TARIFNAME KALSIYUM FOSFAT BIYOSERAMIK VE EKSOZOMLARIN, ANNEKSIN V ARACI MOLEKÜLÜ ILE BAGLANMASI Bulusun Ilgili Oldugu Alan Mevcut bulus, kendi kendine iyilesme potansiyeli düsük, morbidite ve mortalite orani yüksek olan nekrotik ya da travmatik kemik hasarlarlî ve metabolik bir kemik hastalFgI_ olan osteoporoz ile ilgilidir. Bulus, kemik hasarlarmm onarEhEia yönelik olup doz ayari: olarak hücresel olmayan, kemiklesmeyi tetikleyecek hücresel kargolarEtasSIan osteoindüktif etkili eksozom ve kemik rejenerasyonu için önemli osteokondüktif etkili kalsiyum fosfat komponentlerinden olusacak olan süper tasgißümolekülün etkilerini içermektedir. Bu dogrultuda, klinikte replasman ameliyatlarüsîîasîida da kullanElabilecek, etkin, hücresel olmayan, koruyucu veya tedaviye yönelik bir yöntem gelistirilmesi hedeflenmistir. Bulusla ilgili Teknigin Bilinen Durumu (Önceki Teknik) Kemik dokusu kendini tümüyle yenileyebilen dinamik bir dokudur. Osteoporoz gibi metabolik hastaliklarda, osteonekroz ya da travmatik kemik hasarlarinda kemigin hücre- matriks yapßlîve mineralizasyon mekanizmas leozulabilir. Yaslanan nüfus ile artan, kemik mineral kayb @la seyredip kEEklarla sonuçlanan osteoporoz ve travmalar ya da kemik dolasEh bozukluklarjsonucu olusan osteonekroz dünyada en yüksek morbidite ve mortaliteye neden olan iskelet hastalEBlarElEL Dünya SaglEk Örgütünün 2003 raporuna göre osteoporoz; Avrupa, Japonya ve Amerika Birlesik Devletleri°nde 75 milyondan fazla insanüetkilemekte ve y[[da 2.3 milyon kEEga neden olmaktadi (Dumell-Scguiling vd., 2011). Bu tür kilklarda dß ve iç tespitin yanEs Ea kirik iyilesmesine olanak saglayacak yapilandiiildl i(oste0k0ndüktif) veya tetikleyici/yapicl (osteoindüktif) medikal malzemelerin kullanilmasl gerekmektedir. Amerika Birlesik vd., 2015) ve tüm kalça eklem replasman cerrahilerinin yaklasik %10'unun osteonekroz nedenli oldugu bildirilmektedir (Mankin vd., 1992). Toplumda sEk görülen osteoporoz ve 0steonekroz`un ilerleyisinin durdurulmasj sorunlu bölgede yeniden kemiklesmenin ve mineralizasyonun saglanarak tedavinin basargtla gerçeklestirilmesi yüksek morbidite ve mortalite oranlarîi B indirgeyeceginden önemlidir. Osteoporoz gibi metabolik kemik hastalklarnda, nekrotik kemik hasarlartnda rejenerasyon dengesini saglamak için ilk asamada tbbi tedavi yöntemlerine basvurulur. Bu yöntemler; besin takviyeleri, ilaçlar, egzersiz ve fizik tedavi yaklasîmlar Il kapsamaktad It Osteonekroz tedavisinde ise femur basTiÜkomyucu girisimler ve femur basîiii yüzeyinin degistigi veya femur basEiEi feda edildigi girisimlerin yanjsia bu yaklasiilara alternatif olarak, hücresel tedavi yöntemleri ve biyomühendislik yaklasühlar ile hasarlü bölgenin onariiîia yönelik çalßmalar yapÜInaktadm Osteoporozun tedavisinde, osteogenezin tetiklenmesi önemlidir. Bu amaçla klinikte öncelikli olarak osteoblastlarm fonksiyonlarEiÜ uyarBDya da osteoklastik rezorpsiyonu önleyici ilaç tedavisi ile destekleyici hücre tedavileri uygulanmaktadE (Antebi vd., 2014; Liu vd., 2015). Osteoporoza baglEkEEklar için eklem replasmanüve fiksasyonu içeren cerrahi tedavi yöntemleri uygulanmaktadE (Pesce vd., 2009; Kim vd., 2017). Bu asamada biyolojik kökenli doku yamalarEblan otogreftler, allograftler ya da metaller, seramikler, polimerler ve bunlarn kompozitleri olan sentetik biyomalzemeler uygulanmaktad n (Korkusuz vd., 2011). Kalsiyum fosfat bilesiklerinin yüksek osteokondüktif etkili oldugu bilinmektedir (Denry vd., 2016; Ginebra vd., 2018). Travmatik ya da metabolik kemik hasarlarmm cerrahi asamaya kadar gelmis tedavisinde kemigin inorganik matriksinin temel bileseni olan hidroksiapatit (HAp) ve diger sentetik kalsiyum fosfat bilesikleri implant kaplamalarEUiabraken vd., 2016; kullan [[abilmektedir. Hidroksiapatitin, nanometre boyutunda kullanmam& malzeme yüzey alanij(Korkusuz vd., 2013) ve saglamltgmümeimbach vd., 2017) arttîdîgübilinmektedir. Pre-klinik ve klinik bir çok osteoporoz çallsmaslnda hidroksiapatit, kemik yaplmlnl l artt Itrken, kemik ylkmn azaltan, bifosfanatlar (Kettenberger vd., 2015; Shen vd., 2016; Ma kullanülnaktadEL Klinikte aynE zamanda hidroksiapatit kaplE implantlarEi, kemik fiksasyonunu arttEdEgE (Moroni vd., 2001) osteoporotik trokanterik kiklarda fiksasyon hatalariüazalttîg](Moroni Vd., 2004), osteoporotik hastalaan kalça replasmanlarnda, periprostetik kemik kaybLni_ azaltt g. Ne implant n femoral sap kisim ndaki kemik mineral yogunlugunu arttirdi gi (Rahmy Vd., 2004) gösterilmistir. Ancak kritik kemik kayiîjlarmda rejenerasyonun saglanabilmesi için, sadece osteokondüktif kalsiyum fosfatlarEi etkileri yetersiz kalabilir ve osteoindüktif temelli yaklas Enlarla amaçla Çesitli büyüme faktörleri (Casarrubios vd.,2020; Izquierdo-Barba vd., 2019; Wang vd., 2017; Shu