TR201809679T4 - Hücre aracılı bir immün yanıt tahlili. - Google Patents

Abstract

Mevcut beyan genel olarak hücre aracılı immüno yanıt verebilirliği ölçmeye yönelik bir tahlil dahil olmak üzere immünolojik temelli tanı tahlilleri alanı ile ilgilidir. Mevcut beyan, bir deneğin, numunenin antijen ile inkübasyonu esnasında bir indirgen olmayan şekerin eklenmesiyle elde edilen arttırılmış duyarlılığa sahip hücre aracılı immüno yanıt verebilirlik temelli olan bir antijene maruz kalma tanısını ele alır.

Description

TARIFNAME HÜCRE ARACILI BIR IMMÜN YANIT TAHLILI BULUSUN ALANI Mevcut beyan genel olarak immünolojik temelli tani tahlilleri alani ile ilgilidir ve hücre aracili immüno yanit verebilirligi ölçmeye yönelik yöntemleri tarif eder. Mevcut beyan, arttirilmis duyarliliga ve gelistirilmis depolama stabilitesine sahip hücre aracili immün yanit aktivitesini ölçmeye yönelik yöntemler, bilesimler ve kitleri ele alir.

BULUSUN GEÇMISI Immünolojik temelli tani tahlilleri, tip alaninda genis bir uygulamaya sahiptir. Özellikle, çok Çesitli hastalik durumlarinin tespit edilmesinde izlenmesinde yardimci olan önemli araçlardir. Bu tür tahlillerin etkinligi, T-lenfositler gibi immün sistemi içindeki bilesenlerin özgüllügü ile kismen iliskilidir. Bu özgüllüge bagli olmaksizin, immünolojik temelli tanilar, düsük dereceli enfeksiyonlari, persistan düsük seviyeli enfeksiyonun varligini tespit etmede, aktif veya latent enfeksiyöz hastalik durumlari olan deneklerde veya immün yetmezlik ya da herhangi bir immünosupresyon biçimi gösteren deneklerde enfeksiyonlari tespit etmede her zaman yeterince duyarli degildir. Hücre aracili bir immün yanit tahlilinin, özellikle antijene özgü bir T-hücre yanitinin tespit edilmesi açisindan, istenilen performans karakteristikleri arasinda duyarlilik, özgüllük, güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik bulunur ve ayrica basit ve hizli bir sekilde gerçeklestirilmelidir.

Immünolojik temelli bir tani tahlilinin mevcut bir biçimi, immün sisteme ait T-hücrelerin veya diger hücrelerin antijenler ile uyarilmasini ve ardindan antijen ile uyarmaya yanit olarak üretilen IFN-gama veya diger sitokinler gibi immün efektör moleküllerinin tespit edilmesini içerir. Immün efektör moleküller, enzim immünolojik tahlilleri, multipleks boncuk analizi, ELISA, ELISpot ve akis sitometrisi gibi iyi bilinen teknikler kullanilarak tespit edilir. Immün efektör moleküllerin seviyesinin varligi veya seviyedeki artis ayni zamanda RNA seviyesine bagli olarak belirlenebilmektedir. Bu tür tahliller, örnegin, hastaliga özgü immün yanitlari, özellikle de patojene özgü immün yanitlari tespit etmede kullanislidir. Ilgili tahliller, QuantiFERON (Tescilli Marka; Cellestis Limited) markasi ile piyasadan temin edilebilir ve örnegin patojen enfeksiyonunu teshis etmek veya bir hastaliga karsi hücre aracili immüniteyi izlemek için kullanilabilmektedir.

Ilgili hücre aracili immün yanit tahlillerinin diger uygulamalari arasinda asilara veya immünoterapiye, örnegin kanser immünoterapisi, verilen hücresel immün yanitlarin analizini veya izlenmesi bulunur.

Arttirilmis duyarliliga sahip ilgili tahlillere yönelik büyük bir talep vardir. Önceden, hücre aracili immün yanitlari ölçmeye yönelik yöntemler, tam kan numunesi gibi bir numunenin dekstroz gibi bir basit seker varliginda antijen ile inkübe edilmesiyle glikoz gibi basit sekerlerin immün hücreler araciligiyla IFN- gama üretimini arttirdigi ve böylece tahlil duyarliligini gelistirdigi bulunmustur. Glikoz ve dekstroz gibi basit sekerlerin kullanilmasinin, hücrelerin bu enerji kaynagindan yararlanmasina olanak saglamak ve dolayisiyla antijen ile inkübasyon sirasinda sekerin eklenmesinden fayda saglamak için gerekli olduguna inanilmistir. Basit seker antijene ek olarak numuneye dogrudan eklendiginde INF-y seviyesinde önemli artislar gözlenmistir. Bununla birlikte, yöntemin performansini basitlestirmek için, kullanima hazir reaktif bilesimlerinin sunulmasi ve elle isleme asamalarindan kaçinilmasi tercih edilir. Bu nedenle, antijeni ve basit sekeri içeren tek bir bilesimin sunulmasi istenmistir. Söz konusu bilesim bir numune toplama tüpünde sunulabilir, böylece numune dogrudan dogru konsantrasyonda antijen ve basit seker ile temas ettirilir, bu sayede isleme hatalarindan kaçinilir. Burada, antijen ve basit sekeri içeren ilgili numune toplama tüplerinin oda sicakliginda veya yüksek sicakliklarda depolandigi zaman tahlil aktivitesinin zaman içinde azaldigi bulunmustur. Bu belirli antijenler ile bulunmustur. Bu nedenle, bu kit bilesenlerinin raf ömrü sinirlidir~ ve belirli. bir depolama. süresinden. sonra, tahlil sadece düsük hassasiyet sunar veya tahlil aktivitesi tamamen kaybolur. Bu nedenle, antijenin bir bilesimde bir basit sekerle uygun bir sekilde sunuldugu ilgili kitler/tahlil materyalleri, depolamada stabil degildir ve dolayisiyla tahlil duyarliliginin zamanla azalmasi veya hatta kaybolmasi riskini dogurur. Bu, basit sekerin, numune toplama tüpünde antijen ile birlikte dahil edilmedigi, fakat antijen ile inkübasyon için numuneye ayri olarak ilave edildiginde görülmemistir.

EPl 312 670 A1, asidik polisakkaritler, asidik oligosakkaritler, asidik monosakkaritler ve bunlarin tuzlarindan olusan gruptan seçilen en az bir bilesigin etkili bir bilesen olarak kullanilmasiyla antijene özgü sitotoksik bir aktiviteye sahip sitotoksik T hücrelerini indükleme, sürdürme ve genisletme yöntemleri ile ilgilidir.

Xu Zhi-Jun ve dig. (Archives of Pathology and Laboratory immünohistokimya alani ile ilgilidir ve sitolojik preparasyonlari depolamak için bir sakaroz-magnezyum klorür- gliserol çözeltisinin kullanilabilecegini tarif eder.

R. aurantiacus'tan bir mikoloil glikolipid, trehaloz 2,3,6'- trimikolat (GaGM)'nin in Vivo immüno-modifiye edici aktivitesi ile ilgilidir.

Roser (Biopharm l99l,4(8):47-53), dondurarak kurutma makromolekülleri için yeni bir ikame olarak "trehaloz kurutma" olarak adlandirilan bir yöntem ile ilgilidir.

DATABASE WPI Hafta 200103 Thomson Scientific, Londra, GB; AN CITY), trehalozun biyolojik preparasyonlarin koruyucusu olarak kullanilabilecegini tarif eder. US 4,891,319 A, trehaloz varliginda kurutma esnasinda denatüre etmeye karsi üçüncül yapilara sahip proteinler ve diger biyolojik makromoleküllerin korunmasi ile ilgilidir.

WO 98/58259 Al, immünosorbent tahliller olan ve antikorlarin yakalandigi, örnegin ELISA tahlili, immünolojik tahlilleri gelistirmeyi amaçlar.

EP l 529 536 Al, uygulandigi bir konakçinin immün sisteminin immüno-uyarimi için gelistirilmis bir kapasiteye sahip olan bir immünojenik bilesini ile ilgilidir; bilesim, sakkaroz asetat izobutirat (SAIB) bilesigini içerir.

WO 00/56365 Al, bir tasiyici proteine ve trehaloza bagli bir polisakkaritten olusan en az bir antijeni içeren bir sivi asi bilesimi ile ilgilidir.

Mevcut bulusun amaci, önceki teknikte yer alan yöntemlere ait dezavantajlarin en az birinin üstesinden gelmektir. Özellikle, mevcut bulusun amaci, hücre aracili immün yanit verebilirligi ölçmeye yönelik duyarli ve güvenilir yöntemler ile birlikte depolamada stabil olan kitler ve kit bilesenleri sunmaktir.

BULUSUN ÖZETI Mevcut bulus, ekteki istemlerle tanimlanabilmektedir.

Buna uygun olarak, mevcut bulus, hücre aracili immün yanit aktivitesini ölçmeye yönelik bir yöntem sunmakta olup söz konusu yöntem asagidakileri içerir: (a)bir peptid antijen ile uyarimin ardindan immün efektör molekülleri üretebilen immün hücrelerini içeren bir numuneyi ila 50 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip en az bir` peptid antijen ile ve antijene yanit veren immün hücrelerin interferon-gama yanitini arttirabilen en az bir indirgen olmayan seker ile temas ettirerek bir inkübasyon bilesimi sunulmasi; ve (b)en az bir immün efektör molekülünün varliginin veya seviyesinin tespit edilmesi; burada en az bir immün efektör molekülünün varliginin veya seviyesinin tespit edilmesi, interferon-gama'nin› (INF-gama) varliginin `veya seviyesinin tespit edilmesini de içerir.

Mevcut bulus ayrica istem 14'e göre bir bilesim, istem 16'ya göre bir numune toplama kabi, istem l7'ye göre bir kit ve istem l9'a göre bir kullanim sunar.

Bulus sahipleri, numunenin antijen ile inkübasyonu› sirasinda indirgen olmayan bir sekerin ilave edilmesinin, sasirtici bir sekilde, yanit seviyelerini arttirdigini ve böylece dekstroz ve glikoz gibi bir basit seker eklenmesi durumuna benzer bir sekilde yöntemin duyarliligini da arttirdigini bulmustür. Bu beklenmedik bir durumdu çünkü daha öncesinde duyarliliktaki artisin sadece indirgen sekerleri temsil eden basit sekerler ve dolayisiyla monosakkaritler ile elde edilebilecegine inaniliyordu. Ayrica, sasirtici bir sekilde, indirgen olmayan seker ve antijen tek bir bilesim halinde sunulmus olsa bile, yöntemin, tahlil materyallerinin uzun süreli depolama süreleri boyunca bile arttirilmis duyarliligini koruyabildigi bulunmustur. Bu nedenle, bulus sahipleri sasirtici bir sekilde, bir basit seker yerine indirgen olmayan bir sekerin kullanilmasinin, tahlil bilesenlerinin depolama stabilitesini önemli ölçüde arttirdigini ve ayni zamanda yanit seviyelerini de arttirdigini ve dolayisiyla tahlil duyarliligini arttirabildigini bulmuslardir.

Teoriye bagli kalmaksizin, indirgen olmayan sekerin, pozitif bir hücre aracili immün yaniti durumunda salinan immün efektör moleküllerinin miktarini arttirdigina, böylece tahlil duyarliliginin da arttigina inanilir. Görünüse göre, immün efektör molekülü üretimi artar. Bu nedenle, burada tarif edilen sekilde indirgen olmayan bir sekerin kullanilmasi, immün hücre uyariminin, aksi takdirde mümkün olandan daha erken tespit edilmesinini de mümkün kilabilir. Bir hücre aracili immün yanit tahlilinin duyarliligini arttirma kabiliyeti ayni zamanda efektör moleküllerin tespit edilmesinde daha az duyarli yollarin kullanilmasini ve daha küçük numune boyutlarinin kullanilmasini mümkün kilabilir. Ayrica, bu faydali etkiler, tahlil materyallerinin uzun süreli depolanmasindan sonra da elde edilir, böylece tahlilin güvenilirligi ve tekrarlanabilirligi gelistirilir.

Ayrica asagidaki yönler de açiklanir: Birinci bir yöne göre, hücre aracili immün yanit aktivitesini ölçmeye yönelik bir yöntem sunulmakta olup söz konusu yöntem asagidakileri içerir: (a)bir antijen ile uyarimin ardindan immün efektör molekülleri üretebilen immün hücrelerini içeren bir numuneyi en az bir antijen ile ve en az bir indirgen olmayan seker ile temas ettirerek bir inkübasyon bilesimi sunulmasi, ve (b)bir immün efektör molekülünün varliginin veya seviyesinin tespit edilmesi.

Söz konusu yöntem, örnegin, bir hasta gibi bir denekte hücre aracili immün yanit aktivitesinin ölçülmesi için kullanilabilmektedir. Tespit edilen immün efektör molekülünün varligi (veya yoklugu) veya seviyesi, bir denegin test edilen antijene karsi hücre aracili bir immün yanitini baslatma seviyesinin veya kapasitesinin göstergesidir.

Ikinci bir yöne göre, hücre aracili bir immün yaniti indüklemeye yönelik bir bilesim sunulmakta olup söz konusu bilesim asagidakileri içerir: a)en az bir antijen; b)en az bir indirgen olmayan seker; ve c)istege bagli olarak en az bir antikoagülan.

Ilgili bir bilesim, immün hücreleri içeren numuneyi söz konusu bilesim ile temas ettirerek inkübasyon bilesimi hazirlamak amaciyla birinci yöne göre olan yöntemde uygun bir sekilde kullanilabilmektedir. Üçüncü bir yöne göre, ikinci yöne göre bilesim içeren bir numune toplama kabi sunulur. Numune toplama kabi, birinci yöne göre olan yöntemde uygun sekilde kullanilabilmektedir. Tercihen, numune toplama kabi, vakumlu bir kan alma tüpüdür.

Dördüncü bir yöne göre, bir denekte hücre aracili immün yanit aktivitesini ölçmeye yönelik bir kit sunulmakta olup söz konusu kit en az bir antijen, en bir indirgen olmayan seker, tercihen bir kan alma tüpü olan en az bir numune toplama kabi ve en az bir immün efektör molekülü için en az bir tespit etme araci içerir. Birinci yöne göre yöntemin gerçeklestirilmesi için ilgili bir kit kullanilabilmektedir.

Besinci bir yöne göre, mevcut beyan, hücre aracili yanit aktivitesinin ölçülmesine yönelik immünolojik bir tahlilde indirgen olmayan bir sekerin kullanilmasi ile ilgili olup burada indirgen olmayan sekerin ilave edilmesi, en az bir immün efektör molekülünün, tercihen IFN-gama, söz konusu tahlilde test edilen antijene yanit veren immün hücrelerden salinimini arttirir.

Mevcut uygulamanin diger amaçlari, özellikleri, avantajlari ve yönleri, asagidaki açiklama ve ekteki istemler sayesinde teknikte uzman kisiler için daha anlasilir hale gelecektir.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1: Bir QFN-CMV tahlilinde trehaloz ilavesinin IFN-gama yaniti üzerindeki etkisi. (** p<0,01; *** p<0,001) Sekil 2: Bir QFN-TB tahlilinde trehaloz ilavesinin IFN-gama yaniti üzerindeki etkisi.

Sekil 3: Dört farkli indirgen olmayan seker, nicel QFN CMV sonucunu arttirir.

BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Mevcut bulus, ekteki istemlerle tanimlanabilmektedir.

Bu tarifname boyunca, baglam aksini gerektirmedikçe, "içerme" kelimesinin veya "içerir" ya da “içeren” gibi varyasyonlarinin, belirtilen bir unsur veya tam sayi veya yöntem asamasinin ya da unsurlar veya tam sayilar veya yöntem asamalari grubunun dahil edildigini belirttigi ancak baska herhangi bir unsur veya tam sayi veya yöntem asamasinin ya da unsurlar veya tam sayilar veya yöntem asamalari grubunun dahil edilmedigini belirtmedigi anlasilacaktir.

Söz konusu tarifnamede kullanildigi sekilde “bir”, “bu” ifadelerinin tekil biçimleri, baglam aksini açikça belirtmedigi sürece çogul göndermelerini de kapsar. Bu nedenle, örnegin, "bir T-hücre" referansi, tek bir T-hücresi ile birlikte iki veya daha fazla T-hücresini içerir; "bir antijen" referansi, tek bir antijen ile birlikte iki veya daha fazla antijen içerir. Benzer sekilde, bir "ajan", "reaktif", "molekül" ve "bilesik" referanslari, tek entitileri ve söz konusu entitilerin iki veya daha fazlasinin kombinasyonlarini içerir. "Beyan" referansi, mevcut beyan tarafindan ele alinan tek veya birden fazla yönü, ve benzerini, içerir. Birinci bir yöne göre, hücre aracili immün yanit aktivitesini ölçmeye yönelik bir yöntem sunulmakta olup söz konusu yöntem asagidakileri içerir: (a)bir antijen ile uyarimin ardindan immün efektör molekülleri üretebilen immün hücrelerini içeren bir numuneyi en az bir antijen ile ve en az bir indirgen olmayan seker ile temas ettirerek bir inkübasyon bilesimi sunulmasi, ve (b)bir immün efektör molekülünün varliginin veya seviyesinin tespit edilmesi.

Söz konusu yöntemin avantajli somut gösterimleri ve uygulamalari burada tarif edilmistir. Birinci yönün bir somut gösterimine göre, hücre aracili immün yanit aktivitesini ölçmeye yönelik bir yöntem sunulmakta olup söz konusu yöntem asagidakileri içerir: (a)bir denekten alinan antijen ile uyarimin ardindan immün efektör molekülleri üretebilen immün hücrelerini içeren bir numuneyi en az bir antijen ile ve en az bir indirgen olmayan seker ile temas ettirerek bir inkübasyon bilesimi sunulmasi, (bJbir immün efektör molekülünün varliginin veya seviyesindeki yükselmenin tespit edilmesi.

Immün efektör molekülünün varligi (veya yoklugu) veya yükselmis seviyesi, bir denegin hücre aracili immün yanit verebilirligi seviyesinin veya kapasitesinin göstergesidir. Özellikle, söz konusu yöntem, söz konusu denegin daha önce antijen ile veya test edilen antijenin temsilcisi oldugu bir antijen ile karsilasip karsilasmadiginin belirlenmesine olanak saglar.

Böylece, denegin söz konusu antijene karsi hücre aracili bir immün yanit ortaya çikarma kabiliyetine sahip olup olmadigi belirlenebilmektedir. Belirli somut gösterimlerde, ayni zamanda, hücre aracili immün yanit verebilirligin nicel seviyesi de belirlenebilmektedir. Tahlilde tespit edilen hücre aracili immün yanitinin büyüklügü, belirli somut gösterimlerde bir hastaligin durumu, ilerlemesi ve/veya siddeti ile iliskilendirilebilmektedir. Bu nedenle, mevcut beyan, bir denekte hücre aracili immün yanit verebilirligi belirlemeye yönelik araçlar sunar. Tarif edilen yöntem, digerlerinin yani sira hastaliklarin, özellikle de enfeksiyöz hastaliklarin, patolojik durumlarin teshisini mümkün kilar ve/veya destekler, immünokompetans seviyesinin belirlenmesine olanak saglar ve endojen veya egzojen ajanlar ile birlikte protein toksik maddelerine karsi immün hücre yanit verebilirliginin degerlendirilmesine olanak saglar. Tahlil ayrica, bir hastalik, enfeksiyon veya kontaminant ile iliskili bir antijen gibi, belirli bir antijene daha önce maruz kalmis deneklerin taranmasini veya izlenmesini mümkün kilar. Söz konusu yöntemin diger önemli uygulamalari ve faydalari daha sonra tarif edilecektir.

Birinci yöne ve bulusa göre yöntemin özel yöntem asamalari ve tercih edilen somut gösterimleri buradan itibaren ayrintili olarak açiklanacaktir. (a) asamasinda, bir antijen ile uyarimin ardindan immün efektör molekülleri üretebilen immün hücrelerini içeren bir numune, en az bir antijen ile ve en az bir indirgen olmayan seker ile temas ettirilir. Immün hücreler ve/Veya tam numune, örnegin, hücre aracili immün yanit verebilirligi belirlenecek bir denekten elde edilebilmektedir. (örnegin koyunlar, inekler, domuzlar, atlar, esekler, keçiler), laboratuvar deneyi hayvanlari (örnegin fareler, siçanlar, tavsanlar, gine domuzlari, hamsterlar), evcil hayvanlar (örnegin köpekler, kediler), kus türleri (örnegin kümes hayvanlari, kafes kuslari), Sürüngenler ve amfibiyanlar dahil olmak üzere insan veya insan olmayan türler bulunur. Burada açiklanan yöntem arastirma, insan tibbi ile birlikte hayvancilik, veterinerlik ve vahsi yasam uygulamalarinda uygulanabilirlige sahiptir.

