TR201815511T4 - Preni̇llenmi̇ş protei̇nleri̇n kalicilaşmasi ve/veya bi̇ri̇kmesi̇ i̇le i̇lgi̇li̇ hastaliklarin tedavi̇si̇ i̇çi̇n, hmg-coa redüktaz i̇nhi̇bi̇törünün ve farnesi̇lpi̇rofosfataz sentaz i̇nhi̇bi̇törünün bi̇r kombi̇nasyonu - Google Patents

Abstract

Bu buluş, bir hidroksimetilglutaril-koenzim A (HMG-CoA) redüktaz inhibitörünün ve bir farnesil-pirofosfat sentaz inhibitörünün, ya da bunların fizyolojik olarak kabul edilebilir ilişkili tuzlarından birinin, insanlar veya hayvanların tedavisinde, örneğin progeri (Hutchinson-Gilford sendromu), restriktif dermopati veya fizyolojik yaşlanma esnasında olduğu gibi, prenillenmiş proteinlerin hücrelerde birikmesi ve/veya burada kalıcılaşması ile ilgili olarak, patolojik olan veya olmayan durumların tedavisini hedefleyen, özellikle bir farmasötik bileşim olmak üzere bir bileşimin hazırlanmasında kullanımı ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME PRENILLENMIS PROTEINLERIN KALICILASMASI VE/VEYA BIRIKMESI ILE ILGILI HASTALIKLARIN TEDAVISI içiN, HMG-COA REDÜKTAZ INHIBITÖRÜNÜN VE FARNESILPIROFOSFATAZ SENTAZ INHIBITÖRÜNÜN BIR KOMBINASYONU Mevcut bulus, prenillenmis proteinlerin hücrelerde birikmesi ve/ya kalicilasmasi ile ilgili patolojik olan veya patolojik olmayan hastaliklarin tedavisi alaninda yer almaktadir. Ökaryotik hücrelerin çekirdekleri, içindeki gözeneklerle birlikte bir çift zar, iki çekirdek ve sitoplazmik bölüm arasindaki moleküler degisimi kontrol eden bir çekirdek zarfi tarafindan sinirlandirilirlar. Bu zarf kismen çekirdek içerigini, yani genetik malzemeyi ve çekirdek genomunun islevleri için gerekli olan tüm enzimatik mekanizmayi izole eder. Çekirdek zarfi iki es merkezli zar içerir, endoplazmik retikulumla süreklilik arz eden dis zar ve iç zar. Sonraki, iç yüzeyi üzerinde çekirdek Iaminasi olarak adlandirilan yogun bir fibriler örgü tarafindan sinirlandirilir. Bu, büyük ölçüde Iamin polimerlerinden ve ilgili proteinlerden olusan bir protein örgüsüdür. Omurgalilarda hepsi de Iamin üretimine katilan iki Iamin alta sinifi bulunur: tip A Iaminleri (lamin A ve C)ve tip B laminleri (Iamin Bl, BZ ve BS). Sonraki, diger proteinlerle birleserek, çekirdek zarfinin iç zarina sabitlenmek suretiyle yerinde tutulur (süreli yayin için, Gruenbaum ve arkadaslari 2005).

Laminler, hepsi ayni yapiya sahip olan ara filamentler ailesine (tip V) ait olan filamentler formundaki proteinlerdir, yapi su sekildedir: bir kaç alfa sarmali (çubuk alani) içinde organize edilen uzun bir merkezi alan tarafindan diger C-uçlu glolüber segmentten (kuyruk) ayrilan kisa bir N-uçlu globüler segment. Globüler kuyruk, özellikle sentezden sonra çekirdegin adresini belirlemeye izin veren bir çekirdek konumu sinyalini (NLS) içerir. Merkezi alan, iki paralel Iamin molekülünün birlesmesine izin verir ve dimerlerin zit yönlenmelerde birlesmesi ile bunlarin filamentler içinde organizasyonuna izin verir. Bu yapi, bunlara çok dirençli mekanik özellikler bahseder.

Sadece A-tipi lamin ve B-tipi Iamin, öncül sentezinin ardindan olgunlasmaya ugrar (süreli yayin için bkz. Gruenbaum ve ark 2000). C-tipi Iamin dogrudan olgun formunda sentezlenir.

A-tipi ve B-tipi Iaminin öncülleri karakteristik bir CaaX birimi ile sonlanir (C bir sisteindir, a yüklü olmayan alifatik zincir ile birlikte bir amino asittir ve X herhangi bir amino asittir, burada bir metiyonindir, süreli yayin için bkz. Levy & Cau 2003).

C-uçlu CaaX birimi, bir farnesil-transferaz sayesinde bir yag asidinin (genellikle bir C15 yag aside, farnesil) sabitlenmesine izin verir. Bu prenilasyon (farnesil birimi, izopren olarak adlandirilan bir C5 alifatik birimden türetilir), sitozol içindeki sentezlerinden sonra ön retikulumun zarf zarina sokulan ve aktif bölgesi sitozolik olan endoproteazin etkisine ugrarlar. Ön lamin A'nin spesifik endoproteazi Facel'dir (veya ZMPSTE24 (STE24 mayasinin homologu olan Çinko Metallo-Proteaz), diger taraftan Face2 (veya Rcel, Ras- dönüstürücü enzim) B ön laminlerine özgüdür. Bu enzimler, ön Iaminleri 3 amino asit kisaltarak sistein ve takip eden amino asit (alifatik) arasindaki peptit baginin hidrolizini katalizlerler. Daha sonra farnesillenmis sisteinin karboksil ucu, buraya bir metil grubunu esterlesme yoluyla takan bir izopreniIsistein-karboksimetil (ICMT) transferaz tarafindan Sadece ön Iamin A'nin olgunlasmasi, Facel ile ikinci bir endoproteolitik parçalanma ile devam eder, bu da 15 amino asidin bir farnesil-peptidini ve bir olgun Iamin A'yi serbest birakir. Artik yag asidini içermeyen bu Iamin A çözünür hale gelir ve kendi çekirdek konum sinyali vasitasiyla çekirdegin içine tasinir ve çekirdek Iamininin kendi içerisine ve ayrica çekirdek kompartmaninin geri kalanina yerleserek, adeta bir çekirdek iskeleti meydana getirir (Gruenbaum ve ark, 2005). Diger taraftan olgun B Iamin, hala C-ucunda farnesillenmis ve metilesterlenmis sistenine sahiptir. Bu yüzden retikulumun zarf zarinin içine ve sonra çekirdek zarfinin nükleoplazmik yüzüne ve bagli bulundugu çekirdek zarfinin iç zari altina takilmis halde bulunur.

Prenillenmis terimi, ya 15 karbon atomlu farnesil zincirinin ki bu durumda farnesillenmeden bahsedilir ya da 20 karbon atomlu geranil geranil zincirinin ki bu durumda geranil geranillenmeden bahsedilir (Reid ve ark. 2004) veya izoprenin herhangi bir diger türevinin bir sisteininin tiyol grubuna takma olarak anlasilmalidir.

C-ucu FarnesiI-transferaz (FTaz) ile katalizlenen, C-ucu consensus dizisini (CaaX) taniyan farnesillenme tercihen bir farnesil grubunu birimin sistein kalintisina takar.

Geranil geranilasyon, geranil geranil grubunun geranil geraniI-tarnsferaz (GGTaz) ile birimin sistein kalintisina takilmasidir.

Bu yag asitleri, hidroksimetiI-glutariI-Koenzim A'yi kullanarak, özellikle kolesterol, steroidler, hemoglobinin hemi ve ubikinonlari üretmek için hücreler tarafindan kullanilan biyosentez yönteminden kaynaklanir (Hampton ve ark. 1996).

Prenillenmis protein ailesi insan gemomu içinde yaklasik 300 üye içerirler, bunlarin çogu C-uçlu bbirim CaaX ile tanimlanir (Reid ve ark. 2004). Rus, Rho, Rab (Leung ve ark. 2006) protein aileleri, mitokondri için önemli bir islevi yerine getiren belirli proteinler, (HDJZ), bazi mitotik proteinler (CENPE, CENPF) özellikle prenillenmislerdir (Winter-Vann & Casey 2005). Genel olarak CaaX biriminde X bir serin, bir metiyonin, bir sistein, bir alanine veya bir glutamattir, tercihen greftlenen isoprenoid farnesildir. Eger X bir Iösinse, CaaL birimi tercihen bir geranil geranil grubunu katalizleyecek olan GGTaz ile taninir (Basso ve ark. 2006). Izoprenden türetilen diger gruplarin da bu sisteine takilabilmesi mümkündür, ancak bu, literatürde açiklanmamistir.

Insanlarda üç lamin geni vardir. 1q21.2-q21.3'de bulunan LNMA geni (Wydner ve ark. 1996), ardisik uçbirlestirme ile Iamin A ve C'yi verir. LMNA geni 12 eksondan olusur.

Ekson 1'in baslangici Iamin A ve C için sik görülen N-uçlu globüler ucu kodlar, ekson 1'in sonu ve ekson 7'nin baslangicina kadar merkezi sarmal parka kodlanir, son olarak diger eksonlar C-uçlu globüler ucu kodlar (Levy & Cau 2003).

Aslinda gen 4 farkli sekilde uç birlestirilme yapilmis ürünleri kodlar, bunlar arasinda Iamin C ve ön Iamin A iki ana üründür (Lin & Worman 1993). Lamin A ve C'nin farklilasan üretimi, ön mesajcinin ekson 10'ununda ardisik bir uç birlestirme alaninin kullanilmasi ile yapilir, böylece Iamin C ekson 1 ila 10 tarafindan ve Iamin A ekson 1 ila 9, ekson 10'un birinci 90 baz çifti ve ekson 11 ve 12 (A-spesifik lamin) tarafindan kodlanir.