vd., 2017) ya da bunlara kaynak saglayan kök ve öncü] hücreler (Garcia-Gareta vd., 2015; Oryan vd., 2018) kalsiyum fosfat bilesikleri ile birlikte uygulanabilmektedir. Pre-klinik osteoporoz çal Emalarîida, hidroksiapatit hücre iskelesi içinde uygulanan adipoz kaynakljmezenkimal kök hücrelerin (MKH`lerin) (Chandaran vd., 2018) ve osteoprotegerin ile beraber kemik iligi kaynaklj mezenkimal kök hücrelerin (Liu Vd., 2016), sadece hidroksiapatit ve saglikl igruplara göre osteoporotik kemik rejenerasyonunu yüksek oranda tetikledigi görülmüstür. Pre-klinik, bifosfanat kaynakli tavsan çene osteonektrozu onarimina yönelik bir çalisimada, hidtoksiapatit-adipoz kaynaklHnezenkimal kök hücre kompleksinin sadece hidroksiapatite ve sagl 1113 gruplara göre yeni kemik olusumunu arttidigj görülmüstür (Zang vd., 2019). Osteonekroz klinik çalßmalarmda ise baglantJij gözenekli hidroksiapatit ile kemik iligi kaynaklîtnononükleer hücre kombinasyonunun osteonekrotik bölgenin küçültülmesinde etkili oldugu (Yamasaki vd., 2010; Liu vd., 2012) bildirilmistir. Kemigin kendi kendini onaramadgjosteoporozun kEEErlara neden oldugu ya da kritik boyutlu nekrotik kemik kaygilarîiîi görüldügü vakalarda rejenerasyonun saglanabilmesi için, sadece osteokondüktif kalsiyum fosfatlar n yetersiz kaldigi i durumlarda osteoindüktif temelli yaklasimlarla kombine edilerek daha etkin sonuçlar elde edilmesi saglanmaktadir (Allais Vd., çesitli büyüme faktörleri (Wang Vd., 2017; Shu vd., 2017) ya da bunlara kaynak saglayan kök ve öncül hücreler (Garcia-Gareta vd., 2015; Oryan Vd.; 2018) uygulanmaktadEi Çözünerek Ca2+ ve P043` iyonlarEla ayrÜJan kalsiyum ve fosfat temelli malzemeler hücre içine çesitli kanallar arac JJg Stla (CaSR, L tipi voltajlECa kanal: SLC20u1-fosfat tasStEJhrjvs.) alEiE ve Runx2, ERK1/2, BMP-2 gibi sinyal yolaklarEiEetkileyerek osteogenezi tetikler (Shih Vd., kemiklesme belirteçleri olan genler ve proteinler; BMP-2, BMP-4, BMP-7, Runx2/Cbfa-1, Osteriks, tip 1 kollagen , osteopontin, osteokalsin, kemik siyaloproteinleri (bone sialoproteins- BSP) ve alkalen fosfataz (ALP) olarak slrÄalanabilir. Bu genler ve proteinler, hücrelerin fonksiyonlarmîve farklanmalarîiîkemik olusumu ve iyilesmesi süreçlerinde kontrol eder (Tang Vd., 2018). Mezenkimal kök hücreler olgun hücrelere farklanarak ya da bulunduklarümikro-çevreye parakrin olarak salgühdklarjosteojenik, antiinflamatuvar ve immünsupresif moleküllerin etkisiyle hasarljbölgede rejeneratif potansiyel göstermektedir (von Bahr vd., 2012; Wang 2018). Mezenkimal kök hücrelerin parakrin etkilerini, eksozom adD verilen hücre içi vezikülleri toplu halde hücre dßma salarak gösterdigi bildirilmektedir (Lou vd., 2017; Wu Eksozomlar elde edildikleri hücreye ait nükleik asit, lipid ve proteinleri bulunduran nanometre boyutlu hücre içi yerlesimli keseciklerdir (Farooqi Vd., 2018; Raposo Vd. 2013). Mezenkimal kök hücre eksozomlarU bu hücrelerin rejeneratif etki süreçlerinden sorumlu molekülleri içermeleri (Deng Vd., 2018; Marote Vd., 2016), hedef hücre içine kolayca alhmalarICheng Vd., 2017; van Neil Vd., 2018) ve immün yanü olusturmamalarFKCosenza Vd., 2018; Burello vd., 2016) nedeniyle, kemik rejenerasyonunu hedefleyen çalEmalarda kullanETmaktadEl Ayrßa eksozomlar, tasîlklarü moleküller sayesinde transkripsiyonun düzenlenmesi, gen ifadesinin kontrolünü saglayabilmeleri ve nükleus içermediklerinden, spontan malign transformasyona ugramamalarü nedeniyle MKH71erin yerine tercih edilmektedir (Rezaie Vd., 2018). Kalsiyum fosfat hücre iskelesinin, insan kökenli uyartüng pluripotent kök hücrelerden farkl lastlnlmls MKH eksozomlar. lile, PI3K/Akt yolag lüzerinden, kemiklesme sürecinde olumlu etkileri kanltlanmlstlr (Zhang Vd., 2018). Shuo Yang Vd. yapmls oldugu çal smada öncelikle hidrojeller (HA-ALG) sentezlenmekte sonrasîida hidroksiapatit (HAP) eklenerek enjekte edilebilir hidroksiapatit (HAP)"in situ çapraz baglEgömülü hyaluronik asit-aljinat (HA-ALG) hidrojel sistemi elde edilmektedir. Son olarak da eksozomlarEi hidroksiapatit (HAP)'in situ çapraz baglügömülü hyaluronik asit- alj inat (HA-ALG) hidrojel sistemine entegrasyonu saglanmaktad E. faydalü biyolojik bir tasßißüve osteojenik prekürör hücrelerden elde edilen ürünleri içeren kompozisyonlari temel almaktadn Osteojenik progenitör hücrelere örnek olarak SM30, MEL2 ve SKll hücre hatlarlnl, hücre türevi preparatlar olarak lizatlar, özler, liyofilizatlar, eksozom preparatlarî lve sartlandlrllrnsl ortamlarl, biyolojik tas yîd lar olarak da kolajen (örnegin, kolajen süngerler) ve hidrojelleri göstermislerdir. Teknigin bilinen durumunda eksozomlarîl herhangi bir baglayîijmolekül ile tasßzßßza baglanmas Dsöz konusu olmadgidan dolayEmalzemenin hücre içerisine girisinin takibi zor olmakta ve maksimum