TR2023019700A2 - Bakteri̇ i̇denti̇fi̇kasyonu amaciyla yatay akiş anali̇z si̇stemleri̇nde faj reseptör bağlayici protei̇nler kullanilan hizli tani ki̇ti̇ - Google Patents

Abstract

Bir numunenin içerdiği bakterinin tipi, türü veya suşunun tespitine yönelik bir test yöntemi ve test kiti ile ilgili olup, yakalayıcı probun test edilecek bakteriye özgü bakteriyofaj reseptör bağlayıcı protein içermesidir. Reseptör bağlayıcı protein altın nanopartiküller ile konjuge halde işaretli olabilir.

Description

TARIFNAME BAKTERI IDENTIFIKASYONU AMACIYLA YATAY AKIS ANALIZ SISTEMLERINDE FAJ RESEPTÖR BAGLAYICI PROTEINLER KULLANILAN HIZLI TANI KITI Teknik Alan Bakteri tanisi için bakteriyofaj reseptör baglayici protein kullanilan ve yatay akis analiz (LFA) teknigi uygulanan test yöntemi ve tam kiti ile ilgilidir. Teknigin Durumu Bakteri tanisi için moleküler metotlar hedef bakterilerin belirli DNA/RNA bölgesini tespit etmeye dayali yöntemler olup, patojenik bakterilerin arastirilmasi için multipleks polimeraz e zincir reaksiyonu (mPCR), gerçek zamanli PCR (RT-PCR), nükleik asit dizisi bazli amplifikasyon (NASBA) ve döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) gibi farkli PCR türleri kullanilmaktadir. Moleküler metotlara alternatif olarak modern laboratuvarlarda yeni nesil dizileme (NGS) uygulanmaktadir. Sekanslamanin en büyük yarari, sepsis veya menenjit durumunda ve ayni zamanda tüberküloz tanisinda da uygulanabilen klinik bir örnekten en atipik mikroorganizmalari bile saptama yetenegidir. Bakteriyel patojenlerin tanimlanmasinda kullanilan bir diger metot da MALDI-TOF MS teknigidir. MALDI- TOF ile mikroorganizmanin tanimlanmasi, her türe özgü kütle piklerinin veri tabanindaki örüntülerle karsilastirilmasina dayanmaktadir. Bu benzersiz protein profiline moleküler "parmak izi" denmektedir. Numunelerde bakteri tespiti için ayrica antij en (Ag) ve antikor (Ab) etkilesimi ile analiz esasina dayanan ELISA yöntemi de kullanilabilmektedir. Bahsi geçen tekniklerin bakteri tespitindeki kritik derecede önemli sinirlamalari vardir. Bu nedenle kullanimi basit, hassas, spesifik, uygun maliyetli, hizli tekrarlanabilir yanit üreten, yerinde tespit ve tasinabilirlik kolayligi dahil olmak üzere sayisiz avantajlar sunan biyosensörler esasli yöntemlere ihtiyaç vardir. Literatürde bakterilerin tespitine yönelik birçok sensör tipi tanimlanmis olmasina ragmen bu sensör sistemleri genellikle kompleks yapilarda, teknik beceri ve uzmanlik gerektiren veya pahali ekipmanlardan olusmaktadir. Biyosensör, genellikle biyolojik bir bilesen olan prob ve biyokimyasal sinyali duyulur elektrik sinyaline dönüstüren elektronik dönüstürücü araciligiyla biyokimyasal veya fizyolojik bir degisikligi tespit eden cihaz ve sistem olarak tanimlanmaktadir. Dönüstürücü, elektrokimyasal, optik, akustik, mekanik, kalorimetrik veya elektronik olarak farkli yollarla ölçülebilen ve daha sonra analit konsantrasyonuyla iliskilendirilebilen saptanabilir bir sinyale karsi en küçük biyolojik yaniti yükseltebilme özelligi gösteren cihazlardir. Dirençli bir izolatla enfeksiyon söz konusu oldugunda, hizli, ekonomik ve kullanici dostu yöntemlerle aninda, yerinde tanimlama gerektirmektedir . Bu baglamda, hizli teshis testi (RDT) olarak da bilinen yanal akis tahlil tekniginin (LFA), antibiyotige dirençli izolatlarin tespiti ve tanimlanmasinda degerli oldugu