Sonuç olarak, ön Iamin A ve Iamin C peptitleri ilk 566 amino asitte aynidirlar, C laminlerinin C-uçlu sonlari ve ön lamin A daha sonra sirasiyla 6 ve 98 spesifik amino asit B-tipi Iaminler üç farkli protein içerirler (Shelton ve ark. 1981): Iamin B1, B2 (en çok temsil edilen iki izoform) ve B3. LIViNBl geni 5q23.3-q31.1'de bulunur ve Iamin Bl'i kodlayan 11 eksonu içerir. LMNBZ geni 19p13.3'de bulunur ve ardisik uçbirlestirme mekanizmasi ile Iamin 32 ve B3'ü kodlar (Biamonti ve ark. 1992).

B-tipi Iaminler ilk gelisim asamalarindan itibaren tüm hücrelerde yapilandirici bir sekilde ifade edilirler, diger taraftan A tipi Iaminler genel olarak embriyonuk soy hücrelerinde bulunmazlar (Rober ve ark. 1989, Stewart ve ark. 1987) ve tüm farklilastirilmis somatik hücrelerde ifade edilirler. Ifadeleri, dokuya göre düzenlemelere tabidir ve bu hayat boyu sürer (Duque ve ark. 2006). ifadelerinin gerekli olmadigi görülür, çünkü Iamin A ifadesinin özellikle bloke edildigi, ancak lamin C ve diger laminlerin ayni sekilde ifade edildigi fareler herhangi bir belirgin fenotipe sahip degillerdir (Fong et al 2006).

Laminler, çok çesitli islevlere sahip çok yüksek sayidaki proteinlerle etkilesirler, sonunda DNA replikasyonunu ve onarimini, transkripsiyon ve uçbirlestirme kontrolünü, kromatin yapisi organizasyonunu içeren çok büyük sayida çekirdek proseslerine dahil olurlar (süreli Gruenbaum ve ark. 2005). Lamin yapisinda degisiklikler çok sayida kalitimsal insan patolojilerine yol açar. Laminleri kodlayan genlerin veya Iaminin diger proteinlerinin mutasyonlarina baglidirlar. Bu patolojiler, Iaminopatiler jenerik terimi altinda gruplandirilirlar (Broers ve ark. 2006, Mattout ve ark. 2006). Yakin zamanda laminlerin (özellikle Facel) olgunlasmasindan sorumlu enzimlerin genlerindeki, yine Iaminopati grubuna ait patolojilere yol açan mutasyonlar tanimlanmislardir (Navarro ve ark. 2004 ve 2005) Bugüne kadar, insanlarda LMNBI veya 2 genlerinin mutasyonlari ile iliskili tek patoloji, LMNBl geninin tam bir duplikasyonunun neden oldugu bir lökodistrofidir (Padiath ve ark. 2006). Barraquer-Simon sendromundan muzdarip hastalarda LMNBZ içinde bulunan varyasyon dizilerinin potansiyel içerimlerine dahil bir süphe bulunmaktadir (Hegele ve ark. deneyleri ile in vitro olarak (Harborth ve ark. 2001) ve muriri modelinde gösterildigi gibi (Vergnes ve ark. 2004), B tipi Iaminler hücre gelisimi ve bütünlügü için çok önemlidirler. Bu, Iamin Bl yetmezliginin farelerde perinatal ölüme yol açmasindan kaynalanir. Ayrica ayni LMNBl yetmezligi olan ayni farelerin embriyonik fibroblastlarinin çekirdegi, çekirdek morfolojisinde, LMNA geminin mutasyonlarini tasiyan hastalarda gözlenene yakin, göze çarpan degisimler sergilerler.

Ayrica yakin zamanda B-tipi Iaminlerin, mitoz sirasinda bölünme igciginin olusumu için gerekli oldugu gösterilmistir, bu da hücre döngüsü sirasinda bunlarin rolünün dinamik ve çoklu oldugunu, sadece çekirdegin yapisinin korunmasi ile sinirli olmadigini kanitlama egilimindedir (Tsai ve ark. 2006). Sonraki rol için son zamanlardaki bir makale B-tipi hücreler hücre içinde, kendi üzerine dönen bir "yüzme” etkisine sahiptirler (Li ve ark. 2007). Iki Iamin Bl ve 82 arasinda var olan islevsel fazlalik hiç süphe yok ki, yüksek bir seçim baskisini ortaya koyan ve ilgili genlerin dizisinin herhangi bir mutasyonunun etkisini maskeleyen vazgeçilmezliklerinin dogrudan bir yansimasidir.

LMNA geninin mutasyonlarina bagli olarak A/C Iaminleri içindeki islevsel degisiklikler, klinik spektrumda bir dokuyu izole bir sekillde etkileyen hafif formlardan perinatal periyotta ölümcül olan sistemik formlara kadar degisen çok çesitli patolojileri içeren en az 15 bozukluga yol açarlar.

LMNA geninin pek çok mutasyonu çekirdek zarfinda protein birligini gözle görülür derecede degistirir ve bunlarin çalismalarina müdahale eder. Çesitli dokularin hücrelerinde çekirdegin morfolojisi degistirilir: sitoplazmada genetik malzemeyi ekstrüde eden fitikla ra sahiptirler (Goldman ve ark. 2004).

Normalde çekirdek zarfi ile iliskilendirilen proteinler, B Iaminler, çekirdek gözeneklerinin belirli proteinleri ve LAP2 proteinleri bu fitiklarin çevre kenarlarinda mevcut degillerdir.

Bu morfolojik anormallikleri, hücre ölümüne yol açarak sonlanan islevsel degisiklikler takip eder. Laminopatiler terimi altinda birlikte gruplanan tüm patolojiler arasinda, sadece proteinin prenillenmis bir formunun anormal birikimi ile ilgili olanlar mevcut bulus ile ilgilidirler.

Bunlar çogunlukla Hutchinson-Gilford sendromu veya Progeria (De Sandre-Giovannoli ve Bu 2 sendromda, fizyopatolojik neden olgunlasmamis farnesillenmis ön laminîn, hastalarin hücrelerinde birikmesi ve kalicilasmasidir.

Natal peryot sirasinda ölümcül olan restriktif dermopati, neredeyse tamami in utero olarak hareketleri kisitlayan bir kutanöz eksikliginin sonucu olan klinik isaretlerle karakterizedir. Patoloji çok nadirdir. Deri sert ve gergindir ve koltuk altlarinda veya boyun gibi yerlerde terlemelere yol açar. Kirpikler, kaslar ve tüyler yoktur veya çok seyrektir.

Genellikle hidramniyoz mevcuttur ve gebeligin altinci ayindan itibaren fetal hareketlerde bir azalma belirlenir. Radyografi, iskelet düzeyinde tüm eklemlerde daralmalari, deforme ayaklari, ince, displastik ve iki parçali köprücük kemiklerini, kurdele sekilli kaburgalari, kollarin boru biçimli uzun kemiklerini ve kafatasinin demineralizasyonunu açiga çikarir.

Fatal restriktif dermopatinin aktarimi otozomal çekiniktir.

LMNA ve ZIVIPSTE24/Face1 mutasyonlari bu patoloji için bildirilmislerdir (Navarro ve ark. 2004). Her iki durumda da fizyopatolojik mekanizma aynidir: ön lamin A olgunlasamaz (sifir Facel mutasyonu ya da ön Iamin A'nin mutasyonla parçalanma bölgesinin ortadan kaybolmasi) ve farnesillenmis olarak kalir ve bu yüzden çekirdek zarina takilir.

Muhtemelen lamin B ve C'nin kendi esleriyle normal bir etkilesimini önleyen anormal öncüllerin hücrelerinin birikimi ve kaliciligi hücrelerin ölümüne ve çok yakinda hastanin ölümüne neden olur. Hücre toksisitesinden sorumlu olanin, ilk önce akla gelen olgun gösterilmistir (Fong ve ark. 2004).

Nisan 2003'te akromandibular displazide yaygin olan semptomlarin ve erken yaslanmayla sonuçlanan bazi hastaliklarin çapraz kontrolünde, bulus sahipleri erken yaslanmanin en tipik ve en ciddi formu olan Progeria'nin LMNA geninin bir mutasyonundan kaynaklanir (De Sandre-Giovannoli ve ark. 2003). Ayni zamanda Hutchinson-Gilford sendromu olarak anilan bu hastaliktan etkilenen çocuklar, normal bir bireyin yaslanmasinin on katina kadar daha hizli olan, ivmelenmis bir yaslanmadan muzdariptirler ve 13 yili asmayan bir ömür beklentileri vardir. Fransa'da yaklasik alti milyon çocuktan biri etkilenir.

Semptomlar cilt yaslanmasi, kellik, çene boyutunda azalma ve ileri yasa bagli problemler, örnegin eklemlerde katilik ve kardiyovasküler bozukluklardir. Sonraki, örnegin miyokard enfarktüsü veya ateroskleroz, genellikle ölüm nedenidir.

EP 1 127 573 29 dokümani, osteoporoz tedavisine yönelik bilesim ve metotlari açiklar.

Daha özel bir anlatimla, tavsanlarda kolesterol düzeyini azaltmak üzere bir statin ve bir polifosfonati birlikte içeren bir bilesimi tarif eder. Bu bilesim, kemik kaybinin tedavisinde (Örnegin osteoporoz) ve/veya aterosklerozun tedavisinde kullanim için uygun olarak tanimlanmaktadir.