verimde eksozom kullanEn miktarütespit edilememekte ve bu durum da malzeme kay @lar Ila neden olmaktadm Bulusun K ,da Aç klamas `_ive Amaçlar J Mevcut bulus yukarma bahsedilen gereksinimleri kars Jhyan, tüm dezavantajlarE ortadan kald fan ve ilave baz Evantajlar getiren, nano boyutlu kalsiyum eksik hidroksiapatit (KEHA) ve eksozomlarîi, Anneksin V arac Emolekülü ile baglanarak morbiditesi ve mortalitesi yüksek olan kemik hasarlari tve metabolik kemik hastaliklarlnda hastallgln profiline göre onarlcl ve koruyucu etki gösteren güvenli doz kontrollü bir tedavi edici ürün ve bunun elde edilme yöntemi ile ilgilidir. Bulusun öncelikli amacü nano boyutlu kalsiyum eksik hidroksiapatit (KEHA) ve eksozomun Anneksin V aracjmolekülü ile baglanarak tedavi edici ürün kompleks elde edilmesi ve ürünün hücreye bir arada alEiarak es zamanlEve kombine etkilerinin tespit edilmesidir. Bulusun amac: klinikte pratik olarak kullanEIabilecek, morbiditesi ve mortalitesi yüksek olan kemik hasarlarE ve metabolik kemik hastalklarida hastalgßi profiline göre onarßü ve koruyucu etki gösteren güvenli doz kontrollü bir tedavi edici ürün elde edilmesidir. Bulus ile, hücresel tedavilerin getirebilecegi riskleri baridimayan, doz kontrollü, kemik rejenerasyonu için gerekli osteokondüktif ve osteoindüktif komponentlerin her ikisini de tas yan, inovatif ve potansiyel etkili bir tedavi ajanln üretimi hedeflenmektedir. Bulusun bir diger amac`,l kemige içten nüfuz etmek suretiyle hlzla sonuç veren, kemigi güçlendirerek osteoporozda kaybedilen kemik dokusunu yerine getirmekte destekleyici olan kemik iligi bosluguna uygulanabilecek bir malzeme elde etmektir. Bulus ile, malzemenin kompleks olarak (KEHA ve eksozom bir arada) hücre içine girisi saglanarak takibi teknikte bilindigi gibi tek tek malzemelerin hücre içerisine al Elmas Ea göre daha rahat olmaktadî Bulus ile sadece enjekte edilebilir malzemelerin degil, aynüzamanda KEHA bazljdoku iskelelerine de eksozomlarn baglanmasu mümkün olmakta böylece birden çok formda kompleks malzeme ihtiyaca yönelik hazirlanabilmektedir. Bulus taslyldl kompleksi, kemigin korunmasl lveya rejenerasyonunu gerektiren durumlarda kullan FI"maktadüi Bulus tasglZiEkompleksi ayrßa nekrotik ya da travmatik kemik hasarjveya metabolik kemik hastalglilan osteoporoz veya osteonekroz tedavisinde kullan [Trnaktadß Bulus ile ayrßa nano-hidroksiapatit"in ve mezenkimal kök hücre eksozomlarßm, osteoblast hücre hatlarüidaki etkili ve güvenli doz aralEgESaptanm Et& Bulusu Açlklayan Sekillerin Tan mlari l Bulus konusunun daha iyi anlasllabilmesi için gerekli olan sekiller ve ilgili açEklamalar asag Baki gibidir. Sekil 1: (A) Sentezlendikten sonra vakumda kurutulmus KEHA örnegine ait XRD difraktograml (B) Sentezlendikten sonra 750°C"de sinterlenmis ß-TCP örnegine ait XRD difraktograml görülmektedir. Sekil 2: (A) Kurutma sonrasTKEHA ve (B) 750°C°de sinterleme sonrasTß-TCP örneklerine ait XRD difraktogramlarüve HA (PDF No: için referans kartlara ait XRD difraktogramlar Egörülmektedir. Sekil 3: Kurutma sonrasDKEHA ve 750°C°de sinterleme sonrasj elde edilen ß-TCP örneklerine ait Raman spektrumlarü (A) KEHA, (B) ß-TCP7yi temsil etmektedir. Spektrumlarda 962 piki HA spesifik, 947 ve 969 pikleri ise ß-TCP spesifik piklerdir. Sekil 4: (A) Kurutulmus KEHA ve (B) 7500C'de sinterleme sonrasüelde edilen ß-TCP örneklerine ait aydinlllst alan geçirimli elektron mikrograflarl görülmektedir. Sekil 5: Mezenkimal kök hücreler inverte lsllk mikroskobu altlnda igisi sekil gösterilmekte ve kültür plagîna tutunmaktad 11(slraslyla Ki 00, X200). Sekil 6: Insan kemik iligi kökenli mezenkimal kök hücrelerinin akEn sitometrisi teknigiyle belirteçlerini ise yüksek oranda bulundurdugu görülmektedir. Dikey kolon yüzey belirteçlerini bulunduran hücre yüzdesini göstermektedir. Sekil 7: Insan kemik iligi kökenli mezenkimal kök hücrelerin 21. gün yapLlan osteojenik farki lastmma deneyine ait ELISA optik yogunluk degerlerine ait ortalama- standart sapma grafigi görülmektedir. Sekil 8: Büyüme besiyeri ve kondrojenik farklüasma besi yerlerinde kültüre edilen mezenkimal kök hücrelerin 7. gün SOX9 ve COMP genlerinin ifade etme verilerine ait kutu diyagram grafigi gösterilmektedir. Grafikte yatay eksen besi yeri tipini gösterirken, dikey eksen ise gen ifadelenme düzeylerini ifade etmektedir. Düz kutular SOX 9, çizgili kutular ise COMP gen ifadelenmesini temsil edilmektedir. Sekil 9: Eksozom çaplarßîl dagEÜüiEgösterilmistir. Sekil 10: CD63 boncuklarEile yakalanan ve CD81 ile boyanan eksozomlar& ifadelenme oranlarjgösterilmistir. YukarEian asaggfa sEas @la boyanmamß grup, izotip grubu ve CD81 ile baglEgruplarîi pikleri görülmektedir. CD81 boyamasßß ortalama floresan yogunlugunun (387), boyanmamls (57) ve izotip (213) gruplarlnlnkine