kanitlanmistir. LFA'larin günümüzde bu kadar popüler olmasinin nedenlerinden bir digeri, kagit bazli zemin üzerinde yapilandirilmis olmasidir. Kagit bazli malzemelerin düsük maliyeti, sürdürülebilir üretimi desteklemesi, gözenekli matrisleri, ekipman gerektirmeyen mikro akiskan sistemlerine uygun olmasi, modifiye edilebilir biyoetkilesim elemanlari tasarimina ve stratejilerine olanak saglamasi önemli özellikleri arasindadir. LFA, örnegin bir test cihazina yerlestirildigi ve sonuçlarin 5-30 dakika içinde görüntülendigi, karmasik karisimlardaki analitlerin saptanmasi ve miktarinin belirlenmesi için kagit tabanli bir platform olarak tanimlanmaktadir . Kullanilan tanima unsurlarina bagli olarak, LFA'lar antij en- antikor etkilesimine (Lateral Flow ImmunoAssay: LFIA) veya DNA-DNA hibridizasyonuna (Nucliec acid Lateral ImmunoAssay: NALFIA veya Nucleic Acid Lateral Flow: NAFL) seklinde gruplandirilabilmektedir. LFA'nin çalisma prensibi; ilgili analiti içeren siVi numunenin, kilcal etki yardimiyla analit ile etkilesime girebilen moleküllerin eklendigi çesitli polimerik serit bölgeleri boyunca hareket etmesine dayanmaktadir. Genellikle LFA daha iyi stabilite ve kullanim için bir destek kartina monte edilen üst üste binen membranlardan olusur . LFA platformunda yapilan tipik bir test için numune, tespit sistemi ile etkilesime girmeye uygun hale getiren tampon tuzlari ve yüzey aktif maddelerle emprenye edilmis adsorban numune pedi üzerine uygulanir. Numune pedi, numunede bulunan analitin yakalama reaktiflerine ve membrana baglanabilmesini saglar. Islenen numune, hedef analite özgü ve renkli veya floresan partiküllere konjuge edilmis antikorlar içeren konjugat salim yastigindan geçer. Numune, hedef analite bagli konjuge antikorla birlikte serit boyunca algilama bölgesine geçer. Bu bölge, çizgiler halinde immobilize edilmis spesifik biyolojik bilesenlere (çogunlukla antikorlar veya antijenler) sahip genellikle nitroselülozdan olusan gözenekli bir zardir . Rolleri, konjuge antikora bagli analit ile reaksiyona girmektir. Örnek analitin taninmasi, test hattinda uygun bir yanitla sonuçlanirken, kontrol hattindaki bir yanit, serit boyunca uygun siVi akisini gösterir. Farkli yogunluklarda görünen çizgilerle temsil edilen okuma, gözle veya özel bir okuyucu kullanilarak degerlendirilebilir. Birden çok analiti ayni kosullar altinda ayni anda test etmek için, farkli analitlere özgü ek antikor test hatlari bir dizi formatinda immobilize edilebilir. Öte yandan, yari kantitatif analizler için ayni antikorla yüklenmis çoklu test hatlari kullanilabilir. Bu "yatay akis analizi" testinin prensibi, kolorimetrik konjugat-antijen komplekslerinin, serit üzerinde görünen çizgi sayisinin analitin konsantrasyonuyla dogru orantili oldugu, her bir ardisik çizgide immobilize edilmis antikor tarafindan adim adim yakalanmasina dayanir . Sivi, serit malzemesinin kilcal kuvveti nedeniyle cihaz boyunca akar ve bu hareketi sürdürmek için, seridin ucuna bir emici yastik takilir. Emici pedin rolü, fazla reaktifleri fitillemek ve sivinin geri akisini önlemektir. LFA sistemlerinde bakteri tayini için literatür örnekleri mevcuttur. Ve bu örneklerde genellikle yakalayici prob olarak antikor kullanilmaktadir. Kullanilan antikorlar oldukça pahali olup gerek konfigürasyon problemi gerek antikorun bozulmasi sebebiyle alternatif yöntemlere basvurulmaktadir. Bugüne