約丨〇到大約6〇個核替酸之 間，在大約10到大約50個核苷酸之間，在大約1〇到大約40 個核甞酸之間，在大約10到大約3〇個核苷酸之間或在大約 10到大約20個核甞酸之間。 在另一個具體實施例中，該經過分離的寡核替酸，在 HIV中編碼蛋白酶，其在密碼子2〇、33、34、43、46、48、 50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或 89處 包括突變，其中該突變與降低對蛋白酶抑制劑之感受性有 關，其限制條件為該密碼子並非在位置2〇處編碼減R， 在位置46處編碼碱L，在位置M處編碼l、τ或v，在位置 63處編碼P，在位置82處編碼A、卩或τ或在位置^處編碼v 以寡核菩酸的長度可以是在大約1〇到大約議個核甞酸 <間，在大約1〇到大約9〇個核誓酸之間，在大約到大約 大約_大約7_核#酸之間，在大 約1〇到大約60個核苷酸之間，在大約1〇到大約5〇個核铭酸 《門在大、，，勺10到大約40個核苷酸之間，在大約_大約 30個核苷酸之間，岑 4在大、，々1〇到大約2〇個核苷酸之間。 卜、 “把實她例中，本發明提供在mv中編碼蛋白 酶心經過分離的宸 ^ A曰 ^ X甘故，其在密碼子20、33、34、50、 54、63、66、73、74、76 突變與降低對蛋… 82或89處包括突變，其中該 學抑制劑之感受性有關，其限制條件為 -17- 200303362 __ (13) 發明說明續頁 該密碼子並非在位置20處編碼Μ或R，在位置33處編碼F或 Μ，在位置46處編碼I或L，在位置54處編碼A、L、S、Τ或V ，在位置63處編碼P，在位置73處編碼S或T，在位置74處 編碼S，在位置82處編碼A、F或T或在位置84處編碼V。該 寡核甞酸的長度可以是在大約10到大約100個核甞酸之間 ，在大約10到大約90個核甞酸之間，在大約10到大約80個 核苷酸之間，在大約10到大約70個核苷酸之間，在大約10 到大約60個核甞酸之間，在大約10到大約50個核甞酸之間 ，在大約10到大約40個核甞酸之間，在大約10到大約30個 核甞酸之間，或在大約10到大約20個核甞酸之間。 在另一個具體實施例中，本發明提供包括序列識別1號 之胺基酸序列的殘基1-10的多肽。在另一個具體實施例中 ，該多肽包括序列識別1號之胺基酸序列的殘基11-20。在 另一個具體實施例中，該多肽包括序列識別1號之胺基酸 序列的殘基21-30。在另一個具體實施例中，該多肽包括 序列識別1號之胺基酸序列的殘基3 1 -40。在另一個具體實 施例中，該多肽包括序列識別1號之胺基酸序列的殘基 41-50。在另一個具體實施例中，該多肽包括序列識別1號 之胺基酸序列的殘基51-60。在另一個具體實施例中，該 多肽包括序列識別1號之胺基酸序列的殘基61-70。在另一 個具體實施例中，該多肽包括序列識別1號之胺基酸序列 的殘基71-80。在另一個具體實施例中，該多肽包括序列 識別1號之胺基酸序列的殘基81-90。在另一個具體實施例 中，該多肽包括序列識別1號之胺基酸序列的殘基91-99。 200303362 (14) 發明說明績頁 在另一個具體實施例中，該多肽與具有序列識別1號之 胺基酸序列的多肽，是至少70%，但低於100%相同的。在 另一個具體實施例中，該多肽具有與序列識別1號之胺基 酸序列至少80%相同的胺基酸序列。在另一個具體實施例 中，該多肽具有與序列識別1號之胺基酸序列至少90%相 同的胺基酸序列。 在一個具體實施例中，本發明提供一種方法，其中藉著 序列-專一之寡核：y：酸探針與編碼該突變之人類免疫缺陷 病毒的雜交作用，來檢測在蛋白酶中突變的出現或缺乏， 其中雜交作用的發生，表示該突變的存在或缺乏。 在另一個具體實施例中，本發明提供一種方法，其中藉 著核酸定序來檢測在蛋白酶中突變的出現或缺乏。 在一個具體實施例中，該個體正接受或先前曾經接受利 用該或不同的蛋白酶抑制劑之治療。 在一個具體實施例中，在該蛋白酶之位置20處的胺基酸 ，是具有中性、忌水性或非-極性側鏈的胺基酸。在另一 個具體實施例中，在該蛋白酶之位置20處的胺基酸是I。 在另一個具體實施例中，在該蛋白酶之位置33處的胺基酸 ，是具有中性、忌水性或非-極性側鏈的胺基酸。在另一 個具體實施例中，在該蛋白酶之位置33處的胺基酸是I、F 或V。在另一個具體實施例中，在該蛋白酶之位置33處的 胺基酸是I或V。在另一個具體實施例中，在該蛋白酶之位 置3 4處的胺基酸，是具有驗性、極性或親水性侧鏈的胺基 酸。在另一個具體實施例中，在該蛋白酶之位置34處的胺 200303362 _ (15) 發明說明續頁

基酸是K。在另一個具體實施例中，在該蛋白酶之位置46 處的胺基酸，是具有中性、忌水性或非-極性側鏈的胺基 酸。在另一個具體實施例中，在該蛋白酶之位置46處的胺 基酸是V。在另一個具體實施例中，在該蛋白酶之位置50 處的胺基酸，是具有中性、忌水性或非-極性側鏈的胺基 酸。在另一個具體實施例中，在該蛋白酶之位置50處的胺 基酸是L或V。在另一個具體實施例中，在該蛋白酶之位 置54處的胺基酸，是具有中性、忌水性、非-極性、親水 性或極性侧鏈的胺基酸。在另一個具體實施例中，在該蛋 白酶之位置54處的胺基酸，是具有中性、忌水性或非-極 性側鏈的胺基酸。在另一個具體實施例中，在該蛋白酶之 位置54處的胺基酸是A或Μ。在另一個具體實施例中，在 該蛋白酶之位置54處的胺基酸是Μ。在另一個具體實施例 中，在該蛋白酶之位置54處的胺基酸，是具有中性、親水 性或極性側鏈的胺基酸。在另一個具體實施例中，在該蛋 白酶之位置54處的胺基酸是S。在另一個具體實施例中， 在該蛋白酶之位置63處的胺基酸，是具有中性、親水性或 極性側鏈的胺基酸。在另一個具體實施例中，在該蛋白酶 之位置63處的胺基酸是Τ。在另一個具體實施例中，在該 蛋白酶之位置66處的胺基酸，是具有中性、忌水性或非-極性側鏈的胺基酸。在另一個具體實施例中，在該蛋白酶 之位置66處的胺基酸是F或V。在另一個具體實施例中，在 該蛋白酶之位置73處的胺基酸，是具有中性、親水性或極 性側鏈的胺基酸。在另一個具體實施例中，在該蛋白酶之 -20- 200303362 (16) 發明說明續頁

位置73處的胺基酸是C或T。在另一個具體實施例中，在該 蛋白酶之位置73處的胺基酸是C。在另一個具體實施例中 ，在該蛋白酶之位置74處的胺基酸，是具有中性、忌水性 、非-極性、親水性或極性側鏈的胺基酸。在另一個具體 實施例中，在該蛋白酶之位置74處的胺基酸，是具有中性 、忌水性或非-極性側鏈的胺基酸。在另一個具體實施例 中，在該蛋白酶之位置74處的胺基酸是A或P。在另一個具 體實施例中，在該蛋白酶之位置74處的胺基酸，是具有中 性、親水性或極性側鏈的胺基酸。在另一個具體實施例中 ，在該蛋白酶之位置74處的胺基酸是S。在另一個具體實 施例中，在該蛋白酶之位置76處的胺基酸，是具有中性、 忌水性或非-極性側鏈的胺基酸。在另一個具體實施例中 ，在該蛋白酶之位置76處的胺基酸是V。在另一個具體實 施例中，在該蛋白酶之位置79處的胺基酸，是具有中性、 忌水性、非-極性、酸性、親水性或極性側鏈的胺基酸。 在另一個具體實施例中，在該蛋白酶之位置79處的胺基酸 ，是具有中性、忌水性或非-極性側鏈的胺基酸。在另一 個具體實施例中，在該蛋白酶之位置79處的胺基酸是A。 在另一個具體實施例中，在該蛋白酶之位置79處的胺基酸 ，是具有酸性、親水性或極性側鏈的胺基酸。在另一個具 體實施例中，在該蛋白酶之位置79處的胺基酸是D或E。在 另一個具體實施例中，在該蛋白酶之位置82處的胺基酸， 是具有中性、親水性或極性侧鏈的胺基酸。在另一個具體 實施例中，在該蛋白酶之位置82處的胺基酸是S。在另一 -21 - 200303362 (17) 發明說明續頁 個具體實施例中，在該蛋白酶之位置84處的胺基酸，是具 有中性、忌水性或非-極性側鏈的胺基酸。在另一個具體 實施例中，在該蛋白酶之位置84處的胺基酸是L。在另一 個具體實施例中，在該蛋白酶之位置89處的胺基酸，是具 有中性、忌水性或非-極性側鏈的胺基酸。在另一個具體 實施例中，在該蛋白酶之位置89處的胺基酸是I或Μ。在另 一個具體實施例中，在該蛋白酶之位置43處的胺基酸，是 具有中性、忌水性或非-極性側鏈的胺基酸。在另一個具 體實施例中，在該蛋白酶之位置43處的胺基酸是Τ。在另 一個具體實施例中，在該蛋白酶之位置48處的胺基酸，是 具有中性、忌水性或非-極性側鏈的胺基酸。在另一個具 體實施例中，在該蛋白酶之位置48處的胺基酸是V。在另 一個具體實施例中，在該蛋白酶之位置55處的胺基酸，是 具有鹼性、親水性或極性側鏈的胺基酸。在另一個具體實 施例中，在該蛋白酶之位置55處的胺基酸是R。在另一個 具體實施例中，在該蛋白酶之位置58處的胺基酸，是具有 酸性、親水性或極性側鏈的胺基酸。在另一個具體實施例 中，在該蛋白酶之位置58處的胺基酸是Ε。 在另一項觀點中，本發明提供在至少2、3、4、5、6、7 、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或 19個胺基 酸位置，檢測與降低對利用該蛋白酶抑制劑之治療的感受 性有關之突變的存在或缺乏的方法。在一個具體實施例中 ，本發明提供在2或多個胺基酸位置，檢測與降低對利用 該蛋白酶抑制劑治療的感受性有關之突變的存在或缺乏 -22- 200303362 (18) _ 發明說明續頁 的方法。在另一個具體實施例 胺芙酸尸番认τ t *明提供在3或多個 受性有關、、 用咸蛋白峰抑制劑治療的感 又性有關爻哭變的存在或缺乏 Μ φ , * ^ 々万法。在另一個具體實施 J中本發明提供在4或多個胺A ^ 划阳今疋 收基K义置，檢測與降低對 利用Θ蛋白酶抑制劑治療 ^ ^又性有關之突變的存在或 缺之的方法。在另一個且辦鲁、Α 々又 八a貫她例中，本發明提供在5或 夕個胺基酸位置，檢測與降低 _、 - 利用该蛋白酶抑制劑治療 :感受性有關之突變的存在或缺乏的方法。在另一個具體 實她例中，本發明提供在6或多個胺基酸位置，檢測與降 低、子利用攻蛋白轉抑制劑治療的感受性有關之突變的存 在或缺之的方法。在另一個具體實施例中，本發明提供在 7或夕個胺基酸位置，檢測與降低對利用該蛋白酶抑制劑 治療的感受性有關之突變的存在或缺乏的方法。在另一個 具體實施例中，本發明提供在8或多個胺基酸位置，檢測 與降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性有關之突變 的存在或缺乏的方法。在另一個具體實施例中，本發明提 供在9或多個胺基酸位置，檢測與降低對利用該蛋白酶抑 制劑治療的感受性有關之突變的存在或缺乏的方法。 在另一個觀點中，本發明提供判定HIV是否在降低對利 用第一個蛋白酶抑制劑治療的感受性上具有增加之可能 性的方法，包括在該HIV之蛋白酶中，在該蛋白酶之胺基 酸序列的胺基酸位置10、11、32、33、34、43、46、47、48 、50、54、58、71、76、79、82、84或 95處，檢測與降低對 利用第二個蛋白酶抑制劑治療的感受性有關之突變的存 -23- 200303362 _ (19) 發明說明續頁 在或缺乏，其中該突變的出現，表示HIV在降低對利用第 一個蛋白酶抑制劑治療的感受性上具有增加的可能性，其 限制條件為該突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、 I54L、I54M、V82A或I84V。在一個具體實施例中，第一個 蛋白酶抑制劑為囉匹那章或安普那章。在另一個具體實施 例中，第二個蛋白酶抑制劑為囉匹那章或安普那韋。 在另一項觀點中，本發明提供判定被HIV感染的個體， 是否在降低對利用第一個蛋白酶抑制劑治療的感受性上 具有增加之可能性的方法，包括在得自該個體之試樣中， 在該HIV之蛋白酶的胺基酸序列之胺基酸位置10、11、32 、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82 、84或95處，檢測與降低對利用第二個蛋白酶抑制劑治療 的感受性有關之突變的存在或缺乏，其中該突變的出現， 表示該個體在降低對利用第一個蛋白酶抑制劑治療的感 受性上具有增加的可能性，其限制條件為該突變不是V32I 、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、V82A或 I84V。在 一個具體實施例中，第一個蛋白酶抑制劑為囉匹那韋或安 普那韋。在另一個具體實施例中，第二個蛋白酶抑制劑為 囉匹那韋或安普那韋。 5.實施方式 本發明以藉著表現型臨床截止值引導之成對表現型和 基因型資料的總括分析為基礎，提供發展用來判定抗-病 毒藥物之效力的演算法之方法和組合物。本發明亦提供判 定病毒對抗-病毒治療感受性的方法，判定被病毒感染之 -24- 200303362 (20) 發明說明讀頁 個體的抗-病毒治療效力的方法，以及在接受抗-病毒治療 之個體中，監視病毒感染之臨床進行的方法。在另一項觀 點中，本發明亦提供在人類免疫缺陷病毒（”HIVn)中，與降 低對蛋白酶抑制劑，例如囉匹那章感受性有關之突變的核 酸和多肽。 4.1縮寫 MLPV,f是蛋白酶抑制劑囉匹那韋的縮寫。

MAPV,f是蛋白酶抑制劑安普那韋的縮寫。 ·’ £Γ是蛋白酶抑制劑的縮寫。 ’’ PT-RM和’’ PT-S’，分別為'’在表現型上是有抵抗力的π和 在表現型上是敏感的’’的縮寫。 ’’ GT-R’，和” GT-S’，分別為’’在基因型上是有抵抗力的π和 在基因型上是敏感的’’的縮寫。 丨，PCRn為π聚合酶連鎖反應π的縮寫。 nm’’為’’倍數變化”的縮寫。

關於20個在遺傳學上編碼之L-胺基酸，在本文中使用 的胺基酸標1己法為慣用的，並如下： 胺基酸 一個字母的縮寫 三個字母的縮寫 丙胺酸 A Ala 精胺酸 R Arg 天冬醯胺 N Asn 天冬胺酸 D Asp 半胱胺酸 C Cy s 穀胺醯胺 Q Gin 25 200303362 (21) 發明說明續頁 胺基酸 一個字母的縮寫 三個字母的縮寫 穀胺酸 E Glu 甘胺酸 G G ly 組胺酸 Η His 異亮胺酸 I lie 亮胺酸 L Leu 離胺酸 Κ Ly s 甲硫胺酸 Μ Met 苯丙胺酸 F Phe 脯胺酸 P Pro 絲胺酸 S Ser 蘇胺酸 T Thr 色胺酸 W Trp 酪胺酸 Y Ty r 纈胺酸 V Val 除非另外提到，當以一連串一個字母及/或三個字母的 縮寫提供多肽序列時，係根據普通的習慣，以N-> C的方 向提供該序列。 在本文中，以AN表示在序列中的個別胺基酸，其中A為 在序列中之胺基酸的標準一個字母符號，而N為在序列中 的位置。在本文中，以AiNA2表示在胺基酸序列中的突變 ，其中AiS在參考蛋白質序列中，胺基酸的標準一個字母 符號，A2則是在突變之蛋白質序列中，胺基酸的標準一個 字母符號，而N是在胺基酸序列中的位置。例如，G25M突 -26- 200303362 _ (22) I發朋說明讀頁

變代表在胺基酸位置25處，從甘胺酸至甲硫胺酸的改變。 在本文中，亦可以NA2表示突變，其中N為在胺基酸序列 中的位置，而A2為在突變之蛋白質序列中，胺基酸的標準 一個字母符號（例如25M，是在胺基酸位置25處，從野外型 胺基酸至甲硫胺酸的改變）。此外，在本文中亦可以Αβ表 示突變，其中人1是在參考蛋白質序列中，胺基酸的標準一 個字母符號，而N是在胺基酸序列中的位置（例如，G25代 表在胺基酸位置25處，從甘胺酸至任何胺基酸的改變）。 通常當在突變蛋白質序列中之胺基酸任一是未知的，或如 果在突變蛋白質序列中的胺基酸，可以是在參考蛋白質序 列中找到的以外的任何胺基酸時，使用這種標記法。以從 其中衍生出包括該突變之區域的蛋白質之全長序列為基 礎，將胺基酸的位置編號。在DNA序列中，核甞酸和點突 變的代表是類似的。