göre yüksek oldugu belirlenmistir. Sekil 11: (A) Uranil asetat ile boyanmtsi (x100000); (B) fosfotungustik asit ile boyanmts (7480000) eksozomlar görülmektedir. Sekil 12: Eksozomlarü taramalHelektron mikrograflarTgörülmektedir. Eksozomlar hem (A) Eksozomlarub mikrograflar üzerinde yapüan ölçümlerinde 30 ile 150 nm arasjboyutlarda oldugu belirlenmistir. Sekil 13: KEHA ve Annkesin V- KEHA"nîi beraber etkilesimi geçirimli elektron mikrograilarüle görülmektedir. (A) KEHA seramikler (x20000); (B) Anneksin V ile bir araya getirilmis KEHA görülmektedir (x1500). Sekil 14: Izole edilmis eksozomlar n Anneksin V -KEHA karlsilrhna eklenmesi ile elde edilen kompleks malzemenin taramalt elektron mikrografl görülmektedir (x150000). Sekil 15: Kompleks malzeme ve komponentlerine ait raman spektroskopu degerlendirmesi Intansite/Dalga numaras Fgraiikleri ile gösterilmektedir. Sekil 16: SDS-Page Jel elektroforezi kullan Ihrak elde edilen, kompleks malzeme ve komponentlerine ait bantlarEi jel üzerindeki konumlar:görülmektedir. Buna göre soldan saga dogru bantlar sîas Stla Kompleks, KEHA-Anneksin V, Anneksin V ve Eksozom gruplarEiD temsil etmektedir. Sekil 17: Eksozomlarm kompleksten salLanLn zaman/konsantrasyon grafigi görülmektedir. Zamana baglt blarak, ilk 1 saatte eksozomlarln kompleksçe tutuldugu, sonrasnda da kontrollü olarak saltrtdt gt görülmektedir. Bulusun Ayr Iit JDAÇ llamas 3 Bu detaylj açiklamada kalsiyum eksik hidroksiapatit ve insan kemik iligi kaynaklü mezenkimal kök hücrelerinden eksozom eldesi islem adüilar] kalsiyum eksik hidroksiapatitlerin Anneksin V aracüEgEile eksozomlara baglanmasj ve görüntülenmesi sadece konunun daha iyi anlasüînasßa yönelik olarak ve hiçbir sßülayßü etki olusturmayacak sekilde aç [Elanmaktad E. Bulus, kemik iligi kaynaklEmezenkimal kök hücrelerden elde edilen eksozomlarjtas Stan bir tas 3? Il :kompleks ile ilgilidir. Bulus tas y d kompleks; a) Osteokondüktif etki gösteren nano-hidroksiapatit, b) Osteoindüktif etki gösteren mezenkimal kök hücre kaynaklt eksozom, c) a adünîidaki nano-hidroksiapatit ve b adünüidaki eksozomu birbirine baglayan Anneksin V molekülünü içermektedir. Osteokondüktif etki gösteren nano-hidroksiapatit tercihen igne benzeri yap Bad& AyrBa kalsiyum/fosfor (Ca/P) molar oran Etercihen 1.67'den azd E. Nano-hidroksiapatitîn konsantrasyonu O.l-O.5 tig/ml, eksozomun konsantrasyonu ise 25-100 ug/ml aral [g Eidad E. Anneksin V molekülü yapßal olarak kalsiyum ve fosfotidilserin baglanma bölgeleri içermektedir. Ortamda kalsiyum miktart artt g Zaman, ya da Anneksin V baglanabilecegi bir Ca molekülü buldugu zaman, Anneksin V üzerindeki fosfotidilserin baglanma bölgeleri aktiflesir. Bu mekanizma göz önünde bulundurularak, KEHA kalsiyumuna tutunmus olan Anneksin V"ler arac [IEgEile eksozomlarEi membranßda bulunan fosfotidilserin fosfolipidine baglanmas Esaglanm Et 1. 1. Kalsiyum Eksik Hidroksiapatitlerin Üretimi ve Karakterizasyonu: 1.1.Kalsiyum Eksik Hidroksiapatitlerin Üretimi Insan vücudunda bulunan sert dokulaan mineral kanini stokiometrik olmayan hidroksiapatitler olusturur. Stokiometrik olmayan hidroksiapatitte Ca/P oran |1.67°den daha düsük oldugundan bu bilesikler kalsiyum açlslndan eksiklik gösterir. Bu sebeple bu bilesikler kalsiyum eksik hidroksiapatit (KEHA) olarak adlandmlm Tstlîl. KEHA, Elak çökeltme yöntemi ile kalsiyum ve fosforun yüksek saflktaki baslangE çözeltileri kullanührak sentezlenmistir. Bu reaksiyonun reaksiyon kontrol parametrelerinden özellikle pH degisimine karsjoldukça duyarljoldugu literatürde bildirilmistir. Bu yöntem teknikte bilinen bir yöntemdir. Bu üretiminde kullanühn baslangß çözeltileri asagîia verilmektedir. Her iki baslangg çözeltisinin haz Elanmas Eda 18.2 MQ.cm°lik saf su kullanJh'iEti KEHA üretimi için Ca/P oranl ll.55"dir. Baslangiç çözeltilerinin prnm ayarlanmaslnda amonyak çözeltisi kullanllln sttln. Reaksiyon, 45°C"de kar slt 11 Itnakta olan fosfor baslang çi çözeltisine, kalsiyum baslangd çözeltisinin peristaltik pompa ile kontrollü bir sekilde damlatllm san. Çözeltiler karßtîildlktan sonra olusan je] oda sßakllgüida 24 saat yaslandlîllmaya bmaküînßt E. Yasland @ma süresi sonunda santrifüjleme islemini takiben birkaç defa saf su ile yikama yap Jhrak reaksiyon ortam Eidan kalan saf olmayan bilesikler uzaklastmüînst m. Olusan partiküller 80°C°de 12 saat kurutulmustur. Bu kosullarda elde edilen KEHA daha sonra Em islem ile yine çok önemli bir kalsiyum fosfat bilesigi olan trikalsiyum fosfat'a (ß-TCP) dönüstürülebilir. Bu faz asidik susuz dikalsiyum fosfat& CaO gibi bir bazla kat] hal reaksiyonu ile veya Elak kimyasal metotlarla elde edilebilir. ß-TCP yüksek sßaklk faz: oldugundan slvl fazda dogrudan elde edilemez, ancak stokiyometrik olmayan ve Ca/P orani 1 1.33 ila 1.65 arasinda degisen kalsiyum eksik apatitlerden islll islem sonrasi lelde edilebilir. Esitlik l'e göre stokiyometrik olmayan apatitin HA ve ß-TCP'ye dönüsüm reaksiyonu verilmektedir: Birinci denklemde x=1 ve Ca/P oranEl.5 oldugunda elde edilen apatit, kalsiyum eksik apatit (KEHA) olarak adlandEEmakta olup kimyasal olarak ß-TCP fazEia benzemektedir. KEHA"dan @mislem sonras Elsaf ß-TCP fazEelde edilebilmektedir. Bu amaçla sentezlenen KEHA partiküllerinden kurutma sonras Jß-TCP fazijhi elde edilmesi için Is Ilislem uygulanmlstn. 