Tercihen, denek bir insandir ve burada tarif edilen hücre aracili immün yanit yöntemi, patojenik mikroorganizmalara, virüslere ve parazitlere yanit verebilirligin, hastalik durumlarinin, gelistirme olasiliginin taranmasinda veya otoimmün durumlarin izlenmesinde, bir denegin onkolojik zorluga veya immünoterapiye verdigi yanitin izlenmesinde, bir hastaliga karsi hücre aracili immünitenin izlenmesinde ve herhangi bir immün yetmezlik veya immünosupresyonun varligini belirlemeye yönelik taramada kullanilir. Sonuncusu, örnegin, çesitli kemoterapötik ajanlar dahil olmak üzere belirli ilaçlara bagli olarak ortaya çikabilir. Alternatif olarak, çevresel proteinli toksik maddelere ve kirletici maddelere maruz kalmak, mevcut bulusa göre olan yöntem kullanilarak belirlenebilmektedir.

Numune, uygun bir antijen ile uyarimin ardindan immün efektör molekülleri üretebilen immün hücreleri içerir. “Immün hücreler” arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, dogal katil (NK) hücreleri, T-hücreler, B-hücreler, makrofajlar ve Hmnositler, dendritik hücreler veya dogrudan veya dolayli antijen uyarimina yanit olarak bir veya daha fazla immün efektör molekülü üretebilen herhangi bir baska immün hücresi dahil olmak üzere lenfositler bulunur. Tercihen, numune lenfositleri, daha tercihen ise T-lenfositleri içerir. “T-hücreler” ve “T- lenfositler” terimleri burada birbirinin yerine kullanilir. T- hücreler, sunulan antijeni tanimalari durumunda güçlü bir immün yaniti saglayabilmektedir. T-hücreler, test edilen antijene veya test edilen antijenin temsilcisi oldugu bir antijene daha önceden maruz birakilmissa, bu antijenin spesifik. bellegine sahip T-hücrelerin hizli bir yeniden uyarimi gerçeklesir. Bu antijene özgü T-hücreler, Özellikle interferon gama gibi immün efektör moleküllerini salgilayarak yanit verir. Interferon gama veya salinan interferon gamaya yanit olarak salinmis bir immün efektör molekülü, daha sonra test edilen antijene karsi immün yanit verebilirligin spesifik bir markörü olarak ölçülebilmektedir. Bu nedenle, bir somut gösterime göre, numune, T-lenfositleri, tercihen CD4+ yardimci T-hücreleri ve/Veya CD8+ sitotoksik T-hücreleri içerir. Tercihen, numune ayrica, karsilik gelen uyarici hücreleri, özellikle test edilen antijeni T- hücrelere sunabilen antijen sunucu hücreleri içerir. Bununla birlikte, uygun antijen sunucu hücreler, inkübasyon bilesimine ayri olarak ilave edilebilir. Sirasiyla ilave edilen antijen sunucu hücreler (APC), dogalin yani sira yapay antijen sunucu hücreleri veya parçaciklari da içerir. Örnegin isinlanmis otolog veya HLA ile eslestirilmis antijen sunucu hücreler gibi uyarici hücreler, istege bagli olarak inkübasyon bilesimine ayri olarak ilave edilebilmektedir ve daha sonra antijeni T-hücrelere sunmaktadir. Bu somut gösterim, Örnegin, numune bir T-hücre yanitini indüklemek için gerekli olan ilgili uyarici hücreleri içermiyorsa uygulanabilirdir. Yapay antijen sunucu somut gösterimler arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, iliskili rekombinant MHC molekülleri veya peptidleri ve rekombinant ortak uyarici molekülleri olan parçaciklar veya lipid vesiküller bulunur.

Tercihen, numune bir denekten alinir. Bir somut gösterime göre, numune, immün hücreleri içeren bir vücut sivisidir veya ilgili bir Vücut sivisindan türetilen kismi içeren bir immün hücredir.

Tercih edilen bir somut gösterime göre, numune tam kandir. "Tam kan" ile bir denekten alinan büyük ölçüde seyreltilmemis veya fraksiyonlara ayrilmamis kan kastedilirn Bir somut gösterime göre, tam kan numunesi periferik kandir. Tam kan, hücre aracili immün yanit aktivitesini belirlemek için tercih edilen ve en uygun numune olmakla birlikte, immün hücreleri içeren baska numuneler de kullanilabilmektedir. Örnekler arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, lenf sivisi, serebral sivi, doku sivisi (kemik iligi veya timüs sivisi gibi) ve burun ve akciger sivisi ve bronkoalveoler lavaj dahil olmak üzere solunum sivisi bulunur. Ayrica yukarida belirtilen numunelerin kisimlari veya türevleri, örnegin hücre aracili immün yaniti ölçmek için gerekli olmayan hücrelerden yoksun hale getirilen numuneler, numune olarak kullanilabilir ve numune isleme ile elde edilebilmektedir. Örnegin tam kan, teknikte bilinen yöntemlerle kirmizi kan hücreleri V /veya trombositler gibi CMI yaniti için gerekli olmayan bilesenleri çikarmak için isleme tabi tutulabilir veya beyaz kan hücrelerini zenginlestirmek için islenebilir. Ayrica, buffy coat hücreleri veya periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC), teknikte bilinen yöntemlerle elde edilebilmekte ve numune olarak kullanilabilmektedir. Bir somut gösterime göre, kültürlenmis immün hücreleri numune olarak kullanilir. Ayrica, dondurularak saklanmis hücreler, örnegin dondurularak saklanmis PBMC hücreleri, denegin immün hücre kaynagi ve dolayisiyla numune olarak kullanilabilmektedir. Örnegin çözülmüs PBMC hücreleri, immün hücreleri içeren numuneyi saglamak amaciyla kültür ortami ile temas ettirilebilmekte olup söz konusu numune daha sonra, tercihen tek bir bilesim halinde ilave edilen bir antijen ve indirgen olmayan seker ile temas ettirilir inkübe edilir. Bir somut gösterime göre, numune bir hücresel immün yanita aracilik etmek için gerekli olan tüm immün hücreleri içerir. Bununla birlikte, yukarida tarif edildigi gibi, uyarici hücrelerin, özellikle de antijen sunucu hücrelerin ayri ilave edilmesi de mevcut bulusun kapsami dahilindedir. Bir somut gösterime göre, numune en az T-hücreleri (T-lenfositleri) ve NK hücrelerini (NK-lenfositleri) içerir. Bir somut gösterime göre, numune, numunenin antijen ve/Veya indirgen olmayan seker Analiz edilecek olan numune bir inkübasyon bilesimi elde etmek üzere en az bir antijen ile ve en az bir indirgen olmayan seker ile temas ettirilir.

Burada kullanildigi sekliyle "antijen" terimi, özellikle bir immün yaniti uyarma veya yeniden uyarma kabiliyetine sahip olan ve özellikle bir hücresel immün yaniti uyarma veya yeniden uyarma kabiliyetine sahip olan herhangi bir molekülü veya ajani ifade eder. Bu nedenle "antijen" terimi genis anlamda kullanilir. Özellikle terim, majör histokompatibilite kompleksi (MHC) ile baglanabilen ve bir T-hücre reseptörüne sunulabilen veya bir antikor ile baglanabilen herhangi bir molekülü veya ajani ifade eder. Terim ayrica örnegin CDld veya diger CDl aile üyeleri gibi klasik olmayan MHC proteinleri ile baglanabilen herhangi bir molekülü veya ajani da ifade edebilir. Bir somut gösterime göre, antijen bir immünojendir. Bir somut gösterime göre, antijen bir immünojen degildir. Antijenler arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, peptidler, proteinler, haptenler, alerjenler veya toksinler veya herhangi bir dogal olarak olusan veya sentetik Inolekül veya bunlarin parçalari bulunur. Bir somut gösterime göre, antijen inaktif bir patojen veya bunun bir kismi veya lizatidir. Bir somut gösterime göre, antijen, peptidler, glikoproteinler dahil olmak üzere proteinler, karbonhidratlar, fosfolipidler, fosfoproteinler, fosfolipoproteinler ve yukarida belirtilenlerin fragmanlarindan olusan gruptan seçilir. Burada kullanildigi sekliyle "peptid" terimi ayrica baglam aksini açikça belirtmedikçe polipeptidleri ve proteinleri içerir. modifiye edilmis biçimleri de içerir. Bir somut gösterime göre, antijen bir veya daha fazla tam uzunlukta veya kismi uzunlukta peptid içerir. Bir somut gösterime göre, antijen bir peptid tarafindan saglanir. Bir somut gösterime göre, antijen olarak kullanilan bir veya daha fazla peptid, 5 ila 100 amino asit, tercihen 7 ila 50 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahiptir. Bir somut gösterime göre, antijen, bir veya daha fazla farkli tam uzunluktaki veya kismi uzunluktaki peptidlerden olusan bir peptid seti tarafindan saglanir. Bir peptid seti, en az iki peptid içerir ve bir somut gösterimde bir dizi örtüsen veya örtüsmeyen peptid içerir. Ilgili bir peptit seti, dogal olarak olusan bir protein antijeninin tüm uzunlugunu veya bir kismini kapsayabilir. Ayrica, peptidlerin mutlaka örtüsmesi gerekmez veya tek bir amino asit veya birden fazla amino asit ile örtüsebilir. Bir somut gösterime göre, dogal olarak olusan bir peptid veya protein antijeninin %80-100'ünü kapsayan bir peptid seti kullanilir.

Bir somut gösterime göre, antijen, bir CD8+ sitotoksik T-hücresi tarafindan taninan en az bir peptid tarafindan saglanir. Bu somut gösterim için, antijen tercihen, 15 amino asitten daha az, tercihen 13 amino asit veya daha az, 12 amino asit veya daha az, 11 amino asit veya daha az ya da 10 amino asit veya daha az bir uzunluga sahip en az bir peptid tarafindan saglanir. Bir CD8+ sitotoksik T-hücresi tarafindan taninan ilgili bir peptid için uygun boyut araliklari arasinda 7-14 amino asit kalintisi, 7-13 amino asit kalintisi, 8 ila 12 amino asit kalintisi, 8-11 amino asit kalintisi ve 8 ila 10 amino asit kalintisi bulunur. Ayrica CD8+ sitotoksik T-hücreleri tarafindan taninan peptidleri içeren veya bunlardan olusan bir peptid seti de kullanilabilmektedir.

Söz konusu peptidler, dogal olarak olusan bir protein antijeni gibi bir protein antijeninin tamamini veya bir kismini kapsayabilir. Antijen olarak ilgili kisa peptidleri içeren tahlillerin, glikoz veya dekstroz gibi basit sekerlerin varliginda depolama esnasinda tahlil aktivitesinde önemli bir düsüs gösterdigi bulunmustur. Bu, mevcut bulus ile ele alinan indirgen olmayan sekerler kullanildiginda görülmez. Burada, tahlil bilesenlerinin uzun süreli depolama süresinden sonra bile indirgen olmayan sekerin dahil edilmesine bagli olarak tahlil duyarliligi artmaya devam eder. Bu, bir CD8+ sitotoksik T-hücresi tarafindan taninan bir peptid antijeni ve indirgen olmayan bir sekeri içeren bir bilesim örnegin kit bilesigi, sirasiyla bilesen, olarak kullanildiginda önemli bir avantajdir.

Bir somut gösterime göre, antijen, bir birinci setin 7 ila 14 amino asit kalintisi uzunlugundaki en az bir peptid içerdigi ve bir ikinci setin 15 veya daha fazla amino asit kalintisi uzunlugundaki en az bir peptid içerdigi en az iki peptid seti tarafindan saglanmakta olup bu peptidler bir protein antijeninin tamamini veya bir kismini kapsar. Söz konusu her bir set, en az bir peptid ila bir dizi örtüsen veya örtüsmeyen peptid içerir.

Numunede bulunan immün hücreler ile test edilecek hastalik veya durumun temsilcisi olan bir protein antijeninden türetilmis ya da ona karsilik gelen 7 ila 14 amino asit peptidinin ve 15 amino asit peptidinin birlikte inkübasyonu, daha duyarli bir tahlile neden olur, böylece, immün hücresi ve özellikle lenfosit uyariminin, aksi takdirde mümkün olandan daha erken tespit edilmesinini mümkün kilar. Hücre aracili bir immün yanit tahlilinin duyarliligini arttirma kabiliyeti, avantajli olarak tespit sinirini azaltir ve/veya efektör molekülleri tespit etmeye yönelik daha az duyarli araçlarin kullanilmasina olanak saglar. Bu nedenle, indirgen olmayan bir sekerle kombinasyon halinde en az iki ilgili peptid setinin kullanilmasi faydalidir.

Teoriye veya etki sekline bagli kalmaksizin, iki peptid setinin, 7 ila 14mer peptidleri ve ZlSmer peptidleri, hem CD4+ hem de CD8+ T-hücreleri ile tespit edilmeyi mümkün kildigina inanilir. CD4+ T-hücreleri >15 mer peptidleri tanir ve CD8+ T-hücreleri ise 7 ila 14 mer peptidleri tanir. Bu peptidler burada "CD4+ peptidleri" (215 mer peptidler) veya "CD8+ peptidleri" (7 ila 14 mer peptidler) olarak ifade edilebilir. Her bir set en az bir peptid içerir ve bir somut gösterimde bir dizi örtüsen peptid içerir. Bu nedenle, bir birinci set, 7 ila 14 amino asit kalintisi uzunlugundaki bir dizi örtüsen peptid içerebilir. Bu peptidler CD8+ T-hücreleri (CD8+ peptidleri) tarafindan taninir.

Bir ikinci set, 15'ten fazla amino asit kalintisi uzunlugundaki bir dizi örtüsen peptid içerebilir. Bu peptidler CD4+ T-hücreleri (CD4+ peptidleri) tarafindan taninir. Her iki peptid seti, bir protein antijeninin, örnegin test edilecek hastalik veya durumun temsilcisi olan dogal olarak olusan bir protein antijenin, tüm uzunlugunu veya bir kismini kapsayabilir. Peptidlerin mutlaka örtüsmesi gerekmez veya tek bir amino asit veya birden fazla amino asit ile örtüsebilir. Peptidler, bir protein antijeninin somut gösterime göre bir protein antijeninin tamamini veya bir kismini kapsayan yaklasik 7 ila 14 amino asit kalintisi uzunlugundaki bir dizi örtüsen peptid referansi, N-terminal ucundan C-terminal ucuna ya da bunun bir kismina kadar olan bir protein antijeninin toplamda amino asit kalintilarini kapsayan her amino asit kalintisindan en fazla 6 amino asit kalintisina kadar kapsayan 7 amino asit kalintisi uzunlugundan en fazla 14 amino asit kalintisina kadar olan bir peptid anlamina gelir.

Dolayisiyla, belirli bir peptidin uzunlugu x'in 7 ila 14 arasinda oldugu x amino asit kalintisi uzunlugunda ise iki ardisik peptid arasindaki Örtüsme derecesi x-1'den x-6'ya kadardir. Bir somut gösterimde, her bir ardisik peptidin örtüsmesi x-l'dir. 215 amino asit kalintisi uzunlugundaki bir dizi örtüsen peptid ayrica, her bir peptidin en az 15 amino asit kalintisi uzunlugunda ya da en fazla tam protein antijen uzunlugunda oldugu bir protein antijeninin tamamini ya da bir kismini kapsar. Bir somut gösterimde, 215 amino asit kalintisi uzunlugundaki bir amino asittir.

Mevcut beyan, serideki her bir peptidin veya peptid setinin ayni uzunlukta (baska bir ifadeyle x) bulundugu durumu içerir.

Bununla birlikte, peptid serileri veya peptid seti, bir somut gösterime göre xi peptidlerinin her birinin yaklasik 7 ila 14 amino asit kalintisi uzunlugunda veya 215 amino asit kalintisi uzunlugunda oldugu bir XM xz, >g... xi peptidleri karisimi içerebilir. CD4+ ve/Veya CD8+ peptidler, ayri peptid havuzlarina bölünebilmektedir. Bunlar, numuneye ayrica ilave edilebilmektedir veya tercihen indirgen olmayan bir sekerle birlikte bir bilesime dahil edilebilmektedir. Bu bilesim daha sonra inkübasyon bilesimi hazirlamak üzere numune ile temas ettirilebilmektedir.

Bazi somut gösterimlerde, immün sisteme in vivo sunulan antijenlerin bir veya daha fazla etkisini taklit eden bir veya daha fazla antijen kullanilir. Bir somut gösterime göre, antijen, bir öz antijen, bir patojenik organizmadan olan bir antijen ile çapraz reaktif olan veya bundan türetilen bir antijen, immün yaniti uyaran bir metal veya inorganik molekül veya tümör-iliskili bir antijen arasindan seçilir. Bir somut gösterime göre, antijen, bir hastalik durumu ile iliskili bir patojenden türetilmistir ve bu nedenle patojenden türetilen bir antijen ile çapraz reaktiftir veya bir kanser ile iliskili olan tümör-iliskili bir antijendir veya bir toksik maddedir ya da bundan türetilmistir. Bir somut gösterime göre, numune, bunlar için hücre aracili immün yanitin test edilecegi hastaliga veya duruma özgü bir antijen, örnegin degerlendirilecek bir hastalik veya durumla iliskili veya bunun temsilcisi olan bir antijen, ile temas ettirilir. Bir somut gösterime göre, antijen, hastaliga özgü bir antijen, özellikle de patojene özgü bir antijendir. Bazi somut gösterimlerde, patojen, bir bakteri, bir Virüs, bir parazit veya bir mantardir. Örnekleyici bir somut gösterimde, antijen, bir mikobakteriumdan, özellikle de Mycobacterium tuberculosis'den olan bir antijendir. Bu nedenle, bazi somut gösterimlerde, antijen tüberküloza (TB) özgü bir antijendir. Örnegin antijen, Mycobacterium tuberculosis veya M. avium'dan saflastirilmis bir protein türevi olabilmektedir. Bazi somut gösterimlerde, antijen, ESAT-6, CFP-lO ve TB7, sirasiyla TB7.7 gibi mikobakteriyel proteinleri simüle eder. Baska bir örnekleyici somut gösterimde, antijen, sitomegalovirüs (CMV) gibi bir virüstendir veya buna özgüdür.

Antijenlerin, özellikle hastaliga özgü antijenlerin diger örnekleri, daha sonra tarif edilecektir.

Ek olarak, numune, indirgen olmayan bir sekerle (a) asamasinda temas ettirilir. "Indirgen olmayan bir seker" özellikle, Fehling çözeltisi, Benedict reaktifi veya Tollens reaktifi gibi indirgen sekerlere yönelik bir tespit reaktifi ile reaksiyona girmeyen bir sekeri ifade eder. Indirgen olmayan bir seker, serbest bir indirgen uç içermez ve buna uygun olarak, serbest bir aldehit veya serbest keton grubu içermez. Indirgen olmayan seker herhangi bir uzunluga sahip olabilir ve dogrusal veya dalli olabilir. Belirli somut gösterimlerde, indirgen olmayan seker, en az iki monosakkarit birimi içerir. Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan sekerin monosakkarit birimlerinin herhangi birinde ve hepsinde, halka yapisindaki oksijen atomuna komsu olan karbon atomlari, bir hidroksil grubu içermez ve dolayisiyla bir anomerik hidroksil grubu da içermez. Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan oligosakkaritin monosakkarit birimlerinin halka yapilari bir hemiasetal veya hemiketal grup içermez. Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan seker, 10 veya daha az monosakkarit birimi, daha tercihen 8 veya daha az monosakkarit birimi, 6 veya daha az monosakkarit. birimi, 5 veya daha az monosakkarit birimi, 4 veya daha az monosakkarit birimi, 3 veya daha az monosakkarit birimi veya 2 monosakkarit birimi içeren bir oligosakarittir. Tercihen, indirgen olmayan seker bir disakkarittir. Bir somut gösterime göre, bir monosakkarit biriminin indirgen ucunun baska bir monosakkarit biriminin indirgen ucuna baglanmasiyla monosakkarit. birimleri arasinda glikosidik baglar olusturulur. Indirgen olmayan sekerin tercih edilen örnekleri arasinda sakkaroz ve trehaloz bulunur. Ayrica, örneklerle gösterildigi gibi, mannitol ve rafinoz da indirgen olmayan seker olarak kullanilabilir. Dolayisiyla, bir somut gösterime göre, indirgen olmayan seker, trehaloz, mannitol, sakkaroz ve rafinozdan seçilir. Örneklerle gösterildigi gibi, bu örnek niteligindeki indirgen olmayan sekerler, yanitin büyüklügünü arttirir. Trehaloz özellikle tercih edilir çünkü deneyler, trehalozun yanitin büyüklügünü arttirdigini ve dolayisiyla tahlil duyarliligini artirabildigini ve ayrica trehaloz ve bir antijen içeren bir bilesimin oldukça iyi depolama stabilitesi sergiledigini gösterir. Örneklerle gösterildigi gibi, test edilen indirgen olmayan sekerler arasinda, yaniti arttirma etkisi trehaloz ile en güçlü olmustur. Bununla birlikte, indirgen olmayan seker` ayrica. bir` monosakkarit de olabilir, burada, örnegin indirgen uç bir baska kimyasal entiti ile baglanir ve böylece bloke edilir. Buna uygun olarak, indirgen olmayan seker, türevine dönüstürülebilir. Seker türevlerinin örnekleri arasinda, bir veya daha fazla hidroksil grubunun bir amino grubu veya bir asetilamino grubu ile ornatildigi amino sekerler bulunur. Tercih edilen somut gösterimlerde, indirgen olmayan seker ornatilmaz ve özellikle türevine dönüstürülmez.

Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan seker bir polisakkarit degildir. Belirli somut gösterimlerde, indirgen olmayan seker, bir proteine, peptide veya bir lipide ya da baska bir inakromoleküle bagli degildir. Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan seker, bir hücre kültürü ortami veya baska bir ortam içinde bulunmaz. Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan seker bir sivi içinde bulunmaz. Indirgen olmayan seker, numunede bulunan immün hücreleri tarafindan metabolik süreçte degistirilebilirdir. Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan seker, numune ve antijen içeren inkübasyon bilesiminde uygun bir konsantrasyonda mevcut oldugunda yeniden uyarilmis T-hücreler ile interferon gama'nin salinimini arttirabilen indirgen olmayan bir sekerdir.

Numunenin antijen, indirgen olmayan seker ve istege bagli olarak katki maddeleri ile temas ettirilmesiyle bir inkübasyon bilesimi elde edilir. Tercihen, söz konusu bilesinn oda sicakliginin üzerinde ve dolayisiyla yüksek sicakliklarda inkübe edilir.

Tercihen, inkübasyon sicakligi 30°C'nin üzerinde, tercihen °C'nin üzerindedir. Inkübasyon sicakligi için uygun araliklar °C ila 40°C, tercihen 35°C ila 40°C arasindadir. Buna uygun olarak, inkübasyon bilesimi 37°C +/- 1°C'de inkübe edilir.

Tercihen, inkübasyon bilesimi, immün hücrelerin antijen ile uyarimini ve immün efektör` moleküllerinin. üretimini saglamak için bu gibi yüksek sicakliklarda en az 2 saat boyunca inkübe edilir. Inkübasyon asamasi 2 ila 50 saat, örnegin 2 ila 40 saat, zaman araligi olabilir. Bazi somut gösterimlerde, inkübasyon, bilesimi inkübe etme süresince antijen(1er)in, indirgen olmayan sekerin ve numunenin dagitilmasi için istege bagli bir baslangiç karistirma asamasinin ardindan, daha fazla karistirilmadan gerçeklestirilir.

Inkübasyon bilesiminde, indirgen olmayan seker, uyarimi, sirasiyla, immün sistem hücrelerinin antijen tarafindan yeniden uyarimini arttirmak için etkili oldugu bir konsantrasyonda bulunur. Bu nedenle, indirgen olmayan seker, pozitif bir numunede, baska bir ifadeyle antijene karsi immüno yanit verebilir olan bir numunede, indirgen olmayan sekerin inkübasyon bilesimine ilave edilmesinin, indirgen olmayan sekerin eklenmemesiyle karsilastirildiginda, üretilen immün efektör moleküllerinin seviyesini, tercihen interferon gama, arttirdigi bir konsantrasyonda ilave edilir. Bu nedenle, indirgen olmayan seker, hücre aracili bir immün yanit gösteren bir numunede daha fazla immün efektör molekülü üretildigi için immün efektör molekülünün yanit büyüklügünü arttirdigi bir konsantrasyonda ilave edilir. Tercihen, indirgen olmayan seker, immün efektör molekülü yanitini en az 1,1 kat, tercihen en az 1,2 kat, daha tercihen en az 1,3 kata kadar arttirdigi bir konsantrasyonda kullanilir. Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan seker, numunede bulunan immün hücrelerinin uzan süreli zaman periyotlari boyunca ilgili bir yanita aracilik etme kabiliyetini korur. Bir somut gösterime göre, inkübasyon bilesimindeki indirgen olmayan seker konsantrasyonu en az 1 mg/ml, en az 1,5 mg/ml, tercihen en az 1,75 mg/ml, daha tercihen ise en az 2 mg/ml'dir. Örnek niteligindeki araliklar arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, 1 mg/ml ila 20 mg/ml, 1,5 mg/ml ila 12,5 mg/ml ve 5 mg/ml ila 10 mg/ml bulunur. Örneklerle gösterildigi gibi, bu araliklar örnegin trehaloz için uygundur.

Bunlar, örneklerle gösterildigi gibi, sakkaroz, mannitol ve rafinoz gibi diger indirgen olmayan sekerler için de uygundur.

Bir somut gösterime göre, inkübasyon bilesimindeki indirgen olmayan seker konsantrasyonu, 1,5 mg/ml ila 10 mg/ml araliginda, örnegin 1,75 mg/ml ila 7,5 mg/ml veya 2 mg/ml ila. 5 mg/ml araliginda bulunur. Uygun konsantrasyonlar, burada tarif edilen ögretileri takip eden uzman kisi tarafindan da belirlenebilmektedir.

Bir veya daha fazla baska katki maddesi ilave edilebilmekte ve böylece inkübasyon bilesimine dahil edilebilmektedir. Örnegin numune bir kan örnegi oldugunda uygun bir antikoagülan gibi numune hazirlama ve/Veya numune koruma için gerekli veya avantajli olan bir veya daha fazla katki maddesi ilave edilebilmektedir. Tercihen, antikoagülan heparindir. Katki maddeleri, hücre aracili immün yanita müdahale edebilecekleri bir konsantrasyonda bulunmamalidir. Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan sekere ek olarak inkübasyon bilesimine bir basit seker ilave edilmez. Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan sekere ek olarak inkübasyon bilesimine indirgen seker, özellikle indirgen monosakkarit ilave edilmez.

Bir somut gösterime göre, numune, antijen ve indirgen olmayan seker içeren bir bilesim ile temas ettirilir. Bu somut gösterim özellikle avantajlidir, çünkü kullanici indirgen olmayan sekeri inkübasyon bilesimine ayri olarak ilave etmek zorunda degildir.

Bu tür kullanima hazir` bilesimler sunmak, isleme hatalarini önler ve zamandan tasarruf edilmesini saglar. Istege bagli olarak, antijen ve indirgen olmayan seker içeren bilesim içinde bir seyreltici veya çözücü bulunur. Ayrica, inkübasyon bilesimine dahil edileceklerse, söz konusu bilesime bir veya daha fazla katki maddesi dahil edilebilmektedir. Katki maddeleri hücre aracili yanita müdahale etmemelidir. Bir somut gösterime göre, bilesim ek olarak bir antikoagülan, tercihen heparin içerir. Bir somut gösterime göre, bilesim. bir basit seker içermez. Bir somut gösterime göre, bilesim bir indirgen seker içermez, özellikle bir indirgen monosakkarit içermez.

Inkübasyon bilesimini hazirlamak için, antijeni indirgen olmayan seker ve bir kan örnegi durumunda istege bagli olarak bir antikoagülan gibi bir veya daha fazla katki maddesi içeren bilesim numune ile temas ettirilir. Numune bilesime ilave edilebilmekte veya tam tersi yapilabilmektedir. Inkübasyon bilesiminin hazirlanmasi için, numune, antijen, indirgen olmayan seker ve tercihen (mevcut ise) ilave katki maddesi karistirilir.

Uygun bilesim biçimlerinin örnekleri arasinda sivi bilesimler, yari sivi bilesimler, jel benzeri bilesim ve kati bilesimler, özellikle kurutulmus bilesimler bulunur. Bir somut gösterime göre, antijen, indirgen olmayan seker ve istege bagli olarak ilave bir katki maddesi içeren bilesim, bir numune toplama kabinda, tercihen bir kan alma tüpü gibi bir numune toplama tüpünde bulunur. Bu, numune, toplama sonrasinda dogrudan bilesim ile temas ettirildigi için özellikle uygundur. Bir somut gösterime göre, antijen, indirgen olmayan seker ve istege bagli olarak ilave bir katki maddesi içeren bilesim, numune toplama kabinin iç kismina püskürtülerek kurutulur. Püskürterek kurutma yöntemleri, önceki teknikte iyi bilinir ve bu nedenle burada ayrintili bir açiklamaya gerek yoktur.

Bir somut gösterime göre, numune bir denekten alinir ve indirgen olmayan seker ve/Veya antijen ile temas öncesinde örnegin doku kültürü, ortam, eksipiyanlar veya diger sivi ajanlar ile seyreltilmez. Bir somut gösterime göre, inkübasyon bilesimi hacimce en az %10 numune içerir. “Hacimce en az %10” terimi, toplam inkübasyon bilesimi hacminin hacimce % 10, 11, 12, 13, Örneklerle gösterildigi gibi, (a) asamasinda indirgen olmayan bir sekerin ilave edilmesi, sasirtici bir sekilde, özellikle interferon gama gibi immün efektör leeküllerinin salinimini arttirir, böylece tahlilin duyarliligini da arttirir. Bu etkinin sadece basit sekerler ile ve dolayisiyla monosakkaritlerin azaltilmasiyla gerçeklestirilebilecegine inanildigi için bu etki oldukça sasirtici olmustur. Ayrica, antijen ve indirgen olmayan bir seker içeren bilesimlerin yüksek sicakliklarda bile gelistirilmis bir depolama stabilitesi sergiledigi bulunmustur.

Indirgen sekerler ile gözlemlenen, tahlil duyarliliginin ve kalitesinin zamanla azalabildigi etki, indirgen olmayan sekerler ile görülmez. Bu nedenle, mevcut bulus, uzun süreli depolama süreleri boyunca tahlil performansini koruyan duyarli ve depolamada stabil olan bir tahlilin sunulmasi ile önceki teknige önemli bir katki saglar. Mevcut bulusa ait ögreti, antijenin ve indirgen olmayan sekerin, depolamada stabil olan bir bilesim halinde sunulmasina olanak saglar. Mevcut bulusta, indirgen olmayan seker antijen için stabilizör olarak kullanilmaz.

Antijenlerin, özellikle peptid antijenlerin, depolamada çok stabil oldugu deneylerle gösterilmistir. Bu nedenle, antijen bir seker yoklugunda depolanmasi durumunda tahlil performansinda bir düsüs görülmez. Dolayisiyla, indirgen olmayan seker, özellikle immün efektör leeküllerinin, özellikle interferon gama gibi sitokinlerin, üretiminin ve/veya saliniminin arttirilmasi ile tahlil duyarliligini arttirmak için kullanilir. (b) asamasi (b) asamasinda, bir immün efektör molekülünün varligi veya seviyesindeki yükselme tespit edilir. Yukarida tarif edildigi gibi, bir immün efektör molekülünün varligi (yoklugu da içerir) veya seviyesi, bir denegin test edilen antijene karsi hücre aracili immün yanit verebilirligi seviyesinin veya kapasitesinin göstergesidir. Özellikle, söz konusu yöntem, söz konusu denegin önceden test edilmis antijenle mi yoksa tespit edilecek patojen gibi test edilen antijenle çapraz reaktivite gösteren bir antijen ile mi karsilastigini belirlenmesine olanak saglar.

Böylece, denegin söz konusu antijene, sirasiyla test edilen antijenin temsilcisi oldugu antijen, patojen veya hastaliga karsi hücre aracili bir immün yanit ortaya çikarma kabiliyetine sahip olup olmadigi belirlenebilmektedir.

Immün efektör molekülünün tespit edilmesi, peptid veya protein seviyesinde veya nükleik asit seviyesinde, özellikle immün efektör molekülü mRNA ekspresyon seviyesinde meydana gelebilir.

Sonuç olarak, immün efektör molekülünün “varligi veya seviyesini” tespit etme referansi, dogrudan ve dolayli verileri içerir. Örnegin, immün efektör moleküllerinin varligi veya miktari, ELISA veya ELISpot gibi uygun tespit yöntemleri kullanilarak dogrudan belirlenebilmektedir. Ancak, bir somut gösterimde, immün efektör molekülünün varligi veya seviyesi, RNA ekspresyon seviyesine göre ölçülür. Yüksek immün efektör molekülü mRNA seviyeleri, immün efektör molekülünün artan seviyelerini gösteren dolayli verilerdir. Bir hedef genin mRNA ekspresyon seviyesini belirlemeye yönelik uygun yöntemler, önceki teknikte iyi bilinir ve bu nedenle, herhangi bir ayrintili açiklamaya gerek yoktur. Buna göre, bazi somut gösterimlerde, immün efektör molekülü, efektör molekülüne özgü antikorlar gibi ligantlar veya baglayici moleküller kullanilarak. veya immün efektör molekülunü kodlayan genlerin ekspresyon seviyesinin ölçülmesiyle tespit edilebilir.

Tespit edilecek immün efektör molekülleri, bir antijen ile hücre aktivasyonu, uyarma veya yeniden uyarmaya yanit olarak üretilen bir dizi molekülün herhangi biri olabilir. Ayrica, birden fazla immün efektör molekülü veya test edilen antijen ile numunenin temasi sonrasinda salinan bir immün efektör molekülü paterni (b) asamasinda tespit edilebilmektedir. Ölçülecek immün efektör molekülü, immün hücreleri tarafindan üretilebilir, özellikle T hücreleri, özellikle CD4+ yardimci T hücreleri ve/veya CD8+ sitotoksik T hücreleri gibi lenfositler tarafindan üretilebilmektedir. Bu nedenle, bazi somut gösterimlerde, yöntem, bir veya daha fazla immün efektör molekülünün, antijenik uyarmaya yanit olarak, immün sistem hücreleri, özellikle T hücreleri, tarafindan üretilmesine dayanir. Bununla birlikte, immün hücreleri, özellikle yeniden uyarilmis T-hücreler ile salinan IFN-gama gibi immün efektör molekülleri, ile salinmis immün efektör molekülleri ile uyarildiklari için immün olmayan hücreler, immün efektör moleküllerini, immün hücrelerin antijen ile uyarimina, sirasiyla yeniden uyarimina, yanit olarak salabilir. Bu immün efektör nwlekülleri de önemli bir bilgi kaynagi olabilmektedir. Bu nedenle, bir somut gösterime göre, tespit edilecek olan immün efektör nmlekülü, antijen yeniden uyarimina yanit olarak efektör T hücreleri tarafindan üretilen aracisiz efektör molekülü olabilir. Diger somut gösterimlerde, akis yönündeki bir immün efektör molekülü ölçülür. Örnegin, immün hücreler, özellikle test edilen antijen ile (yeniden) uyarilan T-hücreler, tarafindan 'üretilen IFN-gama 'veya diger aracisiz immün efektör molekülleri (b) asamasinda ölçülebilmektedir. Bununla birlikte, yukarida tarif edildigi gibi, bu moleküller genellikle diger hücreler tarafindan diger immün efektör moleküllerinin üretimini indükler veya arttirir.

Bu diger (akis yönündeki) immün efektör moleküllerinin üretimi de (b) asamasinda ölçülebilir. Mevcut bulus ayrica, (b) asamasinda birden fazla tipte immün efektör molekülünün tespit edilmesini de kapsar. Bir somut gösterime göre, bir immün efektör molekülleri paterninin varligi veya seviyesi, (b) asamasinda, tek basina veya IFN-gama gibi aracisiz immün efektör moleküllere ek olarak tespit edilir. Ilgili bir patern ikiden fazla, tercihen üçten fazla farkli immün efektör molekülü içerir. Ilgili bir paterni analiz etmek, denegin immün durumu ile ilgili degerli bilgiler sunabilmektedir. Örnegin spesifik immün efektör moleküller veya immün efektör moleküllerin paternleri spesifik hastaliklar için karakteristik olabilmektedir. Bir somut gösterime göre, (b) asamasinda ölçülecek immün efektör molekülü, bir lenfokin, interlökin veya kemokin gibi bir sitokindir. IFN- gama gibi bir interferon (IFN), belirlenecek immün efektör molekülü olarak oldukça faydalidir. Diger immün efektör molekülleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, interlökinler (IL), örnegin IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL- lO, IL-l2, IL-l3, IL-l6 (LCF) veya IL-l7, IL-ld (IL-lFl), IL-ß (IL-lFZ), IL-lrd (IL-, Dönüstürücü Büyüme Faktörü beta (TGF-ß), Granülosit (G)-CSF veya Granülosit Makrofaj (GM)-CSE` gibi bir Koloni Uyarici Faktör (CSF), kompleman bileseni 5a (C5a), Grog (CXCLl), slCAM-l (CD54), IP-lO (CXCLlO), I-TAC (CXCLll), MCP-l (CCLZ), MIF (GIF), MIP-ld (CCL3), MlP-lß (CCL4), Serpin El (PAI-l), RANTES (CCL5) veya MIG (CXCL9) gibi bir dizi sitokin bulunur. Bazi somut gösterimlerde, mevcut beyan, (b) asamasinda tespit edilecek olan immün efektör molekülünün, bir sitokin, kompleman sistemin bir bileseni, perforin, defensin, katelisidin, granzim, Fas ligandi, CD-4O ligandi, ekzotaksin, bir sitotoksin, bir kemokin veya bir monokin oldugu yöntemleri sunar. Tercih edilen somut gösterimlerde, (b) asamasinda tespit edilen immün efektör molekülü lFN-gama'dir. Dolayisiyla, tercih edilen bir somut gösterime göre, mevcut beyan, bir denekte hücre aracili bir immün yanitin ölçülmesine yönelik bir yöntem sunmakta olup söz konusu yöntem, bir antijen ile uyarimin ardindan IFN-gama üretebilen immün sistem hücrelerini içeren söz konusu denekten alinmis bir numunenin bir toplama kabina toplanmasini, söz konusu numunenin bir antijen ile ve indirgen olmayan bir seker ile inkübe edilmesini ve daha sonra IFN-gama'nin varligi veya seviyesinin bir denegin hücre aracili bir immün yanit baslatma kapasitesinin göstergesi oldugu bir IFN-gama seviyesinin varliginin veya seviyesindeki yükselmenin ölçülmesini içerir.

Ayrica (b) asamasinda immün efektör moleküllerinin bir kombinasyonu da tespit edilebilmektedir. Bu nedenle, özellikle (b) asamasi, bir immün efektör nmlekülünün veya antijen ile uyarima yanit olarak salinan ve analiz edilecek hastalik veya durum için karakteristik olan immün efektör moleküllerinin, özellikle sitokinlerin, kombinasyonunun tespit edilmesini içerir. Ayrica, bir veya daha fazla immün efektör molekülünün seviyeleri, tek baslarina veya baska biyomarkörler veya hastalik indikatörleri ile kombinasyon halinde taranabilir.

Bir somut gösterime göre, immün efektör molekülü, immün efektör molekülünü spesifik olarak baglayan bir ligant kullanilarak tespit edilir. Immün efektörleri baglayan ligantlar, bu molekülleri tespit etmede ve/veya miktarini ölçmede özellikle kullanislidir. Inkübasyon bilesiminde bulunan hücreler, immün efektör molekülünün tespit edilmesinden önce çikarilabilmektedir. (B) asamasinda kullanilabilen tespit tahlillerine yönelik teknikler, teknikte bilinmektedir ve örnegin radyo immünolojik tahlilleri, sandviç tahlilleri, ELISA ve ELISpot'u içerir. Immün efektörleri baglayan antikorlar ligant olarak özellikle kullanislidir. “Antikorlar” referansi, örnegin Fab fragmanlari, memelize edilmis (örnegin hümanize edilmis) antikorlar, deimmünize edilmis antikorlar, rekombinant veya sentetik antikorlar ve hibrit ve tek Zincirli antikorlar gibi efektör molekülünü spesifik olarak baglayan antikor parçalarini içerir. Hem poliklonal hem de monoklonal antikorlar, immün efektör molekülleri veya bunlarin antijenik fragmanlari ile immünizasyon yoluyla elde edilebilir ve her iki tip immünolojik tahlil için de kullanilabilir. Her iki antikor tipini elde etmeye yönelik yöntemler teknikte iyi bilinir.

Poliklonal antikorlar daha az tercih edilir ancak uygun bir laboratuvar hayvanina, hayvandan serum toplanmasi ve spesifik serumlarin bilinen herhangi bir immünoadsorban teknikle izole edilmesiyle etkili bir miktarda immün efektörünün, veya bunun antijenik kisminin, enjekte edilmesi yoluyla nispeten kolaylikla hazirlanir. Bu yöntemle üretilen antikorlar neredeyse her türlü immünolojik tahlilde kullanilabilir olsa da bunlar ürünün olasi heterojenliginden dolayi genellikle daha az tercih edilirler.

Immünolojik bir tahlilde monoklonal antikorlarin kullanilmasi, bunlarin büyük miktarlarda. üretilmesi ve ürünün homojenligi nedeniyle özellikle kullanislidir. Bir ölümsüz hücre hatti ile immünojenik preparasyona karsi duyarli hale getirilen lenfositlerin kaynastirilmasiyla elde edilen monoklonal antikor üretimine yönelik hibridoma hücre hatlari preparasyonu, teknikte uzman kisilerce iyi bilinen tekniklerle yapilabilmektedir.