LMNA geninin ekson 11'inde bulunan, içerilen mutasyon, 150 nükleotidin silinmis RNAm'ina neden olacak sekilde ör RNAm'nin kriptik bir uçbirlestirme bölgesini aktive eder (De Sandre-Giovannoli ve ark. 2003, Eriksson ve ark. 2003). Bu silinen RNAm'nin, normal Iamin A içinde olgunlastirilamayan, anormal Ön Iamin A Içine translasyonu yapilir: proteaz tanima bölgesini içeren ekson 11'in 50 amino asidinin yoklugu, farnesillenmis grubunu koruyan C-uçlu sona sahip progerinin ikinci parçalanmasini bloke eder. Bu nedenle karakteristik degisikleri, sitozolde nükleoplazm fitiklari ve peripheral heterokromatin dagiliminda anormallikler olan çekirdek zarfinin nükleoplazmik yüzünde takilmis halde kalir (Goldman ve ark. 2004). Burada, ayrica progerinin hücre toksisitesinden sorumlu olan, olgunlasmadan sorumlu (parçalanmalar, metilasyon) bazi enzimlerin yerlestirildigi retikulumun zarf zarina tutturulmak için daha fazla gerekli olan farnesillenmis grubun kaliciligidir (Fong ve ark. 2004).

Bu sistemik patolojiler, normalde yaslanmayla ilgili olan isaretlerin erken ortaya çikisiyla iliskili olma özelligine sahiptirler. Ortak fizyopatolojik özellikleri, yukarida açiklanan sonuçlarla birlikte prenillenmis bir amin olusturmaktir.

Iki yakin tarihli çalisma, çekirdek içi farnesillenmis prelamin -kirpilmis veya kirpilmamis- akümülasyonundaki bir düsüsün, hücre fenotipinin ortaya çikmasini etkili sekilde önledigini göstermistir. Bu çalismalarin ilki, Facel proteaz bakimindan eksik durumdaki progeroid murin modeli üzerinde gerçeklestirilmistir (Pendas ve ark., 2002). Bunlar, lamin A miktarinin yarisini ifade eden fareler (LMNA +/- fare) ile melezlendiginde, Facel yoklugunun etkileri daha az olur (Verela ve ark., 2005). Ikinci çalisma, HGPS hastalarina ait hücrelerin, 'sessiz' (kriptik) splays pozisyonunu hedefleyen morfo/fno (antisens oligonükleotitleri) ile muamele edilmesinin, mutant fenotipi ortadan kaldirdigini gösterir (Scaffidi ve Mistelli 2005).

Yakin tarihli birkaç çalisma (Scaffidi ve Mistelli 2006, Cao ve ark., 2007), Iamin A'nin fizyolojik yaslanma sürecine karistigini gösterir. Daha özel bir anlatimla fizyolojik yaslanma esnasinda, zaman içerisinde sira disi bir Iamin A'nin hücre çekirdeginin periferinde biriktigi gösterilmistir. Bu sira disi Iamin aslinda progerindir ve progerin tarafindan üretilen ve normal yasami ve fonksiyonlari esnasinda zaman zaman ekson 11'in kriptik splays pozisyonunu tesadüfen kullanan hücre, !amin altinda azar azar birikir.

Son olarak "normal sekilde" yaslanan hücre, kendi ölümüne sebep olacak sekilde bu rastlantisal splays olaylarinca yol açilan bir Iaminopatinin herni karakteristigini sergileyebilir.

Ayni moleküler mekanizmalarin, ilk olarak progeriden mustarip bireylerde erken yaslanma isaretlerinden sorumlu oldugu ve ikinci olarak, mutasyonlar bulunmayan bireylerin fizyolojik yaslanmasina çok daha düsük bir düzeyde karistigi görünmektedir. Önceki teknikte, patolojik progerin üretiminin sebep oldugu hücre fenotipini iyilestirmek üzere iki terapötik yaklasim tarif edilmistir. Bu çözümlerin birincisi, ekson 11'deki bu kriptik splays pozisyonunun, bir antisens oligonükleotit ile (Scaffidi ve Mistelli 2005), ya da bir siRNA üreten bir retrovirüs ile (Huang ve ark., 2005) muamelesi neticesinde Sonuçlar in vitro olarak ümit vericidir, ancak burada tarif edilenler bir "gen" terapisi durumudur ve bir in vi'vo etki elde etmek amaciyla bir ilacin bu yaklasim etrafinda gelistirilmesi, kaçinilmaz olarak uzun ve karmasiktir ve OAS'Iarin vektörlestirilmesi ile ilgili tüm dezavantajlar söz konusudur. Ikinci çözüm ise, prelaminler üzerinde bulunan farnesil grubunun farnesil-pirofosfattan transferini katalize eden enzim konumundaki farnesil- transferazin inhibe edilmesinden ibarettir. Bu tip inhibitörler (FTI) kullanildigi zaman, bir olarak restore edilir ve RD farelerinin (KO ZMPSTE24) sagkalimi iyilestirilir (Glynn ve Ancak blokaj ve farnesilasyon, bir dengeleyici geranilgeranilasyon durumuna sebep olabilir (Bishop ve ark., 2003).

Dahasi FTI'Ierin, proteazomu bloke etmek yoluyla hücre siklusunun durmasina sebep oldugu yakin tarihlerde bildirilmistir (Demyanets ve ark., 2006, Efuet ve Keyomarsi, 2006). Dolayisiyla bu uygulama, proteazom tarafindan yikima ugratilmayip muhtemelen ubikitinlendigi üzere, progerin çekirdek plazmasinda bir akümülasyona kuskusuz sekilde sebep olur.

Yakin tarihli ilave çalismalar, progerin farnesilasyonu düzeyindeki düsüsün in vivo olarak morfolojisinde in vitro olarak gözlenen restorasyonu izah etmeye yeterli degildir.

Son olarak FTI'Ier, protein prenilasyon yolaklarinin sadece birine spesifiktir ve post- translasyonel prenilasyonlarin genel inhibitörleri olarak tasavvur edilemez.

Dahasi, bu yolaga ait enzimlerden biri olarak mevalonat-kinaz enziminin tamamen eksik olmasinin, bebeklik döneminde ölümcül oldugu bildirilmistir (Hoffmann ve ark., 2003, tarafindan bildirilen bir sendrom olarak, bu enzimin sentezlenmesini saglayan gene ait fonksiyonun homozigot mutasyon kaybi).

Kapsamli arastirmalardan sonra, bulus sahipleri, bir hidroksimetilglutariI-koenzim A redüktaz inhibitörünün (statinler ailesi) ve bir farnesiI-pirofosfat sentaz inhibitörünün (amino-bisfosfonatlar, NBP ailesi) veya bunlarin fizyolojik olarak kabul edilebilir tuzlarindan birinin kombinasyonunun, prenillesmis proteinlerin hücrelerde birikmesiyle ve/veya kalicilasmasiyla ilgili, patolojik olan veya olmayan durumlarda etkili bir tedavi oldugunu göstermislerdir; söyle ki gerek C15 gerek C20'de ya da karakterize edilmemis formlarda, proteinlerin prenil yolunun tamamini bloke etmektedir. Bulus sahipleri, bir hidroksimetilglutaril-koenzim A (HMG-CoA) redüktaz inhibitörü ile birlikte bir farnesil- pirofosfat sentaz inhibitörünün, progeriden etkilenmis durumdaki hastalarin fibroblastlarinda normal fenotipi restore etmede sinerjistik bir etki gösterdiklerini de bulmuslardir. Bu ortakligin etkisi, tek baslarina kullanilan inhibitörlerin ayri etkilerinden kabul edilebilir sekilde daha yüksektir.

Bu ortak kullanimin progeriden muzdarip hastalarin hücreleri üzerindeki etkisi, proteinlerin prenilasyon sürecinin inhibisyonuna ve dolayisiyla farnesillenmeyen prelamin A'nin görünmesine ve çekirdek semptomlarinin iyilestirilmesine sebep olur.

Bu sonuç, bir hidroksimetilglutariI-koenzim A (HMG-CoA) redüktaz inhibitörünün ve bir farnesiI-pirofosfat sentaz inhibitörünün, ya da bunlarin fizyolojik olarak kabul edilebilir tuzlarindan birinin, prenillenmis proteinlerin hücrelerde birikmesi ve/veya burada kalicilasmasi ile ilgili olarak, patolojik olan veya olmayan durumlarin tedavisini hedefleyen, özellikle bir farmasötik bilesim olmak üzere bilesimlerin hazirlanmasinda kullanilmasinin öngörülmesine imkân verir.

Dolayisiyla, bulusun konusu, hücrelerde progerin ve/veya farnesillenmis prelamin A birikmesiyle ve/veya kalicilasmasiyla ilgili olarak, vasküler endotelyumun bozulmasi, cildin yaslanmasi arasindan seçilen dogal, prematüre veya hizlanmis olsun, yaslanma belirtilerini ve kemik Iizizini içeren patolojik durumlarin tedavisinde kullanimi için bir hidroksimetilglutaryiI-koenzim A (HMG-CoA) redüktaz inhibitörü ve bir farnesiI-pirofosfat sentaz inhibitörü veya bunlarin fizyolojik olarak kabul edilebilir tuzlarindan birini içeren bir bilesimdir.

