TR201510165A2 - Meme kanseri̇ erken teşhi̇s yöntemi̇ ve ki̇ti̇ - Google Patents

Abstract

Buluş, meme kanserinin erken teşhisi ve tahmini için in vitro bir yöntem olup, özelliği,kanda veya meme tümör dokusunda miRNA'nın(mikro RNA), uçuş zamanlı kuadrupol kütle spektrometresi (qTOF-MS) ile tespit ve analiz edilmesini içermesidir.

Description

TARIFNAME MEME KANSERI ERKEN TESHIS Y'ONTEMI VE KITI TEKNIK ALAN Bulus, meme kanserinin teshisi için gerçeklestirilen in vitro bir yöntem ile ilgilidir. Mevcut bulus, özellikle miRNAilarin (mikro RNA) kanda veya meme dokusu içindeki tümör dokuda tespiti ilememe kanserininerken teshis ve tahmin edilmesini içeren bir yöntem ve kit ile ilgilidir.

Kanser oldukça degisken, heterozigot genetik ve epigenetik degisikliklerle olusan bir hastaliktir. Kanserin baslamasi ve gelismesi çesitli mutasyonlar, kromozomlarda olusan bozukluklar ve artan gen ekspresyonlari ile karakterize edilmektedir. Kanserli genomlarda artan transkript seviyesi, onkogenlerin çogalmasiyla beraber artan gen kopya sayisi ve tümör baskilayici genlerin inaktivasyonu ile iliskilendirilmektedir.

Meme kanserleri, kisilerin farkli moleküler özellikleri nedeniyle tedaviye yanitlari da degisken alt gruplardan olusmaktadir. Bu nedenle, “kisisel tedavi, arastirmalarina en sik konu olan kanser türlerindendir. Meme kanseri tüm insanlarda akcigerden sonra ikinci, kadinlarda ise ilk sirada görülmektedir. Invaziv ve non invaziv olmak üzere histolojik olarak iki türü vardir. Non invaziv olanlar in situ duktal karsinom ve in situ lobuler karsinom, invaziv olanlar invaziv duktal karsinom ve invaziv lobuler karsinom, tubular karsinom, invaziv kribriform karsinom, med'uller karsinom, müsinöz karsinom, nöroendokrin karsinom, invaziv papiller karsinom, invaziv mikropapiller karsinom, apokrin karsinom, metaplastik karsinom, lipid-rich karsinom, sekretuar (juvenil) karsinom, onkositik karsinom, adenoid kistik karsinom olarak siniflandirilmaktadir.

Dünya Saglik Örgütü (2008) ve TC Saglik Bakanligi (2009) verilerine göre Türkiye'de her 4 kadin kanserinden biri olan meme kanseri insidansi yüzbinde yaklasik 41 olarak belirtilmektedir. Teshis için ise çesitli yöntemler kullanilmakta olup bu yöntemler çesitli dezavantajlara sahiptir. Kirk yasi askin kadinlarda yillik mamografi taramalari mortaliteyi %30-40 düzeyinde azaltirken, 35 yasin altindaki kadinlarda genellikle kisinin elle muayenesi sonrasindaki hekim degerlendirilmesi ile sinirlidir. Bu nedenle genç hastalarda kanserin erken teshisi siklikla gecikmektedir.