在整個說明書中，在提及包括特定核鹼基序列之核酸所 使用的縮寫，是傳統的一個字母縮寫。因此，當包含在核 酸中時，天然存在的編碼核鹼基的縮寫如下：腺嘌呤（A) 、鳥嘌呤（G)、胞嘧啶（C)、胸腺嘧啶（T)和尿嘧啶（U)。除非 另行指定，以一連串一個字母的縮寫來表示單股的核酸序 列，並以i — 3’的方向提供雙股序列的上股。 4.2定義 當在本文中使用時，下列的名詞應具有下列的意義： 除非另行指定，”主要突變’’意指影響酵素活性位置的突 變，也就是在涉及酵素-受質複合物的那些胺基酸位置處 -27- 200303362 (23) 發明說明續頁ι ，或是當病毒經歷抗-病毒製劑之選擇壓力時，在複製的 早期循環中以可再現之方式呈現的突變，或是對抗-病毒 製劑之表現型感受性有極大影響的突變。 Π次要突變Π意指並非主要突變，但對於由主要突變強加 之顯著缺陷，貢獻降低的感受性或補償。 Π基因型測定”是一種判定生物、生物的一部分、基因或 一部分基因之遺傳序列的測試。經常在HI V中進行這類測 定，以便確定某些與藥物抵抗力有關的突變是否出現。 當在本文中使用時，π基因型資料π是關於例如病毒之基 因型的資料。基因型資料的實例包括，但不限於病毒、一 部分病毒、病毒基因、一部分病毒基因的核甞酸或胺基酸 序列，或在病毒核酸或蛋白質中的一或多個核甞酸或胺基 酸殘基的身分。 π表現型測定"是測量病毒（像是HIV)對特定抗-病毒製劑 之敏感性的測試。 Μ感受性π意指病毒對特殊藥物的反應。對藥物具有減少 或降低之感受性的病毒，對該藥物具有增加的抵抗力或降 低的敏感性。對藥物具有增加或提高或較大感受性的病毒 ，對該藥物具有增加的敏感性或降低的抵抗力。 病毒對特定藥物的表現型感受性，是一連續體。它實際 上仍可用來定義閾值或閾值們，簡化特定倍數-變化之結 果的解釋。至於已經收集到充份臨床成果資料的藥物，其 可能定義如下的π臨床截止值”。 "臨床截止值”意指一個特定的點，在該點抵抗力開始而 -28- 200303362 _ (24) I發明說明續頁 敏感性結束。它可藉著藥物感受性的程度來定義，在該程 度下，患者以特定藥物治療失敗的或然率明顯地增加。不 同的抗-病毒製劑有不同的截止值，按照在臨床研究中判 定的。在臨床試驗中，藉著評估抵抗力和成果資料，來判 定臨床截止值。在治療開始時測量藥物感受性（表現型的） 。在整個治療過程中，在預定的時間點監視治療反應，像 是在病毒負荷上的變化。使藥物感受性與治療反應發生關 連，並藉著與治療失敗有關的抵抗力程度來判定臨床截止 值（整個試驗結果的統計分析）。 意指抑制濃度。它是在患者血液中或在活體外，壓 抑η%之致病微生物（像是HIV)繁殖所需的藥物濃度。因此 ，意指抑制50%在缺乏該藥物下所觀察到的病毒複製 程度的抗-病毒製劑之濃度。’’患者的IC5G’f意指抑制50%得 自患者之病毒複製所需的藥物濃度，而π參考IC5Gn則意指 抑制50%參考或野外型病毒複製所需的藥物濃度。簡言之 ，’Ί£Μ’’意指抑制90%病毒複製的抗-病毒製劑之濃度。 ”倍數變化π為患者病毒和藥物-敏感性參考病毒之藥物 感受性的數量比較。它是患者的IC5G對藥物-敏感性參考 IC5〇的比例，也就是患者的IC5〇/參考IC5G=倍數變化（"FC”） 。1 ·0之倍數變化表示患者的病毒顯露出與藥物-敏感性參 考病毒相同程度的藥物抵抗力。小於1的倍數變化，表示 患者的病毒比藥物-敏感性參考病毒更敏感。大於1的倍數 變化，表示患者的病毒比藥物-敏感性參考病毒更沒有感 受性。倍數變化等於或大於臨床截止值，意指患者的病毒 -29- 200303362 (25) 發明說明續頁 較不可能對該藥物產生反應。比臨床截止值更低的倍數變 化，意指患者的病毒對該藥物是敏感的。 π囉匹那韋倍數變化π意指囉匹那韋對抗得自患者血漿 試樣之HIV的IC5〇，對囉匹那韋對抗NL4-3 (GenBank登錄編 號AF324493)參考病毒品系之IC50的比例。 如果其具有小於10的囉匹那韋倍數變化，則該病毒對囉 匹那韋是’’敏感的’’。 如果其具有10或更高的囉匹那韋倍數變化，則該病毒對 囉匹那韋是π有抵抗力的π。 如果一病毒具有某種特性，例如與降低對抗-病毒治療 之感受性有關的突變，則該病毒對該抗-病毒治療便是π在 降低感受性上有增加的可能性’’ 〇如果病毒的族群平均而 言，對抗-病毒治療的感受性比缺乏該特性之病毒的其他 類似族群更低，則該病毒之特性便與降低感受性有關連。 因此，在出現某種特性與降低感受性之間的關連性，不一 定是絕對的，也不必為了賦與降低感受性而一定要有必要 的（也就是該特性在降低感受性上扮演原因的角色），或充 分的（也就是該特性的出現僅是充分的）特性。 在本文中，π序列同種性’’ 一詞與’’同種性％ ” 一詞、π序列 同一性％ ”和，，同一性％，丨交替使用，並意指在使用序列排列 程式排成一直線時，在二或多個肽序列之間的胺基酸序列 同一性的程度。例如，當在本文中使用時，80%同種性意 指與藉著限定演算法判定之80%序列同一性相同的事情 ，因此，特定序列的同系物，在特定序列的長度内，具有 -30- 200303362 (26) 發明說明績頁 80%以上的序列同一性。對特定序列之序列同一性的代表 性程度，包括但不限於60、70、80、85、90、95、98%或更 高的序列同一性。 可用來在兩個序列之間判定同一性的代表性電腦程式 ，包括但不限於BLAST程式組，例如BLASTN、BLASTX和 TBLASTX 、 BLASTP 和 TBLASTN ，可在網際網路

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 處公開獲得。亦參見 Altschul 等人，1990，J· Mol. Biol· 215:403-10 (特別提及公開 的預設設定，也就是參數w=4，t=17)和Altschul等人，1997,

Nucleic Acids Res·，25:3389-3402。當相對於在 GenBank蛋白質 序列或其他公開資料庫中的胺基酸序列，評估特定的胺基 酸序列時，通常使用BLASTP程式完成序列搜尋。至於針 對在GenBank蛋白質序列和其他公開資料庫中的胺基酸序 列，搜尋在所有編閱架構中已經轉譯的核酸序列，則 BLASTX程式是較佳的。使用打開間隙罰點11.0和延伸間隙 罰點1.0的預設參數，並利用BLOSUM-62矩陣，來執行 BLASTP和 BLASTX兩者。參見 Altschul等人，1997。 為了在二或多個序列之間判定”同一性％ ”，使用例如在 MacVector 6.5版中的CLUSTAL-W程式，來進行所選出之序列 的較佳排列，利用預設參數操作，包括打開間隙罰點10.0 ，延伸間隙罰點0.1以及BLOSUM 30類似性矩陣。 π極性的胺基酸π意指具有在生理學的pH值下不帶電荷 之側鏈的親水性胺基酸，但其具有至少一個鍵結，其中由 兩個原子一起共享的一對電子，被其中一個原子抓得較緊 -31 - 200303362 (27) 發明說明續頁 。在遺傳學上編碼的極性胺基酸，包括Asn(N)，Gln(Q)，Ser(S) 和Thr⑺。 π非極性的胺基酸”意指具有在生理學的pH值下不帶電 荷之側鏈的忌水性胺基酸，且其具有一键結，其中由兩個 原子一起共享的一對電子，通常由兩個原子分別均等地抓 住（也就是說，該側鏈是沒有極性的）。在遺傳學上編碼的 非-極性胺基酸，包括 Ala(A)，Gly(G)，Ile(I)‘，Leu(L)，Met(M) 和 Val(V)。 n親水性的胺基酸n意指根據Eisenberg等人，1984，J. Mol. Biol. 179:125-142的標準化一致忌水性等級，顯露出小於0 之忌水性的胺基酸。在遺傳學上編碼的親水性胺基酸，包 括 Arg(R)，Asn(N)，Asp(D)，Glu(E)，Gln(Q)，His(H)，Lys(K)， Ser(S)和 Thr(T)。 n忌水性的胺基酸n意指根據Eisenberg等人，1984，J. Mol. Biol. 179:125-142之標準化一致忌水性等級，顯露出大於0 之忌水性的胺基酸。在遺傳學上編碼的忌水性胺基酸，包 括 Ala(A)，Gly(G)，Ile(I)，Leu(L)，Met(M)，Phe(F)，Pro(P)，Trp(W) ，Tyr(Y)和 Val(V)。 n酸性的胺基酸”意指具有小於7之側鏈pK值的親水性胺 基酸。酸性胺基酸在生理學的pH值下，通常具有帶負電 的側鏈，因為失去一個氳原子。在遺傳學上編碼的酸性胺 基酸，包括Asp(D)和Glu(E)。 ’’鹼性的胺基酸’’意指具有大於7之側鏈pK值的親水性胺 基酸。鹼性胺基酸在生理學的pH值下，通常具有帶正電 -32- 200303362 (28) 發明說明續頁 的側鏈，因為與一個水合氫離子結合。在遣傳學上編碼的 鹼性胺基酸，包括Arg(R)，His(H)和Lys(K)。 ，丨突變’丨是相對於參考核酸或蛋白質，在胺基酸序列或在 相對應之核酸序列中的變化。關於本發明包括HIV蛋白酶 的具體實施例’參考蛋白酶是出現在NL4-3 HIV (GenBank 登錄編號AF324493)中的蛋白酶。雖然可藉著例如Edman降 解作用或質譜分析，直接判定肽的胺基酸序列，但較典型 的是從編碼該肽之核酸的核茹酸序列，來推論肽的胺基酸 序列。可使用在此項技藝中已知的判定核酸序列的任何方 法，例如 Maxam-Gilbert 定序（Maxam 等人，1980，Methods in Enzymology 65:499)、二脫氧定序（Sanger等人，1977, Proc· Natl. Acad· Sci· USA 74:5463)，或以雜交作用為基礎的方法（參見 ’例如 Maniatis等人，1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY和 Ausubel等人，1989,

Current Protocols in Molecular Biology， Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY) o 在病毒中，"與抵抗力-有關的突轡”（nR AMM异與降低該 病毒對抗-病毒製劑之感受性有關連的突變。可在數個病 毒中找到RAM，包括但不限於人類免疫缺陷病毒（”HIVn)。 可在一或多個病毒蛋白質中找到這類突變，例如在HIV的 蛋白酶、接合酶、被膜或逆轉錄酶中。相對於參考品系來 定義RAM。關於本發明包括HIV蛋白酶的具體實施例，參 考蛋白酶是出現在NL4-3 HIV (GenBank登錄編號AF324493) 中的蛋白酶。 -33- 200303362 (29) 發明說明績頁 "突變種’’是具有一序列的病毒、基因或蛋白質，該序列 相對於參考病毒、基因或蛋白質，具有一或多個改變。 完全交替使用名詞”1”、丨’多肽”和”蛋白質”。 完全交替使用名詞π參考π和π野外型’’。 完全交替使用名詞π多核苷酸π、’’寡核苷酸”和”核酸π。

π大約π 一詞意指被修改之數目上10%或下10%的數目。 在其中該數目必須是整數的例子中，例如核酸長度或胺基 酸長度，如果所得的數目不是整數，可四捨五入成為大於 0的最接近整數。 4.3與抵抗力-有關的突變

本發明提供在HIV之蛋白酶中，包括突變的核酸和多肽 。較佳的是，該HIV是人類免疫缺陷病毒第1型（’’HIV-Γ’）。 HIV亦可以是例如人類免疫缺陷病毒第2型（nHIV-2n)。在一 個具體實施例中，該突變係與降低對蛋白酶抑制劑之感受 性有關。在另一個具體實施例中，該突變係與增加對蛋白 酶抑制劑之感受性有關。該蛋白酶抑制劑可以是熟諳此藝 者已知的任何蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑之實例包括， 但不限於沙Ρ奎納維、利托納維、英地納維、娜芙維亞、安 普那韋和囉匹那韋。在一個具體實施例中，該蛋白酶抑制 劑為囉匹那韋。 在一項觀點中，本發明提供在HIV之蛋白酶中，包括與 降低或增加對蛋白酶抑制劑，例如囉匹那韋之感受性有關 之突變的肽、多肽或蛋白質。在一個具體實施例中，本發 明提供衍生自HIV蛋白酶，並包括與降低對蛋白酶抑制劑 -34- 200303362 (30) 發明.說明繞頁 之感受性有關之突變的多肽。在另一個具體實施例中，該 多肽包括一個以上，與降低對蛋白酶抑制劑之感受性有關 的突變。在另一個具體實施例中，該多肽包括與增加對蛋 白酶抑制劑之感受性有關的突變。在另一個具體實施例中 ，該多肽包括一個以上，與增加對蛋白酶抑制劑之感受性 有關的突變。本發明之多肽，包括經過修改或衍生自這些 多肽的肽、多肽和蛋白質。在一個具體實施例中，該多肽 包括轉譯後的修改。在另一個具體實施例中，該多肽包括 一或多個胺基酸類似物。 在一個具體實施例中，該多肽包括一或多個與降低對囉 匹那韋之感受性有關的突變。表1提供與降低對囉匹那韋 之感受性有關的突變的一覽表。在整個文件中提及的胺基 酸或核酸位置，分別意指在序列識別1號或序列識別2號中 的蛋白酶胺基酸或核酸位置，或在其他病毒中的相對應位 置，例如在蛋白酶中有添加或刪除的那些，以及編碼與在 序列識別1號或序列識別2號中之序列有關之蛋白酶的基 因。

在另一個具體實施例中，本發明提供衍生自HIV蛋白酶 ，並包括突變的多肽，該突變係選自由：K20I、M46V、I50L 、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I 、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50V、K55R、 Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D 、P79E、L89I和L89M所組成之群。在另一個具體實施例中 ，該突變係選自由：L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q -35- 200303362

發明說明續頁

、K43T、G48V、I50L、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、 T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和 L89M 所組成之群。在另一個具體實施例中，該突變係選自由： K20I、M46V、I54M、L63T、V82S、I84A、I84L、L33I、L33V

、E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、G73C、T74A、T74P、 L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和 L89M所組成之群。在另 一個具體實施例中，該突變係選自由：L33I、L33V、E34D 、E34K、E34Q、I50L、I50V、G73C、T74A、T74P、L76V、 P79A、P79D、P79E、L89I和L89M所組成之群。在另一個具 體實施例中，該突變係選自由：K20I、E34D、E34K、E34Q 、I50L、I50V、L63T、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和 L89M 所組成之群。在另一個具體實施例中，該突變係選自由： E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、L76V、P79A、P79D、P79E 、L89I和L89M所組成之群。

在一個具體實施例中，該多肽具有序列識別1號的胺基 酸序列，除了該序列與序列識別1號之差異在於其含有至 少一個與降低或增加對蛋白酶抑制劑，例如囉匹那韋之感 受性的突變以外。在另一個具體實施例中，這類多肽包括 至少 5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、85、90 或95個序列識別1號的相鄰胺基酸。 在另一個具體實施例中，這類多肽包括序列識別1號之 胺基酸序列的殘基1-10。在另一個具體實施例中，該多肽 包括序列識別1號之胺基酸序列的殘基11-20。在另一個具 體實施例中，該多肽包括序列識別1號之胺基酸序列的殘 -36- 200303362 (32) 發明說明續頁 基21-30。在另一個具體實施例中，該多肽包括序列識別1 號之胺基酸序列的殘基31-40。在另一個具體實施例中， 該多肽包括序列識別1號之胺基酸序列的殘基41-50。在另 一個具體實施例中，該多肽包括序列識別1號之胺基酸序 列的殘基51-60。在另一個具體實施例中，該多肽包括序 列識別1號之胺基酸序列的殘基61-70。在另一個具體實施 例中，該多肽包括序列識別1號之胺基酸序列的殘基71-80 。在另一個具體實施例中，該多肽包括序列識別1號之胺 基酸序列的殘基81-90。在另一個具體實施例中，該多肽 包括序列識別1號之胺基酸序列的殘基91-99。 在另一個具體實施例中，該多肽對具有序列識別1號之 胺基酸序列的多肽，是至少70%，但低於100%相同的。在 另一個具體實施例中，該多肽具有對序列識別1號之胺基 酸序列而言，80%以上相同的胺基酸序列。在另一個具體 實施例中，該多肽具有對序列識別1號之胺基酸序列而言 ，90%以上相同的胺基酸序列。 欲判定兩個胺基酸序列或兩個核酸的同一性百分比，為 了最適切比較之目的，將序列排成一直線（例如，為了最 適切地與第二個胺基酸或核酸序列排成一直線，可將間隙 導入第一個胺基酸的序列或核酸序列中）。然後比較在相 對應之胺基酸位置或核甞酸位置處的胺基酸殘基或核苷 酸。當在第一個序列中的位置，被與在第二個序列中相對 應位置處相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，此時分子在 該位置處是相同的。在兩個序列之間的同一性百分比，是 -37- 200303362 (33) 發明說明續買 由序列共享之相同位置之數目的函數（同一性％=相同位 置的數目/位置的總數（例如部份重疊的位置）X 1〇〇)。在一 個具體貫施例中，兩個序列的長度是一樣的。 可使用數學演算法，完成在兩個序列之間判定同一性百 分比。用來比較兩個序列的數學演算法之較佳的、非限制 性實例，是 Karlin和 Altschul(1990) Proc· Natl· Acad· Sci. USA 87··2264-2268 的演算法，按照在 Kadin和 Altschul(1993) Proc. Natl. Acad· Sci· USA 90:5873-5877中的來修改。將這類演算法 併入 Altschul等人（1990) J· Mol· Biol· 215:403-410的 NBLAST和 XBLAST程式中。可利用NBLAST程式，分數= l〇〇，字長=12 ，進行BLAST核甞酸搜尋，獲得與本發明之核酸分子同種 的核苷酸序列。可利用XBLAST程式，分數=50，字長=3， 進行BLAST蛋白質搜尋，獲得與本發明之蛋白質分子同種 的胺基酸序列。欲為了比較之目的，獲得有間隙的排列， 可根據在 Altschul等人（1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 中的描述，使用間隙BLAST。或者，可使用PSI_Blast進行 反覆的搜尋，其檢測分子之間的疏遠關係。同上。在利用 BLAST、間隙BLAST和PSI-Blast程式時，可使用個別程式（例 如 XBLAST和 NBLAST)的預设參數。參見 httpi/y^w^ncbi.nlm.nih.gov 。用來比較序列之數學演算法的其他較佳的、非限制性實 例，是Myers和Miller，CABIOS (1989)的演算法。將這類演算 法併入ALIGN程式（2.0版）中，其為CGC序列排列套裝軟體 的一部分。當使用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使 用PAM120加重殘基表、12之間隙長度罰點和4之間隙罰點 -38- 200303362 (34) 發明說明讀頁 。序列分析的額外演算法，為此項技藝中已知的，並包括 在 Torellis和 Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci·，10:3-5中描述 的 ADVANCE和 ADAM ;以及在 Pearson和 Lipman (1988) Proc·