Hem hidroksimetilglutariI-koenzim A (HMG-CoA) redüktazin inhibitörleri hem de farnesil- pirofosfat sentazin inhibitörleri olan bilesiklerin kullanimi da mevcut bulusun kapsami içerisinde bulunmaktadir. Bulusun konusu, ayni zamanda, hücrelerde progerin ve/veya farnisillenmis prelamin A birikmesiyle ve/veya kalicilasmasiyla ilgili, vasküler endotelyumun bozulmasi ve cildin yaslanmasi arasindan seçilen dogal yaslanma belirtilerini içeren patolojik durumlarin tedavisinde, bir hidroksimetilglutaril-koenzim A (HMG-CoA) redüktaz inhibitörü ve bir farnesiI-pirofosfat sentaz inhibitörü veya bunlarin fizyolojik olarak kabul edilebilir tuzlarindan birini içeren bilesimin terapötik olmayan kullanimidir.

Bu yazida, ayni zamanda, bulusa göre bilesimin, hücrelerde progerin birikmesiyle ve/veya kalicilasmasiyla ilgili patolojik olan veya olmayan durumlarin tedavisine, daha da özel olarak ise hücrelerde, kesilmis veya modifiye edilmis olsun veya olmasin, farnesillenmis prelamin A birikmesiyle ve/veya kalicilasmasiyla ilgili durumlarin tedavisine yönelik olabilecegi tarif edilmektedir. Özellikle, fizyolojik yaslanmanin hücrelerdeki progerinin yasam boyunca birikmesini içerdigi ve progerinin özellikle mezenkimal hücrelerde yogunlastigi kabul edildigi için, bulusa göre olan bilesim, hücresel yaslanmanin deri ve / veya vasküler endotelyum üzerindeki etkilerini önlemeye yönelik olabilir.

Bulusa göre olan bilesim, özellikle hücresel yaslanmanin etkilerinin önlenmesi için, insan veya hayvan, herhangi bir canlinin tedavisine yönelik olabilir. Dolayisiyla bu bilesim, hem tipta hem de veterinerlikte uygulama bulabilir.

Mevcut bulusa göre farnesiI-pirofosfat sentazin her inhibitörü veya fizyolojik olarak kabul edilebilirtuzlarindan biri, bulus konusu bilesimin hazirlanmasinda kullanilabilir.

Fizyolojik olarak kabul edilebilir tuzlar, örnegin hidroklorik, hidrobromik, nitrik, sülfürik veya fosforik asitler ile olusturulan tuzlar, karboksilik asitler, örnegin asetik, formik, propionik, benzoik, maleik, fumarik, süksinik, tartarik, sitrik, oksalik, glioksilik veya aspartik asitler ile olusturulan tuzlar, alkan sülfonik, örnegin metan veya etan sülfonik asitler, ya da arilsülfonik, örnegin benzen veya para-tolüen sülfonik asitler ile olusturulan tuzlar olabilir.

FarnesiI-pirofosfat sentazi özellikle inhibe edici olanlar polifosfonat ailesinin üyeleri, özellikle aminobisfosfonatlar (NBP), ya da bunun fizyolojik olarak kabul edilebilir tuzlarindan biri olabilir.

Polifosfonatlar osteoporoz ve kemik rejenerasyonu tedavisinde siklikla kullanilan sentetik moleküllerdir.

Fosfonat terimi, fosfat ile çok benzer olan moleküller için kullanilir: Fosfonat Fosfat Bisfosfonatlarin (BP) çekirdegi, örnegin ATP durumunda oldugu gibi bir P-O-P bagi ile esdegerdir, ancak oksijenin yerini bir karbon almistir. Bu husus, bu moleküllere özel bir kararlilik kazandirir.

Basit bir bisfosfonat molekülü, iki fosfat grubunun (OgP-) bisfosfonat grubu ile ikame edilmis oldugu ADP ile esdeger olacaktir.

Fosfatlardaki oksijenden farkli olarak merkezdeki karbon da iki baga katilabilir ve bisfosfonatlari özel kilan ise bu karbona eklenen gruplarin tabiatidir. daha fazla azot atomuna sahip oldugunda, amino bisfosfonat, yani NBP söz konusu olur.

Dogal olarak diger substituentler oksijene baglanabilir.

Pek çok metabolik reaksiyonda bir substrat tasiyici olarak pirofosforik asit, ya da çözeltideki pirofosfonat (PPI) kullanilir ve 4” "of `x Pirofosforik asit reaksiyonun sonunda restore edilir. Pirofosfata kenetli moleküller kullanilan metabolik yolaklarin biri, protein prenilasyonu yolagidir.

FarnesiI-pirofosfat sentaz (FPS) enzimince katalize edilen bir reaksiyon olarak, farnesiI-PP vermek üzere bir geraniI-PP (C10) üzerine izopenteniI-PP (C5 temel ünite) asilanmasiyla bir PPi açiga çikarilir.

NBP'ler tarafindan özel olarak inhibe edilen asama, bu asamadir.

Bu bakimdan, aminobisfosfonat (farnesil-pirofosfat sentaz inhibitörü), örnegin asagida belirtilenlerin arasindan seçilebilir: I alendronik asit veya iyonik formu olarak alendronat; - ibandronik asit veya iyonik formu olarak ibandronat; - neridronik asit veya iyonik formu olarak neridronat; - olpadronik asit veya iyonik formu olarak olpadronat; - pamidronik asit veya iyonik formu olarak pamidronat; - rizedronik asit veya iyonik formu olarak risedronat; - zoledronik asit veya iyonik formu olarak zoledronat; - 4-N,N-dimetilaminometan difosfonik asit veya iyonik formu olarak dimetiIaminometandifosfonat; a-amino-(4-hidroksibenziliden) difosfonat.

Tercih edildigi haliyle mevcut bulusa göre zoledronik asit (bir diger adi zolendronik asit) veya iyonik formu olarak zoledronat (bir diger adi zolendronat) kullanilir.

Mevcut bulusa göre HMG-CoA redüktazin her inhibitörü, ya da fizyolojik olarak kabul edilebilir tuzlarindan biri, söz konusu bilesimin hazirlanmasinda kullanilabilir.

Daha özel bir anlatimla HMG-CoA redüktaz inhibitörü, Iipo-çözünür veya hidro-çözünür statinlerin ailesindeki bir molekül, ya da bu molekülün fizyolojik olarak kabul edilebilir tuzlarindan biri olabilir.

Statinler, mantarlarda bulunmustur. Statinler, kolesterol ve steroitlerin biyolojik sentezinde bir anahtar enzim konumunda olup, mevalonik asit içerisinde (çözelti formunda mevalonat) koenzim A'ya kenetli hidroksimetilglutaratin redüksiyonunu katalize eden HMG-CoA redüktaza karsi inhibe edici aktivite sergiler. Bu inhibisyon, hidroksimetilglutaratin iskeleti ile yapisal benzerliklerine dayanir. Sürece karisan metabolik yolak kesin olarak kolesterol biyo-sentezinin yolagi, ancak ayrica prenil gruplari sentezinin de yolagidir ve 5 izopren karbonuna sahip prenil gruplari temel ünitesinin polimerleri, hücrelerde yaklasik 300 proteini modifiye etmek üzere kullanilir ve membranlara sabitlenmelerine izin vermek üzere kendilerine bir Iipofilik kuyruk eklenir.

Tamami piruvat ve HMG-CoA'dan türeyen ana poliprenler geranil (C10), farnesil (C15) ve geranilgeranildir (C20).

Tüm statinler genel olarak hepato-selektiftir, ancak hücrelere giris sekli yönünden tamami ayni degildir. Bunun sebebi, hem pravastatin hem de rosuvastatinin, lipofilik durumdaki diger tüm statinlerden farkli olarak hidrofilik ve dolayisiyla suda çözünür olmalari ve dolayisiyla plazma membranlarindan (ikili Iipit tabaka) serbest sekilde yayilabilmeleridir, ki yüksek toksisite sergilemeleri de hiç kuskusuz bu özellikleri ile izah edilir. Suda çözünür statinlerin hücreye girmek için spesifik bir transportöre (Organic Ani'on Transport 3, yani OAT3, ya da SLC22A8) ihtiyaçlari olur (Takedaa ve ark., 2004).

Hiperkolesterolemi tedavisinde çok fazla kullanilirlar ve nadir olmakla birlikte sekonder etkiler de iyi tanimlanmistir. Bunlar, özellikle rabdomiyoliz vakalaridir (kullanilan moleküle göre vakalarin %1 ila %7'si, Evans ve ark., 2002) ve bu vakalarda tedavi gören hastalarda kas agrisi seklinde görülen öncü belirti, tedavinin hemen durdurulmasina sebep olur.

Bu bakimdan bir statin örnegin atorvastatin, simvastatin, pravastatin, rivastatin, mevastatin (veya kompaktin), fluindostatin, velostatin, fluvastatin, dalvastatin, serivastatin, pentostatin, rosuvastatin, Iovastatin, pitavastatin, ya da bunlarin fizyolojik olarak kabul edilebilir tuzlarinin arasindan seçilebilir.

Lovastatin, pravastatin ve simvastatin, fungal metabolitlerden türetilen moleküller iken digerleri (atorvastatin, serivastatin, fluvastatin, pitavastatin ve rosuvastatin), tamamen sentetiktir. Mevcut bulusa göre tercih edildigi üzere, suda çözünür yari dogal bir statin Mevcut bulusa göre bir veya iki ve hatta daha fazla sayida farnesiI-pirofosfat sentaz inhibitörü ile birlikte bir veya iki ve hatta daha fazla sayida HMG-CoA redüktaz inhibitörü kullanmak elbette mümkündür.