kadar, LFA platformunda patojenik bakterileri tanimak için antimikrobiyal peptitler, aptamerler, antibiyotikler gibi çok sayida ajan kullanilmistir. Ancak antimikrobiyal peptitler ve antibiyotikler, belirli hedef patoj enleri taniyacak kadar spesifik degildir Literatürdeki veriler degerlendirildiginde Reseptör Baglayici Proteinlerin (RBP) LFA,larda biyoalgilayici olarak kullanildigi bir çalismaya rastlanmamistir. Literatürdeki çalismalarda RBP'lerin proteazlara ve deterjanlara karsi yüksek dirençli çok kararli proteinler oldugunu gösterilmistir. Genel olarak, yüksek stabilite, özgüllük ve rekombinant ekspresyon kolayligi, RBP'leri antikorlara karsi mükemmel alternatifler ve yeni teshis teknolojilerinin gelistirilmesi için ideal araçlar haline getirmistir. Bunun yaninda fajlarin konakçilarinin bulunabildigi her ortamda bulunma özelligi faj proteinlerinin fizyolojik sivilarda da stabil davranisa sahip olabilecegini göstermektedir. Fajin kuyruk ucunda bulunan RBP,ler ile bakteri yüzeyindeki ligandlar/reseptörler (Gram negatif bakterilerde LPS, dis zar proteinleri, pili ve flagella; Gram pozitif bakterilerde teikoik asit ve lipoteikoik asit birimleri) arasindaki etkilesim, yüksek spesifite barindirir ve bu baglanma esas alinarak RBP,ler rekombinant olarak üretilebilir veya ticari olarak temin edilir. Bakteriyo(faj), yaklasik 1030 partikül ile dogada en yaygin bulunan biyolojik sistemdir. Bakterileri spesifik olarak enfekte ederek kendi hayat döngüsünü saglar. Bakteriyofajlarin karakteristik özelligi, konak bakteri yüzeyinde bulunan molekülleri spesifik olarak tanima yeteneklerinden kaynaklanan belirli bakterilere olan afiniteleridir Bakteriyofajlarin bakteri tanisinda kullanildigi çesitli yöntemler vardir. EP3332022B1 ve bakteriyofajin fotoakustik hücre içeren bir tespit sistemi yoluyla belirlendigi bir yöntemi açiklamaktadir. bakteriyofaj in, bir konakçi bakteri ile temas ettirilmesini ve içinde boya veya florokrom etiketli nükleik asit içeren bakterinin, bir optik tespit araciyla tespit edilmesini açiklamaktadir. Bulusun Kisa Açiklamasi Bakteriyofajlar bakterinin yüzeyindeki özgül reseptörlere baglanirlar, Bu nedenle bir bakteriyofaj ancak baglanabilecegi reseptörler tasiyan bakterileri teshis edebilirler. Bulusun ana hedefleri nanopartikül isaretli veya isaretsiz RBP ile çesitli kaynaklardan gelen örneklerdeki patojenlerin tanilanmasi; portatif, uzman gerektirmeyen ve spesifikligi yüksek RBP bazli-LFA biyosensör ile yerinde taninin saglanmasi, ve enfeksiyon etkeninin hizli bir sekilde belirlenmesi ile etkin izolasyonlarin saglanmasi sonucu yayilimci enfeksiyonlarin engellenmesi ve patojene spesifik ilaçlarin kullanimiyla gereksiz genis spektrumlu ilaç yüklemelerinin önüne geçilmesidir. Dirençli patojen kaynakli hayati ve ekonomik kayiplarin giderek artmasinin önüne geçilmesine yönelik tani odakli çözüm arayisinda konakçi duyarligina sahip faj larin kullanimi için yatay akis analizi (LFA) ile hizli tani kiti gelistirilmistir. Bulusta; LFA sisteminde taniyici molekül olarak antikor esasli tanima yerine RBP esasli tanima prensibi uygulanmistir. Bu bulus kapsaminda yakalayici prob olarak bakteriyofaj reseptör baglayici protein (RBP) kullanilarak lateral flow analizi test seridinin gelistirilmesi hedeflenmistir. Gelistirilen test seridinin düsük maliyetli ve tek kullanimlik olmasi önemli bir avantaj dir. Bulusun