1.2.Kalsiyum Eksik Hidroksiapatitlerin Karakterizasyonu: Elde edilen nanopartikülünün yapüîlübelirlemek için X-@Ilüdifraksiyonu (XRD) ve Raman Spektroskopisi teknikleri kullanlnß, partiküllerin morfolojilerini belirlemek için ise Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM) teknikleri kullanümßtE. Organik ve inorganik maddelerin baglarEhakkîlda kalitatif ve kantitatif bilgilerin yanEs Ea madde veya malzeme yapîlîijmeydana getiren ilgili fonksiyonel gruplar hakkßda da bilgi edinilebilmek için Raman Spektroskopi teknigi de kullanmnßtm. i X-Is n Difraksiyonu ve Raman Analizi: XRD analizlerinde SabancE Üniversitesi Mühendislik ve Doga Bilimleri Fakültesi"nde bulunan Bruker D2 Phaser X-ISEE Difraktometresi kullanEmStE. Raman Spektroskopi Analizlerinde SabancE Üniversitesi Nanoteknoloji Arastmma ve Uygulama Merkezi"nde bulunan, 532 nm yesil lazer eklentisine sahip Renishaw Raman InVia cihazi kullanllm stili. Sentezlendikten sonra vakumda kurutulmus örnege ait XRD difraktogram lSekil l-A'da verilmektedir. Faz analizlerinde HA için 009-0432 noilu standart PDF (Powder Diffraction File) kartFkullanFlhig olup sinterlenmemis örnekte HAiya ait karakteristik pikler tespit edilmistir. Difraktogramda ikincil bir faz olmayi› saf HA varlEgEgösterilmektedir. Sentezlendikten sonra 750°Cide sinterlenmis örnege ait XRD difraktogramj Sekil lB"de verilmektedir. Faz analizlerinde ß-TCP fazjiçin 09-169 n0"lu standart PDF (Powder Diffraction File) kartEkullanElinß olup uygulanan EU] islem ile KEHAinEi tamamEiE ß- TCP*ye dönüstügü Sekil 2 de görülmektedir. Kurutma ve sinterleme sonrasüelde edilen örneklere ait Raman spektrumlarESekil 3" de verilmektedir. XRD teknigi ile elde edilen fazlarîl belirlenebilmesine ragmen, Raman10 spektroskopisi teknigi KEHA"dan ß-TCP°ye kimyasal dönüsümün baslangßü ve tamamlanmasüile ilgili moleküler düzeyde daha hassas bir bilgi verebilmektedir. Bu dönüsüm, PO4 grubunun (P-O bagü simetrik gerilme moduna (v1) ait karakteristik pikin gözlenmesi ile tespit edilebilir. Bu karakteristik pik Sekil 3'deki spektrumlarda KEHA fazE gözlenen iki ayrk pik olarak karslmlza ç kinaktadlr. Bunun temel sebebi, HA birim hücresinde 6 adet PO4`3 grubu olmasina ragmen, ß-TCP fazlnda bu saylnln 42 olmasldlr. Dolay s yla ß-TCP fazlnda fosfat grubundan gelen titresim sayisi n n fazla olmasl l beklenmektedir. Sekil 4-A ve B3de elde edilen spektrumlar XRD sonuçlariia paralel olarak Elislem sonras ji-TCP faz ma geçisi desteklemektedir. o Kalsiyum Eksik Hidroksiapatit ve Beta Trikalsiyum FosfatEi Geçirimli Elektron Mikroskobu ile Morfolojik Analizi: TEM analizlerinde Eskisehir Teknik ÜniversitesFnde bulunan JEOL JEM-ZIOOF UHR7HRP model yüksek çözünürlüklü TEM cihazEkullanÜInEt E. Kurutulmus ve sinterleme sonrasjelde edilen örneklere ait aydEilüi alan TEM görüntüleri Sekil 4-A ve B°de görülmektedir. . Kurutulmus KEHA partiküllerinin stokiyometrik veya stokiyometrik olmayan HA partiküllerinin morfolojisine benzer sekilde igne benzeri morfolojide oldugu gözlemlenmistir [16,20,23]. Yap [Dan ölçümlerde KEHA partiküllerinin, yaklasüst olarak 20 nm eninde ve 150 nm boyunda olduklarUtespit edilmistir. 750°C'de sinterleme sonras faz dönüsümü ile elde edilen ß-TCP partikülleri de KEHA partikülleri ile oldukça benzer bir morfoloji gözlenmistir. Yalnlzca uygulanan Slll isleme bagll olarak partiküllerin kal Blastggözlenmistir. 2. Eksozomlarm Insan Kemik Iligi KaynaklE Mezenkimal Kök Hücrelerinden Izolasyonu ve Karakterizasyoiiu 2.1.Insan Kemik Iligi Kaynak! Mezenkimal Kök Hücrelerin Kültürü: Sßljazot tankEida muhafaza edilen mezenkimal kök hücreler ilk asamada uygun kosullarda çözülmesi saglanmßtm Bunun için; cryo-vialler sEIEazot tankmdan al marak ve hâla 37EC"de su bulunan bir behere koyulmus, içerisinde buz parçacLgLkalmayLneaya kadar bekletilmistir. ArdEldan büyüme besiyeri (MEM-OL, %20 fetal bovine serum, %1 pen-strep, %1 L-glutamin) ile 15 ml"lik santrifüj tüpüne aktarîlhrak 1200 rpm"de 5 dk boyunca santrifüjlenmistir. Elde edilen süpernatan atlrnß ve pellet 10 ml büyüme besiyerinde çözülmüstür. Hemositometrik yöntem ile hücre sayBiügerçeklestirilmistir. Sayin sonras nda hücreler miktarlarma göre hücre kültürü kaplaana ekilip, 37LC ve %5 C02 