Spesifik immün efektör moleküllerine karsi olan antikorlar da piyasadan temin edilebilir.

Bir somut gösterime göre, (b) asamasi, inkübasyon bilesiminin veya bunun bir kisminin, örnegin, hücreden yoksun hale getirilmis bir kisminin, bir antikor-efektör kompleksi olusturmak için yeterli bir süre boyunca ve kosullar altinda tespit edilecek immün efektör molekülüne özgü olan bir antikor veya bunun bir fragmani ile temas ettirilmesini ve daha sonra söz konusu kompleksin tespit edilmesini içerir. Yukarida tarif edildigi gibi, inkübasyon bilesiminde bulunan hücreler, örnegin saptama öncesinde santrifügasyon yoluyla, çikarilabilir. Örnegin numune olarak kan kullanildiginda, hücreler inkübasyon sonrasinda inkübasyon bilesiminden ayrilabilmekte ve böylece tespit etme öncesinde immün efektör moleküllerinin üretimi ve salinimi temel olarak bir plazma numunesi sunabilmektedir. referanslarinda görülebilecegi gibi çok çesitli immünolojik tahlil teknikleri mevcuttur. Üretilen immün efektör moleküllerini tespit etmeye yönelik olarak burada tarif edilen hücre aracili immün yanit testleriyle birlikte kullanilabilen WOZOlO/OO9494 ve WOZOll/O75773'te tarif edilir. Ayni zamanda Clay ve dig. "Assays for monitoring cellular immune responses to active immunotherapy of cancer; Clinical Cancer Research 2001; 7:1127-1135", hücresel immün yanitlari izlemeye yönelik çesitli yöntemler tarif eder ve dolayisiyla antijen (yeniden) uyarimina yanit olarak üretilen immün efektör moleküllerini tespit etmeye yönelik uygun tahlilleri de tarif eder. Burada, örnegin ELISA- temelli tahliller, ELISpot tahlilleri ve gerçek zamanli niceliksel RT-PCR ile sitokin mRNA seviyelerinin ölçümü gibi nükleik asit temelli tahliller tarif edilir. Istege bagli olarak, RNA ekspresyon seviyesine bagli olarak immün efektör molekül seviyesini belirlerken, elde edilen veriler örnegin CD8 gibi kontrol geninin ekspresyonuna normalize edilebilmektedir.

Ilgili yöntemler, üretilen immün efektör moleküllerini tespit etmek için mevcut bulus ile birlikte kullanilabilmektedir. Bir somut gösterime göre, bir immün efektör molekülünün varligini veya seviyesini tespit etmek için bir nükleik asit temelli tahlil kullanilir. Nükleik asitler, özellikle RNA, önceki teknikte iyi bilinen standart yöntemler kullanilarak inkübasyon bilesiminden veya bunun hücresel kismindan izole edilebilmektedir. Tercihen, immün efektör molekülünün ekspresyonunun varligi veya yükselmesi, amplifikasyon temelli tahliller, tercihen PCR temelli tahliller, kullanilarak bu somut gösterimde tespit edilir. Izole edilmis RNA, öncelikle, tespit edilecek immün efektör molekülüne özgü olan primerler ve/veya problar kullanilarak amplifikasyon öncesinde cDNA'ya ters transkribe edilebilmektedir. Tercihen, tespit etme niceldir. Uygun bir yöntem niceliksel gerçek zamanli RT (ters transkripsiyon) PCR'dir.

Tercihen, (b) asamasinda immün efektör molekülünün tespit edilmesi nicel bir tespittir.

Spesifik somut gösterimler Mevcut bulus ve beyana göre yöntemin spesifik ve tercih edilen somut gösterimleri ve burada kullanilan bilesenler asagida tarif edilecektir.

Yukarida tarif edildigi gibi, (a) asamasinda, bir veya daha fazla ilave katki maddesi inkübasyon bilesimine dahil edilebilir. Bir somut gösterime göre, düzenleyici T-hücrelerinin (T-reg hücreleri) aktivitesini modüle etmek için inkübasyon bilesimine bir ajan ilave edilir. Ikincisi, T-reg hücrelerinin supresör fonksiyonunu inhibe etmeyi kapsar. Burada kapsanan T-reg hücrelerini module eden ajanlar arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, bir CD25 ligandi, JAKl veya TYKZ'yi kodlayan genetik materyale yönelik bir sens veya antisens oligonükleotidi, bir nötrlestirici antikor, CpG içeren oligonükleotidler, toll-benzeri bir reseptör (TLR) modüle edici ajan olarak islev gören bir oligonükleotid ve diger TLR module edici ajanlar bulunur. Belirli bir somut gösterimde, T-reg hücreleri, aktivitesi modüle edici ajan tarafindan inhibe edilmis immün yanit supresör hücreleridir. Bir "CpG molekülü", bir CpG sekansi veya motifi içeren bir oligonükleotid anlamina gelir. T-reg fonksiyonu inhibitörleri veya modülatörleri örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, CD25'e yönelik bir poliklonal veya monoklonal antikor veya bunun bir antijen baglayici fragmani, CD25'e yönelik hümanize edilmis veya deimmünize edilmis poliklonal veya monoklonal antikorlar veya poliklonal veya monoklonal antikorlarin rekombinant veya sentetik bir formu dahil olmak üzere CD25 ligantlari bulunur.

Diger ajan örnekleri arasinda Janus Tirozin Kinaz l (JAKl) ya da Tirozin Kinaz 2'yi (TYKZ) veya JAKl ya da TYK2 proteinlerinin küçük molekül inhibitörlerini kodlayan mRNA veya DNA'ya yönelik olan sens ya da antisens nükleik ve moleküller bulunur. "Küçük moleküller" referansi, Uluslararasi Patent Yayin No. WO reseptörlerini (IgNAR'lar) içerir. Yine uygun ajanlarin baska örnekleri arasinda Toll-benzeri reseptörler (TLR'ler) ve/veya baska mekanizmalar araciligiyla islev gören CpG molekülleri gibi uyarici ajanlar bulunur. Bu nedenle, CpG içeren oligonükleotidler ve TLR modüle edici ajan olarak islev gören bir oligonükleotid de mevcut beyanin bir parçasini olusturur.

Tek bir tip ajan kullanilabilir veya T-reg hücrelerini modüle etmek için iki veya daha fazla ajan tipi kullanilabilir. Örnegin, tahlil, bir CD25 ligandi ve bir JAKl/TYKZ sens veya antisens oligonükleotidi; bir CD25 ligandi ve bir TLR modüle edici ajan; bir JAKl/TYKZ sens veya antisens oligonükleotidi. ve bir TLR modüle edici ajan; veya bir CD25 ligandi, bir JAKl/TYKZ sens veya antisens oligonükleotidi ve bir TLR modüle edici ajani ile gerçeklestirilebilir. Alternatif olarak, sadece bir` tip ajan kullanilir. Baska bir alternatifte, CpG içeren bir oligonükleotid ve TLR modüle edici bir ajan kullanilir. Ilgili T-reg modüle edici ajanlar, numuneye ve/veya inkübasyon bilesimine ayri olarak ilave edilebilir veya antijen ve/Veya indirgen olmayan seker içeren bilesime dahil edilebilir.

Bir somut gösterime göre, mevcut bulusa göre yöntem asagidakileri içerir: (a)bir insan denekten alinan bir tam kan örnegini en az bir peptid. antijen ve en az bir indirgen olmayan disakkarit, tercihen trehaloz veya sakkaroz, içeren bir bilesim ile temas ettirerek bir inkübasyon bilesimi hazirlanmasi ve inkübasyon bilesiminin en az 2 saat boyunca oda sicakligi üstündeki (b)IFN-gama'nin varliginin veya seviyesini tespit edilmesi; burada IFN-gama'nin varligi veya seviyesi, insan denegin hücre aracili immün yanit verebilirlik seviyesinin göstergesidir.

Tercihen, peptid antijeni, bir hastalik veya patojene özgü bir antijendir. Sinirlayici olmayan patojen örnekleri burada tarif edilir. Bir somut gösterime göre, patojen bir virüstür ve yöntem, insan deneginin anti-viral hücre aracili immün yanit olusturma kapasitesine sahip olup olmadigini belirlenmesine olanak saglar.

Bir~ somut gösterime göre, bu yönteni ek olarak asagidakileri (c)tespit edilen immün efektör molekül seviyesinin ya da bundan türetilmis bir degerin bir referans seviyesi ile karsilastirilmasi. (c) asamasi, belirlenen immün efektör molekül seviyesinin ya da bundan türetilmis bir degerin bir referans seviyesi ile karsilastirilmasini içerir. Bu somut gösterim, antijenin temsilcisi oldugu bir patojen enfeksiyonunun teshisi için oldukça faydalidir. Eger söz konusu denek patojen ile enfekte ise, belirlenen immün efektör molekül seviyesi veya bundan türetilmis bir deger referans seviyesinin üzerindedir ve eger söz konusu denek patojen ile enfekte degilse, belirlenen immün efektör molekül seviyesi veya bundan türetilen bir deger referans seviyesinin altindadir. Ayni prensip, söz konusu denegin, antijenin temsilcisi oldugu bir patojene karsi hücre aracili bir immün yanit baslatip baslatamayacagini belirlemek için de geçerlidir.

Bir somut gösterime göre, numune en az iki fraksiyona ayrilir ve (a) asamasinda, bir yanit numunesi olusturmak üzere numunenin birinci fraksiyonu bir antijen ve indirgen olmayan bir sekerle temas ettirilir ve burada negatif kontrol (nil) numunesi olusturmak üzere numunenin ikinci fraksiyonu inaktif bir çözelti ile temas ettirilir. Bu somut gösterimin (b) asamasinda, immün efektör molekülünün varligi veya seviyesi iki fraksiyonda belirlenir. (c) asamasinda, numunenin antijene bagimli immün efektör molekülü yaniti, negatif kontrol numunesinde belirlenen immün efektör molekül seviyesinin, yanit numunesinde belirlenen immün efektör molekül seviyesinden çikarilmasiyla belirlenir.

Antijene bagimli immün efektör molekül yaniti veya bundan türetilen bir deger daha sonra bir referans seviyesi ile karsilastirilir, böylece denegin daha önce antijen ile karsilasip karsilasmadiginin belirlenmesine yardimci olur.

Böylece, örnegin, denegin antijene karsi immünolojik reaktivite olusturup olusturmadigi, bir hastaliga yakalanma riski tasiyip tasimadigi ve/veya bir patojen ile enfeksiyona yatkin olup olmadigi belirlenebilmektedir.

Istege bagli olarak, yöntem ayrica, numunenin en az üç fraksiyona bölünmesini ve bir pozitif kontrol numunesi olusturmak üzere numunenin üçüncü fraksiyonunun mitojen gibi bir T-hücre aktivatörü ile inkübe edilmesini içerebilir. Burada, immün hücreleri örnegin üç ayri popülasyonda inkübe edilebilir: negatif kontrol numunesi (örnegin salin), antijen ile uyarilmis yanit numunesi ve pozitif kontrol numunesi (örnegin bir T-hücre aktivatörü, örnegin fitohemaglutinin gibi bir mitojen kullanilarak). Dolayisiyla, bir somut gösterime göre, numune en az üç fraksiyona bölünür. (a) asamasinda, bir yanit numunesi olusturmak üzere numunenin birinci fraksiyonu bir antijen ve indirgen olmayan bir sekerle temas ettirilir, negatif kontrol numunesi olusturmak üzere numunenin ikinci fraksiyonu inaktif bir çözelti ile temas ettirilir ve pozitif kontrol numunesi olusturmak üzere numunenin üçüncü fraksiyonu (örnegin bir mitojen içeren) uyarici bir çözelti ile temas ettirilir. Bu somut gösterimin (b) asamasinda, immün efektör` molekülünün varligi veya seviyesi üç fraksiyonda belirlenir. (0) asamasinda, yanit numunesinin antijene bagimli immün efektör molekülü yaniti, negatif kontrol numunesinde belirlenen immün efektör molekül seviyesinin, yanit numunesinde belirlenen immün efektör molekül seviyesinden çikarilmasiyla ve antijene bagimli immün efektör molekülü yanitinin veya bundan türetilen bir degerin bir referans seviyesi ile karsilastirilmasi ile belirlenir; pozitif kontrol numunesinin immün efektör molekülü yaniti, negatif kontrol numunesinde belirlenen immün efektör molekül seviyesinin, pozitif kontrol numunesinde belirlenen immün efektör molekül seviyesinden çikarilmasiyla ve ortaya çikan immün efektör yanitinin bir referans seviyesi veya bundan türetilen bir deger ile karsilastirilmasi ile belirlenir.

Böylece, denegin önceden test edilmis antijen veya buna çapraz reaktivite gösteren bir antijen ile karsilasip karsilasmadigi ve dolayisiyla antijene karsi immünolojik reaktivite üretip üretmedigi belirlenebilmektedir. Bu, örnegin denegin aktif, yakin geçmis veya latent bir enfeksiyona sahip olup olmadiginin ya da denegin tedaviye yanit verip vermediginin, bir enfeksiyon veya hastalik gelistirip gelistirmeyeceginin ya da immün sisteminin süprese edilip edilmediginin belirlenmesinde önemli bir yardim. saglar. Örnegin, antijene bagimli immün efektör molekülü yaniti, referans seviyesinin üzerinde ise, sonuç, pozitif olarak degerlendirilebilmektedir, baska. bir ifadeyle denek, söz konusu antijene karsi hücre aracili bir yanit verebilmektedir. Antijene bagimli immün efektör molekülü yaniti referans seviyesinin altinda ise ve pozitif kontrol bagimli immün efektör yaniti referans seviyesinin üzerinde ise, sonuç negatif olarak degerlendirilebilmektedir, baska bir ifadeyle denek, söz konusu antijene karsi hücre aracili bir yanit verememektedir.

Mevcut bulusta pozitif kontrol olarak kullanilabilen mitojenler, teknikte uzman kisilerce bilinen tüm mitojenleri kapsar ve bunlarla sinirli olmamak kaydiyla fitohemaglutinin (PHA), konkanavalin A (conA) lipopolisakkarit (LPS) ve pokeweed mitojeni (PWM) içerir. Pozitif bir kontrol saglamak için kullanilabilen mitojenlerin yani sira diger immün uyarici örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, R848 gibi kimyasal bilesikler bulunur.

Yukarida tarif edildigi gibi, bazi somut gösterimlerde, numunenin, antijenin ve indirgen olmayan sekerin birlikte inkübe edildigi kap, ayni zamanda numuneyi denekten toplamak için de kullanilan toplama kabidir. Uygun numune boyutlarini saglamalari kosuluyla çok sayida farkli uygun kaptan herhangi biri kullanilabilir. Bazi somut gösterimlerde, kap, bir denekten kan gibi örnegin toplanmasini kolaylastirmak için bir vakum içeren bir tüptür. Ilgili vakumlu kan alma tüpleri, önceki teknikte iyi bilinir ve bu nedenle burada ayrintili bir` açiklamaya gerek yoktur. Diger somut gösterimlerde, kap bir kapiler tüptür. Bazi somut gösterimlerde, kapiler aksiyon ile cildin yüzeyinden kan toplamak. için kapiler bir tüp kullanilir. Bazi somut gösterimlerde, numune, bir denekten alinarak en az bir antijen, en az bir indirgen olmayan seker ve en az bir antikoagülan, tercihen heparin içeren bir toplama kabina veya bir antijen, bir indirgen olmayan seker ve bir antikoagülanin, tercihen heparin, daha sonra ilave edildigi bir toplama kabina toplanir. Bazi somut gösterimlerde, kan, bir igneleme cihazi gibi bir kapiler numune alma cihazi kullanilarak numunelenir ve kan, heparinize edilmis bir toplama kabi içine toplanir ve daha sonra antijen ve indirgen olmayan seker ile birlikte inkübasyon için uygun bir kaba aktarilir. Tercihen, antijen, indirgen olmayan seker ve istege bagli olarak antikoagülan, yukarida tarif edildigi gibi tek bir bilesim halinde sunulur. Bazi somut gösterimlerde, bir denekten alinan tam kan, antijen, indirgen olmayan seker ve istege bagli olarak antikoagülan içeren bir kaba toplanir. Diger somut gösterimlerde, antijen, indirgen olmayan seker ve/veya antikoagülan, toplama sonrasinda tam kan örnegine ilave edilir.

Mevcut bulus, patojenlere, özellikle Mi tuberculosis gibi mikobakterilere maruz kalma durumunun taranmasinda oldukça faydalidir. Bu nedenle, mevcut tarifname, bir denekte hücre aracili immün yanit aktivitesini ölçmeye yönelik bir yöntemi ele almakta olup söz konusu yöntem, bir antijen ile uyarimin ardindan immün efektör molekülleri üretebilen immün hücrelerini içeren bir` numunenin tüberküloza özgü bir antijen ile ve indirgen olmayan bir seker ile temas ettirilmesini içerir. Antijen olarak kullanilan peptid(ler), M; tuberculosis'in bir protein antijeninin tamamini veya bir kismini kapsayabilir. Inkübasyonun ardindan, immün hücreleri tarafindan üretilen bir immün efektör molekülünün, tercihen interferon gama'nin, seviyesi belirlenmekte olup burada immün efektör molekülünün seviyesi, M. tuberculosis'e karsi denegin hücre aracili immüno yanit verebilirlik seviyesinin göstergesidir.

ESAT-6, M. tuberculosis'in alti kDa'lik erken salgilayici bir antijenik hedefidir. ESAT-6 proteini (erken salgilanmis antijenik hedef 6), M. tuberculosis kisa süreli kültür filtratlarindan saflastirilan önemli bir salgilanmis antijendir.

Burada atif yapilan ESAT-6, CFF-10 (kültür filtrat proteini 10) ve 85B, hücre lizatindan ve saflastirmadan rekombinant tekniklerle elde edilebilmekte veya sentetik peptidler olarak üretilebilmektedir. Örnegin ESAT6, Statens Serum Institute'den (SSI, Kopenhag Danimarka) bir rekombinant protein olarak elde edilebilmektedir. M. Tuberculosis için uygun olan diger hedef protein. antijenleri arasinda TB7.7 ve TB37.6 bulunur. CFPlO ayrica ESAT-6-benzeri protein eesxB ve salgilanmis antijenik protein MTSA-lO olarak bilinir.

Tüberkülin veya PPD (saflastirilmis protein türevi), yalnizca M. tuberculosis genomu içinde bulunan (RD-I bölgesinde) genler tarafindan kodlanan ve BCG'de (Calmette et Guerin. Bacillus) bulunmayan ESAT-6'dan (erken salgilanmis antijenik hedef 6), CFP-lO'dan (kültür filtrat proteini 10) ve TB7.7'den farklidir.

PPD'den farklidir çünkü PPD, örnegin BCG alt suslari ile ve patojenikligi düsük veya hiç olmayan birkaç tüberküloz olmayan mikobakteriyel tür ile paylasilan diger antijenleri de içerir.

Bir somut gösterime göre, PDD antijen olarak kullanilir.

Spesifik olarak burada kullanildigi sekliyle Saflastirilmis Protein Türevi (PPD veya tüberkülin) terimi, türe özgü olmayan moleküllerin bir çökeltisidir. PPD veya tüberkülin, M. tuberculosis veya M. avium gibi baska mikobakterilerin bir karisimindan proteinlerin çikarilmasiyla elde edilir. PPD, BCG'ye karsi veya .ML tuberculosis'e karsi üretilen hücresel immünitenin veya Thl yanitinin varliginin test edilmesinde yaygin olarak kullanilir. Örnegin, büyük bir Master Batch, Connaught Tuberculin'den (CT68) hazirlanan Connaught Laboratories Limited'e ait TubersolB'den elde edilebilmekte veya Statens Serum Institute (SSI, Kopenhag Danimarka)'den elde edilen RT23 formunda elde edilebilmektedir.

Tercihen, antijen, NWCObacterium tuberculosis'den olan CFPlO, ESAT-6, TB7.7 ve TB37.6'dan seçilir.

Bir somut gösterime göre, antijen, bu protein antijenlerine karsilik gelen ve/veya bunlara çapraz reaktivite gösteren Bir somut gösterimde, numune, yukarida ayrintili olarak tarif edilen sekilde, CD4+ ve CD8+ peptidlerinin bir kombinasyonu ile temas ettirilir. Yukaridaki beyana atifta bulunmaktayiz.