Natl· Acad. Sci· 85:2444-8 中描述的 FASTA。在 FASTA 中，ktup 是設定敏感性和搜尋速度的控制選擇權。如果ktup=2，藉 著檢查成對的已排列好的殘基，找出在兩個序列中待比較 的類似區域；如果ktup= 1，則檢查單一的已排列好的胺基 酸。關於蛋白質的序列，可將ktup設定為2或1，或關於DNA φ 序列，設定為從1至6。如果未指定ktup，則其預設值對蛋 白質而言是2，而對DNA而言則是6。 可使用類似上述那些的技術，容許或不容許間隙，判定 在兩個序列之間的同一性百分比。在計算同一性百分比時 ’通¥计算精確的相配。 在另一個具體實施例中，本發明提供具有序列識別1號 之胺基酸序列的多肽的天然存在或以合成方式設計之對 偶基因變體。在另一個具體實施例中，本發明提供由核酸 分子編碼的多肽，該核酸分子為具有序列識別2號之核酸 序列，或其互補物的天然存在或以合成方式設計之對偶基 因變體，除了該多肽與由序列識別2號編碼者之差異，在 於其含有至少一個與降低或增加對蛋白酶抑制劑，例如囉 匹那早之感雙性有關的突變。 在另一項觀點中，本發明提供編碼或與本發明之多肽， 或/、生物活性邵分有關的多核替酸、寡核替酸或核酸，包 括例如足夠用來作為確認、分析、突變或擴大本發明之核 -39- 200303362 (35) 發明說明續頁 酸的雜交探針、PCR引子或定序引子的核酸分子。 在一個具體實施例中，該核酸編碼在HIV之蛋白酶中包 括與降低或增加對蛋白酶抑制劑，例如囉匹那韋之感受性 有關的突變的多肽。在一個具體實施例中，本發明提供之 核酸，編碼衍生自HIV蛋白酶，並包括一或多個與降低對 蛋白酶抑制劑之感受性的突變的多肽。在另一個具體實施 例中，該核酸編碼包括一或多個與增加對蛋白酶抑制劑之 感受性的突變的多肽。本發明之核酸包括經過修改或衍生 自這些核酸序列的核酸、多核苷酸和寡核甞酸。在一個具 體實施例中，該核酸包括核酸類似物。 在一個具體實施例中，該核酸可以是HIV基因組之長度 ，也就是大約9200個核苷酸。在另一個具體實施例中，該 核酸可以是HIV蛋白酶密碼序列的長度，例如大約300個核 甞酸。在另一個具體實施例中，該核酸可與HIV基因組之 片段或HIV蛋白酶密碼序列的片段相符合。例如，該核酸 的長度可以是大約 10、11、12、13、14、15、16、17、18 、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31 、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60 、65、70、75、80、85、90、100、110、120、125、150、175 、200、250或300個核铝酸。或者，該核酸的長度可以是例 如大約350、375、400、425、450、475或500個核甞酸。該 核酸之長度可以是例如小於3、4、5、6、7、8、9、10、11 、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37 -40- 200303362 (36) 發明說明續頁 、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 、100、110、120、125、150、175、200、250、300、350、375 、400、425、450、475、500、525、550、575、600、650、700 、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400 、1500、 1600、 1700、 1800、 1900、 2000、 2500、 3000、 3500 > 4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000 、8500或9000個核苷酸。在較佳的具體實施例中，該核酸 具有適用於檢測在本文中描述之突變的長度和序列，例如 像是探針或引子。 在一個具體實施例中，該核酸編碼包括一或多個與降低 對囉匹那韋之感受性的突變的多肽。表1提供與降低對囉 匹那韋之感受性有關的突變的一覽表。

在另一個具體實施例中，本發明提供編碼衍生自HIV蛋 白酶，並包括突變之多肽的核酸，該突變係選自由：K20I 、M46V、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F

、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、 I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V 、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M所組成之群。在另一個 具體實施例中，該突變係選自由：L33F、L33I、L33V、E34D 、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、K55R、Q58E、 G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E 、L89I和L89M所組成之群。在另一個具體實施例中，該突 變係選自由：K20I、M46V、I54M、L63T、V82S、I84A、I84L 、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、G73C、 •41 _ 200303362 (37) 發明說明續頁 T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和 L89M所組 成之群。在另一個具體實施例中，該突變係選自由：L33I 、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、G73C、T74A、 T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和 L89M所組成之群 。在另一個具體實施例中，該突變係選自由：K20I、E34D 、E34K、E34Q、I50L、I50V、L63T、L76V、P79A、P79D、 P79E、L89I和L89M所組成之群。在另一個具體實施例中， 該突變係選自由：E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、L76V 、P79A、P79D、P79E、L89I和 L89M所組成之群。 在另一個具體實施例中，該寡核甞酸具有序列識別2號 之核酸序列，除了該序列與序列識別2號之差異在於其編 碼至少一個與降低或增加對蛋白酶抑制劑，例如囉匹那韋 之感受性有關的突變。在其他的具體實施例中，這類寡核 替酸包括包括至少 10、11、12、13、14、15、16、17、18 、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35 、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 、110、120、150、180、210、240、255、270或 285個序列識 別2號的相鄰核甞酸。 在另一個具體實施例中，這類寡核誓酸包括序列識別2 號之核酸序列的殘基1-30。在另一個具體實施例中，該寡 核苷酸包括序列識別2號之核酸序列的殘基3 1-60。在另一 個具體實施例中，該寡核茫酸包括序列識別2號之核酸序 列的殘基61-90。在另一個具體實施例中，該寡核茹酸包 括序列識別2號之核酸序列的殘基91-120。在另一個具體實 -42- 200303362 (38) 發明說_續頁

施例中，該寡核苷酸包括序列識別2號之核酸序列的殘基 121-150。在另一個具體實施例中，該寡核甞酸包括序列識 別2號之核酸序列的殘基151-180。在另一個具體實施例中 ，該寡核苷酸包括序列識別2號之核酸序列的殘基181-210 。在另一個具體實施例中，該寡核苷酸包括序列識別2號 之核酸序列的殘基211-240。在另一個具體實施例中，該寡 核甞酸包括序列識別2號之核酸序列的殘基241-270。在另 一個具體實施例中，該寡核苷酸包括序列識別2號之核酸 序列的殘基271-297。

在另一個具體實施例中，該寡核甞酸與具有序列識別2 號之核酸的寡核甞酸，至少60%，但小於100%是相同的。 在另一個具體實施例中，該寡核苷酸所具有的核酸序列， 與序列識別2號之核酸序列，是至少70%以上相同的。在 另一個具體實施例中，該寡核苷酸所具有的核酸序列，與 序列識別2號之核酸序列，是至少80%以上相同的。在另 一個具體實施例中，該寡核苷酸所具有的核酸序列，與序 列識別2號之核酸序列，是至少90%以上相同的。可按照 上述，判定兩個核酸序列的同一性百分比。 除了序列識別2號之核甞酸序列之外，熟諳此藝者應瞭 解在族群（例如人類族群）中亦存有DNA序列的多形現象， 其導致胺基酸序列上的改變。這類遺傳的多形現象，可出 現在族群内的個體中，係歸因於天然的對偶基因變化。天 然的對偶基因變化，通常在特定基因的核苷酸序列中，產 生1-5%的變化。企圖將因為天然的對偶基因變化而產生， -43- 200303362 (39) _____ 發明說命續頁 且不改變功能活性之任何和所 ^ ^ ,> _ 斤有的每一核苷酸變化，以；5 于々胺基酸變化或多形現象， Λ η y 豕匕括在本發明的範園内。 在另—個具體實施例中，本發明提供 本發明> 4、a、 t σ用不作為檢剛 不嗌月艾核酸序列的引子或雜 之核酸八工 雅人抹針的核酸分子。本發明 的一，八 不I明之全長多肽之核酸序列 發明；二列如可用來作為探针或因子的片段，或編碼本 上的广生物活性部分的片段。該探針可包括附接於其 酵辛團’例如放純同位素、w化合物、酵素或 八或碑：在各種具體實施例中，可在鹼基部分、糖部 刀或％鉍主鏈處，修改本發明之核酸分子。 物抵抗力有闞—ϋ毒突_ ，^ ，觀點中，本發明提供在病毒或病毒的衍生物中 出與抵抗力有關之突變的方法。 4,4,1 和病毒試樣 根據本發明之與抵抗力有關的突變(，，RAM，，)，可出現在 =何類型的病毒中M列如任何在動物中找㈣的病毒。在本 :明的-個具體實施例中，該病毒包括已知會感染動物的 :毒，包括狗、雜、馬、綿羊、牛料。在較佳的具體實 、彳中已知汶病毒會感染靈長類。在更佳的具體實施例 中，已知m病毒會感染人類。人類病毒的實例包括，但不 限於人類免疫缺陷病毒（"HIV”）、單純疱疹病毒、細胞巨大 病毒、帶狀疱疹病毒、其他的人類疱疹病毒、A型流行性 感冒病毒、呼吸遒融合細胞病毒、A、6和c型肝炎病毒、 鼻病毒，以及人類乳頭狀瘤病毒。在本發明的一個具體實 -44 - 200303362 (40) 發朋說明續頁 施例中，該病毒為HIV。該病毒最好是人類免疫缺陷病毒 第1型（πΗΐν-Γ)。該HIV亦可以是例如人類免疫缺陷病毒第 2型（"HIV-2”）。前述的是目前有可利用之抗-病毒化學治療 的某些病毒的代表，並代表病毒家族逆轉錄病毒科、癌療 病毒科、正黏液病毒科、副黏液病毒科、小核糖核酸病毒 科、黃病毒科、肺病毒（pneumovirus)和肝DNA病毒科 (hepadnaviridae)。本發明亦可用於由於在這些家族中之其 他病毒引起的其他病毒感染，以及起因於在其他病毒家族 中之病毒的病毒感染，對於這些病毒感染，目前有或沒有 可用的療法。 可在藉著此項技藝中已知，用來獲得病毒試樣之任何方 法獲得的病毒試樣中，找到根據本發明之RAM。這類方法 包括，但不限於從被病毒感染的人類或動物中獲得病毒試 樣，或是從病毒培養物中獲得病毒試樣。在一個具體實施 例中，從被病毒感染的人類個體中獲得病毒試樣。可從被 感染個體之身體的任何部分，或任何預期含有病毒的分泌 物中，獲得病毒試樣。這類部分的實例包括，但不限於血 液、血清、血漿、痰、淋巴液、精液、陰道黏液和其他體 液的試樣。在一個具體實施例中，該試樣為血液、血清或 血漿試樣。 在另一個具體實施例中，根據本發明之RAM出現在可獲 自培養物的病毒中。在一些具體實施例中，可從實驗室獲 得培養物。在其他的具體實施例中，可從收集中心獲得培 養物，例如美國典型培養物收集中心（American Type Culture -45- (41) (41)200303362 發明説明續頁

Collection) 〇 在木二/、把實犯例中，根據本發明之ram出現在病毒的 衍生物中。在一個具體實施例中，病毒的衍生物本身不是 病原性的。在另一個具體實施例中，病毒的衍生物是以質 體為基礎的系、统’其中質體或利用質體轉移感染之細胞的 複製’又到選擇性壓力的存在或缺乏影響，而得以選擇增 加對該選擇性壓力之抵抗力的突變。在一些具體實施例中 ，病毒的何生物包括感興趣的核酸或蛋白質，例如，被抗 -病毒治療瞄準的那些核酸或蛋白質。在一個具體實施例 中，可將感興趣的基因導入載體内。參見，例如美國專利 第 5,837,464號和 6,242，187號，以及 PCT公開案 w〇 99/67427， 將其以引用的方式併入本文中。在較佳的具體實施例中， 該基因可以是編碼蛋白酶或逆轉錄酶的那些。 在另一個具體實施例中，不必使用完整的病毒。可改而 使用導入載體内的一部分病毒。最好是使用被抗_病毒藥 物瞄準的一邵分病毒。 在另一個具體實施例中，根據本發明之RAM出現在以遺 傳方式修改的病毒内。可使用此項技藝中已知，以遺傳方 式修改病毒的任何方法，以遺傳方式修改病毒。例如，可 利用貫驗室培養’使病毒生長至想要數目的世代。在一個 具體實施例中’不應用選擇性壓力（也就是說，病毒不用 接文偏^:具有某些特徵之病毒複製的處理），並經過隨機 的这傳趨勢，累積新的突變。在另一個具體實施例中，當 病毒在培養時生長時，對其應用選擇性壓力（也就是說， -46- 200303362 _ (42) I發明說明續頁

病毒在偏愛具有一或多個特徵之病毒複製的條件下生長） 。在一個具體實施例中，選擇性壓力為抗-病毒治療。可 使用任何已知的抗-病毒治療，作為選擇性壓力。在一個 具體實施例中，該病毒為HIV，而該選擇性壓力為蛋白酶 抑制劑。在另一個具體實施例中，該病毒為HIV-1，而該 選擇性壓力為蛋白酶抑制劑。可使用任何蛋白酶抑制劑， 充當選擇性壓力。蛋白酶抑制劑的實例包括，但不限於沙 p奎納維、利托納維、英地納維、娜芙維亞、安普那韋和囉 匹那章。在一個具體實施例中，該蛋白酶抑制劑係選自由 沙p奎納維、利托納維、英地納維、娜芙維亞、安普那章和 囉匹那韋所組成之群。在另一個具體實施例中，該蛋白酶 抑制劑為囉匹那章。藉著以蛋白酶抑制劑，例如囉匹那韋 處理在活體外培養的HIV，可選擇具有增加對安普那韋之 抵抗力的HIV突變種品系。可巧妙運用選擇性壓力的策略 ，增加或降低不具選擇所需特徵之病毒的存活。

在另一項觀點中，藉著使病毒、病毒基因組或病毒基因 組的一部分發生突變，來製造根據本發明之RAM。為了此 一目的，可使用此項技藝中已知的任何突變生成的方法。 在一個具體實施例中，突變生成作用本質上是隨機的。在 一個具體實施例中，藉著將病毒、病毒基因組或病毒基因 組的一部分暴露在致突變的處理下，進行本質上隨機的突 變生成作用。在另一個具體實施例中，使編碼病毒蛋白質 的基因發生突變，該病毒蛋白質是抗-病毒治療的標靶。 本質上隨機之致突變處理的實例，包括例如，暴露在致突 -47- 200303362 (43) 發明說明續頁 變物質（例如溴化乙錠、甲烷磺酸乙酯、乙基亞硝基瑨 (ENU)等等）、輻射（例如紫外線）下，插入及/或移除可置換 單元（例如Tn5、TnlO)，或是在具有增加突變生成速率之細 胞、細胞萃取物或在活體外之複製系統中複製。參見，例 如 Russell等人，1979, Proc. Nat· Acad. Sci. USA 76:5918-5922 ; Russell, W.，1982，環境的突變劑和致癌劑：環境突變劑之 第三次國際研討會的議事錄（Environmental Mutagens and Carcinogens: Proceedings of the Third International Conference on Environmental Mutagens)。熟諳此藝者應暸解，雖然這些突 變生成方法中的每一個本質上均是隨機的，但在分子的層 面上，分別具有它自己的較佳標革巴。 在另一項觀點中，使用指定位置之突變生成作用，來製 造可能影響病毒對抗-病毒治療之敏感性的突變。可使用 此項技藝中已知的任何指定位置之突變生成方法（參見， 例如 Maniatis 等人，1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory, NY和 Ausubel等人，1989, Current Protocols in Molecular Biology， Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY)。指定位置之突變生成 作用可針對例如特定的基因或基因組區域，特定部分的基 因或基因組區域，或是在基因或基因組區域内的一或數個 特定的核苷酸。在一個具體實施例中，指定位置之突變生 成作用以一或多個判斷標準為基礎，針對病毒基因組的區 域、基因、基因片段或核茹酸。在一個具體實施例中，使 基因或一部分基因接受指定位置之突變生成作用，因為其 -48- 200303362

發明說明續頁

編碼已知或懷疑是抗-病毒治療之標靶的蛋白質，例如編 碼HIV蛋白酶的基因。在另一個具體實施例中，選擇一部 分基因，或在基因内的一或數個核苷酸，進行指定位置之 突變生成作用。在一個具體實施例中，欲使其發生突變之 核苷酸，編碼已知或懷疑其與抗-病毒化合物產生交互作 用的胺基酸殘基。在另一個具體實施例中，欲使其發生突 變之核嘗酸，編碼已知或懷疑其為在具有降低對抗-病毒 治療之感受性的病毒品系中，發生突變的胺基酸殘基。在 另一個具體實施例中，發生突變之核甞酸，編碼鄰近或靠 近已知或懷疑其與抗-病毒化合物產生交互作用，或已知 或懷疑其在具有降低對抗-病毒治療之感受性的病毒品系 中發生突變的蛋白質殘基之主要序列的胺基酸殘基。在另 一個具體實施例中，發生突變的核誓酸，編碼鄰近或靠近 已知或懷疑其與抗-病毒化合物產生交互作用，或已知或 懷疑其在具有降低對抗-病毒治療之感受性的病毒品系中 發生突變的蛋白質殘基之二級、三級或四級結構的胺基酸 殘基。在另一個具體實施例中，發生突變的核甞酸，編碼 在其中或靠近已知或懷疑其與抗-病毒化合物結合的蛋白 質之活性部位的胺基酸殘基。參見，例如Sarkar和Sommer， 1990, Biotechniques，8:404-407 0 4.4.2 在病毒中檢測突變的存在或缺乏 可藉著此項技藝中已知的，用來檢測突變的任何方法， 在病毒中檢測根據本發明之RAM的存在或缺乏。可在編碼 特定蛋白質之病毒基因中，或在蛋白質本身中檢測突變， -49- 200303362 (45) 發明說明績頁 也就是在蛋白質之胺基酸序列中。

在一個具體實施例中，突變是在病毒的基因組中。這類 突變可以是在例如編碼病毒蛋白質的基因中，在編碼病毒 蛋白質之基因的順或反向作用之調節序列中，在基因間序 列或插入序列中。突變可能影響病毒之結構、功能、複製 或環境的任何方面，其改變它對抗-病毒治療的感受性。 在一個具體實施例中，突變是在編碼病毒蛋白質的基因中 ，該蛋白質為抗-病毒治療的標I巴。 可藉著使用許多技術，檢測在病毒基因内的突變。可使 用病毒的DNA或RNA，作為這類測定技術的起點，並可根 據熟諳此藝者已熟知的標準程序來分離。