Onerilen yillik 40 yas üstü mamogrofi takibinin ise kümülatif radyasyon etkisi olabilecegi son yillarda tartisilmaya baslanmistir. Meme kanseri klinik, morfolojik ve moleküler açidan farkli gruplara ayrilan multifaktöriyel bir hastaliktir. Tespitinin ardindan prognozun öngörülebilmesi için dünyada siklikla kullanilan MammaPrint, Oncotype DX ve Mammostrat gibi testler ekonomik olmamakla beraber, tedavinin belirlenmesinde yaygin kullanilmasi için daha ileri arastirma gerektigi de bildirilmektedir. En önemli nokta ise bu platformlarin biyopsi materyaline bagimli olmasi, yani sadece ameliyat sonrasi gerçeklestirilebilmesidir. Genellikle tümörü alinmis hastalarin nüks ihtimalinin puanlanmasi ve tedavi sürecinin yönlendirilmesinde kullanilmaktadir. Türkiye'de ise yaygin olarak gerçeklestirilen BRCA1/2 ve TP53 mutasyon analizleri, tani veya tedaviye katki saglamayan, sadece ailesel meme kanserlerinin risk analizleridir. Klinik parametreleri destekleyen rutin östrojen(ER), progesteron(PR) reseptörleri ve HER2 biyobelirteçlerinin tedavi ve prognozda kullanimi ise yetersiz kalmaktadir. Ornegin, yalnizca HER2 pozitif hastalarda kullanilan hedefe yönelik Trastuzumab tedavisi, bu hastalarin yalnizca Kisaca hastaligin tespitinde süphe duyulmayacak seviyede ayirt edicilige ve önceden tahmin etmeyi saglayacak bir teshis metoduna ihtiyaç duyulmaktadir.

Bahsedilen çalismalar klinik anlamda riskler ve güvenirlik sikintisi içermektedir. Çesitli hücre kültürü ve erken evre meme kanseri hasta dokulari üzerinde yapilan çalismalarda, bazi hücre içi sinyal iletimi ile iliskili protein ve miRNA'Iarin ekspresyon farkliliginin kanserin moleküler gruplandirmasinda biyobelirteç olabilecegi belirtilmistir. Son yillarda, kanser olgularinin önceden tespitinde biyobelirteç olarak tek-gen risk analizleri yerine mamografi taramasinda ek olarak protein ve miRNA tabanli belirteçler de önerilmektedir. MiRNAilar (mikroRNA), 18-22 nükleotit uzunlugunda, tek zincirli ve kodlanmayan küçük oligonükleotitlerdir.

Etkilerini, hedefledikleri mRNA'Iarin yikimi veya inhibisyonuna neden olarak birçok genin ekspresyonunda degisimlere neden olarak göstermektedirler. Ilgilendigimiz bu küçük düzenleyici moleküllerin tümör kaynakli oldugu da biyopsi öncesi ve sonrasinda gerçeklestirilen çalismalarca kanitlanmistir. miRNA ekspresyon düzeylerindeki degisimlerinin tespiti günümüzde, mikroarray yani hibridizasyon teknigi ile veya Real Time PCR yani relatif olarak belirlenebilmektedir. Ornegin mikroarray teknignde ekspresyon gözlenmedigi takdirde akla gelen hibridizasyonun gerçeklesmemis olabilecegidir. Bu nedenle sonuçlarin ikinci bir yöntem ile onaylanmasi gerekmektedir. Bu asamada rastgele seçilen birkaç örnek Real Time PCR yöntemi ile incelenerek sonuç mikroarray bulgulari ile karsilastirilmaktadir.

Kanser çesitli kilit moleküler yolaklardaki mutasyonlarin birikimi ile ortaya çikmaktadir. Mutasyonlarin hangi yolak iliskili gerçeklestigi, yolak üzerinde hangi noktada sorun yasandigi veya kontrol mekanizmalarindaki olasi degisikliklerden kaynakli olusan bir çok farkli ihtimal, ayni kanser tipine sahip bireyler arasinda dahi miRNA ekspresyonu paternlerinde bazi farkliliklarin görülmesine neden olmaktadir.