Immün sistem hücreleri, denekten kan alinmasinin ardindan uzatilan süre sonrasinda tam kanda hücre aracili bir immün yaniti baslatma kapasitesini kaybeder ve müdahale olmaksizin kan alimindan 24 saat sonra yanitlar genellikle ciddi sekilde azalir veya yok olur. Mevcut bulusta is gücünün ve özel ekipmanlara duyulan ihtiyacin azaltilmasi, doktor ofisleri, klinikler, ayakta tedavi tesisleri ve veteriner klinikleri veya çiftlikler gibi bakim noktalarinda gerçeklestirilecek olan antijenler ile hücre aracili immün yanit uyarimina olanak saglar. Antijen uyarimi tamamlandiginda, taze ve aktif hücrelere artik gerek duyulmaz. Antijen ile uyarma nedeniyle salinan IFN-gama ve diger sitokinler veya immün efektör` moleküller, plazma gibi hücre içermeyen veya hücreden yoksun hale getirilmis sivilarda stabildir ve bu nedenle, numune, baska bir enfeksiyöz hastalik veya baska bir hastalik teshisi için kullanilan standart plazma veya seruni numunelerine benzer sekildeki özel kosullar 'veya hizli zaman gereksinimleri olmadan saklanabilmekte veya nakledilebilmektedir. Bu nedenle, gerçek salinmis immün efektör moleküllerinin tespit edilmesi tercih edilir- Bununla birlikte, inkübasyon bilesiminde veya tam inkübasyon bilesiminde bulunan hücreler, immün efektör Hmlekülünün varligi veya seviyesinin immün efektör molekülünün RNA ekspresyon seviyesine bagli olarak belirlenmesi durumunda RNA ekspresyon paternini stabilize eden reaktifleri içeren bir nükleik asit stabilize edici bilesim ile inkübasyon sonrasinda temas ettirilebilmektedir. Birçok stabilize edici bilesim piyasadan temin edilebilir. Örnegin PreAnalytiX, kandaki RNA gen ekspresyon profilinin hemen stabilizasyonuna yönelik reaktifler içeren bilesimler sunar.

Ilgili bilesimler, inkübasyon bilesiminde bulunan hücrelerin RNA gen ekspresyon profilini stabilize etmek için de kullanilabilmektedir. Ilgili stabilizasyon bilesimi, gen indüksiyonu ve transkript degradasyonu ile RNA profilinde degisiklik riski olmadan oda sicakliginda tasima ve depolamaya Kruhoffer ve dig., 2007). Ilgili bilesimler PAXgene Blood RNA Tubes adi altinda satilir.

Uygulamalar, hastaliklar ve durumlar Kullanimlari, hastaliklari ve durumlari içeren sinirlayici olmayan uygulamalar, asagida tarif edilecektir. Buradan anlasilacagi gibi, bulusa göre olan yöntem ile birlikte burada tarif edilen bilesimler ve kitler, tip ve tani alaninda yaygin sekilde kullanilabilmektedir ve örnegin, hastalarin hücre aracili yanit verebilirligini analiz etmek için uygun olan in vitro tahlillerde kullanilabilmektedir. Ayrica, bulusa göre olan yöntem ile birlikte burada tarif edilen bilesimler ve kitler, örnegin uyarim için kanser immünoterapötikleri gibi ajanlarin kabiliyetini test etmede ve böylece hücre aracili immüniteyi arttirmada degerli analitik araçlardir.

Burada ele alinan yöntem, örnegin, patojenik bir ajanin sebep oldugu bir enfeksiyon, bir otoimmün hastalik, kanser, inflamatuar bir ajana maruz kalma, bir ilaca maruz kalma, toksik proteinli bir ajana maruz kalma ve bir hastalik durumunun veya farmasötik ajanlarin indükledigi immün yetmezlik veya immünosupresyon gibi bir denekte bir hastalik veya durumun varligini veya yoklugunu veya derecesini veya evresini tespit etmeyi mümkün kilar. Hücre aracili immüniteyi hatasiz ve duyarli bir sekilde ölçebilme kabiliyeti, örnegin, bir denegin bir mikroorganizma, virüs veya parazit gibi bir patojenik ajanin sebep oldugu bir enfeksiyona yanit verme, bir otoimmün yanit baslatma, bir asiya veya immünoterapötige yanit verme, kansere veya diger onkolojik durumlara karsi koruma, inflamatuar bir durumu tespit etme veya bir denegin berilyum veya çevresel ajanlar gibi toksik bir ajana maruz kalmasini veya duyarliligini tespit etme yetenegini degerlendirmek açisindan önemlidir.

Burada tarif edilen tahlil, immüno yanit verebilirligin erken ve/veya daha duyarli bir sekilde tespit edilmesini saglar.

Burada tarif edilen tahlil ayrica, immünosupresyona yol açan hastalik durumlarinin tespitini veya ilaçlarin indükledigi immünosupresyonun tespit edilmesini saglar. Sonuç olarak, burada ele alinan sekilde "bir denekte hücre aracili bir immün yanitin ölçülmesi", tip alaninda pek çok yararli uygulamalara sahiptir ve sinirlayici olmayan kullanimlar ve uygulama daha sonra tarif edilecektir. Örnegin burada tarif edilen yöntem, enfeksiyöz ve otoimmün hastaliklarin immün tanisi için, immünokompetansa yönelik bir markör olarak ve bunun yani sira inflamatuar hastaliklar, alerjenler, kanser, immünoterapötiklerin etkisi için bir markör olarak ve toksik ajanlara yönelik markör olarak kullanilabilmektedir. Ayrica, yöntem genellikle (bir asinin etkinliginin bir ölçüsü de dahil olmak üzere) endojen ve/veya egzojen antijenlere olan T-hücre yanitlarinin tespit edilmesinde faydalidir.

Hücre temelli, fonksiyonel immün yanit tahlilleri ayrica immün yanitlari etkileyen asilarin, immünoterapötiklerin ve biyolojilerin gelistirilmesinde etkililik markörleri olarak kabul görmüstür. Tahliller, akademik ortamlarda, ilaç ortamlarinda ve asilarin ve biyolojilerin arastirilmasinda ve gelistirilmesinde kullanilabilmektedir. Immün hücrelerinin fonksiyonel kapasitesinin degerlendirilmesi, çesitli hastalik durumlarini ve bunlara yönelik terapötik stratejilerin etkililigini anlamada çok önemlidir. Immün hücreler, örnegin HIV gibi infeksiyöz hastaliklarda, önleme veya tedaviden sorumludur ya da, örnegin otoimmün hastalik durumlarinda, hastalik durumunun kendisinden sorumludur. Öz antijene özgü reaktivite, mevcut bulusa göre olan yöntem kullanilarak multipl skleroz gibi bir otoimmün hastaliktan muzdarip hastalarda ölçülebilmektedir.

Mevcut bulus, bu amaçlar için yararli olan tahliller sunar.

Su anda klinik çalismalarda çok sayida kanser immünoterapi stratejisi test edilmektedir. Klinik etkililik bu yaklasimlarin nihai testi olmasina ragmen, bu nmddelerin uzun ve karmasik gelisim.yolu, basari için en olasi adaylarin ara markörler olarak immünolojik yanitlarini degerlendirmeyi gerektirir. Bu, T-hücre aracili, antijene özgü immün yanitlarini dogru bir sekilde tespit eden ve miktarini belirleyen tahlillere olan ihtiyaci vurgulamistir. Örnegin, tümör gerilemesine neden olmasi beklenmeyen, fakat yine de hastalik üzerinde yararli bir etkiye sahip olmasi beklenen ilgili immünoterapötik. maddeler için, varsayilan aktivite sekline göre bir biyolojik markörün seçilmesi gerekir. Immünoterapi için, böyle bir markör, bir veya daha fazla immünolojik tahlil ile tespit edilebilir olan tümör antijene özgü immün yanitin uyarilmasidir. Burada, tercihen dogrudan sitoliz için bir tetikleyici olarak bir tümör hücresinin yüzeyi üzerindeki MHC molekülleri tarafindan sunulan tümör peptidlerini dogrudan taniyan CD8+ sitotoksik T-hücrelerin ve sitotoksik T hücre olusumuna yol açan CD4+ yardimci T- hücrelerin, özellikle de T yardimci tip 1 yanitlarin, fonksiyonunu degerlendiren analizler kullanilir. Mevcut bulus, duyarliligi ve güvenilirligi nedeniyle bu amaç için yararli olan tahliller sunar. Bu nedenle, burada tarif edilen yöntem, kitler ve bilesimler, örnegin bir kanser immünoterapötik gibi farmasötik bir ajanin, hücre aracili immüniteyi arttirabilip arttiramayacagini analiz etmek için kullanilabilmektedir. Bu, mevcut, örnegin standartlastirilmis, immün hücreler kullanilarak örnegin genel bir seviyede test edilebilmektedir (örnekler yukarida tarif edilir) ya da örnegin bir kanser immünoterapötik gibi spesifik immünoterapötigin söz konusu hastada hücre aracili immüniteyi arttirabilip arttiramayacagini analiz etmek için bireysel bir hastada test edilebilir. Bu tahlil, bir hastanin bir immünoterapötik ile yapilan tedaviden fayda görüp görmedigini analiz etmek için klinik gelisimin yani sira daha sonraki terapötik ortam için de önemlidir. Immünoterapötik örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, T- hücrelerin, özellikle sitotoksik T-hücrelerin, aktivitesini arttiran terapötik antikorlar gibi biyolojiler bulunur. Etki sekli, hücre aracili immünitenin uyarilmasi/artmasi ile sonuçlandigi veya sonuçlanmasi beklendigi sürece uygulanabilir degildir. Örnegin, aktivite, immün hücrelerin dogrudan uyarilmasiyla veya söz konusu T-hücrelerin aktivitesini olumsuz etkileyen inhibe edici mekanizmalarin azaltilmasiyla ya da kapatilmasiyla, böylece hücre aracili immünitenin dolayli olarak uyarilmasiyla/arttirilmasiyla arttirilabilmektedir. Kanser immünoterapötik antikoru lpilimumab buna bir örnektir.

Ayrica, mevcut bulusa göre yöntem, bir hastadaki bir hastalik veya durumunu varligini, yoklugunu, derecesini veya evresini tespit etmek için kullanilabilmekte olup burada mevcut bulusa göre olan yöntem kullanilarak tespit edilen immün efektör molekülünün varligi veya seviyesi, hastalik veya durumun göstergesidir.

Ayrica, mevcut bulusa göre yöntem, bir ajanin veya bir hastalik durumunun, bir denekte immünosupresyonu indüklediginin veya bununla iliskili oldugunun belirlenmesi için kullanilabilmekte olup burada mevcut bulusa göre olan yöntem kullanilarak tespit edilen immün efektör molekülünün varligi veya seviyesi, ajanin indükledigi veya hastalik durumunun indükledigi veya bununla iliskili olan immünosupresyon boyutunun göstergesidir.

Mevcut uygulamanin bir yönü, mevcut bulusa göre olan yöntem kullanilarak belirli bir antijene olan yanit verebilirligin ölçülmesi ile bir denegin hücre aracili immün yanit verebilirligini gösteren yöntemleri içerir. Bir somut gösterimde, tam kan, zenginlestirilmis bir beyaz kan hücresi fraksiyonu veya bronkoalveoler lavaj gibi bir numune, belirli bir hastaliga (örnegin otoimmün hastalik, patojenik bir ajanin sebep oldugu bir enfeksiyonun neden oldugu bir hastalik veya toksik bir ajana maruz kalma) sahip veya bu hastaliga yakalanma süphesi tasiyan bir denekten alinabilir ve immün yanit verebilirlik, mevcut bulusa ait yöntem kullanilarak, örnegin antijen ile uyarima yanit olarak efektör T-hücrelerden (örnegin CD4+ T-hücreleri ve/veya CD8+ sitotoksik T-hücreleri) salinan immün efektör moleküllerinin tespit edilmesi ile ölçülür.

Mevcut bulusa ait yöntem, bir patojenik ajanin sebep oldugu bir enfeksiyon, bir otoimmün hastalik, kanser veya bir inflamatuar durum gibi bir denekteki hastalik veya durumun derecesi veya evresi dahil olmak üzere bir hastalik veya durumun tespit edilmesinde ve/veya izlenmesinde oldukça faydalidir. Diger durumlar, berilyum gibi toksik ajanlara maruz kalmayi içerir.

Mevcut bulusa ait tahlil, terapötik protokollerin izlenmesinde de faydalidir.

Test edilen antijene yanit olarak üretilen immün efektör molekülünün varligi veya seviyesi, denegin hücre aracili yanit verebilirlik seviyesinin bir göstergesidir. Özellikle, yanit verebilirlik seviyesi, bir patojenik ajanin sebep oldugu bir enfeksiyon, bir otoimmün hastalik, bir kanser, bir inflamatuar durum.ve bir toksik.maddeye maruz kalmayi içeren listeden seçilen bir hastalik veya durumun varliginin veya yoklugunun veya derecesinin veya evresinin göstergesidir. Özellikle, immün efektör molekülünün varligi veya seviyesi, test edilen antijenin temsilcisi oldugu bir hastalik veya durumun varligini, yoklugunu, derecesini veya evresini gösterir.

Yöntem ayrica bir denekteki bir hastalik veya durum için bir terapötik protokole verilen bir yanitin izlenmesi için de kullanilabilir. Üretilen immün efektör molekülünün varligi, seviyesi veya paterni, terapötik protokolün etkililiginin göstergesi olabilir.

Mevcut bulusa ait yöntem ayrica bir “tahlil" olarak da ifade edilebilir. Yöntem, ex vivo bir yöntemdir. Burada tarif edilen tahlil, digerlerinin yani sira, bir denegin genel immün yanit verebilirligini degerlendirmede faydalidir veya bir otoimmün hastalik, Çölyak hastaligi, kanser veya bir patojenik organizma veya ajanin sebep oldugu enfeksiyon, toksik bir ajana veya ilaca maruz kalma ve bir hastalik durumunun veya terapötik bir ajanin indükledigi immün yetmezlik veya immünosüpresyon durumlari gibi spesifik hastalik durumlarina karsi yanit verebilirligin tespit edilmesinde faydalidir.

Bir somut gösterimde, denek bir insandir ve hücre aracili immün yanit tahlili, patojenik mikroorganizmalara, virüslere ve parazitlere yanit verebilirligin, gelistirme olasiliginin taranmasinda, bir otoimmün durumun, Çölyak hastaliginin, izlenmesi, bir denegin onkolojik zorluga verdigi yanitin izlenmesi ve herhangi bir immün yetmezlik veya immünosupresyonun varligini belirlemeye yönelik taramada kullanilir. Sonuncusu, örnegin, çesitli kemoterapötik ajanlar dahil olmak üzere belirli ilaçlara bagli olarak ortaya çikabilir. Alternatif olarak, çevresel toksik maddelere ve kirletici maddelere maruz kalma durumu test edilebilmektedir. Bir somut gösterimde, immünosupresyona yol açan hastalik durumlari arasinda kronik enfeksiyon ve kanser bulunur. Immünosupresyona yol açabilecek diger hastalik durumlari arasinda inflamatuar hastalik durumlari yer alir. Immünosupresyona yol açabilen ilaçlar arasinda romatoid artrit, kanser ve inflamatuar bagirsak hastaligini tedavi etmede kullanilan ilaçlar veya organ nakli ile baglantili olarak verilen ilaçlar yer alir.

Bir somut gösterimde, burada tarif edilen yöntem, tüberküloz süphesi tasiyan deneklerin (örnegin aktif, latent veya yakin geçmis TB enfeksiyonu) ve özellikle, örnegin immünosuprese edici ilaç kullanan (baska bir ifadeyle monoklonal antikor tedavisi (anti-CDZO antikorlari (örnegin Rituximab©) veya TNF-alfa bloklayici tedavi (örnegin Remicade©, Enbrel©, Humira©))) veya steroid kullanan veya kanser kemoterapisi alan hastalarda veya immünosuprese edici durumlardan (örnegin HIV enfeksiyonu, kanser, lDDM 'veya insüline bagimli olmayan diyabet (NIDDM), otoimmün durumlar, yanlis beslenme, yaslilik, intravenöz ilaç kullanimi (IVDU) veya kalitsal immün bozukluklar) muzdarip olan hastalarda ve yakin bir dönemde enfekte edilmis bireylerde, latentten aktif tüberküloza ilerlemenin artan riskini tasiyan hastalarin tanisinda veya izlenmesinde yardimci olarak kullanilabilir.

Bir somut gösterimde, burada tarif edilen yöntem, enfeksiyonlar veya diger hastalik durumlari tanisi konmus olan deneklerin izlenmesi için kullanilabilir. Bu, örnegin, bir tedavinin sonlandirilmasi esnasinda ve sonrasinda, örnegin enfeksiyonun olasi nüksetmesini izlemek ve tahmin etmek suretiyle tedavinin etkililigini degerlendirmeye yardimci olabilir.

Bir somut gösterime göre, yöntem, söz konusu denegin, antijenin temsilcisi oldugu bir patojene karsi hücre aracili bir immün yanit baslatip baslatamayacagini belirlemeye yöneliktir.

Patojenik, veya infeksiyöz ajanlar arasinda bakteriler, parazitler ve virüsler bulunur. Bakteri örnekleri arasinda Mycobacterium türleri, Staphylococcus türleri, Streptococcus türleri, Escherichia coli, Salmonella türleri, Clostridium türleri, Shigella türleri, Proteus türleri, Bacillus türleri, Hemophilus türleri, Borrelia türleri gibi Gram pozitif ve Gram negatif mikroorganizmalar bulunur. Tüberküloz (TB) gibi M.

Tuberculosis enfeksiyonundan kaynaklanan durumlarin yani sira Mycobacterium tuberculosis özellikle kullanisli bir hedeftir.

Virüs örnekleri arasinda Hepatit virüsü (Hepatit B virüsü ve Hepatit C virüsü), Herpes virüsü ve CMV virüsü ve Insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile birlikte bunlardan kaynaklanan hastaliklar yer alir. Parazitler arasinda Plasmodium türleri, saçkiran, karaciger parazitleri ve benzerleri bulunur. Diger patojenik ajanlar arasinda mayalar ve mantarlar gibi ökaryotik hücreler bulunur. Bu infeksiyöz entitilere maruz kalan deneklerde olasi veya gerçek hücre aracili yanit verebilirligi degerlendirmek genellikle önemlidir. Mevcut beyana ait yöntem ayni zamanda hastalik sürecinin derecesini veya evresini tespit etmenin yani sira bu enfeksiyonlarin varligini veya yoklugunu tespit etmek için de kullanilabilir.

Yöntem ayrica, ilgili hastaliga yakalanma riski tasiyan kisilerde belirli hastaliklara ve/veya enfeksiyöz ajanlara karsi hücre aracili immün seviyesini izlemek için de kullanilabilmektedir. Organ nakli hastalari gibi immün sistemi süprese hastalardaki CMV enfeksiyonu buna bir örnektir. CMV enfeksiyonlari, özellikle transplantasyondan sonra, immünosupresyonun komplikasyonu olarak siklikla ortaya çikar ve nakil alicilarinda morbidite ve mortaliteye önemli Ölçüde katkida bulunur. Nakledilen organin reddedilmesini önlemek için kullanilan mevcut immünsüpresif tedaviler, T-lenfositleri ve dolayisiyla hücre aracili immün yanitlar üzerinde zararli etkilere sahiptir, bu da nakil sonrasi Viral enfeksiyonlara karsi artan duyarliliga neden olur. T-hücre fonksiyonunun ve CMV replikasyonunun suprese edilmesinin önemi, CD8+ CMV'ye özgü sitotoksik T-lenfositlerin (CTL'ler) virüsle iliskili patojeneze karsi koruyabilecegi gerçegiyle de vurgulanir. HIV ile enfekte hastalar, immünosuprese hastalarin bir baska örnegidir. Mevcut bulusa ait yöntem, immün fonksiyonu kaybi, CMV hastaligi gibi bir hastaligin gelisimi ile iliskili olabilecegi için, ilgili bir hastaligi gelistirme riski tasiyan kisilerde örnegin anti- CMV immünite gibi hastalik immünitesi seviyesini seri olarak izlemek için kullanilabilmektedir. Tercihen, interferon gama, ilgili bir testte efektör molekül olarak belirlenir. Nakil alicisinin immün durumu, nakil alicilarinda CMV'nin (yeniden) aktivasyonunu etkileyebilmektedir. Örnegin CMV'ye özgü bir antijenin indükledigi güçlü bir interferon gama yaniti, hastanin güçlü bir hücre aracili yaniti ve dolayisiyla virüsten korunmasi nedeniyle CMV hastaliginin azalmis bir riskini gösterir. Minimal bir interferon gama yaniti, ya çok düsük hücre aracili bir immünite var oldugundan ya da hiç olmadigindan bir CMV hastaligi riskine isaret eder. Veriler, pozitif bir CMV testine sahip olan hastalarin, anti-viral profilaksinin kesilmesinden sonra negatif testli hastalardan daha sik ve daha uzun süre CMV hastaliklarindan arinmis oldugunu gösterir. Bu nedenle, profilaksinin sonunda CMV'ye hücresel bir immün yaniti olan hastalarin, tespit edilebilir bir immün yaniti olmayanlara göre CMV hastaligina yakalanma riski önemli ölçüde daha düsüktür. Bu nedenle, mevcut bulusa göre olan yöntem, nakil alicilarinda geç baslangiçli CMV hastaliginin gelisimini öngörebilir ve bu nedenle hasta yönetiminde çok faydalidir.