可在雜交或擴大測定中使用病毒的DNA或RNA，來檢測 涉及基因結構的異常，包括點突變、插入、刪除和基因組 的重排。這類測定可包括，但不限於南方分析（Southern， 1975，J. Mol. Biol. 98:503-517)、單股構形多形現象分析 (SSCP)(Orita等人，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770) ，以及PCR分析（美國專利第4,683,202號；4,683，195號； 4,800，159號和 4,965，188號；PCR策略，1995 Innis等人（編輯）， Academic Press，Inc.) 0 這類檢測基因-專一之突變的診斷方法，可能涉及例如 在偏愛這些試劑與其互補序列之專一黏接的條件下，使病 毒的核酸與一或多個已經標示，並包含重組DNA分子、選 殖基因或其簡併變體的核酸試劑接觸並培養。這些核酸試 劑的長度最好至少是15至30個核铝酸。在培養之後，從核 -50- 200303362 (46) 發明說明續頁

酸分子雜化物中移除所有未-黏接的核酸。如果出現任何 的這類分子，然後檢測已經雜交之核酸的存在。使用這類 檢測計畫，可固定得自病毒的核酸，例如固定在固體支撐 物上，像是膜或塑膠表面上，像是在微量滴定盤或聚苯乙 烯小珠上。在該案例中，在培養之後，可輕易地移除上述 類型的未-黏接、已標示之核酸試劑。使用熟諳此藝者已 熟知的標準技術，完成剩下已黏接、已標示之核酸試劑的 檢測。可將已經與核酸試劑黏接的基因序列，與預期得自 正常基因序列的黏接圖案相比較，以便判定是否出現基因 突變。 另一種檢測基因專一之核酸分子的診斷方法，可能涉及 其擴大作用，例如藉著PCR (美國專利第4,683,202號； 4,683，195號；4,800，159號和 4,965，188號；PCR策略，1995 Innis 等人（編輯），Academic Press，Inc.)，接著使用熟諳此藝者已熟 知的技術，檢測經過擴大的分子。可將所得的擴大序列， 與如果待擴大之核酸僅含有個別基因的正常副本將可預 φ 期到的序列相比較，以便判定是否出現基因突變。 此外，可藉著此項技藝中已知的任何定序方法，定出核 酸的序列。例如可藉著Sanger等人，1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 的二脫氧法，由 Messing等人，1981，Nuc· Acids Res. 9:309進一步說明，或藉著 Maxam等人，1980, Methods in Enzymology 65:499的方法，定出病毒DNA的序歹J。亦參見在 : Maniatis等人，1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, . Cold Spring Harbor Laboratory，NY和 Ausubel等人，1989，Current -51- 200303362 (47) 發明說明續頁—

Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY 中描述的技術。 亦可使用對抗病毒基因產物，也就是病毒蛋白質或病毒 肽片段的抗體，在病毒的蛋白質中檢測突變。或者，可藉 著任何此項技藝中已知的定序方法，定出感興趣之病毒蛋 白質或肽片段的序列，以便產生感興趣之蛋白質的胺基酸 序列。這類方法的一個實例是Edman降解法，可用它來* 序小蛋白質或多肽。一開始可藉著此項技藝中已知的化學 或酵素試劑，切開較大的蛋白質，例如溴仆A 、， 儿氰、歿胺、胰 蛋白扭或胰凝乳蛋白酶，然後藉著Edman降解法定序 5·5遇U突》趣病真的表現型感香柹 、 、八笑媽毒 病毒族群對抗_病毒治療的表現性感受性。 >見’例如 國專利第5,837,464號和6,242，187號，將其全女 ， 王又以引用的 式併入本文中。在一些具體實施例中，進杯矣 、 ％仃表現型分析 也就是病毒對特定之抗-病毒製劑的感受性，並梦μ 變足參考病毒的感受性進行測定。這是藥物感受性的直 、定量測量，並可藉著此項技藝中已知的任 、、 1 1可万法來進 判走病毒對抗-病毒製劑的感受性。這麵女 例 只万法的一個 包括但不限於對於參考病毒，判定在ΐΓ & 變化。表現型測試， —姐y卜， 物抑制劑的存在下生長的能力。相對於抑制參考病主 的藥物含量，對特定藥物之感受性較低的病毒，雨要 的抑制劑才能抑制病毒的活性。 係測量特走病毒品系在活體外 仏K5G值上的倍 Μ，測哥絲金益矣口 $丄._ -52- 200303362 (48) 發明說明續y.

在一個具體實施例中，進行表現型分析，並用來計算藥 物對病毒品系的1C50或1C90。亦可以每個病毒品系與易感受 藥物之對照組品系，或得自相同患者的較早病毒品系相比 較，在IC5G或IC9G上的倍數變化，來提交分析的結果。因為 病毒直接暴露在每種可利用的抗-病毒醫藥品之下，故結 果可直接與治療反應連結。例如，如果患者病毒對特定藥 物顯示出抵抗力，則避免或從患者的治療攝生法中省略該 藥物，容許臨床醫師設計比較可能有效的治療計畫，持續 較長的期間。 在另一個具體實施例中，使用重組病毒測定（"RVAs”）來 進行表現型分析。RVAs使用藉著在病毒載體與從患者病毒 中擴大的病毒基因序列之間同種重組作用所產生的病毒 母液。在一些具體實施例中，該病毒載體為HIV載體，而 該病毒基因序列可以是蛋白酶和逆轉錄酶序列。

在一個具體實施例中，使用PHENOSENSETM (ViroLogic Inc·，South San Francisco，CA)進行表現型分析。參見 Petropoulos等人，2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44:920-928 ；美國專利第 5,837,464號和 6,242，187號。PHENOSENSETM是 達到表現型測試之益處，並克服先前測定之缺點的表現型 測定。因為該測定已經是自動化了的，故在經過控制的條 件下，PHENOSENSETM提供較高的輸貫量。結果是對所有 目前可利用之抗逆轉錄病毒藥物，精確定義患者之HIV分 離物的感受性輪廓的測定，並在收到試樣的大約10至大約 15天内，將結果直接送達臨床醫師。PHENOSENSE™是精 -53- 200303362

發明說明績頁 確的，並可僅利用一回合的病毒複製便獲得結果，藉此避 免病毒亞群的選擇。該結果是定量的，測量各種程度的藥 物感受性和敏感性一可對具有大約500個副本/毫升之病毒 負荷的血液樣本進行測試，並可在10°/。或更低濃度的總病 毒族群下，檢測極少族群之某些具有藥物-抵抗力的病毒 。此外，該結果是可再現的，並在大約95%所進行的測定 中，可依據藥物而改變大約1·4-2·5倍以下。

PHENOSENSETM可使用得自經過擴大之病毒基因序列的 核酸。如同在第5·4· 1章中討論的，含有病毒的試樣可以是 得自被病毒感染之人類或動物的試樣，或得自病毒細胞之 培養物的試樣。在一個具體實施例中，病毒試樣包括以遺 傳方式修改的實驗室品系。

然後可藉著使用此項技藝中已知的，將基因序列併入載 體内的任何方法，將經過擴大的病毒基因序列併入有複製 缺陷的病毒載體内，建構抵抗力測試的載體（"RTVn)。在 一個具體實施例中，使用限制酵素和傳統的選殖方法。參 見 Maniatis等人，1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory，NY和 Ausubel等人，1989，Current

Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY。在一些具體實施例中，使用Apal和 PinAI限制酵素。有複製缺陷的病毒載體，最好是指示劑 基因病毒載體（’’IGVV’1)。在一些具體實施例中，該病毒載 體含有檢測RTV複製的工具。最好是該病毒載體含有蟲螢 光素酶表現卡匣。 -54- 200303362 _ (50) I發明說明續頁

可藉著先利用RTV DNA和表現其他逆轉錄病毒之被膜 蛋白質的質體，例如兩向老鼠白血病病毒（amphotropic murine leukemia virus)(MLV)，共同-轉移感染宿主細胞，來 進行該測定。在轉移感染之後，可收獲病毒顆粒，並用來 感染新鮮的標靶細胞。可藉著檢測在載體中所含有之複製 作用的方法，來檢測單一回合之病毒複製的完成。在一個 具體實施例中，單一回合之病毒複製的完成，導致蟲螢光 素酶的產生。可在轉移感染步驟或感染步驟處，加入連續 濃度的抗-病毒製劑。 可藉著在抗-病毒製劑的存在和缺乏下，比較載體的複 製，來測量對抗-病毒製劑的感受性。例如，可藉著在抗-病毒製劑的存在和缺乏之下，比較蟲螢光素酶活性，來測 量對抗-病毒製劑的感受性。在抗-病毒製劑的存在下，易 感受的病毒將產生低程度的蟲螢光素酶活性，而具有降低 感受性的病毒則將產生較高程度的蟲螢光素酶活性。

在一個具體實施例中，在評估HIV-1對抗-病毒藥物的表 現型感受性時，使用PHENOSENSE™。該抗-病毒藥物最好 是蛋白酶抑制劑。更佳的是，它是囉匹那韋。在一些具體 實施例中，參考病毒品系是HIV品系NL4-3或HXB-2。 在一個具體實施例中，可藉著諸如，但不限於PCR之方 法，擴大從血漿試樣及其片段，或完整病毒基因中萃取的 病毒核酸，例如HIV-1 RNA。參見，例如Hertogs等人，1998, Antimicrob Agents Chemother 42(2):269-76。在一個實例中，可 藉著巢式逆轉錄-PCR，擴大含有完整HIV-1 PR-或RT-密碼 -55- 200303362 (51) 發明說明續頁 序列的2.2-kb片段。然後可將經過擴大之核酸的集合，例

如PR-RT-密碼序列，與從其中刪除大部分PR (密碼子10至 99)和RT(密碼子1至482)序列的pGEMT3APRT質體，共同轉移 感染到宿主細胞，像是CD4+T淋巴細胞（MT4)内。同種重組 作用導致產生含有病毒密碼序列，像是衍生自血漿中之 HIV-1 RNA的PR-和RT-密碼序歹ij的嵌合型病毒。可藉著任何 此項技藝中已知的細胞存活測定，判定嵌合型病毒對所有 目前可利用的瞄準轉移感染基因之產物的抗-病毒製劑（例 如proRT及/或PR抑制劑）的感受性。例如，可在容許高試樣 輸貫量的自動化系統中，使用以溴化MT4細胞-3-(4,5-二甲 基p墓岐-2-基）-2,5-聯苯基四唆鑌為基礎的細胞存活測定。 可在單一 PR-RT-抗病毒圖（Antivirogram)中，以圖解之方式 展示對所有抗-病毒製劑，像是RT和PR抑制劑之抵抗力的 輪廓。 可使用其他評估病毒對熟諳此藝者已知的抗-病毒藥物 之表現型感受性的測定。參見，例如Shi和Mellors，1997， φ Antimicrob Agents Chemother. 41(12):2781-85 ; Gervaix等人， 1997, Proc· Natl· Acad. Sci· U.S.A· 94(9):4653-8，將其全文以引 用的方式併入本文中。 在另一個具體實施例中，藉著在抗-病毒治療的存在下 ，測定該抗-病毒治療之標靶的活性，來判定病毒對利用 抗-病毒治療之治療的感受性。在一個具體實施例中，該 病毒為HIV，而抗-病毒治療為蛋白酶抑制劑，且抗-病毒 治療之標靶為HIV蛋白酶。參見，例如美國專利第5,436，131 -56- 200303362 (52) 發明說明續頁 號、6，103,462號，將其全文以引用的方式併入本文中。 4.6使表現型輿基因项感受性發生關連- 可使用此項技藝中已知的任何方法，判定突變是否與降 低病毒對抗-病毒治療的感受性有關連，並因此是根據本 發明之RAM。在一個具體實施例中，使用P值來判定該關 連的統計顯著性，使得P值越小，該測量值就越顯著。P 值最好是小於0.05。更佳的是，P值小於〇.〇1。可藉著任何 熟諳此藝者已知的方法來計算P值。在一個具體實施例中 ，使用Fisher’s精密檢定來計算P值。參見，例如David Freedman, Robert Pisani & Roger Purves, 1980, STATISTICS, W.W. Norton, New York o

在一個具體實施例中，與沒有突變之試樣數目相比較， 分析出有哭變之試樣的數目，具有大於或小於倍的IC5〇 倍數變化。可建構2x2的表，並使用Fisher’S精密檢定計算P 值（參見實例5)。可將小於〇 〇5或〇 〇1之p值歸類為在統計學 上顯著的。 4·7判足對-抗-癌^治瘙的感争性 在另一項觀點中，本發明提供判定病毒對抗-病毒治療 之感文性的方、去。可確認與抵抗力有關的突變（RAMs)，並 使/、人降-病’對抗_病毒治療的感受性發生關連，如同 在上又罘4·3-4·6章中的描述。可藉著此項技藝中已知的任 何方法，檢測出現在病毒中的Ram，例如，如同在上文第 4.4早、勺。RAM出現在病毒中，表示該病毒在降低 對抗-病毒治療々；威爲地 μ 士 义慼文性上，有增加的可能性。在一個具 200303362 (53) 發明說明續頁_

體實施例中，該病毒為人類免疫缺陷病毒（HIV)。在另一 個具體實施例中，該病毒為人類免疫缺陷病毒第1型 (HIV-1)。在另一個具體實施例中，該抗-病毒治療為蛋白 酶抑制劑。蛋白酶抑制劑之實例包括，但不限於沙p奎納維 、利托納維、英地納維、娜芙維亞、安普那韋和囉匹那韋 。在一個具體實施例中，該蛋白酶抑制劑係選自由沙ρ奎納 維、利托納維、英地納維、娜芙維亞、安普那章和囉匹那 韋所组成之群。在另一個具體實施例中，該蛋白酶抑制劑 為囉匹那韋。 在另一個具體實施例中，本發明提供判定HIV是否在降 低對利用蛋白酶抑制劑之治療上，具有增加之可能性的方 法，包括在該HIV的蛋白酶或在該HIV之編碼蛋白酶的核酸 中，在該蛋白酶之胺基酸序列的胺基酸位置20、33、34、 43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、

82、84或89處，檢測與降低對利用該蛋白商每抑制劑治療的 感受性有關之突變的存在或缺乏，其中該突變的出現，表 示該HIV在降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性上， 與沒有該突變的HIV，例如野外型或參考HIV相比較，具有 增加的可能性，其限制條件為該突變不是K20M、K20R、 M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T 或I84V。在一個具體實施例中，在該HIV的蛋白酶中檢測 到突變。在另一個具體實施例中，在該HIV之編碼蛋白酶 的核酸中，檢測到突變。 在另一個具體實施例中，與降低對利用該蛋白酶抑制劑 -58- 200303362

發明說明續頁 治療的感受性有關的突變，是在該蛋白酶之胺基酸序列的 胺基酸位置 20、33、34、46、50、54、63、66、73、74、76 、79、82、84或89處，其限制條件為該突變不是K20M、K20R 、L33F、L33M、K43T、M46I、M46L、I50V、I54A、I54L、I54M 、I54S、I54T、I54V、L63P、G73A、G73S、G73T、T74S、V82A 、V82F、V82I、V82S、V82T或 I84V。

在另一個具體實施例中，與降低對利用該蛋白酶抑制劑 治療的感受性有關的突變，是在該蛋白酶之胺基酸序列的 胺基酸位置10、11、32、47、53、71或95處，其限制條件 為該突變不是V32I也不是I47V。在一個具體實施例中，與 降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性有關的突變，係 選自由：L10F、F53L和A71L所組成之群。

在另一個具體實施例中，與降低對利用該蛋白酶抑制劑 治療的感受性有關的突變，係選自由：K20I、M46V、I50L 、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I

、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、 K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A 、P79D、P79E、L89I和L89M所組成之群。在另一個具體實 施例中，該突變係選自由：K20I、M46V、I50L、L63T、I84A 、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50V、I54M、G73C 、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和 L89M所 組成之群。在另一個具體實施例中，該突變係選自由： K20I、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D 、E34K、E34Q、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、 -59- 200303362 _ (55) 發明說明續頁 P79E、L89I和L89M所組成之群。

在另一項觀點中，本發明提供判定HIV是否在降低對利 用第一個蛋白酶抑制劑治療的感受性上，具有增加之可能 性的方法，包括在該HIV的蛋白酶中，檢測與降低對利用 第二個蛋白酶抑制劑治療的感受性有關之突變的存在或 缺乏，其中該突變的出現，表示該HIV在降低對利用該第 一個蛋白酶抑制劑治療的感受性上具有增加的可能性。在 一個具體實施例中，第一個蛋白酶抑制劑是囉匹那韋。在 另一個具體實施例中，第二個蛋白酶抑制劑是安普那韋。 在另一個具體實施例中，在蛋白酶中的突變是在該蛋白酶 之胺基酸序列的胺基酸位置11、32、33、34、43、46、47 、48、50、54、58、71、76、79、82、84或 95處，其限制條 件為該突變不是 V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M 、V82A或 I84V。 在另一個具體實施例中，本發明提供判定被HIV感染之 個體，是否在降低對利用第一個蛋白酶抑制劑治療的感受 性上，有增加之可能性的方法，包括在得自該個體之試樣 中，在HIV蛋白酶之胺基酸序列的胺基酸位置11、32、33 、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、84 或95處檢測與降低對利用第二個蛋白酶抑制劑治療的感 受性有關之突變的存在或缺乏，其中該突變的出現，表示 該個體在降低對利用第一個蛋白酶抑制劑治療的感受性 上具有增加的可能性，其限制條件為該突變不是V32I、 M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、V82A或 I84V。 -60- 200303362 (56) 發明說明續頁