Bahsedilen dezavantajlar nedeniyle, meme kanserinin teshisi ile ilgili teknik alanda, güvenirlik, süre, hasta uyumu ve maliyet avantajlarini içeren bir yenilik gerekmektedir.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus, yukarida bahsedilen tüm sorunlari ortadan kaldiran ve ilgili teknik alana ilave avantajlar getiren, in vitro olarak meme kanserinin erken teshisi ve tahminini saglayan yeni bir yönteme ve kite iliskindir. miRNA'Iar tümör tarafindan salinabilmekte veya tümör nekrozu sonucu dolasima dahil olabilmektedir. Küçük yapilari ve belli protein ve lipoproteinlere bagli tasinimi dolayisi ile RNAaz aktivitesinden kaçarak dolasimda bozulmadan bulunabilmektedir. Ayrica isi ve pH degisimi gibi zorlayici kosullara ragmen bütünlüklerini korumalari rutin çalismalar için ne kadar elverisli olduklarini da göstermektedir. Gilad ve arkadaslari tarafindan miRNA'Iarin, düzenleyici ve kansere özgü aktiviteleri nedeniyle serumda ve diger vücut sivilarinda dolasan nükleik asitler (CNA) olan miRNA'Iarin seviyelerinin klinikte biyobelirteç olarak kullanilabilecegi ileri sürülmüstür. Çesitli kanser tiplerinin yani sira diyabet hastalarinda da kanda çesitli miRNA9Iar tespit edilmesi genis spektrumda etkinliklerini ortaya koymaktadir.

Teknigin bilinen durumundan yola çikilarak bulusun ana amaci; 'Özellikle kanda veyameme tümbrdokusunda, meme kanserinin erken teshisi ve tahmini için,uçus zamanli kuadrupol kütle spektrometresi (qTOF-MS) iIemiRNA'nin tespit edilmesidir.

Bulusun bir diger amaci; kanda veyameme tümör dokusunda, miRNA tespit edilmesiyle, süre, hasta uyumu ve maliyet avantajlarina sahip olan,meme kanserininerken teshisi ve tahmini için yeni bir yöntem gelistirilmesidir.

Bulusun bir diger amaci; kanda veyamemetümör dokusunda, miRNA'nin(mikro RNA), uçus zamanli kuadrupol kütle spektrometresi (qTOF-MS) ile miRNA tespit ve analizi vasitasiyla, süre, hasta uyumu ve maliyet avantajlarina sahip, meme kanserinin erken teshisi ve tahmini için yeni bir yöntem gelistirilmesidir.

Bulusun bir diger amaci ise, meme kanserinin erken teshisi ve tahmini için, kanda veya meme tümör dokusunda, uçus zamanli kuadrupol kütle spektrometresi (qTOF- MS) iIemiRNA tespiti ve analizini olanakli kilan ve bireysel tani sonrasi takibe uygun bir kit gelistirilmesidir.

Bahsedilen amaçlara ulasmak üzere, meme kanserinin erken teshisi ve tahmini için in vitro bir yöntem gerçeklestirilmistir.

Yukarida bahsedilen ve asagidaki detayli anlatimdan ortaya çikabilecek tüm amaçlari gerçeklestirmek üzere, mevcut yöntem, kanda veya memetüm'ordokusunda miRNA'nin(mikro RNA), uçus zamanli kuadrupol kütle spektrometresi (qTOF-MS) ile tespit ve analiz edilmesiniiçermektedir.

Bulusun tercih edilen bir diger uygulamasi, tespiti ve miktari için analiz edilen söz konusu miRNa paternleri bilinen miRNA*Iardan, en az birini veya kombinasyonlarini içermektedir.

Bulusun tercih edilen bir uygulamasi, tespiti ve miktari için analiz edilen söz konusu miRNA paternleri, bilinen miRNAilardanseçilen en az birinin veya kombinasyonlarinin ifadelenme düzeyindeki azalmanin tespit edilmesini ve miktarinin analizini içermektedir.

Bulusun tercih edilen bir diger uygulamasi da, tespiti ve miktari için analiz edilen söz konusu miRNA paternleri, bilinen miRNAilardanseçilen en az birinin veya kombinasyonlarinin ifadelenme düzeyindeki artisin tespit edilmesini ve miktarinin analizini içermektedir.