Denek alternatif olarak Çölyak hastaligi, otoimmün diyabet, alopesi areata, ankilozan spondilit, antifosfolipid sendromu, otoimmün Addison hastaligi multipl skleroz, otoimmün böbrek üstü bezi hastaligi, otoimmün hemolitik anemi, otoimmün hepatit, otoimmün ooforit ve orsit, Behçet hastaligi, büllöz pemfigoid, kardiyomiyopati, çölyak sprue-dermatit, kronik yorgunluk sendromu (CFIDS), kronik inflamatuar demiyelinizan, kronik inflamatuar polinöropati, Churg-Strauss sendromu, sikatrisyel pemfigoid, crest sendromu, soguk aglutinin hastaligi, Crohn hastaligi, dermatitis herpetiformis, diskoid lupus, esansiyel karisik kriyoglobulinemi, fibromiyalji, glomerülonefrit, Grave hastaligi, Guillain-Barre, Hashimoto tiroiditi, idiopatik pulmoner fibrozis, idiopatik trombositopeni purpura (ITP), IgA nefropati, insüline bagimli diyabet (Tip I), liken planus, lupus, Meniere hastaligi, karisik bag dokusu hastaligi, multipl skleroz, miyastenia gravis, miyokardit, pemfigus vulgaris, pernisiyöz anemi, poliarteritis nodosa, polikondrit, poliglanküler sendromlar, polimiyaljiya romatika, polimiyozit ve dermatomiyozit, primer agammaglobulinemi, primer biliyer siroz, psoriyazis, Raynaud fenomeni, Reiter sendromu, romatizmal ates, romatoid artrit, sarkoidoz, skleroderma, Sjogren sendromu, kati insan sendromu, sistemik lupus eritematozus, Takayasu arteriti, temporal arterit/dev hücreli arterit, ülseratif kolit, uveit, vaskülit, vitiligo ve inflamatuar bagirsak hastaligi arasindan seçilen bir hastalik durumuna sahip olabilir veya bu hastaliklar için test edilebilir. Denek alternatif olarak kansere sahip olabilir veya kanser için test edilebilir. Kanser tedavisi ayrica hücre aracili immüniteye de bir Haktar bagimlidir ve kanserin kendisi veya kanseri tedavi etmede kullanilan ilaçlar immünosupresyona neden olabilmektedir. Burada ele alinan kanserler sunlari içerir: bu hücreleri özel ve farkli hücrelere herhangi bir sekilde farklilastirmadan kontrolsüz hücreli büyüme (Örnegin tümör olusumu) ile karakterize edilen bir grup hastalik ve bozukluk. Bu tür hastaliklar ve rahatsizliklar arasinda ABLl protoonkogen, AIDS ile ilgili kanserler, akustik nöroma, akut lenfositik lösemi, akut miyeloid lösemi, adenokistik karsinom, adrenokortikal kanser, agnojenik miyeloid metaplazi, alopesi, alveolar yumusak kisim sarkomu, anal kanser, anjiyosarkom, aplastik anemi, astrositom, ataksi-telenjiektazi, bazal hücreli karsinom. (deri), mesane kanseri, kemik kanserleri, bagirsak kanseri, beyin sapi gliomu, beyin ve CNS tümörleri, meme kanseri, CNS tümörleri, karsinoid. tümörler, serviks kanseri, çocukluk çagi beyin tümörleri, çocukluk çagi kanseri, çocukluk çagi lösemisi, çocukluk çagi yumusak doku sarkomu, kondrosarkom, koryokarsinom, kronik lenfositik lösemi, kronik miyeloid lösemi, kolorektal kanserler, kutanöz T hücre lenfomasi, dermatofibrosarkom-protuberans, desmoplastik-küçük-yuvarlak hücreli tümör, duktal karsinom, endokrin kanserler, endometriyal kanser, ependimom, özofagus kanseri, Ewing sarkomu, ekstra- hepatik safra kanali kanseri, göz kanseri, göz: melanom, retinoblastom, yumurtalik tüpü kanseri, fankoni anemisi, fibrosarkom, safra kesesi kanseri, mide kanseri, gastrointestinal kanserler, gastrointestinal-karsinoid-tümör, genitoüriner kanserler, germ hücreli tümörler, gestasyonel- trofoblastik hastalik, gliyom, jinekolojik kanserler, hematolojik maliniteler, saçakli hücreli lösemi, bas ve boyun kanseri, hepatosellüler kanser, kalitsal meme kanseri, histiyositoz, Hodgkin hastaligi, insan papilloma Virüsü, hidatidiform mol, hiperkalsemi, hipofarinks kanseri, intraoküler melanom, islet hücre kanseri, Kaposi sarkomu, böbrek kanseri, Langerhan hücre histiositozisi, larinks kanseri, leyomiyosarkom, lösemi, Li-Fraumeni sendromu, dudak kanseri, liposarkom, karaciger kanseri, akciger kanseri, lenfödem, lenfoma, Hodgkin lenfomasi, Hodgkin olmayan lenfoma, erkek meme kanseri, malign böbrek yumusak doku tümörü, medülloblastom, melanom, merkel hücre kanseri, mezotelyoma, metastatik kanser, agiz kanseri, multipl endokrin neoplazi, mikozis fungoides, miyelodisplastik sendromlar, miyelom, miyeloproliferatif bozukluklar, nazal kanser, nazofarenks kanseri, nefroblastom, nöroblastom, nörofibromatozis, nijmegen kirik sendromu, melanoni disi cilt kanseri, küçük hücreli olmayan akciger kanseri (NSCLC), oküler kanserler, özofagus kanseri, oral kavite kanseri, orofarenks kanseri, osteosarkom, ostomi over kanseri, pankreas kanseri, paranazal kanser, paratiroid kanseri, parotis bezi kanseri, penis kanseri, periferik nöroektodermal tümörler, hipofiz kanseri, polisitemi vera, prostat kanseri, nadir kanserler ve iliskili bozukluklar, renal hücreli karsinom, retinoblastom, rabdomiyosarkom, Rothmund-Thomson sendromu, tükürük bezi kanseri, sarkom, schwannom, Sezary sendromu, cilt kanseri, küçük hücreli akciger kanseri (SCLC), ince bagirsak kanseri, yumusak doku sarkomu, spinal kord tümörleri, skuamöz hücreli karsinom (deri), mide kanseri, sinovyal sarkom, testis kanseri, timus kanseri, tiroid kanseri, transizyonel hücreli kanser (mesane), transizyonel hücreli kanser (renal-pelvis-/-üreter), trofoblastik kanser, üretral kanser, üriner sistem kanseri, üroplakinler, uterus sarkomu, uterus kanseri, vajinal kanser, vulva kanseri, Waldenstrom makroglobulinemisi ve Wilms tümörü Denek alternatif olarak bir protein toksik maddesine maruz birakilabilir veya maruz kalma durumu için test edilebilir.

Tespit etmeye ve/veya izlemeye yönelik olarak burada ele alinan otoimmün hastaliklar arasinda digerlerinin _yani sira alopesi areata, ankilozan spondilit, antifosfolipid sendromu, otoimmün Addison hastaligi multipl skleroz, otoimmün böbrek üstü bezi hastaligi, otoimmün hemolitik anemi, otoimmün hepatit, otoimmün ooforit ve orsit, Behçet hastaligi, büllöz pemfigoid, kardiyomiyopati, çölyak sprue-dermatit, kronik yorgunluk sendromu (CFIDS), kronik inflamatuar demiyelinizan, kronik inflamatuar polinöropati, Churg-Strauss sendromu, sikatrisyel pemfigoid, crest sendromu, soguk aglutinin hastaligi, Crohn hastaligi, dermatitis herpetiformis, diskoid lupus, esansiyel karisik kriyoglobulinemi, fibromiyalji, glomerülonefrit, Grave hastaligi, Guillain-Barre, Hashimoto tiroiditi, idiopatik pulmoner fibrozis, idiopatik trombositopeni purpura (ITP), IgA nefropati, insüline bagimli diyabet (Tip I), liken planus, lupus, Meniere hastaligi, karisik bag dokusu hastaligi, multipl skleroz, miyastenia gravis, miyokardit, pemfigus vulgaris, pernisiyöz anemi, poliarteritis nodosa, polikondrit, poliglanküler sendromlar, polimiyaljiya romatika, polimiyozit ve dermatomiyozit, primer agammaglobulinemi, primer biliyer siroz, psoriyazis, Raynaud fenomeni, Reiter sendromu, romatizmal ates, romatoid artrit, sarkoidoz, skleroderma, Sjogren sendromu, kati insan sendromu, sistemik lupus eritematozus, Takayasu arteriti, temporal arterit/dev hücreli arterit, ülseratif kolit, uveit, vaskülit ve vitiligo bulunur.

Ele alinan diger hastalik durumlari arasinda immünosupresyona yol açabildikleri için inflamatuar hastalik durumlari bulunur.

Mevcut beyanda ele alinan inflamatuar hastalik durumlari örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, hasar veya hastaliktan etkilenen dokulari korumaya yönelik olan kizariklik, sisme, agri ve belirli alanlarda isi hissi yaniti ile sonuçlanan hastaliklar ve bozukluklar bulunur. Mevcut beyana ait yöntemlerin kullanilmasiyla tedavi edilebilen inflamatuar hastaliklar arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, akne, anjina, artrit, aspirasyon pnömonisi, hastalik, ampiyem, gastroenterit, inflamasyon, bagirsak gribi, NEC, nekrotizan enterokolit, pelvik inflamatuar hastalik, farenjit, PID, plörezi, girtlak iltihabi, kizariklik, rubor, bogaz agrisi, mide gribi ve idrar yolu enfeksiyonlari, kronik inflamatuar demiyelinizan polinöropati, kronik inflamatuar demiyelinizan poliradikülonöropati, kronik inflamatuar demiyelinizan polinöropati, kronik inflamatuar demiyelinizan poliradikülonöropati bulunur. Insan disi uygulamalar açisindan, mevcut beyan, atlarda ElPH'yi ve hayvanlarda Tazmanya Canavarindaki yüz tümörü hastaligi gibi çesitli durumlari tespit etmeyi kapsar.

Yukaridaki yönlerde, antijen, patojenik ajandan türetilebilir, hastalik durumu veya kanser ile iliskili olabilir veya bir toksik madde olabilir. Alternatif olarak, enfeksiyon, hastalik durumu, kanser veya toksik madde, hücre aracili immüniteyi baskilayabilir, bu durumda denegin önceden maruz birakildigi herhangi bir antijen kullanilabilir.

Açiklamada ve birinci yöne göre yönteme ait olan istemlerde tarif edilen özellikle avantajli somut gösterimler asagida yeniden tarif edilir. Birinci yöne göre, mevcut beyan hücre aracili immün yanit aktivitesini ölçmeye yönelik bir yöntem sunmakta olup söz konusu yöntem asagidakileri içerir: (a)bir antijen ile uyarimin ardindan immün efektör molekülleri üretebilen immün hücrelerini içeren bir numuneyi en az bir antijen ile ve en az bir indirgen olmayan seker ile temas ettirerek bir inkübasyon bilesimi sunulmasi, ve (b)en az bir immün efektör molekülünün varliginin veya seviyesinin tespit edilmesi.

Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan seker, tercihen trehaloz ve sakkarozdan seçilen bir indirgen olmayan disakkarittir. Inkübasyon bilesimindeki indirgen olmayan seker konsantrasyonu bir somut gösterime göre en az 1,5 mg/ml, tercihen en az 2 mg/ml'dir. Inkübasyon bilesimindeki indirgen olmayan seker konsantrasyonu için uygun araliklar ayni zamanda yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur.

Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan seker, trehaloz, mannitol, sakkaroz ve rafinozdan seçilir. Örneklerle gösterildigi gibi, bu indirgen olmayan sekerler, yanit seviyelerini arttirir. Trehaloz özellikle tercih edilir, çünkü burada, yanit seviyesindeki en büyük artis gözlenmistir. Ayrica, arttirma etkisi depolama sirasinda korunabilir.

Bir somut gösterime göre, (a) asamasinda, numune, antijen ve indirgen olmayan seker içeren bir bilesim ile temas ettirilir.

Numunenin bir tam kan örnegi oldugu bir somut gösterime göre, bilesim ek olarak bir antikoagülan, tercihen heparin içerir. Bir somut gösterime göre, antijen, indirgen olmayan seker ve istege bagli olarak bir antikoagülan içeren bilesim, numune toplama kabinda bulunur. Burada tarif edildigi gibi, bu numune toplama kabi, örnegin vakumlu bir kan alma kabi olabilmektedir. Bir somut gösterime göre, bilesim, püskürtülerek kurutulmus bir bilesimdir. Uygun somut gösterimler burada tarif edilmistir.

Bir somut gösterime göre, numune asagidaki karakteristiklerden birine veya daha fazlasina sahiptir: 1) numune bir insan denekten alinmistir; ii)numune, immünsüprese veya immün yetmezligi olan bir insan denekten alinmistir; iin numune, NK hücreleri, T-hücreler, B-hücreler, dendritik hücreler, makrofajlar ve monositlerden olusan gruptan seçilen immün hücreleri içerir; ve/Veya iv)numune tam kandir.

Bir somut gösterime göre, antijen, peptidler, glikoproteinler, fosfoproteinler ve fosfolipoproteinler dahil olmak üzere proteinler, karbonhidratlar, fosfolipidler ve yukarida belirtilenlerin fragmanlarindan olusan gruptan seçilir ve tercihen bir veya daha fazla peptid tarafindan saglanir.

Bir somut gösterime göre, (a) asamasinda iki veya daha fazla farkli antijen kullanilir ve/veya (b) asamasinda iki veya daha fazla farkli efektör molekül tespit edilir.

Bir somut gösterime göre, 5 ila 100 amino asit veya 7 ila 50 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip bir veya daha fazla peptid, antijen olarak kullanilir. Avantajli bir somut gösterime göre, antijen, bir CD8+ sitotoksik T-hücresi tarafindan taninan bir veya daha fazla peptid tarafindan saglanir.

Tercihen, bu somut gösterimde, antijen, 15 amino asitten daha az, tercihen 7-14 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip bir veya daha fazla peptid tarafindan saglanir. Ilgili peptidlere ait ayrintilar yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur.

Bir somut gösterime göre, antijen, bir birinci setin 7 ila 14 amino asit kalintisi uzunlugundaki en az bir peptid içerdigi ve bir ikinci setin 15 veya daha fazla amino asit kalintisi uzunlugundaki en az bir peptid içerdigi en az iki peptid seti tarafindan saglanmakta olup bu peptidler bir protein antijeninin tamamini veya bir kismini kapsar. Ilgili peptid setlerine ait ayrintilar yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur.

Avantajli bir somut gösterime göre, antijen, bir veya daha fazla sentetik peptid tarafindan saglanir. Peptid(ler)e ait ayrintilar yukarida tarif edilmistir ve ilgili açiklamaya atifta bulunulmustur.

Bir somut gösterime göre, numune, bunlar için hücre aracili immün yanitin test edilecegi hastalik veya durum ile iliskili veya bunlarin temsilcisi olan bir antijen ile temas ettirilir.

Avantajli bir somut gösterime göre, antijen, hastaliga özgü bir antijen, özellikle de patojene özgü bir antijendir. Örnegin, antijen, bir hastalik durumu ile iliskili bir patojenden türetilebilir ve bu nedenle patojenden türetilen bir antijen ile çapraz reaktiftir veya bir kanser ile iliskili olan tümör- iliskili bir antijendir. Yukarida tarif edildigi gibi, patojen, bir bakteri, bir virüs, bir parazit, maya veya bir mantar olabilir. Sinirlayici olmayan örnekler asagida tarif edilecektir. Örnegin, bakteri, Gram pozitif ve Grani negatif mikroorganizmalardan, özellikle Mycobacterium tuberculosis gibi Mycobacterium türleri, Staphylococcus türleri, Streptococcus türleri, Escherichia coli, Salmonella türleri, Clostridium türleri, Shigella türleri, Proteus türleri, Bacillus türleri, Hemophilus türleri ve Borrelia türlerinden seçilebilir. Virüs, Hepatit B virüsü ve Hepatit C Virüsü gibi Hepatit virüsü, Herpes Virüsü, CMV virüsü ve Insan immün yetmezlik virüsünden (HIV) seçilebilir. Parazit, Plasmodium türleri, saçkiran ve karaciger parazitlerinden seçilebilir.

Bir somut gösterime göre, antijen, bir virüstendir veya Virüse özgüdür, tercihen sitomegalovirüs (CMV) virüsündendir veya buna özgüdür. Tercihen, söz konusu antijen, 7 ila 14 amino asit kalintisi, 7 ila 13 amino asit kalintisi veya 8 ila 12 amino asit kalintisi uzunluguna sahip olan bir veya daha fazla peptid tarafindan saglanir. Yukarida tarif edildigi gibi, bir veya daha fazla peptid, sentetik peptid de olabilir.

Bir somut gösterime göre, (b) asamasinda tespit edilen immün efektör molekülü asagidaki karakteristiklerden birine veya daha fazlasina sahiptir: 1) bir sitokindir; ii)bir kemokindir; iin antijen ile hücre aktivasyonu, uyarim veya yeniden iv)interferonlar, interlökinler (IL), Tümör Nekroz Faktörü alfa (TNF-d), Dönüstürücü Büyüme Faktörü beta (TGF-ß), Granülosit (G)-CSF veya Granülosit Makrofaj (GM)-CSF gibi bir Koloni Uyarici Faktör (CSF), kompleman bileseni Sa (C5a), Groa (CXCLl), slCAM-l (CD54), IP-lO (CXCLlO), I-TAC (CXCLll), MCP-l (CCLZ), MIF (GIF), MIP-ld (CCL3), MlP-lß (CCL4), Serpin El (PAI-l), RANTES (CCLS) veya MIG'den (CXCL9) olusan gruptan seçilir; ve/veya v) immün efektör molekülü IFN-gama'dir.

Yöntemin bir somut gösterimine göre, bir immün efektör molekülünün varligi veya seviyesi, immün efektör molekülüne bagli olarak belirlenir veya immün efektör molekülünün RNA ekspresyon seviyesine bagli olarak belirlenir. Uygun somut gösterimler yukarida tarif edilmistir.

Bir somut gösterime göre, yukaridaki somut gösterimlerin herhangi birine göre yöntem, patojenik bir ajanin sebep oldugu bir enfeksiyon, bir otoimmün hastalik, bir kanser, inflamatuar bir durum, toksik bir ajana maruz kalma, terapötik bir ajana verilen yanit, bir immün yetmezlik ve bir immünosupresyondan olusan gruptan seçilen bir hastalik veya durumun varliginin, yoklugunun, derecesinin veya evresinin izlenmesi veya belirlenmesine yöneliktir. Tercihen, hücre aracili immün yanit büyüklügü, bir hastalik durumunun evresi, ilerlemesi ve/veya siddeti ile iliskilidir. Bir somut gösterime göre, yukaridaki somut gösterimlerin herhangi birine göre yöntem, bir hastaligin, bir enfeksiyonun ve/veya tedaviye, özellikle immünoterapi veya immünosupresif ajanlarla yapilan bir tedaviye, verilen yanitin tespit edilmesine veya izlenmesine yöneliktir.

Bir somut gösterime göre, yukaridaki somut gösterimlerden herhangi birine göre yöntem asagidakileri içerir: (a)bir insan denekten alinan bir tam kan örnegini en az bir peptid antijen ve en az bir indirgen olmayan disakkarit, tercihen trehaloz veya sakkaroz, içeren bir bilesim ile temas ettirerek bir inkübasyon bilesimi sunulmasi ve inkübasyon bilesiminin en az 2 saat boyunca inkübe edilmesi; ve (b)antijen ile uyarma nedeniyle salinan IFN-gama varliginin veya seviyesinin ölçülmesi; burada tespit edilen IFN-gama'nin varligi veya niceligi, insan denegin hücre aracili immün yanit verebilirlik seviyesinin göstergesidir.

Bir somut gösterime göre, yukaridaki somut gösterimlerden herhangi birine göre yöntem asagidakileri içerir: (c)belirlenen immün efektör molekül seviyesinin ya da bundan türetilmis bir degerin bir referans seviyesi ile karsilastirilmasi.

Mevcut beyan ayrica bir patojenik enfeksiyona, bir otoimmün bozukluga veya kansere veya böyle bir durum veya bozuklugun gelistirilmesi için bir egilime sahip olan bir denegin tedavi yöntemini sunmakta olup söz konusu yöntem, immün efektör molekülünün belirlenmis varligi veya seviyesinin, durumun veya bozuklugun varliginin, yoklugunun, derecesinin veya evresinin göstergesi olan denegin hücre aracili yanit verebilirlik seviyesinin göstergesi oldugu birinci yöne göre hücre aracili yanit aktivitesini ölçmeye yönelik yöntemin gerçeklestirilmesini ve daha sonra durumun ya da bozuklugun tedavi edilmesini içerir.

Birinci yöne göre olan yönteme ait ayrintilar yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur.

Bilesimler, kitler ve kullanimlar Istem 14, bir numunede hücre aracili bir immün yaniti indüklemeye yönelik asagidakileri içeren bir bilesimi tanimlar: a)antijenin hastaliga özgü bir antijen oldugu 5 ila 50 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip en az bir peptid antijen; b)antijene yanit veren immün hücrelerinin interferon-gama yanitini arttirabilen en az bir indirgen olmayan seker; ve c)antikoagülanin heparin oldugu en az bir antikoagülan.