在另一項觀點中，本發明提供判定被病毒感染之個體對 抗-病毒治療之感受性的方法。可確認與抵抗力有關的突 變（RAMs)，並使其與降低病毒對抗-病毒治療的感受性發 生關連，如同在上文第4.3-4.6章中的描述。可藉著此項技 藝中已知的任何方法，在出現在得自該個體之試樣中的病 毒中，檢測RAM的存在，例如，如同在上文第4.4.2章中討 論的。RAM出現在病毒中，表示該個體在降低對抗-病毒 治療之感受性上，有增加的可能性。在一個具體實施例中 ，該病毒HIV。在另一個具體實施例中，該病毒為HIV-1 。在另一個具體實施例中，該抗-病毒治療為蛋白酶抑制 劑。蛋白酶抑制劑之實例包括，但不限於沙p奎納維、利托 納維、英地納維、娜芙維亞、安普那韋和囉匹那韋。在一 個具體實施例中，該蛋白酶抑制劑係選自由沙喳納維、利 托納維、英地納維、娜芙維亞、安普那章和囉匹那韋所組 成之群。在另一個具體實施例中，該蛋白酶抑制劑為囉匹 那韋。 在另一個具體實施例中，本發明提供判定被HIV感染之 個體是否在降低對利用蛋白酶抑制劑治療的感受性上具 有增加之可能性的方法，包括在得自該個體之試樣中，在 HIV蛋白酶之胺基酸序列的胺基酸位置20、33、34、43、46 、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84 或8 9處，檢測與降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性 有關之突變的存在或缺乏，其中該突變的出現，表示該個 體在降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性上，與被沒 -61 - 200303362 發明說明續頁:. • . · · - (57) 有該突變之HIV，例如野外型或參考HIV感染的個體相比較 ，具有增加的可能性，其限制條件為該突變不是K20M、

K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F 、V82T或I84V。在一個具體實施例中，在該HIV的蛋白酶 中檢測到突變。在另一個具體實施例中，在該HIV之編碼 蛋白酶的核酸中，檢測到突變。 在另一個具體實施例中，本發明提供判定蛋白酶抑制劑 之治療，對被HIV感染之個體的效力的方法’包括在得自 該個體的試樣中，在HIV蛋白酶之胺基酸序列的胺基酸位 置 20、33、34、46、50、54、63、66、73、74、76、79、82

、84或89處，檢測與降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感 受性有關之突變的存在或缺乏，其中該突變的出現，表示 該個體對利用該蛋白酶抑制劑之治療，有降低的感受性， 其限制條件為該突變不是K20M、K20R、L33F、L33M、K43T 、M46I、M46L、I50V、I54A、I54L、I54M、I54S、I54T、I54V

、L63P、G73A、G73S、G73T、T74S、V82A、V82F、V82I、 V82S、V82T或 I84V。 在另一個具體實施例中，與降低對利用該蛋白酶抑制劑 治療的感受性有關的突變，是在HIV蛋白酶之胺基酸序列 的胺基酸位置10、11、32、47、53、71或95處，其限制條 件為該突變不是V32I也不是I47V。在一個具體實施例中， 與降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性有關的突變 ，係選自由：L10F、F53L和A71L所組成之群。 在另一個具體實施例中，與降低對利用該蛋白酶抑制劑 -62- 200303362 (58) 發明說明續頁 治療的感受性有關的突變，係選自由：K20I、M46V、I50L 、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I 、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、 K55R、 Q58E、 G73C、 G73T、 T74A、 T74P、 T74S、 L76V、 P79A 、P79D、P79E、L89I和L89M所組成之群。在另一個具體實 施例中，該突變係選自由·· K20I、M46V、I50L、L63T、I84A 、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50V、I54M、G73C 、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和 L89M所 組成之群。在另一個具體實施例中，該突變係選自由： K20I、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D 、E34K、E34Q、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、 P79E、L89I和L89M所組成之群。 4 · 8建構演具法 在一項觀點中，本發明提供建構使有關於病毒之基因組 資料與有關於病毒之表現型資料發生關連的演算法的方 法。在一個具體實施例中，該表現型資料與病毒對抗-病 毒的感受性有關。在另一個具體實施例中，該抗-病毒治 療為抗-病毒化合物。在另一個具體實施例中，該抗-病毒 化合物為蛋白酶抑制劑。在另一個具體實施例中，該蛋白 酶抑制劑為囉匹那韋。 在一個具體實施例中，建構演算法的方法包括創造使有 關於一組病毒的基因型資料，與有關於該組病毒的表現型 資料發生關連的規則或規則們。 在一個具體實施例中，練習資料組包括在一組被集合的 -63- 200303362 (59) 發明說明續頁 病毒中，有關於每個病毒的基因型和表現型資料。可使用 此項技藝中已知的任何方法，收集與病毒有關的基因型資 料。上文提供了收集這類資料之方法的實例。可使用此項 技藝中已知的任何方法，收集與病毒有關的表現型資料。 上文亦提供這類方法的實例。在一些具體實施例中，練習 資料組包括上述的一或多個RAMs。在一個具體實施例中 ，每個基因型資料是在這組病毒中，病毒的全部或部分蛋 白質。在另一個具體實施例中，在練習資料組中的每個基 因型資料，是相對於在參考病毒中之參考蛋白質，在由病 毒編碼之蛋白質中的單一胺基酸改變。在另外的具體實施 例中，基因型包括在病毒蛋白質中的2、3、4、5、6或更 多個胺基酸改變。在另一個具體實施例中，該病毒為HIV ，而該蛋白質為HIV蛋白酶。在一個具體實施例中，該病 毒為HIV-1。在另一個具體實施例中，該參考蛋白質為得 自NL4-3 HIV的蛋白酶。 在一個具體實施例中，在練習資料組中的每個表現型資 料是在這組病毒中，病毒對抗-病毒治療的感受性。在一 個具體實施例中，該抗-病毒治療是抗-病毒化合物。在另 一個具體實施例中，該抗-病毒化合物為蛋白酶抑制劑。 在另一個具體實施例中，該蛋白酶抑制劑為囉匹那韋。在 一個具體實施例中，以在病毒相對於參考病毒之感受性上 的改變，來測量感受性。在另一個具體實施例中，以在病 毒相對於參考病毒之IC5G上的改變，來測量感受性。在另 一個具體實施例中，以在IC5G上之倍數變化來表示在IC50 -64- 200303362 _ (60) 發明說明續頁 上的改變。在一個具體實施例中，該病毒為HIV。另一具 體實施例中，該病毒為HIV-1。在另一個具體實施例中， 參考 HIV為 NL4-3 HIV。

可以此項技藝中已知的任何方式來表達或組織化在練 習資料組中的基因型和表現型資料。在一個具體實施例中 ，以圖表之形式來展示資料，例如，如同在圖2和7中所示 的。在這類型的表現中，y-軸代表在資料組中，相對於參 考病毒，在病毒IC5G上的倍數變化。X-軸代表在該資料組 中有突變之病毒的數目。點的位置代表在抗-病毒治療處 理中，病毒所具有的突變數目和倍數變化兩者，兩者均相 對於參考品系來進行測量。在另一個具體實施例中，以圖 表之形式來展示在練習資料組中的基因型和表現型資料 ，例如，如同在圖2中所示的。

在一項觀點中，以公式表示使在練習資料組中之基因型 資料與表現型資料發生關連的演算法。在一個具體實施例 中，定義表現型截止點。在另一個具體實施例中，表現型 是對抗-病毒治療的感受性。在另一個具體實施例中，表 現型是相對於參考病毒，在對抗-病毒治療之敏感性上的 改變，且截止點是將在病毒或病毒族群定義為在表現型上 是對抗-病毒治療有抵抗力的（’’PT-R”）之值以上，並在將病 毒或病毒族群定義為在表現型上是對抗-病毒治療敏感的 ("PT-S”）之值以下的值。在另一個具體實施例中，該截止 點是超過參考病毒之IC5G 2-倍、5-倍、10-倍、15-倍、20-倍、30-倍、40-倍、50-倍或100-倍的。在另一個具體實施 -65- 200303362 (61) 發明說明續頁 例中，表現型截止點是按照上文定義的臨床截止值。在另 一個具體實施例中，該病毒為HIV，且抗-病毒治療是利用 蛋白酶抑制劑的治療。在另一個具體實施例中，該蛋白酶 抑制劑為囉匹那章。

在另一個具體實施例中，使用表現型截止點來定義基因 型截止點。在一個具體實施例中，這藉著使在練習資料組 之病毒中的突變數目，與病毒之表現型感受性發生關連來 進行。例如，這可使用類似在圖2中的圖表，按照上文的 討論來進行。選擇基因型截止點，使得大多數具有超過在 資料組中之突變數目的病毒，在表現型上是有抵抗力的 (”PT_R’f)，而大多數具有較少突變數目的病毒，在表現型 上是敏感的（nPT-S”）。藉著定義，在練習資料組中具有等 於或大於基因型截止值的病毒，在基因型上是對抗-病毒 治療有抵抗力的（nGT-Rn)，而在練習資料組中，具有少於 基因型截止值之突變數目的病毒，在基因型上是對抗-病 毒治療敏感的（’fGT-Sn)。因此，在一個具體實施例中，選 擇基因型截止點，在練習資料組中產生最大百分比的病毒 ，其在表現型上是有抵抗力的，且在基因型上亦是有抵抗 力的（nPT_R，GT-R”），或在表現型上是敏感的，且在基因 型上亦是敏感的（’’PT-S，GT-S”）。 雖然該簡單演算法可提供在練習資料組中，在基因型和 表現型資料之間關係的有用近似值，但在大多數的案例中 ，將有重大數量的品系，其在基因型上是敏感的，但在表 現型上是有抵抗力的（’’GT-S，PT-R”），或在基因型上是有 -66- (62) (62)200303362 發明說明續頁 抵抗力的，但在表現型上是敏感的（，，gt_r，pT_s,，），如同 在圖2和7中所示的。這些不協調的結果，是演算法不正確 的測量。因此，在一些具體實施例中，進一步修改演算法 ，以便降低在練習資料組中不協調結果的百分比。在一個 具體實施例中，藉著在由所測試之演算法考量的單一位置 處，從資料組中移除每個與包括含有野外型之突變混合物 的病毒族群相符的資料點，來進行之。如同在圖3和實例3 中斤丁的坆對於降低PT-S，GT-R結果的數目有影響，因 此減少了不協碉結果的整體百分比，並因此改善了演算法 對練習資料組的適用性。 在另一個具體實施例中，藉著對在練習資料、组中觀察到 的-或多個突變指派不同的加重值，降低不協調結果的百 分比。不包括該步驟的演算法，假設在練習資料組中的每 個突變同等地促成症主七产主、 成病母或病母 < 族群對抗_病毒治療的整 骨豆抵抗力0在許多妥/丨士 、上 木】中’這將不是真的。圖4顯示在練 習資料組中之突變的眘彳丨 . 、 欠的貫例，它幾乎總是與對抗-病毒治療 之表現型抵抗力有關遠 » 、 關連。也就疋說，幾乎每個具有突變的 病毒，在表現型上撕具孤# 、 P疋對抗-揭毒治療有抵抗力的，即使 那些品系總共僅且右一 $ am 一 一 〃；兩個笑變。在-個具體實施例中 泛*員大·交疋加重的” ^ # f的 也吨疋指派增加的突變分數。可 對突變指派例如2、3、4、$ ^ 刀默可 3 4 5、6、7、§或更多的加f枯 例如，被指派2之加重值的突變，將被視 ：。 個突變。亦可指派分數的加重值。在另一：：有兩 ，可指派小於1，或小# 、且只她例中 义J於0的值，其中該突變 又係與％加病毒 -67- 200303362 (63) 發明說明續頁 對抗-病毒治療之敏感性有關。 熟諳此藝者將瞭解有一種交易，涉及對某些突變指派增 加的加重值。因為增加突變的加重值，可能增加GT-R，PT-S 不協調結果的數目。因此，對突變指派之加重值過大，可 能增加演算法的整體不協調性。因此，在一個具體實施例 中，對突變所指派之加重值，平衡了在GT-S，PT-R結果上 的降低，在GT-R，PT-S結果上的增加。

在另一個具體實施例中，將在練習資料組中不同突變彼 此的交互作用視為演算法中的系數。例如，可能發現二或 多個突變協同作用，也就是在病毒中突變的同時發生，比 以每個與其他獨立之突變的影響為基礎所預測到的，更明 顯地助成病毒的柢抗力。或者，可能發現在病毒中二或多 個突變的同時發生，比從每個突變獨立出現之貢獻中所預 期到的，更不明顯地助成病毒的抵抗力。再者，可發現二 或多個突變，比獨立的突變更常一起出現。因此，在一個 具體實施例中，將一起加重一起出現的突變。例如，將只 有一個的突變指派為1或更高的加重值，而將其他突變或 突變們指派為0之加重值，以避免增加GT-R，PT-S不協調 結果的數目。 在另一項觀點中，可使用表現型截止點來定義基因型截 止點，藉著使在資料組之病毒中的突變數目和，種類與病毒 的表現型感受性發生關連。突變種類的實例包括，但不限 於主要的胺基酸突變、二級胺基酸突變，其中保留在多肽 上之靜電荷的突變，以及不改變在特定位置處胺基酸之極 -68- 200303362 (64) 發明說明續頁 性、忌水性或親水性的突變。對熟諳此藝者而言，以在本 又中的教學為基礎，在本發明範圍内之其他種類的突變將 是明顯的。 在一個具體實施例中，建構演算法，需要一或多種突變 的系數。在另一個具體實施例中，需要一或多種突變之最 少數目的演算法系數。在另一個具體實施例中，需要主要 或一級人變之最少數目的演算法系數。在另一個具體實施 例中’需要主要和二級突變與其他突變之組合，作為演算 法中的系數。例如，可能發現具有特殊突變組合的病毒， 是對抗-病毒治療有抵抗力的，而僅具有該組合中任何突 變’或具有不是該組合之部分的其他突變之病毒，則是對 該抗-病毒治療沒有抵抗力的。 可使用例如上文討論的方法來設計演算法，達到任 要的結果。在一個具體實施例中，設計演算法，使整體協 調性（PT-R，GT-R和PT_S，GT-S組之百分比的總和皈: l〇〇-(PT-S，GT-R+PT-R，GT-S組的百分比））達到最大。在L 些具體實施例中，整體協調性超過75%、8〇%、85%、卯％ 或95%。在一個具體實施例中，設計演算法，使ρτ^，〇丁 ^ 結果的百分比減至最小。在另一個具體實施例中，設計清 算法，使PT-S，GT-R結果的百分比減至最小。在另—個具 體實施例中，設計演算法，使pT_s，GT_s結果的百分比逵 到最大。在另-個具體實施例中，設計演算 GT-R結果的百分比達到最大。 ’ 在建構演算法期間的任何時候，或在 # <後，可進一 -69- 200303362 _ (65) 發明說明續頁

步測試第二個資料組。在一個具體實施例中，第二個資料 組由並未包括在練習資料組中的病毒所組成，也就是說， 第二個資料組是無經驗的資料組。在另一個具體實施例中 ，第二個資料組含有一或多個在練習資料組中的病毒，和 一或多個不是在練習資料、組中的病毒。對第二個資料組使 用演算法，特別是無經驗的資料組，容許評估該演算法的 預測能力。因此，在一個具體實施例中，使用第二個資料 組來評估演算法的精確性，並按照上述修改演算法的規則 ，以便改善其精確性。在另一個具體實施例中，使用重複 的方法來創造演算法，藉此測試演算法，然後重複地修改 ，直到達到想要程度的精確性為止。 4.9使用演算法來預測病毒的感受性

在另一項觀點中，本發明亦提供使用本發明之演算法， 以病毒之基因型為基礎，預測病毒或病毒的衍生物，對抗 -病毒治療之表現型感受性的方法。在一個具體實施例中 ，該方法包括在病毒或病毒的衍生物中，檢測一或多個 RAMs的存在或缺乏，將演算法的規則應用在所檢測到的 RAMs上，其中滿足該演算法之規則的病毒，是在基因型 上對該抗·病毒治療有抵抗力的，而不滿足該演算法之規 則的病毒，是在基因型上對該抗-病毒治療敏感的。在另 一個具體實施例中，該方法包括在病毒或病毒的衍生物中 ，檢測一或多個RAMs的存在或缺乏，將演算法的規則應 用在所檢測到的RAMs上，其中等於或大於基因型截止分 數的分數，表示該病毒是在基因型上對該抗-病毒治療有 -70- 200303362 _ (66) 發明說明續頁 抵抗力的，而低於基因型截止分數的分數，則表示該病毒 是在基因型上對該抗-病毒治療敏感的。 可對任何病毒性疾病使用本發明之演算法，其中該抗-病毒藥物的感受性是令人關切的事，如同上文在第4.4.1 章中討論的。在某些具體實施例中，可使用本發明之測定 來判定逆轉錄病毒對抗-病毒藥物的感受性。在一個具體 實施例中，該逆轉錄病毒是HIV。該病毒較好是HIV-1。

本發明之抗-病毒製劑可以是任何有效對抗病的治療。 這對於本發明之實施是有用的，例如，可用來瞭解在本發 明之藥物感受性測試中測試之病毒的結構、生命週期和遺 傳元件。這些將是熟諳此藝者已知的，並提供例如，可由 抗-病毒製劑瞄準的關鍵性酵素和其他分子。本發明之抗-病毒製劑的實例包括，但不限於核甞逆轉錄酶抑制劑，像 是AZT、ddl、ddC、d4T、3TC、濟而鋼，核甞酸逆轉錄酶 抑制劑，像是泰諾福韋，非-核铝逆轉錄酶抑制劑，像是 奈維拉平、希寧、地拉維定，融合抑制劑，像是T-20和T-1249 ，以及蛋白酶抑制劑，像是沙p奎納維、利托納維、英地納 維、娜芙維亞、安普那韋和囉匹那韋。 在本發明的一些具體實施例中，該抗-病毒製劑針對逆 轉錄病毒。在某些具體實施例中，該抗-病毒製劑是蛋白 酶抑制劑，像是沙p奎納維、利托納維、英地納維、娜芙維 亞、安普那韋和囉匹那韋。在一個具體實施例中，該抗-病毒製劑是囉匹那韋。 某些與降低對利用抗-病毒製劑之治療的感受性有關的 -71 - 200303362 _ (67) 發明說明續1 突變，是此項技藝中已知的。參見，例如Kempf等人，2001， J. Virol. 75:7462-69。可藉著在上文第4.3-4.8章中描述的方法 ，來判定其他的突變。例如，表1提供了與降低對囉匹那 韋之感受性有關的突變的一覽表。 4.10 使用演算法來預測抗-病毒治痊對個體的效力