Bu yazida, bilesimin, proteinlerin prenilasyonunun inhibisyonunu gerektiren, patolojik olan veya olmayan durumlarin tedavisine yönelik olabilecegi de tarif edilmektedir. Bu patolojiler adlandirilmis veya adlandirilmamis olabilir, örnegin Costello veya Noonan sendromu, kardiyo-fasiyo-kutanöz sendrom veya Ras ve sinyal iletim proteinlerinin normal olmayan veya kalici prenilasyonu ile ilgili hastaliklar olabilir.

Bulusa göre, bilesim, hücrelerde progerin ve/veya farnesillenmis prelamin A birikmesiyle ve/veya kalicilasmasiyla ilgili, vasküler endotelyumun bozulmasi (vasküler endotelyumun korunmasi), cildin yaslanmasi arasindan seçilen dogal, prematüre veya hizlanmis olsun, olabilir.

Bu yazida, ayni zamanda, bulusa göre bilesimin Progeria (HGPS, Hutchinson-Gilford Progeria Sendromu) ve restriktif dermatopatinin (DR veya RD) tedavisine yönelik farmasötik bir bilesim oldugu tarif edilmektedir.

Mevcut bulusa göre farnesiI-pirofosfat sentazin her inhibitörü ve HMG-CoA redüktazin inhibitörü, söz konusu bilesimde fizyolojik olarak etkili dozlarda avantajli sekilde bulunur.

Genel itibariyla uygulanacak dozlar, ilgili teknikte uzman kisi tarafindan hastaya göre, patolojiye göre, uygulama sekline ve benzer kriterlere göre uyarlanabilir. Dogal olarak, baska etkin maddeler veya fizyolojik düzeyde kabul edilebilir araçlar (tamponlar, salin solüsyonlari, izotonik solüsyonlar, stabilizörler vs.) ile birlikte tekrarli uygulamalar gerçeklestirilebilir.

Genel itibariyla inhibitörlerin günlük dozu, gerekli terapötik etkiyi elde etmedeki minimum doz olacaktir.

Mevcut bulusa göre bir hidroksimetilglutariI-koenzim A (HMG-CoA) redüktaz inhibitörü ve bir farnesil-pirofosfat sentaz inhibitörü içeren bilesimler, sindirimsel veya parenteral uygulama sekilleri için formüle edilebilir.

Bahsedilen bilesimler, eszamanli veya ayri sekilde ya da zaman içerisinde asamali olarak kullanilmak üzere en az bir baska etkin madde, bilhassa bir baska terapötik etkin madde de içerebilir.

Mevcut bulusa göre hidroksimetilglutariI-koenzim A (HMG-CoA) redüktaz inhibitörü ve farnesiI-pirofosfat sentaz inhibitörü, bilesim içerisinde, bir veya daha fazla eksipiyan ile karisim olarak veya inert araçlar, yani fizyolojik olarak etkisiz ve toksik olmayan maddeler içerisinde kullanilabilir. Bu baglamda, ilgili teknikte uzman kisilerce bilinen ve fizyolojik kullanimlar ile uyumlu olan salin, fizyolojik, izotonik, tamponlu ve benzer solüsyonlar örnek olarak verilebilir.

Söz konusu bilesimler dagiticilar, çözücü ajanlar, stabilizörler, koruyucular ve benzer maddelerin arasindan seçilen bir veya daha fazla madde veya araç içerebilir.

Formülasyonlarda (sivi ve/veya enjektabl ve/veya kati) kullanilabilen ajanlar veya araçlar, özellikle metil selüloz, hidroksimetil selüloz, karboksimetil selüloz, siklodekstrinler, polisorbat 80, mannitol, jelatin, Iaktoz, bitkisel veya hayvansal yaglar, akasya ve benzerleridir.

Söz konusu bilesimler, muhtemelen uzatilmis ve/veya geciktirilmis salim saglayan galenik formlar veya aygitlar vasitasiyla enjektabl süspansiyonlar, jeller, yaglar, tabletler, fitiller, tozlar, kapsüller formunda formüle edilebilir. Bu tipteki formülasyonlar için selüloz, karbonatlar veya nisastalar gibi bir ajan, avantajli sekilde kullanilir.

Uygulama, ilgili teknikte uzman kisilerce bilinen her usule göre, tercihen agizdan veya enjeksiyon yoluyla, tipik olarak intramusküler, intravenöz veya intra-peritoneal sekilde gerçeklestirilebilir.

Agizdan uygulama tercih edilir.

Uzun dönemli bir tedavi söz konusu oldugunda tercih edilen uygulama usulü, sublingual, oral veya transkutanöz olacaktir.

Sekil 1, artan dozlarda suda çözünür bir statin (pravastatin P, 20 ila 100 pm) ve bir aminobisfosfonat (NBP zoledronat Z, 20 ila 100 um) ile muamele edilen "normal" referans fibroblastlarinda gerçeklestirilen Western Blot çalismasinin sonuçlarini PSG/. Serit J, prelamin A varligi için kullanilan bir pozitif kontroldür (DR hastalarinin fibroblastlari), serit K ise salt solvent ile muamele edilen negatif kontroldür (PBS).

Sekil 2, ürünlerin her birine ait etkili dozlarda elde edilen sonuçlari gösterir.

Sekil 3, iki ürün birlikte verildigi zaman elde edilen üstün etkiyi gösterir.

Sekil 4, iki ürünün yaslanmis hücreler üzerindeki birlesik etkisini gösterir.

Sekil 5, iki ürünün, farelerin bir progeri modelindeki (Facel enzimi sentezlenmez) birlesik etkisini gösterir. 5a: 3 aylik ve sirasiyla yabanil, Zmpste24-/- ve muamele görmüs Zmpste24-/- farelerini gösteren fotograf.

Ek): 3 aylik yabanil fareler (n=6), muamele görmemis (n=7) ve muamele görmüs (n=7) Zmpste24-/- farelerin agiligi. 5c: muamele görmüs disilerin (n=7) (-<>-) sagkaliminda, muamele görmemis farelere (n=7) (4-) kiyasli anlamli artisi gösteren sagkalim egrisi (Kaplan-Meier 5d: muamele görmüs ve görmemis farelerin tibialarinda uCT tarayici kullanilarak elde edilen, 3 boyutlu sekle dönüstürülen tomografi görüntüsü (üstte). Altta, birim milimetre karedeki trabekül sayisi (sag tarafta, b) ve kemik hacmi (sol tarafta, a) gösterilir. 5e: karaciger hücrelerinde çekirdek anomalilerinin kantifikasyonu (%). Sol tarafta, çekirdeklerin DAPI ile flüoresans isaretlemesi ve sag tarafta, normal disi çekirdek sayisinin sayimi gösterilir.

Asagida verilen örnekler, herhangi bir sinirlama getirmeksizin mevcut bulusu açiklamaya hizmet eder. ÖRNEK 1: Suda çözünür bir hidroksimetiIglutariI-koenzim A (HMGCoA) redüktaz inhibitörü ve bir farnesil-pirofosfat sentaz inhibitörü birlikteliginin, normal hücrelerin kültürleri ve progeroidler üzerindeki sinerjistik etkisi.

A) PROTOKOLLER Hücre dizileri olarak referans amaçli A616409 fibroblastlari (Coriell Institute), ya da restriktif dermopatiden mustarip hastalarin biyopsilerinden alinan fibroblastlar kullanilir.

Bunlar bir P2 odasinda %5 COZ içerisinde 37°C'de yetistirilir.

Normal komplet kültür ortami, asagidaki gibidir fetal dana serumu %20 (Invitrogen) penisilin/streptomisin/fungizon 1X karisimi (Stock 100 X, Cambrex) ~I° Hücrelerin toplanmasi Hücreler, asagida tarif edildigi gibi tripsinasyon yoluyla toplanir (bu protokol, 75 cmz'lik BD Falcon tipi büyük balon içindir): ortam aspire edilir; hücreler 10 ml PBS 1X (Invitrogen), 10 ml ile yikanir; ml'lik bir tripsin/EDTA 1X solüsyonu (Cambrex) ilave edilir; balon, 37°C'de yaklasik 6 dakikalik bir süre inkübe edilir ve bu zaman zarfinda hücreler ayrilir; tripsin, 15 ml komplet ortam içerisinde seyreltilerek inhibe edilir; hücreler, 16°C'de birim dakikada 1000 devirde 10 dakika santrifüjlenerek konsantre konsantre, 2 ml PBS 1X içinde yeniden süspansiyon haline getirilir ve ayni sartlar altinda yeniden santrifüjlenir; hücreler, ya sonradan kullanilmak üzere dondurulur, ya da yikanmis bu konsantreden baska bir yere ekilir. ~2° Muameleler Pravastatin solüsyonu (suda çözünür statîn), asagida tarif edildigi gibi hazirlanir: mM'Iik bir stok solüsyonu olusturmak üzere 40 mg pravastatin (Sigma Aldrich, P4498) steril su içine alinir. komplet ortam içerisinde seyreltilmesi yoluyla elde edilir.

Kullanilan zoledronat solüsyonu (NBP), asagida tarif edildigi gibi hazirlanir: (1-Hidroksi-2-imidazoI-l-il-fosfono-etil) fosfonik asidin (0.8 mg/ml, Novartis) bir stok solüsyonu, 2 mM'Iik bir konsantrasyona ayarlanir. komplet ortam içerisinde seyreltilmesi yoluyla elde edilir. o Hücrelerin hazirlanmasi Hücrelere, bir Western blot deneyi için asagida tarif edildigi gibi muamele edilir: Yaklasik 7.5 x 105 hücre, büyük bir balona ekilir ve yaklasik konflüens durumu saglanana kadar (4 gün) asagidaki sartlarda yetistirilir. 4. günün sonunda hücreler PBS 1X ile yikanir ve muamele ile takviyeli komplet ortam içerisine alinir.