Ayni zamanda bir numunede hücre aracili bir immün yaniti indüklemeye yönelik asagidakileri içeren bir bilesim de açiklanmistir: a)en az bir izole edilmis antijen; b)en az bir indirgen olmayan seker; c)istege bagli olarak en az bir antikoagülan.

Bilesim, bilesim biçimi, uygun antijenler, indirgen olmayan sekerler ve antikoagülanlar ile ilgili ayrintilar, yöntem ile birlikte yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur. Bu bilesim örnegin birinci yöne göre olan yöntemde kullanilabilmektedir. Böyle bir bilesim kullanilarak analiz edilebilen kullanimlar/amaçlar, hastaliklar ve durumlar dahil olmak üzere uygun uygulamalar ve buna uygun olarak söz konusu bilesimin uygun kullanimlari yukarida ayrintili olarak tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur.

Bilesim yukarida tarif edilen yöntemler, uygulamalar ve kullanimlarda kullanilmak için özellikle uygundur. Bir somut gösterime göre, bilesini bir basit seker içermez. Bir somut gösterime göre, bilesim bir indirgen seker içermez. Tercihen, bilesim yari sivi, jel benzeri veya kati bir bilesimdir. Tercihen kurutulmus bir bilesimdir. Bir somut gösterime göre, bilesim, püskürtülerek kurutulmus bir bilesimdir.

Sinirlayici olmayan, avantajli somut gösterimler asagida yeniden tarif edilmistir: Indirgen olmayan seker, yukarida tarif edildigi gibi, birinci yöne göre olan yöntem ile baglantili karakteristiklere sahip olabilir' ve burada da geçerli olan ilgili açiklamaya atifta bulunulur. Yukarida tarif edildigi gibi, indirgen olmayan seker antijen için stabilizör olarak kullanilmaz, fakat yanit seviyesini arttirmak için kullanilir. Örneklerde gösterildigi gibi, trehaloz, mannitol, sakkaroz ve rafinoz gibi indirgen olmayan sekerler yanit seviyelerini arttirir. Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan seker` bir indirgen olmayan disakkarittir. Indirgen olmayan disakkarit, trehaloz ve sakkarozdan seçilir. Ikinci yöne göre bilesimdeki indirgen olmayan seker konsantrasyonu, bir somut gösterime göre, söz konusu bilesim, istenen numune miktari ile temas ettirildiginde, ortaya çikan inkübasyon bilesimi, en az 1,5 mg/ml, tercihen en az 2 mg/ml'lik bir konsantrasyonda indirgen olmayan seker içerecek sekildedir. Inkübasyon bilesimindeki indirgen olmayan seker konsantrasyonu için uygun araliklar ayni zamanda birinci yöne göre olan yöntem ile birlikte yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur. Uygun ve tercih edilen numune materyalleri de birinci yöne göre olan yöntem ile birlikte yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur. Bir somut gösterime göre, numune asagidaki karakteristiklerden birine veya daha fazlasina sahiptir: 1) numune bir insan denekten alinmistir; ii)numune, immünsüprese veya immün yetmezligi olan bir insan denekten alinmistir; iin numune, NK hücreleri, T-hücreler, B-hücreler, dendritik hücreler, makrofajlar ve monositlerden olusan gruptan seçilen immün hücreleri içerir; ve/Veya iv)numune tam kandir.

Bir somut gösterime göre, bilesimde bulunan antijen, peptidler, glikoproteinler, fosfoproteinler` ve fosfolipoproteinler dahil olmak üzere proteinler, karbonhidratlar, fosfolipidler ve yukarida belirtilenlerin fragmanlarindan olusan gruptan seçilir ve tercihen bir veya daha fazla peptid tarafindan saglanir.

Bir somut gösterime göre, bilesim iki veya daha fazla farkli antijen içerir.

Bir somut gösterime göre, bilesim, antijen olarak, bir veya daha fazla peptidin 5 ila 100 amino asit veya 7 ila 50 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip oldugu bir veya daha fazla peptid. içerir. Avantajli. bir somut gösterime göre, bilesim, antijen olarak, bir CD8+ sitotoksik T-hücresi tarafindan taninan bir veya daha fazla peptid içerir. Tercihen, bu somut gösterimde, antijen, 15 amino asitten daha az, tercihen 7-14 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip bir veya daha fazla peptid tarafindan saglanir. Ilgili peptidlere ait ayrintilar, birinci yöne göre olan yöntem ile birlikte yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur.

Bir somut gösterime göre, bilesim, bir birinci setin 7 ila 14 amino asit kalintisi uzunlugundaki en az bir peptid içerdigi ve bir ikinci setin 15 veya daha fazla amino asit kalintisi uzunlugundaki en az bir peptid içerdigi bir protein antijeninin tamamini veya bir kismini kapsayan en az iki peptid seti tarafindan saglanan bir antijen içerir. Ilgili peptid setlerine ait ayrintilar, birinci yöne göre olan yöntem ile birlikte yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur.

Avantajli bir somut gösterime göre, bilesim, bir veya daha fazla sentetik peptid tarafindan saglanan bir antijen içerir.

Peptid(ler)e ait ayrintilar yukarida tarif edilmistir ve ilgili açiklamaya atifta› bulunulmustur. Bir~ somut gösterime göre, bilesim, bunlar için hücre aracili immün yanitin test edilecegi hastalik veya durum ile iliskili veya bunlarin temsilcisi olan bir antijen içerir.

Avantajli bir somut gösterime göre, bilesimde bulunan antijen, hastaliga özgü bir antijen, özellikle de patojene özgü bir antijendir. Örnegin, antijen, bir hastalik durumu ile iliskili bir patojenden türetilebilir ve bu nedenle patojenden türetilen bir antijen ile çapraz reaktiftir veya bir kanser ile iliskili olan tümör-iliskili bir antijendir. Yukarida tarif edildigi gibi, patojen, bir bakteri, bir virüs, bir parazit, maya veya bir mantar olabilir. Sinirlayici olmayan örnekler asagida tarif edilecektir. Örnegin, bakteri, Grani pozitif ve Gram negatif mikroorganizmalardan, özellikle Mycobacterium tuberculosis gibi Mycobacterium türleri, Staphylococcus türleri, Streptococcus türleri, Escherichia coli, Salmonella türleri, Clostridium türleri, Shigella türleri, Proteus türleri, Bacillus türleri, Hemophilus türleri ve Borrelia türlerinden seçilebilir. Virüs, Hepatit B Virüsü ve Hepatit C Virüsü gibi Hepatit virüsü, Herpes Virüsü, CMV Virüsü ve Insan immün yetmezlik Virüsünden (HIV) seçilebilir. Parazit, Plasmodium türleri, saçkiran ve karaciger parazitlerinden seçilebilir.

Bir somut gösterime göre, bilesim, sitomegalovirüs (CMV) gibi, bir virüsten olan veya virüse özgü olan bir antijen içerir.

Tercihen, söz konusu antijen, 7 ila 14 amino asit kalintisi, 7 ila 13 amino asit kalintisi veya 8 ila 12 amino asit kalintisi uzunluguna sahip olan .bir veya daha fazla peptid. tarafindan saglanir. Yukarida tarif edildigi gibi, bir veya daha fazla peptid, sentetik peptid de olabilir.

Bilesim, bir numune toplama kabinda bulunabilmektedir, vakumlu bir kan alma kabi gibi bu tür kabin uygun ve avantajli somut gösterimleri burada tarif edilir ve ilgili açiklamaya atifta Ayrica, en az bir izole edilmis antijen, en az bir indirgen olmayan seker, antijen ile uyarimin ardindan immün efektör molekülleri üretebilen immün hücreler, tercihen T-lenfositler ve istege bagli olarak en az bir antikoagülan içeren bir inkübasyon bilesimi de sunulur. Tercihen, inkübasyon bilesimi bir tam kan örneginden hazirlanmistir ve bu nedenle bir tam kan örnegi içerir. Bir somut gösterime göre, inkübasyon bilesimi, ikinci yöne göre olan bir bilesimin bir numune ile temas ettirilmesi ile hazirlanmistir. Uygun ve tercih edilen numune materyalleri, birinci yöne göre olan yöntem. ile birlikte yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur. Bir somut gösterime göre, numune asagidaki karakteristiklerden birine veya daha fazlasina sahiptir: i) numune bir insan denekten alinmistir; ii)numune, immünsüprese veya immün yetmezligi olan bir insan denekten alinmistir; iii)numune, NK hücreleri, T-hücreler, B-hücreler, dendritik hücreler, makrofajlar ve monositlerden olusan gruptan seçilen immün hücreleri içerir; ve/Veya iv)numune tam kandir.

Tercihen, inkübasyon bilesimi, ikinci yöne göre olan bir bilesimin, bir özneden alinan, tercihen bir insandan alinan, bir tam kan örnegi ile temas ettirilmesiyle elde edilir. Ikinci yöne göre olan bilesim, inkübasyon bilesimi, bilesimin hazirlanmasi, uygun antijenler, indirgen olmayan sekerler ve antikoagülanlar ile ilgili detaylar, mevcut beyana göre olan yöntem ve ikinci yöne göre olan bilesim ile birlikte yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur. Antikoagülan tercihen heparindir. Bir somut gösterime göre, inkübasyon bilesimi, en az 1,5 mg/ml, tercihen en az 2 mg/ml'lik bir konsantrasyonda indirgen olmayan seker içerir. Inkübasyon bilesimindeki indirgen olmayan seker konsantrasyonu için uygun araliklar ayni zamanda birinci yöne göre olan yöntem ile birlikte yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur. Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan seker, trehaloz, mannitol, sakkaroz ve rafinozdan seçilir. Yukarida tarif edildigi gibi, avantajli bir somut gösterime göre, indirgen olmayan seker, tercihen trehaloz ve sakkarozdan seçilen bir indirgen olmayan disakkarittir.

Ayni zamanda asagidakileri içeren ilgili bir bilesimi içeren bir numune toplama kabi, özellikle bir örnek toplama tüpü de açiklanmistir: a)en az bir izole edilmis antijen; b)en az bir indirgen olmayan seker; c)istege bagli olarak en az bir antikoagülan.

Numune toplama kabinda bulunan bilesim, tercihen ikinci yöne göre olan bilesimdir. Bilesim, uygun antijenler, indirgen olmayan sekerler ve antikoagülanlar ile ilgili ayrintilar, yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur. Bu numune toplama kabi örnegin birinci yöne göre olan yöntemde kullanilabilmektedir. Böyle bir numune toplama kabi kullanilarak analiz edilebilen kullanimlar/amaçlar, hastaliklar` ve durumlar dahil olmak üzere uygun uygulamalar yukarida ayrintili olarak tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur. Üçüncü yöne göre olan numune toplama kabi yukarida tarif edilen yöntemler, uygulamalar ve kullanimlarda kullanilmak için özellikle uygundur. Tercihen, bilesim tercihen vakumlu bir kan alma tüpü olan kabin iç kismina püskürtülür.

Mevcut beyana ait yöntemde bu tür kullanima hazir toplama kaplari kullanilarak, yöntemin kosullari optimize edilir ve standardize edilir ve isleme basitlestirilir.

Bulusa göre yönteni tercihen, yönteni asamalarinin yürütülmesi için gerekli materyalleri sunan bir kit kullanilarak gerçeklestirilir. Böyle bir kit tercihen, yöntemin optimize edilmis kosullar altinda gerçeklestirilmesini ve böylece farkli numunelerden veya hastalar ya da farkli uygulayicilar tarafindan elde edilen sonuçlarin birbiriyle karsilastirilabilmesini saglayan standardize edilmis materyal içerir. Dolayisiyla, dördüncü bir yönde, mevcut bulus, bir denekte hücre aracili immün yanit aktivitesini ölçmeye yönelik bir kit sunmakta olup söz konusu kit en az bir antijen, en bir indirgen olmayan seker, en az bir numune toplama kabi ve en az bir immün efektör molekülü için en az bir tespit etme araci içerir.

Istem 17, bir denekte hücre aracili immün yanit aktivitesini ölçmeye yönelik bir kiti tanimlamakta olup söz konusu kit 5 ila 50 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip en az bir peptid antijen, antijene yanit veren immün hücrelerinin interferon-gama yanitini arttirabilen en az bir indirgen olmayan seker, heparin, en az bir numune toplama kabi ve interferon-gama için en az bir tespit etme araci içerir.

Tercihen, antijen ve indirgen olmayan seker tek bir bilesim halinde sunulur. Bu amaçla, ikinci yöne göre olan bilesim kullanilabilmektedir ve söz konusu bilesimin ayrintilari için yukaridaki beyana atifta bulunulur. Bilesim, antijen ve indirgen olmayan seker ile ilgili ayrintilar, yöntem ve mevcut bulusa göre olan bilesim ile birlikte yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur. Bir somut gösterime göre, kit, antijen ve indirgen olmayan seker içeren bilesimi içeren bir kan alma tüpü gibi bir numune toplama kabini içerir.

Tercihen, bilesim ek olarak heparin gibi bir antikoagülan içerir. Tarif edildigi gibi, numune toplama kabinda bulunan bilesim, ikinci yöne göre olan bilesim olabilmektedir. Tercihen, tespit araci isaretli bir antikor gibi bir immüno tespit reaktifidir. Bununla birlikte, mRNA ekspresyon seviyesinin tespit edilmesine dayanan tahliller için, tespit araci, tespit edilecek immün efektör molekülüne özgü olan primerler ve/veya problar tarafindan saglanabilmektedir. Uygun deneyler ve tespit araçlari teknikte uzman kisilerce bilinir ve ayrica yukarida tarif edilmistir.

Baska bir yöne göre, mevcut beyan, hücre aracili yanit aktivitesinin ölçülmesine yönelik immünolojik bir tahlilde bir indirgen olmayan sekerin kullanilmasi ile ilgili olup burada numunenin antijen ile inkübasyonu esnasinda indirgen olmayan sekerin ilave edilmesi, söz konusu tahlilde test edilen antijene yanit veren immün hücrelerden bir immün efektör' molekülünün salinimini arttirir.

Istem 19, 5 ila 50 amino asit, tercihen 7 ila 50 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip bir peptid antijene olan hücre aracili yanit aktivitesinin ölçülmesine yönelik immünolojik bir tahlilde bir indirgen olmayan sekerin kullanimini tanimlamakta olup burada numunenin antijen ile inkübasyonu esnasinda indirgen olmayan sekerin ilave edilmesi, söz konusu tahlilde test edilen antijene yanit veren immün hücrelerden interferon-gama salinimini arttirir ve burada tercihen, indirgen olmayan seker asagidaki karakteristiklerden birine veya daha fazlasina sahiptir: i)indirgen olmayan seker bir disakkarittir; iiJindirgen olmayan seker, trehaloz ve sakkarozdan seçilir; iii)indirgen olmayan seker, trehaloz, mannitol, sakkaroz ve rafinozdan seçilir; iv)indirgen olmayan seker trehalozdur; v)indirgen olmayan seker, test edilecek numuneyi ve antijeni içeren inkübasyon bilesiminde en az ]_ mg/ml, tercihen 2 mg/ml'lik bir konsantrasyonda kullanilir; vi)indirgen olmayan seker, ek olarak test edilecek antijeni ve istege bagli olarak bir antikoagülan içeren bir bilesim halinde sunulur.

Indirgen olmayan seker, tercih edilen konsantrasyonlar, immünolojik tahlil ve tip alanindaki uygulamalar, uygun ve tercih edilen antijenler, immün efektör molekülleri ve immün hücreler ile ilgili ayrintilar, mevcut bulusa göre olan yöntem ile birlikte yukarida tarif edilmistir* ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur. Indirgeyici olmayan seker asagidaki karakteristiklerden birine veya daha fazlasina sahip olabilir: i)indirgen olmayan seker bir disakkarittir; ii)indirgen olmayan seker, trehaloz ve sakkarozdan seçilir; iin indirgen olmayan seker, test edilecek numuneyi ve antijeni içeren inkübasyon bilesiminde en az 1 mg/ml, tercihen 2 mg/ml'lik bir konsantrasyonda kullanilir; ve/Veya iv)indirgen olmayan seker, ek olarak test edilecek antijeni ve istege bagli olarak bir antikoagülan içeren bir bilesim halinde sunulur.

Bir somut gösterime göre, indirgen olmayan seker, trehaloz, mannitol, sakkaroz ve rafinozdan seçilir.

Burada tarif edildigi gibi indirgen olmayan bir sekerin, örnegin trehalozun, hücre aracili immüniteyi belirlemek veya izlemek için bir tahlilde kullanilmasi önemli avantajlara sahiptir.

Yukarida tarif edildigi gibi, tercihen indirgen olmayan seker, numune ile temas eden tek bir bilesim halinde antijen ile birlikte sunulur. Bir somut gösterime göre, inkübasyon için indirgen seker eklenmez ve/veya indirgen olmayan seker ve antijen içeren bilesim içinde bulunmaz_ Yukarida tarif edildigi gibi, indirgen olmayan seker antijen için stabilizör olarak kullanilmaz. Avantajli bir somut gösterime göre, antijen, bir CD8+ sitotoksik T-hücresi tarafindan taninan bir veya daha fazla peptid, tercihen sentetik peptidler, tarafindan saglanir.

Tercihen, bu somut gösterimde, antijen, l5 amino asitten daha az, tercihen 7-14 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip bir veya daha fazla peptid, tercihen sentetik peptidler, tarafindan saglanir.

Baska bir yöne göre, mevcut beyan, hücre aracili yanit aktivitesinin ölçülmesine yönelik bir tahlilde ikinci yöne göre bilesimin, üçüncü yöne göre bir numune toplama kabinin ve/veya dördüncü yöne göre bir kitin kullanimi ile ilgilidir. Uygun ve tercih edilen kullanimlar ve uygulamalar ile ilgili ayrintilar yukarida tarif edilmistir ve yukaridaki beyana atifta bulunulmustur. Bir somut gösterime göre, tahlil, patojenik bir ajanin sebep oldugu bir enfeksiyon, bir otoimmün hastalik, bir kanser, inflamatuar bir durum, toksik bir ajana maruz kalma, terapötik bir ajana verilen yanit, bir immün yetmezlik ve bir immünosupresyondan olusan gruptan seçilen bir hastalik, veya durumun varliginin, yoklugunun, derecesinin veya evresinin izlenmesi veya belirlenmesine yöneliktir. Bir somut gösterime göre, tahlil, bir hastaligin, bir enfeksiyonun ve/veya tedaviye, özellikle immünoterapi veya immünosupresif ajanlarla yapilan bir tedaviye, verilen yanitin tespit› edilmesine 'veya izlenmesine yöneliktir. Bir somut gösterime göre, ikinci yöne göre bilesimin, üçüncü yöne göre bir numune toplama kabinin ve/veya dördüncü yöne göre bir kit, yukarida ve istemlerde ayrintili olarak tarif edilen birinci yöne göre olan yöntemde kullanilir.

Burada tarif edilen sayisal araliklar, araligi tanimlayan sayilari kapsar. Burada sunulan basliklar, bir` bütün olarak tarifnameye referansla mevcut beyanin çesitli yönlerinin veya somut gösterimlerinin sinirlamalari degildir. Bir somut gösterime göre, yöntemler durumunda belirli asamalari içerdigi seklinde veya örnegin bilesimler, çözeltiler ve/veya karisimlar durumunda belirli bilesenleri içerdigi seklinde tarif edilen konu, ilgili asamalari veya› bilesenleri içeren konuyu ifade eder. Burada tarif edilen tercih› edilen somut gösterimlerin seçilmesi ve birlestirilmesi tercih edilir ve tercih edilen somut gösterimlerin ilgili bir kombinasyonundan kaynaklanan spesifik konu ayni zamanda mevcut beyana da aittir.