在另一項觀點中，本發明亦提供使用本發明之演算法， 以病毒對抗-病毒治療之基因型為基礎，預測該抗-病毒治 療對被病毒感染之個體的效力的方法。在一個具體實施例 中，該方法包括在病毒或病毒的衍生物中，檢測一或多個 RAMs的存在或缺乏，將演算法的規則應用在所檢測到的 RAMs上，其中滿足該演算法之規則的病毒，是在基因型 上對該抗-病毒治療有抵抗力的，而不滿足該演算法之規 則的病毒，是在基因型上對該抗-病毒治療敏感的。在另 一個具體實施例中，該方法包括在病毒或病毒的衍生物中 ，檢測一或多個RAMs的存在或缺乏，將演算法的規則應 用在所檢測到的RAMs上，其中等於或大於基因型截止分 數的分數，表示該病毒是在基因型上對該抗-病毒治療有 抵抗力的，而低於基因型截止分數的分數，則表示該病毒 是在基因型上對該抗-病毒治療敏感的。 如同在上文第4.4.1章中描述的，可對任何病毒性疾病使 用本發明之演算法，其中該抗-病毒藥物的感受性是令人 關切的事，且本發明之抗-病毒製劑可以是任何對病毒有 效的治療。在某些具體實施例中，使用本發明之測定來判 定逆轉錄病毒對抗-病毒藥物的感受性。在一個具體實施 -72- 200303362 _ (68) 發明說明續頁 例中，該逆轉錄病毒為HIV。該病毒較好是HIV-1。在本發 明的一些具體實施例中，該抗·病毒製劑是針對逆轉錄病 毒。在某些具體實施例中，該抗-病毒製劑是蛋白酶抑制 劑，像是沙p奎納維、利托納維、英地納維、娜芙維亞、安 普那韋和囉匹那韋。在一個具體實施例中，該抗-病毒製 劑是囉匹那章。

如同上文在第4.9章中描述的，可從此項技藝中獲得與 降低對利用抗-病毒製劑之治療的感受性有關的突變，或 可藉著在上文第4.4-4.8章中描述的方法來判定。 在一些具體實施例中，本發明提供在被病毒感染，且正 接受或先前曾經接受相同或不同的抗-病毒治療之個體中 ，監視抗-病毒治療之效力的方法，包括在該個體的試樣 中，檢測與降低對利用該抗-病毒治療之治療的感受性有 關之胺基酸殘基的存在或缺乏，其中該殘基的出現與降低 對利用該抗-病毒治療之治療的感受性有關連。

4.11使對一種抗-病毒治療的感受性與對另一種抗-病毒 治療的感受彳生發生關連 在另一項觀點中，本發明提供使用本發明之演算法，以 病毒對不同的抗-病毒治療之基因型感受性為基礎，預測 抗-病毒治療對該病毒之效力的方法。在一個具體實施例 中，該方法包括在病毒或病毒的衍生物中，檢測一或多個 與對抗-病毒治療之抵抗力有關連的突變的存在或缺乏， 並將本發明之演算法的規則應用在所檢測到的突變上，其 中滿足該演算法之規則的病毒，是在基因型上對該抗-病 -73- 200303362 (69) 發明說明續頁

毒治療有抵抗力的，而不滿足該演算法之規則的病毒，是 在基因型上對該抗-病毒治療敏感的。在另一個具體實施 例中，該方法包括在病毒或病毒的衍生物中，檢測一或多 個與對抗-病毒治療之抵抗力有關連的突變的存在或缺乏 ，將演算法的規則應用在所檢測到的突變上，其中等於或 大於基因型截止分數的分數，表示該病毒是在基因型上對 不同的抗-病毒治療有抵抗力的，而低於基因型截止分數 的分數，則表示該病毒是在基因型上對不同的抗-病毒治 療敏感的。在另一個具體實施例中，這兩個抗-病毒治療 影響相同的病毒蛋白質。在另一個具體實施例中，這兩個 抗-病毒治療都是蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑的實例包 括，但不限於沙喹納維、利托納維、英地納維、娜芙維亞 、安普那韋和囉匹那韋。在另一個具體實施例中，兩個抗 •病毒治療之一是囉匹那韋。在另一個具體實施例中，與 對一個蛋白酶抑制劑之抵抗力有關的突變，亦與對另一個 蛋白酶抑制劑的抵抗力有關。在下文的實例8中，提供這 類突變的實例。 5·宜J列 提供下列的實例，說明本發明的某些觀點，且並非企圖 限制其主題。 5.1 實例1 :分析蛋白質試樣，以便確認輿抵抗力有關的 突變 本實例證實分析患者試樣的方法，以便確認與增加或降 低對諸如囉匹那韋之類的蛋白酶抑制劑之感受性有關的 -74- 200303362 (70) 發明說明績買 突變。

為了判定在HIV-1品系之蛋白酶序列與其對利用囉匹那 韋之治療的感受性之間的關係，在基因型上和在表現型上 ，分析2038個患者血漿試樣的練習資料組。使用PHENO-SENSETM (Virologic，South San Francisco, CA) HIV測定，進行表 現型測定（Petropoulos等人，2000，Antimicrob. Agents Chemother. 44:920-928 ；美國專利第 5,837,464 號和 6,242,187 號）。從被 HIV-1感染的患者中收集血漿試樣。移除得自相同患者的 重覆試樣，以避免可能起因於突變之獨特組合的偏見。對得 自患者試樣的HIV-1，獲得囉匹那章的IC5〇值。將其與囉匹 那韋對NL4-3(GenBank登錄編號AF324493)參考病毒品系的 IC5〇值相比較。以在囉匹那韋之50%抑制濃度（IC5〇)上的’’倍 數變化π (或對數倍數變化），來表示表現型資料。藉著以 囉匹那韋對NL4-3 (GenBank登錄編號AF324493)參考病毒品 系的IC5〇，除以囉匹那韋對得自患者血漿試樣之HIV-1的 ic5〇，來計算倍數ic5〇值。 為了定義與降低對囉匹那韋之感受性有關連的基因型 變化，分析在每個患者試樣中之HIV-1的完整胺基酸序列 。將突變與NL4-3 (GenBank登錄編號AF324493)參考品系的 蛋白酶序列相比較。至少有一個試樣，在99個胺基酸位置 的88個中具有突變（表2和3)。在練習資料中的2038個試樣 中，在1%或更多的試樣（也就是20個試樣以上）中，有61個 位置發生突變，而在20或較少的試樣（少於1%的試樣）中， 剩下的38個位置亦具有突變。在表2和3中列舉該資料。表 -75- 200303362 (71) 發明說明續頁 - 1 k供與降低對囉匹那韋之感受性有關的突變一覽表。利 用2038個試樣的完整練習資料組，或利用1418個試樣的資_ 料組（以*表示），在移除沒有任何與蛋白酶抑制劑有關之 主要哭^ ’且對任何蛋白酶抑制劑沒有大於2之π，❹倍數變 · 化（"FC”）（貫例5)的試樣之後，獲得在表1中的資料。用來 计鼻P值的方法’描述在實例5中。 5·2貫例2_·囉匹那j感受性與在HIV-1蛋白酶中之突審、數 目的關連 · 本實例證實使在HIV-1的蛋白酶基因中，均等-加重的突 變數目與其對囉匹那韋之感受性發生關連的簡單演算法 是不精確的。 按照在實例1中的描述，分析2038個患者血漿試樣的資 料組，並確認與降低對囉匹那韋之感受性有關的突變。以 出現在患者血漿試樣中之HIV-1蛋白酶中的突變數目為函 數，分析對囉匹那韋的表現型感受性（囉匹那韋之倍數變 化）。藉著以囉匹那韋對NL4-3 (GenBank登錄編號AF324493) φ 參考病毒品系的IC5〇，除以囉匹那韋對得自患者血漿試樣 之HIV-1的IC5G，計算每個試樣的倍數變化。藉著定出在每 個患者試樣中出現之HIV-1蛋白酶的序列，並相對於NL4-3 (GenBank登錄編號AF324493) HIV的序列，判定序列變化， 獲得基因型資料。在序列識別1號（圖12A)中提供NL4-3蛋白 酶的胺基酸序列，並在序列識別2號（圖12B)中提供NL4-3 : 蛋白酶基因的核酸序列。 ， 圖2顯示對囉匹那韋的抵抗力（對數的囉匹那韋倍數變 -76- 200303362 (72) 發明說明續頁 化）’以與抵抗力有關的突變數目為函數。處理帶有胺基 酸混合物的試樣，作為突變種。在該分析中使用的突變， 是在 Kempf研究（Kempf等人，2001，J. Virol· 75:7462-69)中確認 的那些。為了清楚地證實由Kempf提出之演算法的缺點， * 其企圖以在HIV蛋白酶中已確認之u個位置處觀察到的突 變數目為基礎，預測對囉匹那韋的表現型感受性，將該分 析之圖表分成四個象限。Kempf研究假定如果在這n個位 置處有5個或更少的突變，則mv對利用囉匹那章的治療是 _ 敏感的，但如果這些突變的數目是6個或更多時，便預測 病毒對囉匹那章之治療是有抵抗力的。下左的象限相當於 在其蛋白酶中，含有5個或更少突變的那些病毒，且它們 在表現土和在基因型上，是對囉匹那韋敏感的 。在該象限中，發現Π09個，或2038個試樣中的54%。上 右的象限相當於含有6個或更多突變的那些病毒，且在表 現型和在基因型上，是對囉匹那韋有抵抗力的(pT_R， GT-R)(對數的囉匹那韋倍數變化η)，並含有奶個或的_ 試樣。然而，另兩個象限相當於，，例外，，，其中以基因型（ 突變的數目）為基礎，預期病毒是易感受％，但在表現型 上（以對數的囉匹那韋倍數變化為基礎）是有抵抗力的（左 上，PT-R，GT-S)，或其中以基因型為基礎，預期病毒是有 抵抗力的仁在表現型上（以對數的囉匹那韋倍數變化為 基礎）卻是易感受的（右下，PT-S，GT-R)。 . 圖2_不與預期的相反，在上左（PT-R，GT-S)象限中發現· 182個試樣，相當於開始組的9%，其具有2至5個突變，且顯’ -77- 200303362 v ; 發明說明續頁 π出比參考品系之1C5〇更高10-至100-倍那樣多的扣50值（對 數的倍數變化為：U2)。相反的，一些具有6、7或8個突變的 病毒，對囉匹那章並沒有顯示出任何比…丁品系更大的抵抗· 力，所以出現在下右（PT-S，GT-R)象限中（11〇個試樣（5%》。·‘ 因此，從圖2中證實，對囉匹那韋之感受性與在犯乂一蛋 白酶中之突變數目的簡單關連性一點也不精確。 5,3 不協調組的大小 本實例澄實可藉著在至少一個與囉匹那韋抵抗力有關 _ 之位置中，含有胺基酸混合物之試樣的存在，來解釋在圖 2中看到的PT-S，GT-R資料。 使用實例2的簡單演算法，在上左（"pT-R，GT_S，，）象限產 生大約9%的結果’並在下右（”pT_s，GT_R”）象限產生5%的 結果（圖2)。這些不協調的結果，至少一部分可能是歸因 於患者的試樣含有病毒品系的混合物，該病毒品系所帶有 的蛋白酶，在一或多個與降低對囉匹那韋之感受性有關的 位置處，具有胺基酸殘基的混合物。當從分析中排除這些 鲁 試樣（也就是含有野外型和突變種兩者之混合物的那些試 樣）之後’ PT-S ’ GT-R的結果降低2%，而而pT-R，GT_S結果 的數目仍維持在相同的10%(圖3)。在該修改分析中，使用 1402個試樣。 未與任何特定的理論結合，可藉著下列的假說來解釋。 以含有病母品系之混合物的研究處理試樣作為突變種。因 二 此，可能在處理試樣中，有含有1〇%突變病毒（含有與抵抗 · 力有關的突變）和90%未突變病毒或參考病毒作為突變種 -78- 200303362 _ (74) 發明說明續頁 的結果。因為突變病毒的小族群，故整體的試樣可能不像 如果試樣含有100%突變種將預期到的一樣，顯示出那樣 多的表現型抵抗力。然而，為了基因型的目的，處理試樣 成為含有突變的。因此，這類試樣可能導致觀察到比對具 有100%突變種之試樣所預期到的，更低的表現型抵抗力 。該結果在資料中，將落在下右象限，其中該族群在基因型 上是有抵抗力的（GT-R)，但在表現型上是敏感的（PT-S)。

移除在一或多個與降低對囉匹那韋之感受性有關的位 置處，含有胺基酸之混合物的試樣，清楚地降低了 PT-S， GT-R結果，藉此證實在這兩者之間的連結。 5.4實例4 : PT-R，GT-S不協調組的分析 本實例證實某些突變對囉匹那韋的抵抗力，比其他突變 更有貢獻。 在圖2之PT-R，GT-S象限中的試樣，相當於在與降低對囉 匹那韋之感受性有關的HIV蛋白酶中，具有5個或更少突變 的病毒。這些病毒在表現型上是有抵抗力的（具有10以上 的倍數變化），但預期在基因型上是敏感的（因為它們具有 5個或更少的突變）。未與任何特定的理論結合，可藉著某 些突變對囉匹那韋之抵抗力有比其他突變更顯著的貢獻 來解釋之。這些突變中有一些，甚至可賦與像其他4或5 個與囉匹那韋有關之突變一樣多的對囉匹那章之抵抗力 。當這些較顯著的突變與其他1、2、3或4個與囉匹那韋有 關之突變一起出現時，所賦與之抵抗力可大得足以使該病 毒成為在表現型上有抵抗力的。 -79- (75) (75)200303362 發明說明續頁 在仏置50、54和82處，看到明顯與PT-R，Gn组有關的 犬.交。表1提供與降低對囉匹那韋之感受性有關的突變一 見表圖4、5和6證實當出現較顯著的突變（在位置5〇、54 :82)時，冑匹那韋的倍數變化是高的，而該試樣大多數 疋在圖的上半邵—與增加表現型抵抗力有關的半部。圖2 或3與圖4、5和6的比較，亦證實大部分在象限 中的喊樣’是含有較顯著突變的那些。 因此，顯然PT-R，GT-S組可能與不成比例地對囉匹那韋 賦與比其他突變更多抵抗力之突變的存在有關。 5 5 ·患者試樣一種分折，以#確認斑把杇々 jL關的突# 本實例證實（1)另一種分析患者試樣的方法，以便確認 與增加或減少對諸如囉匹那章之類的蛋白酶抑制劑之感 文性有關的突變；（2)使在HIV之蛋白酶基因中’同等加重 之突變的數目與其對囉匹那韋之感受性發生關連的簡單 演算法是不精確的M3)可藉著在至少—個與囉匹那韋之 抵抗力有關的位置中，含有胺基酸之混合物的試樣的出現 ’來解釋在PT-S，GT-R象限中看到的眘料· 項4 J貝种，以及（4)某些突 變對囉匹那韋之抵抗力，有比其他突變 又尺友的貢獻。 為了判定在HIV-1品系之蛋白酶序列血 土、 /、，、對利用囉匹那 早之治療的感受性之間的關係，在基因刑 土上和表現型上分 析2038個患者血漿試樣的練習资料組。炊 "、 …、便從2038個試樣 的起點中’移除藉著表現型和基因型兩者 土卬#潑明沒有任何降 低蛋白酶抑制劑之感受性的那坡試樣。勢 策涊排除的表現型基 -80 - 200303362 (76) 發明說明續頁. 準是所有具有LPV FC<2的試樣，而基因型基轉是在任何的 下列（主要）位置處，沒有突變：3〇、32、46、48、5〇、54 、82 (除了 V82I)、84、88或90。結果排除了 62〇個試樣，按 照實例1，分析剩下的8個試樣之資料組。 類似圖2 ’以與抵抗力有關之突變的數目為函數，對對 囉匹那早之抵抗力（對數的囉匹那韋倍數變化）作圖。圖7 顯示在該分析（具有1418個試樣）中獲得之資料的圖。圖7 ，就像圖2—樣，亦含有在所有四個象限中的資料。在進 行分析的1418個試樣中，45% (637個試樣）是ρτ-R，GT-R， 34% (489個試樣）是 PT-S，GT_S，13% (182個試樣）為 pT_R，GT_s ，且 8% (110個試樣）為 PT-S，GT-R。 如同在實例3中，從分析中排除含有下述病毒品系之混 合物的試樣，該病毒品系在一或多個與降低對囉匹那章之 感受性有關的位置處，具有胺基酸殘基之混合物時，在 PT-S，GT-R象限中的試樣數目降低至4% (31個試樣）。結果 該分析排除了 555個試樣，總共剩下863個試樣（圖8)。 如同在實例4中，在位置50、54和82處，看到明顯與pT-R ’ GT-S組有關的突變。圖9、1〇和11證實當出現較顯著的突 變（在位置50、54和82處的那些）時，囉匹那韋的倍數變化 是高的’且試樣大多數是在圖的上半部-與增加表現型抵 抗力有關的半部。圖7或8與圖9、10和11的比較，亦择實大 部分在PT-R，GT_s象限中的試樣，是含有較顯著突變的那 些 0 如下計算用來判定關連之統計顯著性的P值：對於在資 -81 - (77) 200303362 發明說明續頁: 料組中之試樣數目、二_ 、這晨，是得自Ν= 863之資料組的在基 因型上敏感之試樣w K灼氐或高於LPV10-倍的每個突變，與帶 有或沒有正在討論φ、、 又尖變的試樣做比較。建構2x2表， 並使用Fisher’s#^檢舍外 鼻P值。出示G4SV的音仞丨： G48V PT^s PT-R —^ P-值 缺乏 275 97 9 Q ^7 Γ7 1 π 出現 7 50 厶· 〇 / L· -丄y ——^ 精確性 算法證實其經過改良的 本實例證實可藉著 構降低PT-R，GT-S結果之發生率 抵抗力之突變的貢獻，|別地加重較明顯促成囉匹那韋 的演算法。 如同在實例5中插述 組中，排除沒有任何斑、’從2038個拭樣的開始練習資料 些試樣，以及對任何：蛋白酶抑制劑有關之主要突變的那 化（，，FC”）的那些試樣，2酶抑制劑沒有大於2之1C5。倍數變 ^ ^ ，結果產生1418個試樣的資料組。進 一步排除含有下述病 ^ ^ , 母w系 < 混合物的試樣，該病毒品系 帶有在一或多個與隆 ,H ^ 低對％匹那拿之感受性有關的位置 處，具有胺基酸殘其士 ^ W $物的蛋白酶，結果產生863個 試樣的終資料組，使用今、欠」 用琢為料組來設計的演算法，可藉著 降低PT-R，GT-S結果从八，+ 勺舍生率’而精確地預測HIV對囉匹 那韋的感受性。 以僅在練習資料&，Q 。、 、、、（863個試樣）中觀察到的結果為基礎 ’將最後的規則公式化。炊 …、傻在練習資料組和第二組試樣 -82- (78) (78)200303362 發明說明續賓 Γ確認組”）上，測試在練習資 π白《枓組中想出的規則。確竦 料組含有1022個試樣，並排 s 降任何得自包含在練習資料組 中之患者的試樣。像練習資料 貝杆—樣，移除沒有降低對蛋白 酶抑制劑之感受性的證據的 T 接 '樣’剩下523個試樣。對於 僅以演算法為基礎，可用來 & ' »义患者之感受性的精確性， 決定所想出之規則或演算法的精確性。當看到不符時， 改演算法，使其依然與在練習組中看到的結果一致。〃 然後再度對確認组測試該經過修改的演算法。在第二版 中看到的結果’比在最初版本中的那些更好。重複這個過 程許多次，且每個版本的結果至少是一樣好的，如果不是 更好，便回到之前的版本。 疋 表4、5和6提供應用於每一回合或版本上的規則之摘要 ，以及在練習資料組（表4)和兩個不同的確認組中獲得的 結果（表5和6)。第一欄提供回合或版本的號碼。下Z欄按 順序提供，根據演算法，在PT_S，GT R，pt r m PT_s ，GT-S和PT_R，GT_S組中的預期數目。下兩襴提供π·/， GT-R和PT_R，GT_S組的百分比。下―欄提供整體的協調性 (PT-R，GT-R和PT_S ’ GT_S組的百分比總和），或⑽很s， GT-R+PT-R ’ GT-S組的百分比）。 最後一欄含有測試之回合所使用的規則。將每組規則加 到其之前的規則中。一些突變比其他的突變更加地被加重 (例如大多數的V82和154突變），一些則完全從分析中移除⑼ 如I54L)，並在演算法之進行中的版本中，改變—些的加重 系數。在版本6中，將所有V82突變種的加重系數從“曾至3 -83- (79) 200303362