Bulusun tercih edilen bir diger uygulamasinda, söz konusu meme kanseri, in situ duktalkarsinom ve in situ Iobuler karsinom, invaziv duktal karsinom ve invaziv Iobuler karsinom, tubular karsinom, invaziv kribriform karsinom, medüller karsinom, müsin'oz karsinom, nöroendokrin karsinom, invazivpapiller karsinom, invazivmikropapiller karsinom, apokrin karsinom, metaplastik karsinom, lipid-rich karsinom, sekretuar (juvenil) karsinom, onkositik karsinom, adenoid kistik karsinomdan seçilen en az biridir.

Bulusun tercih edilen bir diger uygulamasi, a) en az bir bireyden izole edilmis kan veya meme tümör doku numunesi b) bu numune içinde miRNA ifade düzeyini tespit etme, 0) bu düzeyin istatistiksel anlamda yorumlanmasi basamaklarindan olusmaktadir.

Bulusun tercih edilen bir diger uygulamasi, a) en az bir bireyden izole edilmis kan veya meme tümör doku numunesi b) bu numune içinde bilinen miRNAilardan seçilen en az birinin ifadelenme düzeyindeki artisin tespit edilmesi ve miktarinin analizi ile o) bu düzeyin istatistiksel anlamda yorumlanmasi basamaklarindan olusmaktadir.

Bulusun tercih edilen bir diger uygulamasi, a) en az bir bireyden izole edilmis kan veya meme tumor doku numunesi b) bu numune içinde bilinen miRNA'lardan seçilen en az birinin ifadelenme düzeyindeki azalisin tespit edilmesi ve miktarinin analizi ile 0) bu düzeyin istatistiksel anlamda yorumlanmasi basamaklarindan olusmaktadir.

Bulusun tercih edilen bir diger uygulamasi, miRNA tespitinin ve/veya analizinin yapilmasini saglamak üzere, meme kanserinin erken teshisi ve tahmininde bireysel olarak kullanilan bir kiti içermektedir.

Bulusun tercih edilen bir diger uygulamasi, miRNA tespitinin ve/veya analizinin yapilmasini saglamak üzere, uçus zamanli kuadrupol kütle spektrometresi (qTOF- MS) ile meme kanserinin erken teshisi ve tahmininde bireysel olarak kullanilan bir kiti içermektedir.

Söz konusu kit bilinen miRNA=Iardan seçilen en az birinin ifadelenme düzeyindeki azalisin tespitinin ve analizinin yapilmasini saglamaktadir.

Söz konusu kit bilinen miRNA*Iardan seçilen en az birinin ifadelenme düzeyindeki artisin tespitinin ve analizinin yapilmasini saglamaktadir.

BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Bu detayli açiklamada, bulus konusu teshis yöntemi, sadece konunun daha iyi anlasilmasina yönelik örnek olarak, hiçbir sinirlayici etki olusturmayacak sekilde açiklanmaktadir.

Söz konusu teshis yönteminde, in vitro olarak meme kanserinin erken teshisi ve tahminini gelistirilen qTOF yöntemi ile saglanmaktadir.

Bulus kapsaminda, çalismalarimizda tespit ettigimiz ve literatür arastirilarak seçtigimiz miRNA'Iar meme kanseri alt türlerine özgün parmak izleri olarak belirlenerek analiz algoritmasini olusturulmaktadir. Mikroarray ve qTOF-MS ile es zamanli çalisilan numunelerle, günümüzün en hassas yöntemlerinden biri olan qTOF-MS ile yeni yöntem gelistirilmis ve standardize edilerek miRNA kiti olusturulmustur. Bu kitler kullanilarak sadece kan analizi ile kanserin; erken ve geç evre veya metastaz yapmis tümörler hatta çok küçük boyutlardaki tümörlerin önceden tespiti hedeflenmektedir. Meme kanseri alt türlerine özgün parmak izi olusturularak hastanin kan veya tümör örneginden kanser tipinin tanisi konulmakta ve prognozu belirlenmektedir. Ayni zamanda meme tümör kitle çapinin periferik miRNA”Iarin miktarlari üzerinde etkisi karsilastirilarak aradaki baglanti arastirilmistir. miRNA tabanli tasarladigimiz kit qTOF-Msie uyumlu benzeri olmayan ve sadece kan örneklerinden meme kanseri tarama, tani ve takibi için kullanilabilmektedir.