Hücreler, inkübatör içinde 37°C'de islem süresi kadar inkübe edilir (6 ila 72 saat, sirali veya eszamanli sekilde). islemlerin sonunda hücreler tripsinize edilir (yukaridaki protokol) ve elde edilen konsantre, proteinler ekstrakte edilene kadar -80°C`de saklanir. o Proteinlerin Western blot için ekstraksiyonu Hücre konsantresi 300 ul liziz tamponu içine alinir: Triton X100 %1 Sodyum dioksikolat %05 NaCl 50 mM EDTA 1 mM TrîsHCI pH 7.4 20 mM Dogaçlama olarak eklenen: Sodyum orthovanadat 1 mM Hücreler iki kere 30 saniyeligine sonikasyona (Brandson Sonifier Cell Disruptor 815) tabi Hücre kalintisi, 4°C'de birim dakikada 10,000 devirde 10 dakika santrifüjlenir.

Protein süpernatani, kullanilana kadar -80°C'de saklanir.

Proteinler, buzlari çözüldükten sonra dozlu sekilde uygulanir. 0 Western blot deneyi Farkli formlardaki A/C tipi laminleri saptamak üzere konvansiyonel olarak %8'Iik bir akrilamid jel kullanilir.

TrisHCI pH 8.8 375 mM Konsantre birjel, ayirici jelin üzerine bosaltilir: Akrilamid/bisakrilamid 37.5/1 %3 TrisHCI pH 8.8 375 mM Numunelerin protein konsantrasyonu analiz edilir ve numunelerden alinan küçük örnekler, birim qsp 15 |J.I tüpte bulunan Iizîz tamponu içerisinde 50 pg seklinde ayarlanir.

Her bir numuneye 5 pl sarj tamponu eklenir.

TrisHCI pH 6.8 100 mM Glycerol %20 ß-merkaptoetanol %20 Bromofenol mavisi eser miktar Numuneler, 95°C'de 5 dakika isitilarak denatüre edilir ve gözlere konulur.

Bir tampon içerisinde 50 ve daha sonra 100 Volt'ta migrasyon gerçeklesir.

Tris-bazi %03 505 %0.1 i Transfer Transfer membrani (Hybon P, Amersham Biosciences) etanol içine daldirilarak ve akabinde steril suda 5 dakika ve transfer tamponunda 10 dakika banyo edilerek hazirlanir: Tris-bazi 12 mM Glisin 96 mM Etanol %20 Jel, transfer tamponunda 20 dakika nemlendirilir ve daha sonra sandviç monte edilir (Miniprotean system, Biorad).

Transfer genel olarak bir soguk bölmede, 10 Volt'ta gece boyu gerçeklesir.

Membran PBS 1X içinde durulanir, nemden korunur ve deteksiyon için, oldugu gibi kullanilir. i Deteksi yon Membran, doymus bir solüsyonda oda sicakliginda 1 saat inkübe edilir: Kazein %10 Yikama tamponunda (Tween 20 % iki kere 10 dakika yikanir.

Primer antikor, doyurma tamponunda seyreltilir (detaylar ve seyreltme için bkz. asagi immün isaretleme).

Membran, primer antikorlar ile oda sicakliginda karistirma esliginde 1 saat inkübe edilir.

Bu islemin sonunda 3 kere yikama tamponu ile durulanir ve daha sonra ayni tampon ile 3 kere 15 dakika yikanir.

Sekonder antikor (peroksidaza kenetli sistem, Jackson Immunoresearch), doyurma tamponunda 1/10000 oraninda seyreltilir.

Membran, bu solüsyon ile oda sicakliginda karistirma esliginde 30 ila 45 dakika inkübe Bu islemin sonunda 3 kere yikama tamponu ile durulanir ve daha sonra ayni tampon ile 3 kere 15 dakika yikanir.

Deteksiyon islemi, tedarikçi talimatlarina uygun olarak ECL Plus Western Blotting System kiti (Amersham Bioscience) kullanilarak gerçeklestirilir.

Ortaya çikarildiktan sonra membran, tatminkar bir sinyal elde edilmesi için gereken süre kadar Biomax MR filmine (Kodak) alinir. o Hücrelerin hazirlanmasi Bir hücre kültürü tripsinize edilir ve hücreler bir Neubauer cell üzerinde sayilir. yapilir.

Komplet kültür ortami statin, NPB veya her ikisiyle tek veya çoklu kere muamele edilerek takviye edilir ve ad hoc süre kadar yetistirilir.

Bu sürenin sonunda kültür ortami aspire edilir ve gözler bosaltilir.

Kaplar PBS 1X içinde yikanir.

Hücreler %4'lük paraformaldehid solüsyonunda (PBS içinde) oda sicakliginda 10 dakika fikse edilir.

PBS 1X içinde 10 dakika yikanir.

Hücreler, artan etanol konsantrasyonlarina sahip solüsyonlar içeren ardisik banyolarda 3'er dakika yikanarak suyundan temizlenir (%70, %90, %100, son banyo tekrar edilir).

Kurutmadan sonra kaplar kullanilana kadar -80°C'de saklanir. o isaretleme Hücreler, buzlari çözüldükten sonra oda sicakliginda nemli bir bölme içerisinde bulunan 50 ul geçirgenlestirme solüsyonunda 5 dakika inkübe edilir.

Triton X100 %0.5 RNS (normal tavsan serumu, Vector 55000) %5 Her biri 15 dakikalik 3 ön inkübasyon banyosu, 50 ul'lik inkübasyon solüsyonunda gerçeklestirilir: Primer antikor, 50 ul'lik inkübasyon solüsyonunda 1/100 oraninda seyreltilir ve hücreler ile oda sicakliginda bir nemli bölme içerisinde 1 saat temas ettirilir.

Kullanilan primer antikorlar, 2 tiptendir: > Fare anti-lamin A/C (N-termînal tarafi), klon 4A7, bagislayan G Morris (Oswestry, > Keçi anti-prelamin A (15 aa C-terminal ucu), ürün SC6214, Santa Cruz Biotechnology Inc.

Her biri 15 dakika olacak sekilde 50 (il PBS 1X içinde üç durulama yapilir.

Sekonder antikor ile yapilan inkübasyon, bir nemli bölme içinde bulunan 50 ml inkübasyon solüsyonunda oda sicakliginda 1 saat gerçeklestirilir. Sekonder antikorlar, 2 tiptendir: > Anti-mouse donkey, Jackson Immunoresearch, 1/100'Iük seyrelti > Anti-mouse donkey, Jackson Immunoresearch, 1/200'Iük seyrelti Her biri 10 dakika olacak sekilde 50 pl PBS 1X içinde üç durulama yapilir.

Bir nemli bölme içerisinde bulunan ile oda sicakliginda 15 dakika inkübasyon yapilir.

Her biri 5 dakika olacak sekilde, kabi tutan tanklarda PBS 1X içinde üç durulama yapilir.

PBS içinde bulunan %O.1'Iik bir Tween20 solüsyonunda 5 dakika son kez durulama yapilir. 0 Montaj Hücreler, bir damla VectaShield (Vector) içerisine daldirilir, bir Iamel kapak ile kapatilir ve bir cooISNAP (Princeton) kamera sistemi ile donatili bir flüoresans mikroskobu (Leica DMR, Leica Microsystems) üzerinde gözlenir.

B) SONUÇLAR B.1) Western blot (Sekil 1) bir aminobisfosfonat (NBP zoledronat Z, 20 ila 100 um) ile birlikte muamele edilmistir PIOO/ZZO, P100/260, P100/ZlOO). Western blot analizi, Iamin A'nin matürasyonu için farnesilasyonun gerekli oldugunu dogrulamak üzere, iki molekülün konsantrasyonundaki artisa uygun olarak immatür (kirpilmamis) prelamin A'nin boyutuna karsilik gelen bir bandin "ortaya çiktigini" gösterir. Bu sonuç, farnesiI-PP sentezinin metabolik yolakta 2 noktada bloke edilmesinin, tek bir noktada bloke edilmesine kiyasli olarak, prelamin A farnesilasyonunun inhibisyonu üzerinde, hiç degilse ex vivo olarak daha etkili oldugunu gösterir. .2) Immün-histo-kimya uygulamasinda doz ve süre yaniti (Sekil 2) Doz-yanit ve süre-yanit egrileri, bir taraftan saglikli referans hücreleri üzerinde ve daha sonra HGPS hastalarina ait hücreler üzerinde 2 parametrenin ölçülmesi yoluyla, maksimum etkinligin belirlenmesine imkan vermistir. En etkin pravastatin (suda çözünür)/zo|edr0nat (NBP) kombinasyonu, 1 uM pravastatin için 24 saatte ve akabinde zoledronat için 12 saatte elde edilir: saglikli hücreler üzerinde toksisite gözlenmemisken, HGPS hücreler (çekirdek anomalileri olan hücreler) ile ilgili olarak "deforme" hücrelerin sayisi %75`ten %40'a düsmüstür. Ayni zamanda saglikli hücreler üzerinde elde edilen prelamin A düzeyi maksimumdadir. .3) Immün-histo-kimya uygulamasinin etkisi (Sekil 3) Pravastatin ve zoledronatin birlesik etkisi, daha iyidir, çünkü muamele edilmis saglikli hücrelerde üretilen prelamin A düzeyi (%35 olarak kestirilir), moleküllerin tek baslarina eklendikleri durumdan (ayri ayri %25 ve %15) birlikte çok daha yüksektir. Diger taraftan deforme çekirdeklerin düzeyi (saglikli hücreler üzerindeki toksisite isareti), örnegin tek basina pravastatin ile muamele edilen hücrelerdekinden daha az olacak sekilde (yaklasik saat 20 uM zoledronat.