然 而，關於版本7，將V82T之加重系數陁^ 降回1，因為八 像其他的V82突變種一樣顯著地促成對囉郎伽 、、、匕不 F拿的抵括士 。圖13顯示在位置82處之各種胺基酸（野外 -机力 I和突變、沾 響。可看到VMT對囉匹那韋之倍數變化的旦，# } ^ ^ μ衫響，不 的V82突變種那樣大。154突變種的預備分紅 、象其他 々啊，結果心、、 法中移除了 IML。然而，後續的分析顯示 從續算 斗L明顯站 匹那韋的抵抗力有貢獻（圖14)。因此，在表7中 ^ 對囉 I54L的加重系數為【，雖然其未包括在表4 已經指派 τ知交的洽々々、 中。未與任何特定的理論結合，從演算 ”弃法 '、/甲移除Ι54Τ ^ 為它是相對上較罕見的突變，並因此常 ，因 、 1吊出現在資料知山 。因為它是罕見的，所以它可能對大量 、、、、中 ，有很少或沒有影響，但t出現在特殊刀析 患者的病毒中時，它顧薯地侣成料r 或仵自特殊 當從”開始”進行至版太彳ηΒφ ^ -柷力。 丁 土版本10時，增加了全部3個 整體協調性，且在PT R , Γ 由 貝科、、且的 杜m GT-S組中的資料百分比 減少；在練習資料組巾 減劇化地 十、、且中接近7-倍，而在確認資料組中大 6-倍。 表7提供了對每個也押批v 、上 ^大交才g派之加重信劣六舌& 表。可使用該表來預、目… 重值或加重系數的-覽 ^@ & 特足的HIV品系，是否可能對囉匹那 韋具有降低的感受料 切地大 。根據表7 ’分別對在品系中檢測之 在表7中列舉的每_ ^ π 、 個蛋白酶哭變，指派加重系數。然後 將加重系數相力u，復 ^ ^ .. ^ 、到HIV的總分。如果總分為ό或更多，此 時該HIV對利用囉 ν , 那早足治療可能是有抵抗力的，但如 果總分小於6，則此、 牝時孩HIV對囉匹那韋之治療是敏感的。 -84- 200303362 發明說明續頁 (80) 5·7實盤_7 :第二氪^^的演算法，並證會也 精確性 本實例證實可藉著調整適合特殊病毒品系所需之總分 ’認為該病毒品系在基因型上是有抵抗力的，或易感受利 用囉匹那韋之治療，來建構降低pt_r，GT-S和pT_s，GT-R 結果之發生率的演算法。 分析2195個試樣的混‘合資料組，也就是由，，練習資料組· 和”確認資料組”所組成的資料組。排除沒有與對蛋白酶抑 制劑之表現型抵抵力有關的主要突變，對任何蛋白g每抑制 劑而言，與大於2之ICm倍數變化（，，Fc，，）無關連的試樣，或 含有下述之病毒品系的混合物，該病毒品系具有在與降低 對囉匹那韋之感受性有關的位置，帶有不同胺基酸殘基的 蛋白酶，如果該混合物包括在NL4-3 HIV品系中在該位置 處發現的胺基酸。使用具有1〇99個試樣的終資料組，改變 在實例6中描述的演算法，以便改善其整體的協調性。 使用在表7中列舉的相同加重系數。在已經改變的演算 法中，將截止值從6改為8，也就是如果特定mv的總分為8 或更大，此時该HIV在基因型上是對利用囉匹那章之治療 有抵抗力白Β果總分小於8,貝,】此時該mv在基因型上是 對利用囉匹那韋之治療敏感的。使用8之截幻直，整體協 調性9〇·5%比在截止值為6時戶斤看到的更高（表8)。® i 5提供 使用8之截止值的點圖 可看到與圖2和7相比較，降低了 PT-R，GT-S和 PT-S， 止值，可觀察到更 GT-R的結果。當在演算法中使用7之截 咼的整體協調性91.5% (表8)。這在圖I6 • 85 * 200303362 (81) 發明說明續:頁 中看到。 5.8 實例8 :輿I善那韋抵抗力有關之突變，對囉匹那韋 抵抗力的影響 本實例證實某些與增加HIV對安普那韋（nAPVn)之抵抗 力有關連的突變，亦與增加對囉匹那韋的抵抗力有關連。

圖17顯示在HIV中與對安普那章（nAPVn)之抵抗力有關的 蛋白酶突變，在對囉匹那韋之抵抗力上的影響。已經在活 體外選擇，並從利用安普那韋處理的患者中獲得具有降低 對安普那章之感受性的HIV-1分離物。這些分離物的基因 型分析，顯示對APV之抵抗力，與在HIV-1蛋白酶基因中的 8個突變有關：5個主要的（V32I、I50V、I54L/M和I84V)和3 個次要的（M46I/L和 I47V)。參見 Maguire等人，2002, Antimicrob Agents Chemother 46:731-738。沒有例外，這些突變均與降低 對囉匹那韋的感受性有關連（表1)。亦已知V32I和I47V是在

活體外由 LPV選出。Carrillo等人，1998, J· Virol· 72:7532-41。 在表9中概述這些突變和這些突變彼此組合的影響，以及 I84V對LPV和APV的感受性。對於APV，在每組中的中間FC 為9.5-倍或更高，如同可預期的。然而，中間的LPV FC通 常與APV平行，且通常比APV更大。該觀察引導在這兩個 蛋白酶抑制劑之間，調查交叉-抵抗力的程度。 從26個與APVFC22.5有關之突變的一覽表中，以單變分析 為基礎，有23個亦與LPV FC22.5有關（表10)。使用回歸分析 ，分析在兩個Pis之FC(對數-變換）之間的關連。圖18顯示囉 匹那韋倍數變化Γ對數LPV FC”）對安普那韋倍數變化（’’對 -86- 200303362 (82) 發明說明續頁 數APV FC1·)的二變數點圖。較暗的點（在圖例中的，，APV GT-R”）代表在基因型上對安普那韋有抵抗力的那些試樣 ，而較淡的點（在圖例中的nAPV GT-S，’）代表在基因型上對 安普那章敏感的那些試樣。圖18顯示在基因型上對安普那 韋有抵抗力的那些試樣（關連系數，r2=〇.52)，在安普那韋 和囉匹那章之間的關連上，比在基因型上對安普那韋敏感 的那些（關連系數，R2=0.39)更高（對該分析而言，排除對任 一蛋白酶抑制劑具有FC<2.5的所有試樣）。76%的所有試樣 鲁 ，以及82%的APV GT-R試樣，其對任一蛋白酶抑制劑是pT_R ’對兩者均有抵抗力。而95%被定義為對APV是GT-R的試 樣，亦是PT-R，80%亦是對LPV為PT-R (表11)。 無論關連性，APV突變的單獨存在，不足以是LPV FC>10 ’需要累積8或更多個在表1中列舉之與降低對LPV之感受 性有關的那些突變。 將所有在本文中提及的參考文獻以引用的方式併入本 文中。 ^ 在本文中提供的實例，實際的和預言性的兩者皆僅為本 發明之具體實施例，並非企圖以任何方式限制本發明。 6.圖式簡單說明 圖1為HIV-1之基因組結構的圖解說明。 圖2為顯示獲自有2038位患者之練習資料組的hiv試樣 ，以在蛋白酶中與抵抗力有關之突變的數目為函數，對囉 ： 匹那韋之感受性（對數的囉匹那韋倍數變化）的點圖。基型 · 的截止值’’為6，也就是說’如果其總分為6或大於6，便 -87- (83) 200303362 發明說明續頁 將HIV定義為在基因型上，s 芸至她八丨、人 疋對囉匹那韋有抵抗力的，而 …刀小& 6 ’在基因型上^敏感的。 圖3為顯示在移卩会名i 任何"#入 對囉匹那章之感受性有關的 任何位置處’含有胺基酸、、曰 Φ血w 士 的試樣之後，以在蛋白酶 中人抵抗力有關之突變的 土、成心 又0數目為函數，HIV試樣對囉匹那 早（。受性（對數的囉匹那拿 排除含有野外型和突_種二《）的點圖。從分析中 广I和大變種兩者的那些試樣。 圖4為顯示在蛋白酶中含有突變請之HIV試樣，以在那 些式樣中與抵抗力有關之突變的總數為函數，對囉匹那章 之感受性（對數的囉匹那韋倍數變化）的點圖。

:圖5為顯示在蛋白酶中含有突變篇A、F、S、叫之HIV 4樣’以在那些試樣中與抵抗力有關之突變的總數為函數 ，對囉匹那韋之感受性(對數的囉匹那章倍數變化)的點圖。 、圖6為顯示在蛋白酶中含有突變154八、l、μ、s、丁或ν 之HIV4樣，以在那些試樣中與抵抗力有關之突變的總數 為函數，對囉匹那韋之感受性（對數的囉匹那韋倍數變化） 的點圖。 σ 圖7為顯示在移除不含任何與蛋白酶抑制劑有關之主要 犬’交，且對任何蛋白酶抑制劑而言沒有超過2之IC50倍數變 化("FC”)的試樣之|，以在蛋白酶中與抵抗力有關之突變 的數目為函數，HIV試樣對囉匹那韋之感受性匹 那韋倍數變化）的點圖。 圖8為顯示在移除不含任何與蛋白酶抑制劑有關之主要 突變，且對任何蛋白酶抑制劑而言沒有超過2之IC5G倍數變 -88- (84) 200303362 發明說明續頁 化（FC )的4樣，並移除在與降低對囉匹那韋之感受性有 關的任何位置處，含有胺基酸混合物的試樣之後:以在蛋 白母2 /、、抵抗力有關之突變的數目為函數，HIV試樣對囉 人、‘又〖生（對數的囉匹那章倍數變化）的點圖。移除 吝、兩者野外型或參考品系和突變種的那些試樣。

圖9為顯不在移除不含任何與蛋白酶抑制劑有關之主要 犬交，且對任何蛋白酶抑制劑而言沒有超過2之IC5G倍數變 化（FC )的4樣之後，在蛋白酶中含有突變i5〇v之HIV試樣 、在那二忒樣中與抵抗力有關之突變的總數為函數，對 囉匹那早之感受性（對數的囉匹那章倍數變化）的點圖。

圖10為顯示在移除不含任何與蛋白酶抑制劑有關之主 要大、交’且對任何蛋白酶抑制劑而言沒有超過2之ICw倍數 k化（"FC”）的試樣之後，在蛋白酶中含有突變V82A、F、S 、丁或I之HIV試樣，以在那些試樣中與抵抗力有關之突變 的總數為函數，對囉匹那韋之感受性（對數的囉匹那韋倍 數變化）的點圖。 圖11為顯示在移除不含任何與蛋白酶抑制劑有關之主 要突變，且對任何蛋白酶抑制劑而言沒有超過2之IC5G倍數 變化（"FC”）的試樣之後，在蛋白酶中含有突變I54A、L、Μ 、S、Τ或V之HIV試樣，以在那些試樣中與抵抗力有關之 突變的總數為函數，對囉匹那韋之感受性（對數的囉匹那 韋倍數變化）的點圖。 圖12A顯示NL4-3 HIV (GenBank登錄編號AF324493)蛋白酶 (序列識別1號）的胺基酸序列。 圖12B顯示NL4-3 HIV (GenBank登錄編號AF324493)蛋白酶 -89 - 200303362 (85) 發明說明績:頁 (序列識別2號）的核酸序列。 圖13顯示在位置82處的胺基酸，對囉匹那章倍數變化的 » 影響。顯示中線（平行線），第25和第75百分值（盒子），第1〇 和苐90百为值（4 )和不合格值（〇utHer)(點）。 圖14顯示在位置54處的胺基酸，對囉匹那韋倍數變化的 影響。顯示中線（平行線），第25和第75百分值（盒子），第1〇 和第90百分值（鬚）和不合格值（點）。 圖15為顯示獲自有2195位患者之練習資料組的HIV試樣 籲 ’以在蛋白酶中與抵抗力有關之突變的數目為函數，對囉 匹那章之感文性（對數的囉匹那韋倍數變化）的點圖。基因 型的’’截止值"為8，也就是說，如果其總分為8或大於8， 則HIV在基因型上’是對囉匹那韋有抵抗力的，而若其總 分小於8，在基因型上就是敏感的。 圖16為顯示獲自有1099位患者之資料組的HIV試樣，以 在蛋白酶中與抵抗力有關之突變的數目為函數，對囉匹那 韋之感受性（對數的囉匹那韋倍數變化）的點圖。基因型的 _ ·*截止值”為7 ’也就是說，如果其總分為7或大於7，則HIV 在基因型上’是對囉匹那韋有抵抗力的，而若其總分小於 7，在基因型上就是敏感的。 圖17顯示在HIV中，與對安普那韋（” apv，，）之抵抗力有關 的突變，對囉匹那韋之抵抗力的影響。顯示中線（平行線） ，第25和第75百分值（盒子），第1〇和第9〇百分值（鬚）和不合 ： 格值（點）。 圖18顯示囉匹那韋倍數變化（’’對數lpv，，）對安普那章倍 數變化Γ對數APV’’）的二統計數點圖。 -90- 200303362 (86) 囉 表1 匹那韋突變 發明說明續頁 突變 FC<10 FC>10 %R:%S P值 L10F 16 25 9 <0.0001 L10F* 15 25 3 0.0001 L10I* 105 97 2 <0.0001 G16E* 8 23 6 <0.0001 K20I 21 24 6 <0.0001 K20I* 14 24 3 0.0001 K20M 6 10 9 <0.0001 K20M* 4 10 5 0.0045 K20R 17 13 4 0.0002 L24I 7 10 8 <0.0001 V32I 9 18 11 <0.0001 Y32I* 9 18 4 0.0004 L33IFV** 38 47 7 <0.0001 L33F* 14 42 6 <0.0001 E34DKQ** 4 18 25 <0.0001 E34Q* 2 12 12 0.0001 K43T* 4 22 11 <0.0001 M46I 49 57 6 <0.0001 M46L 16 19 7 <0.0001 M46I* 49 57 2 <0.0001 M46L* 16 19 2 0.009 M46V* 不能獲得 不能獲得 不能獲得 不能獲得 I47V* 5 22 8 <0.0001 I47A 不能獲得 不能獲得 不能獲得 不能獲仔 I47V 5 22 25 <0.001

-91 - 200303362 (87) G48V 7 G48V* 7 I50V 1 I50V* 1 I54A 0 I54L 不能獲得 I54M 6 I54S 0 I54T 0 I54V 7 I54A* 0 I54M* 6 I54S* 0 I54T* 0 I54V* 7 K55R 13 Q58E 19 Q58E* 18 L63T* 4 I66FV** 14 A71I 5 G73C 2 G73T 10 T74ASP** 27 T74S* 14 L76V 1 L76V* 1 P79ADE* 3 V82A 14 發明說明續頁 40 <0.0001 14 <0.0001 123 <0.0001 48 <0.0001 -N/A- <0.0001 得 不能獲得 不能獲得 20 <0.0001 -N/A- <0.0001 -N/A- <0.0001 37 <0.0001 -N/A- <0.0001 7 <0.0001 -N/A- <0.0001 -N/A- 0.0045 13 <0.0001 5 <0.0001 8 <0.0001 3 0.0003 5 0.002 5 0.0001 8 0.0007 17 0.0002 7 <0.0001 8 <0.0001 3 0.0001 34 <0.0001 12 0.0076 11 0.0006 29 <0.0001 -92- 200303362 _ (88) 發明說明續頁 V82F 2 6 17 0.0002 V82A* 14 73 10 <0.0001 V82S 0 7 -N/A- <0.0001 V82S* 0 7 -N/A- 0.0005 I84A* 不能獲得 不能獲得 不能獲得 不能獲得 I84L* 不能獲得 不能獲得 不能獲得 不能獲得 I84V 41 33 4 <0.0001 L89I* 0 5 -N/A- 0.0045 L89M* 7 13 4 0.0004

開始的試樣數目=2038 *開始的試樣數目=1418 (在移除任何與蛋白酶抑制劑無關 ，且對任何蛋白酶抑制劑而言，沒有大於2之IC5〇倍數變化 (”FCn)之主要突變的試樣之後）。 **同等地處理所有變體 -N/A-:不能應用（結果除以0)