Bilinen tüm miRNA lar kari, serum ve hücre kültürü materyallerinde taranarak bir algoritma olusturulmustur. Mikroarray çalismasinin validasyonu, Real-Time PCR teknigi ile rastgele seçilen 10 miRNA ekspresyonunun mikroarray sonucu ile karsilastirilmasi yapilmistir.

Numune standardizasyonu ve hücre soylari ile yapilan array çalismalarindan toplanan meme kanseri alt tipine özgü izler, metot validasyonlari, ölçüm belirsizligi hesaplamalari da yapilarak belirlenmis ve rutin ölçümlerde kullanilmak üzere kit gelistirilmistir.

Rutin meme kanseri kontrolleri 35 yas altinda genellikle elle muayene ile sinirli oldugundan kanserin erken teshisi genç hastalarda siklikla gecikmektedir. Onerilen yillik 40 yas üstü mamogrofi takibinin ise kümülatif radyasyon etkisi olabilecegi son yillarda tartisilmaya baslanmistir. Mevcut bulus sayesinde olusturulan kit çogunlukla elle takip edilen 15-40 yas araligindaki milyonlarca genç kadinin ve rutin radyolojik takip önerilen 40 yas üzeri kadinin yillik takibine yönelik kullanilabilecektir. Bu kit, kan ve/veya doku Örnegi alinarak, yan etkisi olmadan, DNA tabanli risk belirleyen kitlerden çok farkli olarak kanserin taranmasi, tanisi ve takibine ybneliktir. Benzeri olmayan bir çalisma dizayni ile meme kanseri hastalarinin miRNA parmak izleri elde edilerek hizli ve ucuz sonuç elde edilen qTOF-MS tabanli bir kit olusturulmustur.

Mevcut yöntemlere olan en 'öne çikan üstünlügü kütlesel 'ölçüm teknigi ile gerçek ölçümün yapilabilmesidir. Bu kitin amaci, kanserin erken yasta tanisinin yani sira erken evrede ve mamografi görüntülenmesinde zorluk olan kitlelerin tanisini yapilmasinin saglanmasi ve hatta tedavinin planlanmasini saglayabilecek bir kit gelistirilmesidir. Ayrica, kemoterapi ilaçlarina direnç gösteren vakalar için de algoritmalar üretilebilmektedir. Ornek olarak taranan miRNA'Iardan bazilari sunlardir; çesitli kombinasyonlarda farkli türde meme kanserlerinde ve hatta farkli kisilerde artmis/azalmis olarak görülebilmektedir.

Sonuç itibari ile sasirtici bir biçimde, in vitro ortamda, meme kanserli hastalarda, kanserin tespit/tahmin etmeyi ve erken teshisini gerçeklestirmeyi saglayan yeni bir yöntem gelistirilmistir. Bilinler arasindan seçilen miRNAlarin en az birinin ifadelenme düzeyindeki artisin/azalisin önemli bir marker olarak, meme kanserli hastalarda, kanserinin erken tespit/tahmin etmesini saglamak üzere degerlendirilmistir.

Bulusa göre bilinen miRNA'lar arasindan seçilen miRNA'Iarin ifadelenme düzeyinde azalisin veya ifade düzeyindeki artisin her biri veya kombinasyonlari meme kanserinin tekrar etme tahmininde bir ön gösterge olabilecektir.

Yukarda bahsedilen bulus konusu yöntemdeki teknikler, ölçümler, araçlar ile yöntem basamaklarindan en az biri veya hepsinin kullanildigi ve bunlardan baz alinarak miRNA tespitinin ve/veya degisim düzey analizinin yapilmasini saglayan, prostat kanserinin erken teshisinde bireysel olarak kullanilan bir kit söz konusudur.