Detayli Açiklamasi Gelistirilen bulus, bir numunenin içerdigi bakterinin tipi, türü veya susunun tespitine yönelik bir test yöntemi olup, özelligi yakalayici probun (4) bakteriyofaj reseptör baglayici protein (RBP) içermesidir. Kullanilan reseptör baglayici protein altin nanopartiküller ile konjuge halde isaretli veya isaretlenmemis olabilir. Ayrica gelistirilen bulus, bir numunenin içerdigi bakteri tipi, türü veya susunun tespitine yönelik test yönteminin uygulanmasini saglayan bir tani kiti ile ilgilidir. Tani kitinin özelligi bakterilerin identifikasyonu amaciyla bakteriyofajin konakçisina baglanmasini saglayan reseptör baglayici protein kullanilmasi ve antikorlar ile yakalama yerine oldukça ekonomik ve kolay kobalt veya nikel (Ni-NTA, Nickel Nitrilotriacetic) metal selatli resin sistemiyle yakalama yapilmasidir. Uygun kobalt veya nikel (Ni-NTA) metal selat resin sistemi ticari olarak temin edilebilir (ThermoFisher). Ayrica yakalayici probun içerdigi reseptör baglayici protein altin nanopartiküller ile konjuge halde isaretli olabilir. Patent kapsaminda bakteri ifadesi ile bakteri tipi, türü veya susu anlasilmalidir. Reseptör baglayici protein (RBP) olarak hedef mikroorganizmaya özgü RBP kullanilir. Örnegin bu amaçla Staphylococcus aureus tanisi için rGpl44 kullanilir. Test yönteminde tespiti istenen bakteri tipi, türü veya susu ile ayni bakteri tipi, türü veya susu içeren pozitif örnek ve tespiti istenen bakteri tipi, türü veya susunun içerdigi antijenle birlesebilen spesifik faj reseptör baglanma proteini kullanilir. Gelistirilen bulusta yatay akis platformunun Nitroselüloz membran (l), Destek karti (2), Test seridi (3), Reseptör baglayici protein (RBP) içeren yakalayici prob (4), Kontrol seriti (5), Metal selatli resin prob (6), Taniyici prob (7), Konjugat ped (8), Ped üzerinde örnek ve tampon uygulama yeri (9) ve Emici ped (10) kisimlari bulunur (Sekil 1). Yatay akis analizinde kullanilacak platform/test seridinin hazirlanmasi için etiket olarak kullanilacak altin nanopartikülleri sentez edilerek veya ticari olarak temin edilebilmektedir. Analizde mobil faz amaçli sivi olarak; elektrolitler, yüzey aktif maddeler gibi çesitli kimyasallari içerebilen uygun çözeltiler veya tampon çözeltiler kullanilir. Gelistirilen tani kiti ile test islemi asagidaki adimlarla yapilabilir (Sekil 2); a) Numune (12) ve pozitif örnegin (1 l) ped (9) üzerine uygulanmasi, b) Tani kitinin uygun sivi ortama yerlestirilmesi ve numune (12) ile pozitif örnegin (11) ped üzerinde taniyici prob (7) ile temas edinceye kadar ilerlemesi, c) Pozitif örnekteki (11) ve varsa numunedeki (12) spesifik antijenin taniyici prob (7) ile birlesmesi ve olusan konjugatin test seritine (3) dogru ilerlemesi, d) Konjugatin test seritindeki RBP içeren yakalayici prob (4) ile temas etmesi ve konjugat ile RBP ,nin birlesmesi ve konjugat-RBP bilesigi- ilgili faj in konak bakterisi ( öm, rGpl44 için S. aureus) (13) olusmasi, e) Konjugat-RBP bilesiginin kontrol seritine (5) dogru ilerlemesi ve pozitif kontrol için konjugat-RBP bilesigi- ilgili faj in konak bakterisi ( öm, rGpl44 için S. aureus) (13) olusmasi, numune için konjugat-RBP bilesigi- ilgili fajin konak bakterisi ( öm, rGpl44 için S. aureus) (13) olusmadigi takdirde RBP ile baglanmamis konjugat ile metal selatli resin birlesmesi adimlari ile uygulanir. Numune ve pozitif örnek ayni antij