Mevcut bulus simdi asagidaki sinirlayici olmayan örneklerle ayrintili sekilde açiklanacaktir. Hak iddiasinda bulunulan bulus ile ilgili olmayan örnekler yalnizca açiklama amaçlidir. ÖRNEKLER Örnek 1: Trehalozun Epstein-Barr virüs tahlili duyarliligina Epstein-Barr virüsünden olan model antijen EBNA-l'e verilen yanitlari ölçmek için QuantiFERON teknolojisini kullanan arastirmalar, inkübasyon karisimina indirgen olmayan sekerlerin ilave edilmesiyle indüklenen tahlil duyarliligindaki artislari degerlendirmek için gerçeklestirilmistir. Kisacasi, bir kan alma tüpüne, arti/eksi bir trehaloz çözeltisinin 3 konsantrasyonuna (0,5, 1,0 veya 2,0 mg/ml trehaloz) EBNA-l peptidleri ilave edilmistir. Anti-EBV hücresel immün yanitlari ölçen QuantiFERON tahlili, üreticinin talimatlarina uygun olarak gerçeklestirilmistir. IFN-gama yaniti, trehaloz konsantrasyonuna bagli olarak belirlenmis ve karsilastirilmistir. Artan trehaloz konsantrasyonu ile IFN-gama yanitinda. bir artis gözlenmistir. Bu test tahlilinde en iyi sonucu 2 mg/ml'lik bir trehaloz konsantrasyonu sunmustur. Bu çalismalar, trehaloz gibi bir indirgen olmayan sekerin, tam kan tahliline ilave edilmesinin, hücre aracili bir immün yanit tahlilinde IFN-gama yanitinda önemli bir artisa yol açtigini gösterir. Indirgen olmayan sekerin ilave edilmesiyle indüklenen Örnek 2: Önceki teknik tahlilinin depolama stabilitesi Bu örnekte, CMV'ye karsi hücre aracili bir immün yanit testi gerçeklestirilmis ve deney bilesenlerinin depolama stabilitesi analiz edilmistir. Antijen olarak, sitomegalovirüs ile iliskili antijenlerden, 8-12 amino asit uzunlugunda sentetik peptidler kullanilmistir. CMV ile iliskili sentetik peptidler, bir basit seker (glikoz) içeren çözelti içinde formüle edilmis ve bir kan alma tüpünün içine püskürtülmüs ve kurutulmustur. Bu nedenle, antijen ve basit seker, bir bilesimde bulunmustur. Kan alma tüpünde bulunan söz konusu bilesimin stabilite testi, tahlil aktivitesinin, oda sicakliginda depolanan zamanla birlikte azaldigini göstermistir. Ayrica, CMV cihazinin tahlil aktivitesi, antijen ve glikoz içeren püskürtülerek kurutulmus bilesimi içeren kan alma cihazi, 3 haftadan (21 gün) daha uzun bir süre boyunca 55°C'de depolandiginda yok olmustur. Bu nedenle, ilgili bilesimler ve buna bagli olarak, ilgili bilesimleri içeren toplama tüpleri, eksik depolama stabilitesi nedeniyle kullanima hazir kit bilesenleri olarak kullanilmak için uygun olmamistir. Glikozun bilesimden çikarilmasi, tahlil stabilitesini ve islevini geri getirmistir. Bu nedenle, basit sekeri antijen ile birlikte bir bilesime dahil etmek mümkün olmamistir. Bunun yerine, tahlil duyarliligini arttirmak için, inkübasyon bilesiminin hazirlanmasi esnasinda numuneye ayri olarak basit seker ilave edilmesi gerekmistir.

Bunun aksine, burada ele alindigi gibi antijen ve bir indirgen olmayan seker içeren bilesimler, uzun süreli depolama süreleri boyunca artan tahlil duyarliligini da koruyabilir.

Bu sonuçlar ayrica diger deneylerle de dogrulanmistir. Glikoz içeren veya glikoz içermeyen CMV tüpleri, üç hafta boyunca 4°C, 22°C, 37°C ve 55°C'de depolanmistir ve daha sonra 4 reaktif vericiden ve 1 reaktif olmayan vericiden alinan kan örnekleri ile test edilmistir. Tablo 1, reaktif vericiler ile elde edilen ortalama sonuçlari gösterir. Belirtilen sicakliklarda, glikoz içeren CMV tüpleri, 4°C ya da 22°C'de depolanan tüplerden daha az reaktiftir ve CMV tüplerini hazirlamak için kullanilan sivi formülasyona (referans standart) göre yanitlarda belirgin bir azalma gösterir. Aksine, glikoz içermeyen tüpler reaktiflikte bir kayip göstermemistir.

Tablo 1: Depolama esnasinda glikozun etkisi. Retansiyona olan kat farki gösterilmistir (ortalama IU/ml) 55°C 37°C 22°C 4°C tüpleri Glikoz içermeyen CMV tüpleri Örnek 3: Bir QFN-CMV tüpünde trehaloz ilavesinin IFN-gama yanitina etkisi QuantiFERON (QFN) CMV, Sitomegalovirüs'ten türetilen antijenlere karsi yöneltilmis bir T-hücre immün hafizasini izleyen CE tescilli bir tahlildir. QFN-CMV kan tüpleri, interferon gama (IFN-gama) üretmek için CD8+ T-hücrelerini spesifik olarak aktive etmek üzere tasarlanmis peptidleri içerir. Bu tüpler, herhangi bir seker molekülü ilave edilmeden, sadece peptid ve heparin Bu deney, indirgen olmayan seker, trehaloz, QFN-CMV tüplerine ilave edildiginde IFN-gama yaniti üzerindeki etkiyi arastirmayi amaçlamistir.

QFN-CMV kan alma tüplerine 0, l, 5 veya 10 mg/ml'lik trehaloz (su içinde) çözeltisi ilave edilmistir. Bilinen bir anti-CMV T- hücre yanitina sahip 17 saglikli vericiden alinan 1 ml kan, daha sonra dört tüpün her birine ilave edilmistir ve ek olarak bir Nil tüpü ve bir Mitojen tüpü kontrol olarak çalistirilmistir.

QFN tahlili daha sonra kullanma talimatina uygun olarak gerçeklestirilmistir. Tüm degerlerden Nil degeri çikartilmistir. olusturmak, yanit büyüklügünde vericiler-arasi varyasyonu kontrol etmek için ilgili QFN-CMV + O mg/ml trehaloza (islenmemis kontrol) karsi normalize edilmistir. Trehaloz tarafindan spesifik olmayan IFN-gama indüksiyonuna karsi kontrole tespit edilebilir bir anti-CMV immün yaniti olmayan saglikli veriçiler dahil edilmistir.

Trehalozun ilave edilmesi, IFN-gama'nin ortalama seviyesinde konsantrasyona bagli bir artisa neden olmustur (kat degisimi lFN-gama olarak eksprese edilene karsi eslenmis islenmemis kontrol). 5 ve 10 mg/ml trehaloz eklenmesiyle etkide önemli bir artis gözlenmistir; Dunn çoklu karsilastirma testi ile Friedman testi. Sonuçlar Sekil 1'de gösterilmistir. CMV-negatif kontrol vericilerinde IFN-gama'nin önceki seviyesinde önemli bir artis gözlenmemistir (veriler gösterilmemistir).

Bir QFN tahliline trehaloz ilave edilmesi, önceki IFN-gama seviyesini spesifik olarak arttirmaksizin kan alma tüpünde bulunan spesifik antijen(ler)e yanit olarak üretilen IFN-gama seviyesini önemli ölçüde artirir. Örnek 4: Bir QFN-TB tüpünde trehaloz ilavesinin IFN-gama yanitina etkisi QuantiFERON (QFN) tahlili gibi peptide özgü hücresel immüniteyi degerlendiren bir tahlile indirgen olmayan seker trehalozun ilave edilmesinin testin niceliksel sonucunu arttirdigina dair gözlemi dogrulamak için, QFN tüpleri bir indirgen olmayan seker ilavesi ile üretilmistir. QFN kan alma tüpleri, Mycobacterium tuberculosis (MTB) antijenleri ESAT-6 ve CFP-lO'dan herhangi bir seker ilavesi olmadan veya indirgen olmayan seker trehaloz ilavesi ile birlikte sentetik peptidler içerecek sekilde üretilmistir.

QuantiFERON Gold In Tube tahlili kullanilarak dogrulanmis 20 denekten alinan MTB enfeksiyonu kanitina sahip tam kan, mevcut QuantiFERON platform teknolojisi kullanilarak, bununla birlikte, yukarida tarif edilen bir indirgen olmayan seker (Trehaloz) ile ya da olmaksizin (sekersiz) üretilen modifiye QFN TB antijen tüpleri kullanilarak test edilmistir. Tahlil, mevcut bir tahlil olan QFT Gold kullanma talimatina uygun olarak gerçeklestirilmistir. Bu eslestirilmis klinik analizde, indirgeyici olmayan sekerin, trehalozun, TB antijen tüpüne dahil edilmesi, Sekil 2'de gösterildigi gibi tahlilin (P = 0,0005) niceliksel yanitini önemli ölçüde arttirmistir. Tüplerden elde edilen degerler (y-ekseni) Log dönüstürülmüs IFN-gama lU/ml degerleri olarak gösterilmistir (çikartilan nil tüpü degerler ile birlikte). Iki kohort arasindaki istatistiksel önemi göstermek için ikili tek kuyruklu t testi yapilmistir. Sonuçlar, trehaloz ilavesinin, TB enfeksiyonu olan kisilerde gösterildigi gibi, interferon gama yanitini arttirdigini açikça gösterir. Örnek 5: Farkli indirgen olmayan sekerlerin ilave edilmesi, nicel INF-gama yanitini artirir Gözlemlenen arttirma etkisi, ilave indirgen olmayan sekerler ile de gösterilmistir. Bu deneyde, QFN CMV antijen tüplerine ve karsilik gelen bir Nil tüpüne dört farkli indirgen olmayan seker ilave edilmistir. 2 mg/ml'lik nihai bir kan konsantrasyonuna ulasmak için, 5 vericiden alinan tam kana PBS içindeki karsilik gelen bir sakkaroz, trehaloz, mannitol ve rafinoz çözeltisi ilave edilmistir. Dolayisiyla, bir QFN tahlili, QFN CMV tüpleri kullanilarak bir indirgen olmayan sekerin (sakkaroz, trehaloz, mannitol veya rafinoz) ilave edilmesi ile birlikte ya da olmaksizin (N/S) 5 vericiden alinan kan üzerinde gerçeklestirilmistir. Tahlil, mevcut bir tahlil olan QFN kullanma talimatina uygun olarak gerçeklestirilmistir. Sonuçlar Sekil 3'te gösterilmistir. X ekseni (bkz. Sekil 3) test edilen durumlari gösterir. Önceki (ilgili sekerin ilave edilmesi ile birlikte/olmaksizin Nil tüplerinden elde edilen deger), karsilik gelen CMV tüpünden ve hesaplanan ilave olmayan tüp (y ekseni) üzerinden IFN-gama degerindeki (lU/ml) artis yüzdesinden çikartilmistir. Sonuçlar, niceliksel IFN-gama (lU/ml) degeri ile ölçülen sekilde CMV antijenlerine olan artan bir yanitin, indirgen olmayan dört sekerin tümü ile gözlendigini gösterir. Bu nedenle, test edilmis indirgen olmayan tüm sekerler, INF-gama yaniti üzerinde faydali bir etkiye sahip olmustur- Trehaloz ile en yüksek artis görülmüstür, bunu mannitol, sakkaroz ve rafinoz izlemistir.

Trehaloz konsantrasyonunun QFN-CMV yaniti üzerindeki etkisi (degerler CMV yanitina normalize edilmistir)

Claims (1)

1. ISTEMLER 1.Hücre aracili immün yanit aktivitesini ölçmeye yönelik bir yöntem olup, özelligi; söz konusu yöntemin asagidakileri içermesidir: (a) bir peptid antijen ile uyarimin ardindan immün efektör molekülleri üretebilen immün hücrelerini içeren bir numuneyi 5 ila 50 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip en az bir peptid antijen ile ve antijene yanit veren immün hücrelerin interferon-gama yanitini arttirabilen en az bir indirgen olmayan seker ile temas ettirerek bir inkübasyon bilesimi sunulmasi; ve (b) en az bir immün efektör molekülünün varliginin veya seviyesinin tespit edilmesinin, interferon-gama'nin (INF- gama) varliginin veya seviyesinin tespit edilmesini de içerdigi en az bir immün efektör molekülünün varliginin veya seviyesinin tespit edilmesi. 2.Istem l'e göre yöntem olup, özelligi; indirgen olmayan sekerin, tercihen trehaloz ve sakkarozdan seçilen bir indirgen olmayan disakkarit olmasidir. 3.Isteni 1 veya Z'ye göre yöntem› olup, özelligi; inkübasyon bilesimindeki indirgen olmayan seker konsantrasyonunun en az 1,5 mg/ml, tercihen en az 2 mg/ml olmasidir. 4.Istemler 1 ila 3'ten birine veya daha fazlasina göre yöntem olup, özelligi; (a) asamasinda, numunenin, antijen ve indirgen olmayan seker içeren bir bilesim ile temas ettirilmesi ve tercihen, söz konusu bilesimin bir numune toplama kabinda bulunmasidir. 5.Istem 4'e göre yöntem olup, özelligi; bilesimin ek olarak bir antikoagülan, tercihen heparin içermesi ve numunenin bir tam kan örnegi olmasidir. 6.Istemler 1 ila 5'ten herhangi birine göre yöntem olup, özelligi; numunenin asagidaki karakteristiklerden birine veya daha fazlasina sahip olmasidir: i) numune bir insan denekten alinmistir; ii) numune, immünsüprese veya immün yetmezligi olan bir insan denekten alinmistir; iii) numune, NK hücreleri, T-hücreler, B-hücreler, dendritik hücreler, makrofajlar ve monositlerden olusan gruptan seçilen immün hücreleri içerir; ve/Veya iv) numune tam kandir. 7.Istemler 1 ila 6'dan herhangi birine göre yöntem olup, özelligi; antijenin asagidaki karakteristiklerden birine veya daha fazlasina sahip olmasidir: i) bir veya daha fazla peptid antijen olarak kullanilir, burada bir veya daha fazla peptid '7 ila 50 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahiptir; ii) antijen, bir veya daha fazla sentetik peptid tarafindan saglanir; iii) antijen, bir birinci setin 7 ila 14 amino asit kalintisi uzunlugundaki en az bir peptid içerdigi ve bir ikinci setin 15 veya daha fazla amino asit kalintisi uzunlugundaki en az bir peptid içerdigi bir protein antijeninin tamamini veya bir kismini kapsayan en az iki peptid seti tarafindan saglanir; iv) antijen, bir CD8+ sitotoksik T-hücresi tarafindan taninan bir veya daha fazla peptid tarafindan saglanir; v) antijen, bir CD8+ sitotoksik T-hücresi tarafindan taninan bir veya daha fazla peptid tarafindan saglanir ve burada bir veya daha fazla peptid 15 amino asitten daha az, tercihen 7-14 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahiptir. 8.Istemler 1 ila 7'den birine veya daha fazlasina göre yöntem olup, özelligi; (a) asamasinda iki veya daha fazla farkli antijenin kullanilmasi ve/Veya (b) asamasinda iki veya daha fazla farkli efektör molekülün tespit edilmesidir. 9.Istemler 1 ila 8'den birine veya daha fazlasina göre yöntem olup, özelligi; antijenin hastaliga özgü bir antijen, özellikle de patojene özgü bir antijen olmasidir. 10. Istemler 1 ila 9'dan birine veya daha fazlasina göre yöntem olup, özelligi; antijenin asagidaki karakteristiklerden birine veya daha fazlasina sahip olmasidir: i) antijen, bunlar için hücre aracili immün yanitin test edilecegi hastalik veya durum ile iliskilidir veya bunlarin temsilcisidir; ii) antijen, bir hastalik durumu ile iliskili bir patojenden türetilebilir ve bu nedenle patojenden türetilen bir antijen ile çapraz reaktiftir veya bir kanser ile iliskili olan tümör-iliskili bir antijendir; iii) antijen patojene özgü bir antijendir ve burada patojen bir bakteri, bir virüs, bir parazit, maya veya bir mantardir; iv) antijen patojene özgü bir antijendir, baska bir ifadeyle bakteriye özgü bir antijendir ve burada bakteri, Gram pozitif ve Gram negatif mikroorganizmalardan, özellikle Mycobacterium tuberculosis gibi Mycobacterium türleri, Staphylococcus türleri, Streptococcus türleri, Escherichia coli, Salmonella türleri, Clostridium türleri, Shigella türleri, Proteus türleri, Bacillus türleri, Hemophilus türleri ve Borrelia türlerinden seçilebilir; v) antijen, patojene Özgü bir antijendir, baska bir ifadeyle Virüse özgü bir antijendir ve burada Virüs, Hepatit B Virüsü ve Hepatit C Virüsü gibi Hepatit Virüsü, Herpes virüsü, CMV virüsü ve Insan immün yetmezlik virüsünden (HIV) seçilir; ve/veya vi) antijen, bir virüstendir veya Virüse özgüdür, tercihen sitomegalovirüs (CMV) Virüsündendir veya buna özgüdür ve antijen 7 ila 14 amino asit kalintisi, 7 ila 13 amino asit kalintisi veya 8 ila 12 amino asit kalintisi uzunluguna sahip ol an bir veya daha fazla peptid tarafindan saglanir. Istemler' 1 ila 10'dan herhangi birine göre yönteHL olup, özelligi; patojenik bir ajanin sebep oldugu bir enfeksiyon, bir otoimmün hastalik, bir kanser, inflamatuar bir durum, toksik bir ajana maruz kalma, terapötik bir ajana verilen yanit, bir immün yetmezlik ve bir immünosupresyondan olusan gruptan seçilen bir hastalik veya durumun varliginin, yoklugunun, derecesinin veya evresinin izlenmesi veya belirlenmesine yönelik olmasidir. Istemler 1 ila ll'den herhangi birine göre yöntem olup, özelligi; asagidakileri içermesidir: (a) bir insan denekten alinan bir tam kan örnegini 5 ila 50 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip en az bir peptid antijen ve en az bir indirgen olmayan disakkarit, tercihen trehaloz veya sakkaroz, içeren bir bilesim ile temas ettirerek bir inkübasyon bilesimi sunulmasi ve inkübasyon bilesiminin en az 2 saat boyunca inkübe edilmesi; (b) antijen ile uyarma nedeniyle salinan IFN-gama varliginin veya seviyesinin ölçülmesi; burada tespit edilen aracili immün yanit verebilirlik seviyesinin göstergesidir. Istemler 1 ila 12'den birine veya daha fazlasina göre yöntem olup, özelligi; indirgen olmayan sekerin trehaloz, mannitol, sakkaroz ve rafinozdan seçilmesi ve tercihen, indirgen olmayan sekerin trehaloz olmasidir. Bir numunede hücre aracili bir immün yaniti indüklemeye yönelik bir bilesim olup, özelligi; asagidakileri içermesidir: a) antijenin hastaliga özgü bir antijen oldugu 5 ila 50 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip en az bir peptid antijen; b) antijene yanit veren immün hücrelerinin interferon- gama yanitini arttirabilen en az bir indirgen olmayan seker; c) antikoagülanin heparin oldugu en az bir antikoagülan. Istem› 14'e göre bilesim olup, Özelligi; asagidaki karakteristiklerden birine veya daha fazlasina sahip olmasidir: i) indirgen olmayan seker, tercihen trehaloz ve sakkarozdan seçilen bir indirgen olmayan disakkarittir; ii) indirgen olmayan seker, trehaloz, mannitol, sakkaroz ve rafinozdan seçilir; iii)indirgen olmayan seker trehalozdur; iv) antijen, Istem 7 ila lO'dan birinde veya daha fazlasinda tanimlanan sekilde bir veya daha fazla karakteristige sahiptir; v) antijen, 15 amino asitten daha az, tercihen 7-14 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip bir veya daha fazla peptid, tercihen sentetik peptidler, tarafindan saglanir; ve/Veya vi) bilesim, püskürtülerek kurutulmus bir bilesimdir. Bir numune toplama kabi olup, özelligi; Istem 14 veya 15'e göre olan bilesimi içermesidir. 17. Bir denekte hücre aracili immün yanit aktivitesini ölçmeye yönelik bir kit olup, özelligi; 5 ila 50 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip en az bir peptid antijen, antijene yanit veren immün hücrelerinin interferon-gama yanitini arttirabilen en az bir indirgen olmayan seker, heparin, en az bir numune toplama kabi ve interferon-gama için en az bir 18. Istem l7'ye göre kit olup, özelligi; numune toplama kabinin, Istem l6'ya göre olan numune toplama kabinin karakteristiklerine sahip olmasidir. 19. 5 ila 50 amino asit, tercihen 7 ila 50 amino asit arasindan seçilen bir uzunluga sahip bir peptid antijene olan hücre aracili yanit aktivitesinin ölçülmesine yönelik immünolojik bir` tahlilde bir indirgen olmayan sekerin kullanimi olup, özelligi; numunenin antijen ile inkübasyonu esnasinda indirgen olmayan sekerin ilave edilmesinin, söz konusu tahlilde test edilen antijene yanit veren immün hücrelerden interferon-gama salinimini arttirmasi ve tercihen, indirgen olmayan seker asagidaki karakteristiklerden birine veya daha fazlasina sahip olmasidir: i) indirgen olmayan seker bir disakkarittir; ii) indirgen olmayan seker, trehaloz ve sakkarozdan seçilir; iii)indirgen olmayan seker, trehaloz, mannitol, sakkaroz ve rafinozdan seçilir; iv) indirgen olmayan seker trehalozdur; v) indirgen olmayan seker, test edilecek numuneyi ve antijeni içeren inkübasyon bilesiminde en az 1 mg/ml, tercihen 2 mg/ml'lik bir konsantrasyonda kullanilir; vi) indirgen olmayan seker, ek olarak test edilecek antijeni ve istege bagli olarak bir antikoagülan içeren bir bilesim halinde sunulur.