Claims (10)

1. ISTEMLER .
2. Bulusi meme kanserinin erken teshisi ve tahmini için in vitro bir yöntem olup, özelligi, kanda veya meme tumor dokusunda miRNA'nin (mikro RNA). uçus zamanli kuadrupol kütle spektrometresi (qTOF-MS) ile tespit ve analiz edilmesini içermesidir. .
3. Istem 1`e uygun bir yöntem ile ilgili olup, özelligi, tespiti ve miktari için analiz edilen söz konusu miRNA'nin ifadelenme düzeyindeki artisin tespit edilmesini ve miktarinin analizini içermektedir. istem 1 ve 2`ye uygun bir yöntem ile ilgili olup. özelligi, tespiti ve miktari için analiz edilen söz konusu miRNA'nin ifadelenme düzeyindeki azalmanin tespit edilmesini ve miktarinin analizini içermektedir. .
4. Önceki istemlerden herhangi birine uygun bir yöntem ile ilgili olup, söz konusu meme kanseri, in situ duktal karsinom ve in situ Iobuler karsinom, invaziv duktal karsinom ve invaziv Iobuler karsinom` tubular karsinom, invaziv kribriform karsinom, medüller karsinom, müsinöz karsinom, nöro endokrin karsinom, invaziv papiller karsinom, invaziv mikropapiller karsinom, apokrin karsinom, metaplastik karsinom, lipid-rich karsinom, sekretuar (iuvenil) karsinom, onkositik karsinom, adenoid kistik karsinomdan seçilen en az biridir. .
5. Önceki istemlerden herhangi birine uygun bir yöntem ile ilgili olup, özelligi, a) en az bir bireyden izole edilmis kan veya meme tumor doku numunesi b) bu numune içinde miRNA ifade düzeyini tespit etme, o) bu düzeyin istatistiksel anlamda yorumlanmasi basamaklarindan olusmasidir. .
6. Önceki istemlerden herhangi birine uygun bir yöntem ile ilgili olup, özelligi, a) en az bir bireyden izole edilmis kan veya meme tümör doku numunesi b) bu numune içinde bilinen miRNAilardan seçilen en az birinin ifadelenme düzeyindeki artisin tespit edilmesi ve miktarinin analizi ile o) bu düzeyin istatistiksel anlamda yorumlanmasi basamaklarindan olusmasidir. .
7. Önceki istemlerden herhangi birine uygun bir yöntem ile ilgili olup, özelligi, a) en az bir bireyden izole edilmis kan veya meme tumor doku numunesi b) bu numune içinde bilinen miRNA'lardan seçilen en az birinin ifadelenme düzeyindeki azalisin tespit edilmesi ve miktarinin analizi ile o) bu düzeyin istatistiksel anlamda yorumlanmasi basamaklarindan olusmasidir. .
8. Önceki istemlerden herhangi birine uygun olarak meme kanserinin erken teshisi ve tahmini için bir kit ile ilgili olup, özelligi, miRNA tespitinin ve degisim düzeyinin analiz edilmesini saglamak üzere, uçus zamanli kuadrupol kütle spektrometresi (qTOF-MS) içermektedir. .
9. Önceki istemlerden herhangi birine uygun olarak meme kanserinin erken teshisi ve tahmini için bir kit ile ilgili olup, özelligi, miRNA ifadelenme düzeyindeki artisin tespit ve analiz edilmesini saglamak üzere uçus zamanli kuadrupol kütle spektrometresi (qTOF-MS) içermektedir.
10. 10.Önceki istemlerden herhangi birine uygun olarak meme kanserinin erken teshisi ve tahmini için bir kit ile ilgili olup, özelligi, miRNA ifadelenme düzeyindeki azalisin tespit ve analiz edilmesini saglamak üzere uçus zamanli kuadrupol kütle spektrometresi (qTOF-MS) içermektedir.