kosullarndsaglayan inkübatörde inkübe edilmis, 2-3 günde bir büyüme besiyeri ile beslenmistir. Mezenkimal kök hücreler ~%80-90 yogunluga ulastlklarlnda karakterizasyon ve eksozom izolasyonu asamalarl l gerçeklestirilmistir. Deneylerde kullan Han hücreler 5. pasaj olarak kullan llrn @t li. 2.2.Insan Kemik Iligi KaynakllVIezenkimal Kök Hücrelerin Karakterizasyonu: Mezenkimal kök hücreler, UluslararasJHücresel Tedavi Dernegi"nin (The International Society for Cellular Therapy-ISCT) taniiia göre; yag, kemik ve kEkEdak gibi mezoderm kökenli en az iki hücre serisine multipotent farkIJhsma özelligi gösteren, standart kültür kosullarîida bulundugu kaba yapßabilme özelligi olan, CD105, CD90, CD73 yüzey belirteçlerini ifade etmemeleri ile karakterize edilmistir. Hücre kültürü gerçeklestirildigi sîlada hücrelerin, inverte SEI& mikroskobu altüida plastik hücre kültürü kabj yüzeyine yap slabilmeleri ve mezenkimal kök hücrelerin karakteristik özelligi olan poligonal, igsi morfoloji göstermeleri degerlendirilmistir. Kemik iligi kaynakll lmezenkimal kök hücrelerin dördüncü pasajda, bulunduklarl lkültür kabin yüzeyine tutunduklarmgk mikroskopunda gözlemlenmistir. Sekil 5*de ig biçimli mezenkimal kök hücreler sitoplazmik uzant [larg/la görülmektedir. Tablo 1°de yer alan antikorlar ile isaretlenen 4. pasajdaki mezenkimal kök hücrelerin CD38, HLA-DR, CD45 yüzey belirteçlerini düsük oranda ifade ettigi ve CD29, CD44, CD73 ve CD90 yüzey belirteçlerini yüksek oranda ifade ettigi tespit edilmistir (Sekil 6). Bu veriler, mezenkimal kök hücre olma kosullarEiEsaglamaktad E. Osteojenik Farklmastmna; Yirmi bir gün süresince osteojenik farkIJhstima besiyeri uygulanan mezenkimal kök hücrelerin (4. pasaj) hücre içi ALP aktivitesi, büyüme besiyeri uygulanan mezenkimal kök hücrelerin hücre içi ALP aktivitesi ile karsllastlnlllnstln. Yapllan degerlendirme sonucunda osteojenik farklll'astlrma besiyeri uygulanan mezenkimal kök hücrelerin istatistiksel olarak anlamlTlsekilde osteojenik farklllasmalarrlbüyüme besiyeri uygulanan mezenkimal kök hücrelerden yüksek deger verdikleri tespit edilmistir (p= 0,001; Kondrojenik FarkIJhst mina; Yedi günün sonunda kondrojenik farklüast Etna besiyeri uygulanan mezenkimal kök hücrelerin SOX9 kondrojenik farklmasma belirtecinin ifadelenmesinin, büyüme besiyeri uygulanan mezenkimal kök hücrelerdekinden yüksek deger verdikleri tespit edilmistir (Sekil 8). Tablo 1. Bulusta kullan Ian antikorlar tabloda özetlenmistir. Antikor Florokrom Fare anti insan CD73, IgG1 PE Fare anti insan CD44, lgGi FITC Fare anti insan CD45, lgG1 FITC Fare anti insan CD90, IgG1 F ITC Fare anti insan CD38, IgG1 PE Fare anti insan HLA-DR, IgGg APC 2.3. Insan Kemik Iligi Kaynakll Mezenkimal Kök Hücrelerinden Ultrasantrifüj Yöntemi ile Eksozom Eldesi: Kemik iligi kaynakll mezenkimal kök hücreler standart kültür (37°C ve 5% C02) kosullarlnda çogalt ldlktan sonra bulunduklarl kaba tutunduklarl | Slk mikroskopunda tespit edilen hücrelerin içerisinde bulunduklari standart serumlu besiyeri, eksozomlar luzaklastlrllmls serum içeren besiyeri ile degistirilerek eksozom kontaminasyonu engellenmistir. YogunluklarE toplanmßti ArdIidan kademeli santrifüj yöntemleri ile eksozom izolasyonu saglanmßtß. Kademeli santrifüj asamalarEasagElaki gibidir, - 400g"de 10 dk (süpernatan al Elm& pellet atEl'mStE) 3000g"de 10 dk (süpematan alinmls, pellet atllmlstln) 0 10000 g"de 10 dk (süpernatan almmß, pellet atElmßtE) - 30000 g"de 30 dk (süpernatan al Etmß, pellet atlrnßtî) - 100000 gide 90 dk (süpernatan atlltnls, pellet allnmlStlr) 0 100000 g'de 90 dk (süpernatan atüing, pellet al mmßtî) Elde edilen pellet gerekli hacimde HEPES ya da PBS ile sulandEElarak karakterizasyon asamas Ela geçilmistir. 2.4. Insan Kemik Iligi Kaynakll Mezenkimal Kök Hücre Kaynakl lEksozomlarln Karakterizasyonu: Eksozomlar protein miktar analizi, nano-parçacik miktar ve boyut analizi, akLm Sitometrisi ve morfolojik olarak geçirimli elektron mikroskopu ile karakterize edilmistir. - Kantitatif Protein Miktari Degerlendirmesi: Protein analizi için 10 farklEdilüsyonda Albumin çözeltisi haz Elanmß ve standart egrisi için 96 plate"e iki tekrarljolarak 20ul koyulmustur. Eksozom içeren örnek de 1/20 oranEida suland nlarak iki tekrarll lolarak plate"e 20u1 96 kuyucuklu plate,e koyulmustur. Üzerlerine BCA kit karlsilml |80u1 eklenmis ve 30 dk boyunca 60°C de inkübe edilmistir. lnkübasyon sonras nda plate sogumaya blfakllmls ve sonrasinda ELISA okuyucu ile 462nm dal gaboyunda okumas Fgerçeklestirilmistir. Elde edilmis eksozom içeren örnekler için yapman ölçümlerde, yap Ian iki tekrarlü degerlendirme sonucunda 1 ml basßa ortalama 1872,5 ug protein oldugu belirlenmistir. Bu miktar karakterizasyon için yeterli bir miktar olarak degerlendirilmistir. o