B.4) Immün-histo-kimya uygulamasinda yaslanmis hücreler üzerindeki etki (Sekil 4) yasina göre normal olmayan çekirdeklerin sayisi artar, ki bu durum da muamele edilmemis HGPS hücrelerin bir karakteristigidir. Eger ki hücreler muamele edilir ise, bu oran korunur ve hatta bir miktar azalir (bir plasebo ile muamele edilen hücrelerde görülen %80 oranindan çok daha düsük olan %40'in alti). Muamele sekli: 24 saat 1 uM pravastatin , 12 saat 1 pM zoledronat. 85) Sonuç Pravastatin/zoledronat kombinasyonu, moleküllerin ayri ayri uygulandigi durumda neredeyse hiç etki görülmeyen dozlarda etkindir.

Dolayisiyla prenilasyon kanali blokajinin fizyolojik etkileri, hücre kültürleri hakkinda yayinlanmis olan makalelerdeki tekli tedavilerde kullanilanlardan (Kusuyama ve ark., 2006, vasküler hücrelerin progenitörleri üzerinde tek basina 10 ulvi pravastatin; Flint ve ark., 1997, neonatal siçan kasi hücreleri üzerinde 25 uM pravastatin) çok daha düsük dozlarda elde edilir. ÖRNEK 2: Suda çözünür bir hidroksimetilglutariI-koenzim A (HMG-CoA) redüktaz inhibitörü ve bir farnesiI-pirofosfat sentaz inhibitörü kombinasyonunun, farelerde progeroid sendromu modelindeki etkisi (Sekil 5).

Burada kullanilan KO Zmpste24`/` fareleri, Varela ve arkadaslarina (2005) ait makalede tarif edilenlerdir. Bu fareler, bir yetistirme çiftliginde, kontrollü bir atmosfer altinda, 12 saat aydinlik/12 saat karanlik döngüsünde ve 20 ± 2°C`Iik bir sicaklik ve %SO'lik nemde, istedikleri kadar yem ve suya erisebilecek sekilde yetistirilir. 2 molekül (Zometa 100 ug/kg/gün ve Pravastatin 100 ug/kg/gün), PBS 1X içerisinde çözülür ve 1. aydan itibaren yaslanan farelere Ölümlerine kadar intraperitoneal yoldan günlük olarak enjekte edilir.

Kontrol olarak ayni tipten olup sadece PBS 1X ile muamele edilen yabanil fareler kullanilir. Agirliklari günlük olarak ölçülür ve farelerin sagkalimi bir egri halinde grafige dökülür (Sekil 5b).

Farelerin ölümü üzerine tibialari disekte edilir ve uCT tarayicisi kullanilarak tomografide analiz edilir. Birim milimetredeki trabekül sayisi, Hildebrand ve arkadaslari (1997) tarafindan tarif edilen metoda göre ölçülür (Sekil 5d).

Karaciger hücrelerinden numuneler alinir, 4°C'de paraformaldehid içerisinde fikse edilir, parafine alinir ve kromatinin DAPI (4'6-diamidino-Z-fenilindol) ile isaretlenmesinden sonra esodakli mikroskop ile analiz edilir. Anormal çekirdeklerin yüzdesi sayim yoluyla kestirilir (Sekil 5e).

Muamele edilen farelerin sagkalimi büyük ölçüde iyilestirilir ve ortalama yasam sürelerinde yaklasik %SO'Iik bir artisla özellikle disilerde maksimuma ulasilir (sekil 5c).

Hastaligin klinik semptomlari, sadece PBS ile muamele edilen bireylere kiyasli olarak tamamen kayda deger sekilde azalir.

Referanslar Basso AD, Kirschmeier P, Bishop WR. Famesyl transferase inhibitors. J Lipid Res 47:15- 31, 2006.

Biamonti G, Gîacca M, Perini G, Contreas G, Zentilin L, Weighardt F, Guerra M, Della Valle G, Saccone S, Riva S ve ark.. The gene for a novel human !amin maps at a high/y transcribed locus of chromosome 19 which replicates at the onset of S-phase. Mol Cell Bishop WR, Kirschmeier P, Baun C. Farnesy/ transferase inhibitors: mechanism of Broers JLV, Ramaekers FCS, Bonne G, Ben Yaou R, Hutchinson CJ. Nuclear lamins: Cadinanos J, Varela I, Lopez-Otin C, Freije JM. From immature !amin to premature aging: molecular pathways and therapeutic opportunities. Cell Cycle 4:1732-1735, 2005.

Capell BC, Erdos MR, Madigan JP, Fiordalisî JJ, Varga R, Conneely KN, Gordon LB, Der CJ, Cox AD, Collins FS. Inhibiting farnesylation of progerin prevents the characteristic nuc/ear b/ebbing of Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Proc Natl Acad Sci ABD De Sandre-Giovannolî A, Bernard R, Cau P, Navarro C, Amiel J, Boccaccîo I, Lyonnet S, Stewart CL, Munnich A, Le Merrer M, Levy N. Lamin A truncation in Hutchinson-Gilford Demyanets S, Kaun C, Pfaffenberger S, Philipp J. Hohensinner PJ, Rega G, Pammer J, Maurer G, Haber K, Wojta J. Hydroxymethylglutatyl-coenzyme A reductase inhibitors induce apoptosis in human card/'ac myocytes in vitro. Biochem Pharmacol 71:1324- 1330, 2006.

Duque G, Rivas D. Age-related changes in Lamin A/C expression in the osteoarticular system: Iaminopathies as a potentiel new aging mechanism. Mech Aging Dev 1272378- 383, 2006.

Efuet ET, Keyomarsi K. Farnesyl and geranyigeranyl transferase inhibitors induce GI Eriksson M, Brown WT, Gordon LB, Glynn MW, Singer J, Scott L, Erdos MR, Robbins CM, Moses TY, Berglund P, Dutra A, Pak E, Durkin S, Csoka AB, Boehnke M, Glover TW, Collins FS. Recurrent de novo point mutation In lam/'n A cause Hutchinson-Gilford Flint OP, Masters BA, Gregg RE, Durham SK. HMG CoA reductase inhibitor-induced myotoxicity: pravastatin and Iovastatin inhibit the geranylgeranylation of low- molecular-weight proteins in neonata/ rat muscle cell culture. Tox Appl Pharmacol Fong LG, Frost D, Meta M, Qiao X, Yang SH, Coffinier C, Young SG. A protein farnesyitransferase inhibitor ameliorates disease in a mouse model of progeri'a.

Fong LG, Ng JK, Lammerding J, Vickers TA, Meta M, Coté N, Gavino B, Qiao X, Chang SY, Young SR, Yang SH, Stewart CL, Lee RT, Bennett CF, Bergo MO, Young SG. Prelamin A and Lamin A appear to be dispensabie in the nuclear Iamina. J Clin Invest 1162743- 752, 2006.

Fong LG, Ng JK, Meta M, Cote N, Yang SH, Stewart CL, Sullivan T, Burghardt A, Majumdar S, Reue K, Bergo M0, Young SG. Heterozygosity for Lmna deficiency eliminates the progeria-iike phenotypes in Zmpste24 deficient mice. Proc Natl Acad Sci Glynn MW, Glover TW. Incomplete processing of mutant !amin A in Hutchison-Gilford progeria Ieads to nuc/ear abnorma/ities, which are reversed by farnesy/transferase Goldman RD, Shumaker DK, Erdos MR, Eriksson M, Goldman AE, Gordon LB, Gruenbaum Y, Khuon S, Mendez M, Varga R, Collins FS. Accumuiation ofmutant !amin A causes progressive changes in nuclear architecture in Hutchinson-Gilford progeria Gruenbaum Y, Margalit A, Goldman RD, Shumaker DK, Wilson KL. The nuclear lam/'na comes of age. Nat Mol Cell Biol 6:21-31, 2005.

Gruenbaum Y, Wilson KL, Harel A, Goldberg M, Cohen M. Review: nuclear Iamins - Hampton R, Dimster-Denk D, Rine J. The biology of HMG-CoA reductase: the pros of Harborth J, Elbashir SM, Bechert K, Tuschl T, Weber K. Identification of essential genes 2001.

Hegele RA, Cao H, Liu DM, Costain GA, Charlton-Menys V, Rodger NW, Durrington PN.

Sequencing of reannotated LMNBZ gene reveals nove/ mutations in patients with Hildebrand T, Ruegsegger P. A new method for the model independent assessment of Hoffmann GF, Charpentier C, Mayatepek E, Mancini J, Leichsenring M, Gibson KM, Divry P, Hrebicek M, Lehnert W, Sartor K. Clinical and biochemical phenotype in 11 Huang S, Chen L, Libina N, Janes J, Martin GM, Campisi J, Oshima J. Correction of cellular phenotypes of Hutchinson-Gilford Progeria cells by RNA interference. Hum Genet. 2005 Oct 6;:1-7 Hutchinson CJ, Worman HJ. A-type Iamins: guardi'ans of the soma? Nat Cell Biol Ji JY, Lee RT, Vergnes L, Fong LG, Stewart CL, Reue K, Young SG, Zhang Q, Shanahan CM, Lammerding J. Cell nuclei spin in the absence of Lamin Bl. J Biol Chem online, 8/05/2007.