eni içerdigi takdirde; pozitif kontrol ve numune için konjugat- RBP bilesigi (13) olusur ve e) kademesinde metal selatli resinle birlesmez. Numune ve pozitif örnek ayni antijeni içermedigi takdirde; pozitif kontrol için konjugat-RBP bilesigi (13) olusur, ancak numune için konjugat-RBP bilesigi (13) olusmaz ve e) kademesinde RBP ile baglanmamis konjugat- metal selatli resin bilesigi (15) olusur. Buna göre e) kademesinde metal selatli resin konjuge olmadigi takdirde test edilen örnekte bulunan bakteri ile pozitif örnekte bulunan bakterinin ayni oldugu anlasilir. Aksi durumda e) kademesinde metal selatli resin konjuge oldugu takdirde test edilen örnekte bulunan bakteri ile pozitif örnekte bulunan bakterinin ayni olmadigi sonucuna varilir. Tani kiti uygun sekilde ambalajlanabilir. Ambalaj içinde en azindan test edilecek bakteriye uygun RBP, metal selatli resin, mobil faz olarak siVi bulunabilir. Ambalaj üzerinde ise test edilecek bakterinin adi ve kullanim talimati belirtilir. Sekillerin açiklamasi: Sekil 1. Bakteri tani kitinin sematik görünümü Sekil 2. Bakteri tani isleminin sematik görünümü Referanslarin açiklamasi: 1- Nitroselüloz membran 2- Destek karti 3- Test seridi 4- Reseptör baglayici proteinleri (RBP) içeren yakalayici prob - Kontrol seriti 6- Metal selatli resin prob 7- Kolloidal altin ile isaretlenmis veya isaretlenmemis taniyici prob (öm, rGp144 ile modifiye 8- Konjugat ped 9- Ped üzerinde örnek ve tampon uygulama yeri1 11315 Emici ped Pozitif örnek Hedef antij en (ilgili faj in konak bakterisi ( öm, rGp144 için S. aureus)) Altinla isaretlenmis yakalayici prob konjugatla spesifik antij en Yakalanmis yakalayici probla sandviç olusumu Baglanmamis isaretli konjugat Gelistirilen LFA test kitinin klinik örneklerde degerlendirilmesi için Tibbi Mikrobiyoloji Laboratuvarinda çesitli kliniklerden gelmis kan kültürü ve burun/bogaz sürüntü örneklerinden tani almis örnekler kullanilacaktir. Klinik kullanima uygunlugunun yani sira, çevre ve halk sagligi açisindan önemli olan sektörlerde, örnegin gida, kimya, ilaç ve çevre analizlerinde uygulama alani bulabilecegi düsünülmektedir. Verifiye edilen LFA kitinin ek çalismalari, S. aureus ve non-S. aureus tanisi almis kan ve bogaz-burun sürüntüsü klinik örneklerinde yapilacaktir. Bu asamada; ayni örnekler, ticari olarak satin alinan S. aureus LFA tani kiti ile degerlendirilecek olup, bulus sonucunda gelistirilen LFA kiti ile sonuçlari karsilastirilacaktir. Bulusta üretilen kâgit tabanli sistemlerin en önemli avantaji maliyetinin düsük olmasi ve hedef moleküle özgü yüzey modifikasyonlarinin yapilabilmesidir. Bulus tek bir analite özgü olup, klinik laboratuvarlarda ve yogun bakim üniteleri gibi alanlarda hizli analize imkân sagladigi için baslica saglik sektöründe kullanimi hedef almaktadir. Ileri çalismalar ile çesitli bakterilere göre spesifik tani kitleri ve bakteri kantitasyonuna imkan verecek kitlerin hazirlanmasi saglanacak olup, bulusun bu gibi gelistirmelerinde ek patentlere basvurulmasi öngörülmektedir. Mevcut bulus, bir test örneginde mevcut olan bakterilerin basit bir prosedürle hizli ve dogru bir sekilde belirlenmesini saglayan bir bakteri tespit kiti saglar. Dolayisiyla mevcut bulus, saglik tesislerinde, gida endüstrisinde, ilaç endüstrisinde ve benzerlerinde sihhi kontrol, proses kontrolü ve kalite kontrolü için kullanilabilecektir. TR TR TR TR TR