Nano-parçactk Miktar ve Boyut Analizi: Partikül sayEEve boyutu Nanopartikül Takip Analizi (Nanoparticle tracking analysis-NTA) yöntemi ile iZON qNano Gold (lzon Science Ltd, Christchurch, NeW Zealand)cihazjile gerçeklestirilmistir. Eksozom örnekleri 1:20 HEPES içerisinde dilüe edilmis, 40-225 nm çaplü parçacüllarj hedefleyen, NPSO nanopor aparat: kullanllarak ölçüm 0.56V akil ile gerçeklestirilmistir. EksozomlarEi ortalama partikül çaleZl nm olarak tespit edilmistir (Sekil 9). Maksimum parçacEk boyutu aralîg380-383nm olarak bulunmustur. Parçactk çapEiEl modu 96nm7dir. Parçacik konsantrasyonu 5.34e+10 partikül/ml olarak belirlenmistir. o Eksozom Yüzey Belirteçlerinin Akim Sitometrisi ile Degerlendirilmesi: Elde edilen protein miktarEia göre kullanül'icak olan antikorlarîl miktarlarDbelirlenmistir. Yüzey belirteçlerinin degerlendirilmesi için ilk olarak her bir eksozom izolasyon yöntemine göre belirteç için belirlenen her bir tüpe Sul, 3,6um boyutunda (4,2g/100ml) karboksil lateks boncuklar (Thermo Fisher, MA, ABD) eklenmistir. Belirlenen protein miktarlna göre her 1 ug10 eksozom için lnl boncuk koyulmas :gerekmektedin Boncuklar ayrîayrECDQ, CD63 ve CDSl belirteçlerini yakalayacak sekilde grupland Emnßt i. Boncuklar tüplere eklendikten sonra gece boyunca rotator°da karßmalarüsaglanacaktî Ardßdan kargii 10.000 g'de 5 dk boyunca santrifüjlenmis, pelet tüp basEia 50 pl olacak sekilde PBS çözülmüstür. Üzerlerine ilgili antikorlar koyulduktan sonra oda sLdaklLgLnda 1 sa karanltha inkübe edilmis, tüp baslûa 1 mlPBS eklenerek vortekslenmistir. Sonras nda karlslm 10.000 g°de 10 dk santrifüjlenmis, elde edilen pellet 100ul PBS içerisinde çözülerek vortekslenmistir. Hazlrilanan örnekler Novocyte marka akin sitometre cihazia analiz edilmek üzere yerlestirilmistir. Antikorlar ile isaretlenen hücrelerin yüzey belirteçlerinin 10.000 olgu ile okumas Eyap [[arak degerlendirme Akßi sitometre ölçümlerine göre CD 81 ile yakalanan eksozomlarEi CD63 ile isaretlendikleri; yani hem CD81 hem de CD63 yüzey belirteçlerine sahip olduklarEgörülmüstür (Sekil 10). Yapilan analizde CD81 boyanmasEiEi, izotipe göre 1,82 kat daha fazla oldugu tespit edilmistir. Buna göre eksozomlarEi basar :ile elde edildigi sonucuna varÜInßt E. 0 Eksozomlarm Elektron Mikroskop Analizi: Geçirimli Elektron Mikroskopisinde kullanllacak olan fosfotungustik asit (PTA) ve uranil asetat (UA) önceden haz Elanm @t E. Gridlerin mat yüzüne eksozom içeren örneklerden uygun miktarda (~5pl) damlatllîl pipet ucuyla gridlerin üstünün örnek solüsyonuyla kaplanmasü saglanmßti 10-15 dk kadar petrinin agzüyarEaçEk biçimde bekletilip gridlerin üstündeki örnek solüsyonlarlnln çökmesi beklenmistir. 0.22"1ik filtre yardlmlyla süzülen PTA ve UA kullanllarak damlaclk yüzdürme yöntemi kullanîlarak boyama yapllmlst 11. Gridler, eksozom örnegi bulunan mat taraflar ldamlaya temas edecek sekilde damlalar üzerine blrakllm sen. YaklasllL olarak 1-2 dk UA ve PTA7da oda sTcaklFgmda inkübe edilen gridler Ter defa distile su ile yülanarak fazla boyadan arElmemßtm Ylkama basamaklarßdan sonra gridler oda sBaklgîida kurumaya bmakülnßtî Kuruyan gridler TEMide 80 kV°da (JEOL-JEM 1400, Japonya) dijital atasmanlE CCD kamera (Gatan Inc., Pleasanton, CA, ABD) araCJJIgglla kantitatif olarak ultrastrüktürel düzeyde incelenmistir. TaramalE Elektron Mikroskopi için eksozom örnegi HEPES içinde 12100 oranEida seyreltilmistir. Bu sayede eksozomlarEl kümeler olusturulmasüönlenmistir. Eksozom örnegi silikon plaka üzerine damlatüdlktan sonra etüvde 30m3"de 60 dk süreyle kurutulmus; üzeri 5nm kal EiltgEida altEila kaplanmgtü (Cressington Sputter Coating-108 auto model, Ted Pella JEOL Ltd., Japonya). Eksozomlar, tek tek, ya da kümeler halinde, 30-100 nanometre boyutlu yuvarlak kesecikler seklinde izlenmistir (Sekil 11-A,B). Eksozomlar uranil asetat ile pozitif, fosfotungustik asit ile negatif isaretli olarak saptanm LstLti Taramall .elektron mikroskopu ile yapllan incelemede eksozomlar tekli ve gruplar halinde görülmektedir. Eksozomlar n boyutlarl BO ile 150 nm aras nda gözlemlenmistir (Sekil 12A- 3. Kalsiyum Eksik Hidroksiapatitlerin Anneksin V Araemgj ile Eksozomlara Baglanmas Eve Baglanman Il Görüntülenmesi 3.1.Kalsiyum Eksik Hidroksiapatitlerin Anneksin V ile Modifiye Edilmesi ve Görüntülenmesi - Kalsiyum Eksik Hidroksiapatitlerin Anneksin V ile Modifiye Edilmesi: Anneksin V, hücrede apoptozis sßasßda, ortamda Ca moleküllerinin artmasEile, normal sartlar altEida hücre çift katmanljmembranEiEi iç yüzeylerinde bulunan ancak yine aynE esnada hücre membran yüzeyine çülan fosfotidilserinlere baglanarak apoptozis teshisinde kullanüinaktadm Normal sartlarda hücre çift katmanlEmembranEiEi iç yüzeyinde bulunan fosfotidilserin eksozom membranîida dg yüzeyde bulunmaktadm. Bulusta farklE olan, Anneksin V"in bir baglayîi :molekül olarak kullan Jinasüi. Daha önce Anneksin V baglayBD molekül olarak kullanilmamlstlr. Bulusta, KEHA nano parçaclklarl, eksozomun membranlnda bulunan fosfatidilserin moleküllerini hedefleyerek baglayacak Anneksin V ile modifiye edilmistir. Kontrollü analiz için 2 grup hazliilanm slt ri; (i) sadece KEHA içeren grup ve (ii) Anneksin V ve KEHA"i bir arada içeren grup. Sadece KEHA içeren grupta HEPES ile haz Elanan 0,2 nano molar"l[l?