Kusuyama T, Omura T, Nishiya D, Enomoto S, Matsumoto R, Murata T, Takeuchi K, Yoshikawa J, Yoshiyama M. The effects of HMG-CoA reductase inhibitor on vascular Leung KF, Baron R, Seabra MC. Geranylgeranylation of Rab GTPases. J Lipid Res Lévy N, Cau P. Anomalies du noyau et maladi'es. Pour la Science 313:2-7, 2003.

Lin F, Worman HJ. Structural organization of the human gene (LMNBl) encoding Lin F, Woman HJ. Structura/ organization of the human gene encoding nuc/ear !amin A Maraldi NM, Squarzoni S, Sabatelli P, Capanni C, Mattioli E, Ognibene A, Lattanzi G.

Laminopathies: involvement of structural nuclear proteins in the pathogenesis of an Mattout A, Dechat T, Adam SA, Goldman RD, Gruenbaum Y. Nuclear lamins, diseases Navarro CL, Cadinanos J, De Sandre-Giovannoli A, Bernard R, Courrier S, Boccaccio I, Boyer A, Kleijer WJ, Wagner A, Giuliano F, Beemer FA, Freije JM, Cau P, Hennekam RC, Lopez-Otin C, Badens C, Levy N. Loss of ZMPSTE24 (FACE-l) causes autosomal recessi've restrictive dermopathy and accumu/ation of Lamin A precursors. Hum Mol Navarro CL, De Sandre-Giovannolî A, Bernard R, Boccaccio I, Boyer A, Genevieve D, Hadj-Rabia S, Gaudy-Marqueste C, Smitt HS, Vabres P, Faivre L, Verbes A, Van Essen T, Flori E, Hennekam R, Beemer FA, Laurent N, Le Merrer M, Cau P, Levy N. Lamin A and ZMPSTE24 (FACE-l) defects cause nuclear disorganizati'on and identify restrictive Padiath QS, Saigoh K, Schiffmann R, Asahara H, Yamada T, Koeppen A, Hogan K, Ptacek LJ, Fu YH. Lamin Bl duplications cause autosomal dominant Ieukodystrophy.

Pendas AM, Zhou Z, Cadinanos J, Freije JM, Wang J, Hultenby K, Astudillo A, Wernerson A, Rodriguez F, Tryggvason K, Lopez-Otin C. Defective pro/amin A processing and muscular and adipocyte alterations in Zmpste24 metalloproteinase- Reid TS, Terry KL, Casey PJ, Beese LS. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate Robber RA, Weber K, Osborn M. Differential timing of nuclear lamin A/C expression in the various organs of the mouse embryo and the young animal: a developmental Scaffidi P, Misteli T. Lamin A-dependent nuclear defects in human aging.

Sciencexpress, 27 avril 2006.

Scaffidi P, Misteli T. Reversal of the cellular phenotype in the premature aging disease Scaffidi P, Misteli T. Reversal of the cellular phenotype in the premature aging disease Shelton KR, Egle PM, Cochran DL. Nuclear envelope proteins: identification of lamin B Shumaker DK, Kuczmarski ER, Goldman RD. The nucleoskeleton: /amins an actin are Stewart C, Burke B. Teratocarcinoma stem cells and early mouse embryos contain only Takedaa M, Noshiroa R, Onozatob ML, Tojob A, Hasannejada H, Huangc XL, Narikawac S, Endoua H. Evidence for a role of human organic anion transporters in the muscular Toth Jl, Yang SH, Qiao X, Beigneux AP, Gelb MH, Moulson CL, Miner JH, Young SG, Fong LG. Blocking protein farnesyltransferase improves nuclear shape in fibroblasts 2005.

Tsai MY, Wang S, Heidinger JM, Shumaker DK, Adam SA, Goldman RD, Zheng Y. A mitotic !amin B matrix induced by RanGTP required for spind/e assembly. Science Varela I, Cadinanos J, Pendas AM, Gutierrez-Fernandez A, Folgueras AR, Sanchez LM, Zhou Z, Rodriguez FJ, Stewart CL, Vega JA, Tryggvason K, Freije JM, Lopez-Otin C.

Accelerated ageing in mice deficient in ZmpsteZ4 protease is Iinked to p53 signal/ing Vergnes L, Peterfy M, Bergo M0, Young SG, Reue K. Lamin Bl is required for mouse Winter-Vann AM, Casey PJ. Post-prenylation-processing enzymes as new targets in Wydner KL, McNeiI JA, Lin F, Worman HJ, Lawrence JB. Chromosomal assignment of human nuclear envelope protein genes LMNA, LMNBl and LBR by fluorescence in situ Young SG, Meta M, Yang SH, Fong LG. Prelamin A farnesylation and progeroid Zastrow MS, Vlcek S, Wilson KL. Proteins that bind A-type Iamins: integrating iso/ated Zhang FL, Casey PJ. Protein prenylation: molecular mechanisms and functionnal PRENILLENMIS PROTEINLERIN KALICILASMASI VE/VEYA BIRIKMESI ILE ILGILI HASTALIKLARIN TEDAVISI IÇIN, HMG-COA REDÜKTAZ INHIBITÖRÜNÜN VE FARNESILPIROFOSFATAZ SENTAZ INHIBITÖRÜNÜN BIR KOMBINASYONU Bu bulus, bir hidroksimetilglutariI-koenzim A (HMG-COA) redüktaz inhibitörünün ve bir farnesil-pirofosfat sentaz inhibitörünün, ya da bunlarin fizyolojik olarak kabul edilebilir iliskili tuzlarindan birinin, insanlar veya hayvanlarin tedavisinde, örnegin progeri (Hutchinson-Gilford sendromu), restriktif dermopati veya fizyolojik yaslanma esnasinda oldugu gibi, prenillenmis proteinlerin hücrelerde birikmesi ve/veya burada kalicilasmasi ile ilgili olarak, patolojik olan veya olmayan durumlarin tedavisini hedefleyen, özellikle bir farmasötik bilesim olmak üzere bir bilesimin hazirlanmasinda kullanimi ile ilgilidir.

Claims (4)

1. ISTEMLER Bir bilesim olup, özelligi; Hücrelerde progerin ve/veya farnesillenmis prelamin A birikmesiyle ve/veya kalicilasmasiyla ilgili, vasküler endotelyumun bozulmasi, cildin yaslanmasi ve kemik erimesi arasindan seçilen dogal, prematüre veya hizlanmis olsun ya da olmasin yaslanma belirtilerini gösteren patolojik durumlarin tedavisinde kullanim için bir hidroksimetilglutariI-koenzim A (HMG-CoA) redüktaz inhibitörü ve bir farnesiI-pirofosfat sentaz inhibitörü veya bunlarin fizyolojik olarak kabul edilebilir tuzlarindan birini içermesidir.
2. Istem 1'e uygun kullanima yönelik bilesim olup, özelligi; farnesiI-pirofosfat sentaz inhibitörünün, aminobisfosfonatlar (NBP) ailesinin bir molekülü veya bu molekülün fizyolojik olarak kabul edilebilir tuzlarindan biri olmasidir.
3. Istem Z'ye uygun kullanima yönelik bilesim olup, özelligi; aminobisfosfonatin, asagida belirtilenlerin arasindan seçilmesidir: alendronik asit veya bunun iyonik formu olarak alendronat; - ibandronik asit veya bunun iyonik formu olarak ibandronat; - neridronik asit veya bunun iyonik formu olarak neridronat; - olpadronik asit veya bunun iyonik formu olarak olpadronat; - pamidronik asit veya bunun iyonik formu olarak pamidronat; - rizedronik asit veya bunun iyonik formu olarak risedronat; - zoledronik (veya zolendronik) asit veya bunun iyonik formu olarak zoledronat (veya zolendrat); - 4-N,N-dimetilaminometan difosfonik asit veya bunun iyonik formu olarak dimetiIaminometandifosfonat; - a-amino-(4-hidroksibenziliden)difosfonat; - tercihen zoledronik asit veya bunun iyonik formu olarak zoledronat.
4. 4. Önceki istemlerden herhangi birine uygun kullanima yönelik bilesim olup, özelligi; HMG-CoA redüktaz inhibitörünün, statin ailesinin bir molekülü veya bu molekülün fizyolojik olarak kabul edilebilir tuzlarindan biri olmasidir. Istem 4'e uygun kullanima yönelik bilesim olup, özelligi; HMG-CoA redüktaz inhibitörünün, suda çözünür bir statin olmasidir. Istem 4'e uygun kullanima yönelik bilesim olup, özelligi; statinin, atorvastatin, simvastatin, pravastatin, rivastatin, mevastatin, fluindostatin, velostatin, fluvastatin, dalvastatin, serivastatin, pentostatin, rosuvastatin, pitavastatin veya Iovastatin, ya da bunlarin fizyolojik olarak kabul edilebilir tuzlarinin birinden seçilebilmesidir. 1 ila 6 arasindaki istemlerde tanimlanan bilesimin hücrelerde progerin ve/veya farnesillenmis prelamin A birikmesiyle ve/veya kalicilasmasiyla ilgili, vasküler endotelyumun bozulmasi ve cildin yaslanmasi arasindan seçilen dogal yaslanma belirtilerini içeren patolojik olmayan durumlarin tedavisinde terapötik olmayan kullanimi. Istem 7'ye uygun kullanim olup, özelligi; burada hücrelerde progerin ve/veya farnesillenmis prelamin A birikmesiyle ve/veya kalicilasmasiyla ilgili, patolojik olmayan durumlarin, ciltte ve / veya vasküler endotelyumda hücre yaslanmasini içeren gruptan seçilmesidir.