FC : IC5G的倍數變化 %R :與所有的PT-R，GT-S試樣相比較，有突變試樣的百分比 %S :與所有的PT-S，GT-S試樣相比較，有突變試樣的百分比 -93- 200303362 _ (89) 發明說明續頁 表2 位置的號碼與有突變之試樣數目的關連 位置的號碼 有突變之試樣的數目 11 0 9 1 3 2 2 3 2 4 3 5 1 6 3 7 0 8 0 9 34 <10 65 >10 61 >20 46 >100 4 10 至 20 15 20 至 100 -94- 200303362 (90) 發明說明續頁 表3 在HIV蛋白酶的每個位置，看到有突蠻的試樣數目 位置 試樣數目 P1 0 P9 0 D25 0 G27 0 D29 0 T3 1 0 P44 0 G78 0 G86 0 L97 0 N98 0 Q2 1 T26 1 A28 1 G49 1 G52 1 V56 1 P8 1 1 G94 1 F99 1 13 2 L5 2 G40 2

-95- 200303362 (91) 發明說明續頁 位置 試樣數目 W6 3 W42 3 R87 4 T96 4 R8 5 G5 1 5 Y59 5 T80 6 Q7 7 E2 1 7 G68 7 V75 12 G17 13 L38 17 L23 20 T4 24 A22 24 N83 25 E65 33 P79 39 T9 1 39 K45 45 L76 57 C9 5 59 P39 61 Q18 63 D30 74 150 80

-96- 200303362 (92) 發明說明續頁 位置 試樣數目 N88 89 K70 96 E34 101 166 103 C67 1 10 147 1 12 V32 1 16 VI 1 117 Q92 121 185 13 1 L24 134 G16 136 Q61 144 K55 153 G48 156 F53 159 Q58 159 L89 186 T74 202 K43 208 K14 210 H69 213 R57 237 T12 244 D60 247 L19 297 L33 41 1 G73 416

-97- 200303362 (93) 發明說明續頁 位置_試樣數目 164 458 184 482 115 172 R41 113 K20 V77 E35 V82 M46 193 N37 154 M36 162 L90 A71 L10 L63 489 5 18

534 556 63 1 708 735 741 780 823 826 834 841 897 946 1047 1242 1858 -98- 200303362 (94) 表4 發明說明續頁 建構演算法，並應用在練習資料上 編號PT-S， PT-R，PT-S， PT-R, %PT-R, %PT-S? 濃度規則 GT-R GT-R GT-S GT-S GT-S GT-R 開始32 412 281 138 16.0% 3.7% 80.3%同等地加重所有的突變 1 36 457 277 93 10.8% 4.2% 85.1% 加入M46V，I50V (加重=3) I54AMS，I84AL，V82S 6 58 519 255 31 3.6% 6.7% 89.7% 加入L33F，I47V，G48MV， 丄63T，增加V82AFST加重至3 7 56 517 257 33 3.8% 6.5% 89.7%將V82T的加重設定回到1 8 57 522 256 28 .3.2% 6.6% 90.2% 加入V32I，E34Q，K43T， L89IM，移除I54L 10 65 530 248 20 2.3% 7.5% 90.2% 加入58E，74S，76V，增加54的 加重至3倍

-99- 200303362

發明說明續頁 表5 應用演算法於確認資料組1中 編號 PT-S， GT-R PT-R， GT-R PT-S, GT-S PT-R， GT-S %PT-R， GT-S %PT-S, GT-R 整體協調性 開始 37 130 302 54 10.3% 7.1% 82.6% 1 38 140 301 44 8.4% 7.3% 84.3% 10 66 175 273 9 1.7% 12.6% 85.7%

在資料組中的試樣數目=523。 表6 應用演算法於確認資料組2中 編號 PT-S， GT-R PT-R， GT-R PT-S， GT-S PT-R， GT-S %PT-R? GT-S %PT-S， GT-R 整體協調性 開始 8 86 172 41 13.4% 2.6% 84.0% 1 8 94 172 33 10.7% 2.6% 86.6% 10 25 120 155 7 2.3% 8.1% 89.6%

在資料組中的試樣數目=307 (從表7之5 23個試樣的開始資 料組中，移除在任何與降低對囉匹那韋之感受性有關的位 置處，含有胺基酸混合物的試樣之後）。 -100- 200303362 (96) 表7 發明說明續頁 力口重係數 突變 加 重係數 突變 加重係數 L10F 1 I54M 3 L10I 1 I54S 3 G16E 1 I54T 3 K20I 1 I54V 3 K20M 1 K55R 1 K20R 1 Q58E 1 L24I 1 L63T 1 V32I 1 A71I 1 L33F 1 L76V 1 E34Q 1 V82A 3 K43T 1 V82F 3 M46I 1 V82S 3 M46L 1 V82T 1 M46V 1 I84A 1 I47V 1 I84L 1 G48V 1 I84V 1 I50V 3 L89I 1 I54A 3 L89M 1 I54L 1 表8 混合資料組的分析 截止值 PT-S， PT-S， PT-R， PT-R， 整體協調性 GT-R GT-S GT-R GT-S 6 93 404 589 13 90.4% 7 63 434 572 30 91.5% 8 50 447 548 54 90.5% -101 - 200303362 (97) 表9 發明說明續頁 APV突變對LPV和APV感受性的影響 基因型組別 η 中間值LPV FC 中間值APV FC 野外型（所有的主要位置） 623 0.6 0.6 不含任何受試的突變 1096 2.1 1.6 32 26 12 9.5 47 8 191 26 50 42 54 20 54a 9 160 22 84 247 7.1 11 32, 47 23 7.5 12 32, 84 3 124 51 46b，54 16 138 84 47, 54 3 88 42 47, 84 4 28 12 54, 84 22 93 67 32, 47, 54 17 146 40 46, 54, 84 29 30 47 47, 54, 84 3 20 24 32, 46, 47, 54 4 208 130 32, 47, 54, 84 5 227 130 32, 46, 47, 54, 84 6 200 130

I54L或 M only M46I或 L -102- 200303362 (98) 發明說明續頁 表10

輿APV和LPV FC>2.5有關的突蠻 APV APV/LPV 1 0F 1 OF 11 11 23 321 321 33F 33F 34Q 34Q 43T 43T 47V 47 V 48M 48M 50V 50V 53L 53L 54A 54A 54L 54L 54M 54M 54S 54S 54T 54T 55 55 58E 58E 66 71L 71L 76V 76V 79 79 82F 82F 84V 84V 92 95 95

針對FC〉2,5，突變具有％11: %S>5且P<0.01 -103- 200303362 _ (99) 發明說明續頁 表1 1 概要統計LPV-APV交叉-抵抗力 試樣的百分比 分類 全部a APV GT-R APV FC〉2.5 亦為 LPV FC〉10 82 83 LPV FC>10 亦為 APV FC〉2.5 9 1 99 對任一 PI為PT-R，對兩者均為PT-R 76 82 APV FC>2.5 6 1 95 LPV FC>10 55 80 試樣沒有蛋白酶抑制劑FC>2，也沒有排除蛋白酶抑制劑

主要突變；n=1099

-104- 200303362 序列表 <110>Petropoulos, Christos Parkin, Neil Chappey, Clolombe < 120〉測定病原性病毒對於蛋白酶抑制劑之敏感度之組合物及方法 <130> 11068-026-228 <140〉 092103100 <141> 2003-02-14 <150> US 60/357,171 <151〉 2002-02-15 <150> US 60/359,342 <151〉2002-02-22 <150> US 60/392,377 <151> 2002-06-26 <160> 2 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 99 <212>蛋白質 <213>人類免疫缺陷病毒 <400> 1

Pro Gin ·工 le Thr Tip Gin. Arg Pro LeuVal Tiir lie Lys lie Gly :1 5 10 . X5 .Gly Gin Leu Lys Glu Ala Leu. Leu Asp Thr, Gly Ala Asp Asp Thr Val 20 25 30

Leu Glu Glu Met Asn Leu Pro Gly Arg Trp Lys Pro Lys Met lie Gly 35 4Q 45

Gly lie Gly .Gly Phe 工le Lys Val Arg Gin Tyr Asp Gin 工le Leu 工le 50 55 : 6〇

Glu He Cya Gly Hi$ Lys Ala. lie Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr 65 70 : 75 80

Val Asn lie 工le Gly Arg Asn Leu Ι^μ‘. Thr Gin lie Gly Cys Thr 85 90 95

Leu Asn Phe 200303362 序列表續頁

<210> 2 <211> 297 <212> DNA <2 13>人類免疫缺陷病毒 <400> 2 cctcagatca ctctttggca gcgacccctc gtcacaitiaa agataggggg gcaattaaag 芩0 • ·〆： ：*

_ I gaagctctat tagatacagg eigcagatgat acagta^tag aagaaatgaa tttgccagga. 120. .· ii!·' . · agatggaaac caaaaatgat agggggaatt ggaggtitta tcaaagtaag acagtatgat 1:80 • ' :;卜 ’ cagatactca tagaaatctg cggacataaa gctataiggta cagtattagt aggacctaca 240: . :r . cctgtcaa.ca taattggaag aaatctgttg actcagmttg gctgc^cctt aaatttt · 297

Claims (1)

1. 200303362 拾、申請專利範圍 1. 一種判定HIV是否在降低對利用蛋白酶抑制劑治療的感 受性上具有增加之可能性的方法，包括在該HIV的蛋白 酶中，或在該HIV之編碼蛋白酶的核酸中，檢測在該蛋 白酶之胺基酸序列的胺基酸位置20、33、34、43、46、 48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84 或89處，與降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性有 關之突變的存在或缺乏，其中該突變的出現，表示該 HIV對於降低對利用該蛋白酶抑制劑之治療的感受性具 有增加的可能性，其限制條件為該突變不是K20M、K20R 、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F 、V82T或 I84V。 2. —種判定被HIV感染的個體是否在降低對利用蛋白酶抑 制劑治療的感受性上具有增加之可能性的方法，包括在 得自該個體的試樣中，檢測在HIV之蛋白酶的胺基酸序 列之胺基酸位置 20、33、34、43、46、48、50、54、55 、58、63、66、73、74、76、79、82、84或 89處，與降低 對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性有關之突變的存 在或缺乏；其中該突變的出現’表示該個體對於降低對 利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性具有增加的可能性’ 其限制條件為該突變不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L 、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或 I84V ° 3. 根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中在該HIV之蛋 200303362 _ 申請專利範圍續頁 白酶中檢測突變。 4·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中在該HIV之編 碼蛋白酶的核酸中檢測突變。 5. 根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中與降低對利用 該蛋白酶抑制劑治療的感受性有關的突變，選自由： K20I、M46V、I50L、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A 、I84L、L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T 、G48V、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P 、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和 L89M所組成 之群。 6. —種經過分離的寡核甞酸，長度在大約10至大約100個 核甞酸之間，其在HI V中編碼蛋白酶，其包括突變，係 在該人類免疫缺陷病毒中，在該蛋白酶的胺基酸序列之 胺基酸位置 20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、 63、66、73、74、76、79、82、84或 89處，其中該突變與 降低對蛋白酶抑制劑的感受性有關，其限制條件為該突 變不是 K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、 L63P、V82A、V82F、V82T或 I84V。 7. 根據申請專利範圍第6項之經過分離的寡核甞酸，其中 該寡核替酸的長度在大約ίο到大約9〇個核:酸之間。 8·根據申請專利範圍第6項之經過分離的寡核苷酸，其中 該寡核替酸的長度在大約10到大約80個核苷酸之間。 9.根據申請專利範圍第6項之經過分離的寡核甞酸，其中 該寡核苷酸的長度在大約10到大約70個核苷酸之間。 200303362 _ 申請專利範圍續頁 10. 根據申請專利範圍第6項之經過分離的寡核苷酸，其中 該寡核茫酸的長度在大約10到大約60個核甞酸之間。 11. 根據申請專利範圍第6項之經過分離的寡核甞酸，其中 該寡核嘗酸的長度在大約10到大約50個核苷酸之間。 12. 根據申請專利範圍第6項之經過分離的寡核苷酸，其中 該寡核甞酸的長度在大約10到大約40個核苷酸之間。 13. —種判定人類免疫缺陷病毒（HIV)是否在降低對利用蛋 白酶抑制劑之感受性上，具有增加之可能性的方法，包 括： (a) 在該HIV中，檢測一或多個在表7中列舉之HIV蛋白 酶突變的存在或缺乏； (b) 按照在表7中提供的，對每個突變指派加重係數；並 (c) 將該加重係數相加，得到該HIV的總分，其中如果 該總分等於或大於6，則該HIV對於利用該蛋白酶抑 制劑的治療具有增加抵抗力的可能性。 14. 根據申請專利範圍第13項之方法，其中如果該總分等於 或大於7，則該HIV對於利用該蛋白酶抑制劑的治療具有 增加抵抗力的可能性。 15. 根據申請專利範圍第13項之方法，其中如果該總分等於 或大於8，則該HIV對於利用該蛋白酶抑制劑的治療具有 增加抵抗力的可能性。 16. 根據申請專利範圍第13項之方法，其中在該HIV的蛋白 酶中檢測突變。 17.根據申請專利範圍第13項之方法，其中在該HIV之編碼 200303362 _ 申請專利範圍續頁 蛋白酶的核酸中檢測突變。 18. —種判定被人類免疫缺陷病毒（HIV)感染的個體是否在 降低對利用蛋白酶抑制劑之感受性上具有增加之可能 性的方法，包括： (a) 在得自該個體的試樣中，檢測一或多個在表7中列 舉之HIV蛋白酶突變的存在或缺乏； (b) 按照在表7中提供的，對每個突變指派加重係數；並 (c) 將該加重系數相加，得到該個體的總分，其中如果 該總分等於或大於6，則該個體對於利用該蛋白酶 抑制劑的治療具有增加抵抗力的可能性。 19. 根據申請專利範圍第18項之方法，其中如果該總分等於 或大於7，則該個體對於利用該蛋白酶抑制劑的治療具 有增加抵抗力的可能性。 20. 根據申請專利範圍第18項之方法，其中如果該總分等於 或大於8，則該個體對於利用該蛋白酶抑制劑的治療具 有增加抵抗力的可能性。 21. 根據申請專利範圍第18項之方法，其中在該HIV的蛋白 酶中檢測突變。 22. 根據申請專利範圍第18項之方法，其中在該HIV之編碼 蛋白酶的核酸中檢測突變。 23. 根據申請專利範圍第1、2、13或18項之方法，其中該人 類免疫缺陷病毒是人類免疫缺陷病毒第1型（HIV-1)。 24. 根據申請專利範圍第1、2、13或18項之方法，其中該蛋 白酶抑制劑是囉匹那韋。 200303362 _ 申請專利範固續頁 25. 根據申請專利範圍第4、17或22項之方法，其中藉著使 序列-專一之寡核茹酸探針，與該人類免疫缺陷病毒之 編碼該突變的核酸序列雜交，來檢測該突變在該蛋白酶 中的存在或缺乏，其中雜交的發生代表該突變的存在或 缺乏。 26. 根據申請專利範圍第25項之方法，其中該序列-專一之 寡核牮酸探針與編碼該突變之核酸雜交，且該雜交的出 現代表該突變的存在。 27. 根據申請專利範圍第4、17或22項之方法，其中藉著核 酸定序，來檢測在該蛋白酶中該突變的存在或缺乏。 28. 根據申請專利範圍第2或18項之方法，其中該個體正接 受或先前曾經接受利用該或不同蛋白酶抑制劑的治療。 29. 根據申請專利範圍第1、2、13或18項之方法，其中該蛋 白酶具有與序列識別1號至少90%相同的序列。 30. 根據申請專利範圍第1、2、13或18項之方法，其中該蛋 白酶具有與序列識別1號至少80%相同的序列。 31. 根據申請專利範圍第1、2、13或18項之方法，其中該方 法包括在2或多個胺基酸位置，檢測與降低對利用該蛋 白酶治療的感受性有關之突變的存在或缺乏。 32. —種判定HIV是否在降低對利用第一個蛋白酶抑制劑治 療的感受性上具有增加之可能性的方法，包括在該HIV 的蛋白酶中，檢測在該蛋白酶之胺基酸序列的胺基酸位 置 10、11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、 71、76、79、82、84或95處，與降低對利用第二個蛋白 200303362 申請專利範圍續頁 酶抑制劑治療的感受性有關之突變的存在或缺乏，其中 該突變的出現，表示該HIV對於降低對利用該第一個蛋 白酶抑制劑治療的感受性具有增加的可能性，其限制條 件為該突變不是 V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L 、I54M、V82A或 I84V。 33.—種判定被mv感染的個體是否在降低對利用第一個蛋 白酶抑制劑治療的感受性上具有增加可能性的方法，包 括在得自該個體的試樣中，檢測在HIV之蛋白酶的胺基 酸序列之胺基酸位置1〇、η、32、33、34、43、46、47 、48、50、54、58、71、76、79、82、84或 95處，與降低 對利用第二個蛋白酶抑制劑治療的感受性有關之突變 的存在或缺乏，其中該突變的出現，表示該個體對於降 低對利用該第一個蛋白酶抑制劑治療的感受性具有增 加的可能性，其限制條件為該突變不是V32I、M46I、M46L 、I47V、I50V、I54L、Ι54Μ、V82A或 I84V。 34·根據申請專利範圍第32或33項之方法，其中該第一個蛋 白:抑制劑是囉匹那章或安普那章。 35. 根據申請專利範圍第32或33項之方法，其中該第二個蛋 白S母抑制劑疋囉匹那韋或安普那韋。 36. —種判定HIV是否在降低對利用蛋白酶抑制劑治療的感 受性上具有增加之可能性的方法，包括在該HIV的蛋白 酶中’或在該HIV之編碼蛋白酶的核酸中，檢測在該蛋 白酶之胺基酸序列的胺基酸位置1〇、U、32、47、53、 71或95處，與降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性 200303362 中請專利範圍續頁 有關之突變的存在或缺乏，其中該突變的出現，表示該 HIV對於降低對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性上具 有增加的可能性，其限制條件為該突變不是V32I也不是 I47V。 37. —種判定被HIV感染的個體是否在降低對利用蛋白酶抑 制劑治療的感受性上具有增加之可能性的方法，包括在 得自該個的試樣中，檢測在該HIV之蛋白酶的胺基酸序 列之胺基酸位置10、11、32、47、53、71或95處，與降低 對利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性有關之突變的存 在或缺乏，其中該突變的出現，表示該個體對於降低對 利用該蛋白酶抑制劑治療的感受性上具有增加的可能 性，其限制條件為該突變不是V32I也不是I47V。 38. 根據申請專利範圍第36或37項之方法，其中與降低對利 用該蛋白酶抑制劑治療的感受性有關的突變，係選自由 :L10F、F53L和A71L所組成之群。