( KEHA solüsyonu kullan Illnßt E. Anneksin V ve KEHA içeren grup için solüsyonlar l:l oranElda karßtîümßtî. - Modifiye Edilmis Kalsiyum Eksik Hidroksiapatitin Görüntülenmesi: Örnekler silikon plaka üzerine damlatlklfktan sonra etüvde 30El3°de 60 dk. süreyle kurutulmus; üzeri 5nm kalmlfgßda altEila kaplanmßtm (Cressington Sputter Coating-108 auto model, Ted Pella Inc., ABD) Örnek, düsük vakumlu ikincil elektron detektörü ile incelenmistir (J IB-. TaramalEelektron mikrograflarîlda, KEHA grubunda kristalli yap :görülmektedir (Sekil 13- A). Anneksin V ve KEHA nano kristallerinin beraber uygulandîgjömekte Anneksin V ve KEHA`nLn iç-içe yerleserek etkilesim halinde oldugu görülmüstür (Sekil 13-B). 3.2.Kalsiyum Eksik Hidroksiapatitlerin Anneksin V AracUlEgE ile Eksozomlara Baglanmas Eve Görüntülenmesi: - Kalsiyum Eksik Hidroksiapatitlerin Anneksin V AraCJlEgjile Eksozomlara Baglanmas T: KEHA nanoseramiklerinin anneksin V ile modifiye edilmesi sonraslnda eksozoma membranlnda bulunan fosfatidilserini hedeflemesi saglanm st It Bulusta farkli olan, Anneksin Viin bir baglaylcl molekül olarak kullari lmas d 11. Daha önce Anneksin V baglay d tnolekül olarak kullan lllnam Fstlü - Kalsiyum Eksik Hidroksiapatitlerin Anneksin V AraCJTgjile Eksozomlara BaglandEgIi i Görüntülenmesi: Kompozit baglanmaslnln morfolojik degerlendirmesi için yüksek çözünürlüklü JEOL 4601F MultiBeam Platform (JEOL Ltd., Tokyo, Japan) cihaz l kullanilmlst n. Morfolojik degerlendirme öncesinde örnekler, yüzey yükü etkilerini azaltmak amac Ella, 5nm kal EiIEgEida altElla kaplanmßtîl (Cressington Sputter Coating- Örnek, düsük vakumlu ikincil elektron detektörü ile incelenmistir (JIB-4601F; JEOL Anneksin V, KEHA nano kristalleri ve eksozomlarEi beraber oldugu örnekte eksozomlarEi, KEHA ile kompleks olusturdugu görülmüstür (Sekil 14). 4. Kalsiyum eksik hidroksiapatit-eksozom kompleksinin baglanma analizi Eksozomlarln Anneksin V araclllgl l ile kalsiyum eksik hidroksiapatite baglandlglnln gösterilmesi için Raman spektroskopisi, taramall .elektron mikroskobu ve SDS Page elektroforez yöntemleri kullan [Im St E. 4.1.Raman Spektroskopisi Degerlendirmesi Raman spektroskopisi degerlendirmesinde, 532nm laser kaynagüle Reinshaw Raman in Via spektrometresi ve Leica @13: mikroskopu (Leica, Vienna, Austria) kullanünßt E. Cihaz, 30 nm lazer gücü kullanarak 35 saniyede bir veri toplayacak, 10)( ve 20x büyütme gösterecek sekilde ayarlanm LstLd. Raman spektroskopisi degerlendirmesine göre; örnekler araslnda farkllllklar vardir (Sekil 15). Burada kompleks pikini diger pikler ile karsllast rdîgîmlzt zaman bir baglanmadan bahsetmek mümkündür. 4.2. SDS Page Jel Elektroforezi Kopolimerize jelatin (1.5mg/ml) içeren %12 poliakrilamid jel (llcm çözünmüs jel-0.75mm kalillta) kal Ba dökülmüstür. Örnekler 121 oranüda yükleme solüsyonu (SDS, bromofenol mavi, gliserol, tris ve distile su içeren karßîn) ile karßtEüînßtE. 20°ser ml örnek karßüi: kuyucuklara yüklenmistir. Elektroforez `10 dk 12OV, 60dk 190V olarak uygulanmß, örneklerin j elde yürümeleri saglanm St m. Elektroforez sonucuna göre kompleks, CDHA-AnneksinV karßîhîia ve sadece AnneksinV örnegine göre ilerledigi tespit edilmistir (Sekil 16). Bu sonuca göre baglanmanîi gerçeklestigi sonucuna varilabilir. Malzemelerin aglrtllklarl \ benzer oldugundan bantlar yakln olarak görülmüstür. . Kalsiyum eksik hidroksiapatit-eksozom kompleksinden eksozomlarîl salih: esit konsantrasyonlarda santrifuj tüplerine hazElanmEtî Süresi dolan örnek ilk olarak 1200 rpm"de 10 dk boyunca santrifüjlenmis sonras Eida da süpernatandan alElan örneklerin içerdikleri eksozom miktarDBCA protein tayin yöntemi kullanüarak ELISA okuyucu ile 562 nm dalga boyunda analiz edilmistir. Sami deneyine göre, 25 ug olarak baslayan eksozomlarB ilk 1 saat içinde miktarEidaki düsüs; eksozomlar n CDHA-AnneksinV ile baglandgn. tve ilk 12 saatte büyük çogunlugunu (yaklas k 10 ug°\n\)l kontrollü bir sekilde serbest bmaktlglrll göstermektedir (Sekil 17). 12-24 saat arasl lsal rh yavaslam sl, 24. saatin sonraslnda sallm 21.04 uglda sabit hale gelmistir. Sonuçlara göre, eksozomlarii CDHA-AnneksinV ile kompleks olusturdugu ve sonrasiida kontrollü bir sekilde salEhßEi gerçeklestigi gösterilmistir.Intansite (sayim). TR TR TR TR TR TR