Claims (8)
------25/12/2562------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 2 หน้าข้อถือสิทธิ 1. กรรมวิธีการสกัดสารกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุที่มีสารโรโดไมรโทนเป็นสารหลัก ประกอบด้วยขั้นตอนดังนี้ ก. คัดเลือกส่วนใบของกระทุ จากนั้นล้างทำความสะอาดแล้วนำมาทำให้แห้ง อบที่อุณหภูมิ 60-75 องศาเซลเซียส จากนั้นนำใบกระทุแห้งไปบดละเอียด ในขั้นตอนนี้ได้ใบกระทุแห้งบดละเอียด ข. นำใบกระทุแห้งบดละเอียดที่ได้จากขั้นตอน ก มาแช่ในตัวทำละลายที่อุณหภูมิ 25-28 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3-15 วัน จากนั้นกรองและแยกเอากากออก แล้วนำสารละลายที่ได้มาระเหยตัวทำละลาย ออก ที่อุณหภูมิ 40-45 องศาเซลเซียส ในขั้นตอนนี้จะได้สารสกัดหยาบจากใบกระทุ ค. บรรจุซิลิกาเจล (silica gel) ขนาดหยาบ ลงในคอลัมน์ โดยคอลัมน์ที่มีเส้นผ่าศูนย์กลาง 8 ซม. บรรจุ ซิลิกาเจลให้ได้ความสูง 32 เซนติเมตร ใช้เฮกเซน (C6H14) ทำให้ซิลิกาเจลเปียก ในขั้นตอนนี้จะได้ซิลิ กาเจลคอลัมน์ ง. นำสารสกัดหยาบจากใบกระทุที่ได้จากขั้นตอน ข มาละลายด้วยตัวทำละลาย จากนั้นใส่ซิลิกาเจล ชนิดหยาบลงในสารละลายสกัดหยาบ คนจนสารละลายสกัดหยาบแห้งเป็นผงร่วน จากนั้นค่อย ๆ ถ่าย ลงไปในคอลัมน์อย่างช้า ๆ เพื่อให้ผิวหน้าของซิลิกาเจลเรียบอยู่เสมอ จากนั้นใช้ตัวทำละลายผสม เฮกเซน-เอทิลอะซิเตต เป็นตัวชะสารสกัดกึ่งบริสุทธิ์ออกจากคอลัมน์ ตามลำดับ ในขั้นตอนนี้จะได้สาร สกัดกึ่งบริสุทธิ์ที่มีสารโรโดไมรโทน จ. สารสกัดกึ่งบริสุทธิ์ที่มีสารโรโดไมรโทน ที่ได้จากขั้นตอน ง. มาทำการแยกต่อด้วยวิธีคอลัมน์โคร มาโทกราฟีใช้ตัวทำละลายผสมเฮกเซน-เอทิลอะซิเตต จากนั้นนำไประเหยด้วยเครื่องกลั่นระเหยสาร แบบหมุน (Rotary Evaporator) จะได้สารสกัดย่อยโรโดไมรโทนลักษณะเป็นผงละเอียด สีเขียวเข้ม ออกดำ ฉ. นำสารสกัดย่อยโรโดไมรโทนที่ได้จากขั้นตอน จ. มาทำการแยกต่อด้วยวิธีคอลัมน์โครมาโทกราฟีใช้ตัว ทำละลายผสมเฮกเซนและไดคลอโรมีเทนและเมนทานอล จากนั้นนำไประเหยด้วยเครื่องกลั่นระเหย สารแบบหมุน (Rotary Evaporator) จะได้สารสกัดกึ่งบริสุทธิ์ที่มีโรโดไมรโทนเป็นสารหลัก โดยมี ลักษณะเป็นผงละเอียด สีเขียวอ่อน 2. กรรมวิธีการสกัดสารกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุที่มีสารโรโดไมรโทนเป็นสารหลัก ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง ใน ขั้นตอน ข ตัวทำละลาย เลือกได้จาก อะซิโตน (C3H6O) เอทานอล ( CH3CH2OH) หรือ อะซิโตน 3. กรรมวิธีการสกัดสารกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุที่มีสารโรโดไมรโทนเป็นสารหลัก ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง ใน ขั้นตอน ข อาจจะเปลี่ยนตัวทำละลายทุกๆ 3 วัน แทนการแช่สารละลายเป็นเวลา 3-15 วัน 4. กรรมวิธีการสกัดสารกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุที่มีสารโรโดไมรโทนเน้นสารหลัก ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง ใน ขั้นตอน ง ตัวทำละลาย เลือกได้จาก คลอโรมีเทน (CH2Cl2) หรือ เอทิลอะซิเตท (C4H8O2) 5. กรรมวิธีการสกัดสารกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุที่มีสารโรโดไมรโทนเป็นสารหลัก ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง อัตราส่วนระหว่างตัวทำละลายเฮกเซนและเอทิลอะซิเตตในขั้นตอน ง คือ อัตราส่วน 80-96 ต่อ 4-20 %โดยปริมาตร 6. กรรมวิธีการสกัดสารกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุที่มีสารโรโดไมรโทนเป็นสารหลัก ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง อัตราส่วนระหว่างตัวทำละลายเฮกเซนและเอทิลอะซิเตตในขั้นตอน จ คือ อัตราส่วน 94 ต่อ 6 %โดย ปริมาตร หน้า 2 ของจำนวน 2 หน้า 7. กรรมวิธีการสกัดสารกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุที่มีสารโรโดไมรโทนเป็นสารหลัก ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง อัตราส่วนตัวทำละลายผสมเฮกเซน-ไดคลอโรมีเทน-เมนทานอล ในขั้นตอน ฉ คือ อัตราส่วน 80 ต่อ 16 ต่อ 4 %โดยปริมาตร 8. กรรมวิธีการสกัดสารกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุที่มีสารโรโดไมรโทนเป็นสารหลัก ตามข้อถือสิทธิ 1-5 ข้อใด ข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง สามารถเพิ่มเติมขั้นตอนการทดสอบปริมาณสารสกัด ดังนี้ ช. นำ 100 % ไดคลอโรมีเทนมาเป็นเฟสเคลื่อนที่ ทำการตรวจสอบสารละลายที่ถูกชะออกมาด้วย ทินเลเยอร์โครมาโตกราฟีที่มีซิลิกาเจลเป็นเฟสอยู่กับที่และทำการรวมสารละลายที่มีลักษณะของจุดสาร บนทินเลเยอร์โครมาโตกราฟีที่คล้ายกันเข้าด้วยกัน จากสารสกัดไดคลอโรมีเทนให้ได้สารกึ่งบริสุทธิ์ ใช้ เครื่องโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงวิเคราะห์ปริมาณสารโรโดไมรโทนในสารสกัดย่อยกึ่งบริสุทธิ์ เทียบกับสารโรโดไมรโทนบริสุทธิ์ที่ทำการวิเคราะห์หาสูตรโครงสร้างด้วย เอ็นเอ็มอาร์ สเปคโทรสโคปี (1D และ 2D NMR spectroscopy) และแมส สเปกโทรสโครปี (mass spectroscopy) ------------ หน้า 1 ของจำนวน 2 หน้า ข้อถือสิทธิ------December 25, 2019------(OCR) Page 1 of 2 pages of Claims 1. The process for extracting semi-purified compounds from rhodomyrtone leaves with rhodomyrtone as the main active compound consists of the following steps: a. Select rhodomyrtone leaves, wash them, and dry them by oven at 60-75°C. The dried leaves are then finely ground. This step yields finely ground dried rhodomyrtone leaves. b. The finely ground dried rhodomyrtone leaves obtained from step a are soaked in a solvent at 25-28°C for 3-15 days. The solids are then filtered and separated. The solvent is evaporated from the resulting solution at 40-45°C. This step yields a crude extract from rhodomyrtone leaves. c. Coarse silica gel is packed into a column with a diameter of 8 cm to a height of 32 cm. Hexane (C6H14) is used to wet the silica gel. In this step, a silica gel column is obtained. The crude extract from the leaves obtained in step B is dissolved with a solvent. Then, coarse silica gel is added to the crude extract solution and stirred until the solution dries into a loose powder. It is then slowly transferred into the column to maintain a smooth silica gel surface. Next, a hexane-ethyl acetate mixture is used to elute the semi-pure extract from the column. In this step, a semi-pure extract containing rhodomyrtone is obtained. The semi-pure extract containing rhodomyrtone obtained from step D is further separated using column chromatography with a hexane-ethyl acetate mixture. It is then evaporated using a rotary evaporator, yielding a sub-extract of rhodomyrtone in the form of a fine, dark green to black powder. Finally, the sub-extract of rhodomyrtone obtained from step E is further separated using column chromatography with a mixture of hexane, dichloromethane, and menthanol. The substance is then evaporated using a rotary evaporator to obtain a semi-purified extract with rhodomyrtone as the main component, which is a fine, light green powder. 2. A method for extracting semi-purified substances from kratom leaves with rhodomyrtone as the main component, according to claim 1, where in step b the solvent can be selected from acetone (C3H6O), ethanol (CH3CH2OH), or acetone. 3. A method for extracting semi-purified substances from kratom leaves with rhodomyrtone as the main component, according to claim 1, where in step b the solvent may be changed every 3 days instead of soaking the solution for 3-15 days. 4. A method for extracting semi-purified substances from kratom leaves with rhodomyrtone as the main component, focusing on the active ingredient. According to claim 1, in step d, the solvent can be selected from chloromethane (CH2Cl2) or ethyl acetate (C4H8O2). 5. Semi-purified extraction method from kratom leaves with rhodomyrtone as the main substance. According to claim 1, the ratio between hexane and ethyl acetate solvents in step d is 80-96 to 4-20% by volume. 6. Semi-purified extraction method from kratom leaves with rhodomyrtone as the main substance. According to claim 1, the ratio between hexane and ethyl acetate solvents in step e is 94 to 6% by volume. Page 2 of 2 pages. 7. Semi-purified extraction method from kratom leaves with rhodomyrtone as the main substance. According to claim 1, where the solvent ratio for the hexane-dichloromethane-mentanol mixture in step f is 80:16:4% by volume, 8. The semi-purified extraction method from kratom leaves with rhodomyrtone as the main compound, according to any one of claims 1-5, may include the following quantification steps: B. 100% dichloromethane is used as the mobile phase. The eluted solution is examined using thin-layer chromatography with silica gel as the stationary phase, and solutions with similar spot characteristics on the thin-layer chromatography are combined to obtain a semi-purified dichloromethane extract. The rhodomyrtone content in the semi-purified sub-extract is then analyzed using high-performance liquid chromatography. Compared to pure rhodomyrtone samples whose structural formulas were determined using NMR spectroscopy (1D and 2D NMR spectroscopy) and mass spectroscopy. ------------ Page 1 of 2 pages. Claims.
1. กระบวนการสกัดสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากสารสกัดกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุ ประกอบด้วยขั้นตอน ดังนี้ ก. คัดเลือกส่วนใบของกระทุ จากนั้นล้างทำความสะอาดแล้วน่ามาทำให้แห้ง อบที่อุณหภูมิ 60-75 องศาเซลเซียส จากนั้นน่าใบกระทุแห้งไปบดละเอียด ในขั้นตอนนี้ได้ใบกระทุแห้งบดละเอียด ข. นำใบกระทุแห้งบดละเอียดที่ได้จากขั้นตอน ก มาแซในตัวทำละลายที่อุณหภูมิ 25-28 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3-15 วัน จากนั้นกรองและแยกเอากากออก แล้วน่าสารละลายที่ได้มาระเหยตัวทำละลาย ออก ที่อุณหภูมิ 40-45 องศาเซลเซียส ในขั้นตอนนี้จะได้สารสกัดหยาบจากใบกระทุ ค. บรรจุซิลิกาเจล (silica gel) ขนาดหยาบ ลงในคอลัมน์ ใช้เฮกเซน (C6H14) ทำให้ซิลิกาเจลเปียก ใน ขั้นตอนนี้จะได้ซิลิกาเจลคอลัมน์ ง. น่าสารสกัดหยาบจากใบกระทุที่ได้จากขั้นตอน ข มาละลายด้วยตัวทำละลาย จากนั้นใส่ซิลิกาเจล ชนิดหยาบลงในสารละลายสกัดหยาบ คนจนสารละลายสกัดหยาบแห้งเป็นผงร่วน จากนั้นค่อย ๆ ถ่าย ลงไปในคอลัมน์อย่างข้า ๆ เพื่อให้ผิวหน้าของซิลิกาเจลเรียบอยู่เสมอ จากนั้นใช้ตัวทำละลายผสม เฮกเซน-เอทิลอะซิเตต เป็นตัวซะสารสกัดกึ่งบริสุทธิ์ออกจากคอลัมน์ ตามลำดับ ในขั้นตอนนี้จะได้สาร สกัดกึ่งบริสุทธิ์ที่มีสารโรโดไมรโทน จ. สารสกัดกึ่งบริสุทธิ์ที่มีสารโรโดไมรโทน ที่ได้จากขั้นตอน ง. มาทำการแยกต่อด้วยวิธีคอลัมน์โคร มาโทกราฟีใช้ตัวทำละลายผสมเฮกเซน-เอทิลอะซิเตต จากนั้นนำไประเหยด้วยเครื่องกลั่นระเหยสาร แบบหมุน (Rotary Evaporator) จะได้สารสกัดย่อยโรโดไมรโทนลักษณะเป็นผงละเอียด สีเขียวเข้ม ออกดำ ฉ. นำสารสกัดย่อยโรโดไมรโทนที่ได้จากขั้นตอน จ. มาทำการแยกต่อด้วยวิธีคอลัมน์โครมาโทกราฟีใช้ตัว ทำละลายผสมเฮกเซนและไดคลอโรมีเทนและเมนทานอล จากนั้นนำไประเหยด้วยเครื่องกลั่นระเหย สารแบบหมุน (Rotary Evaporator) จะได้สารสกัดกึ่งบริสุทธิ์ที่มีโรโดไมรโทนเป็นสารหลัก โดยมี ลักษณะเป็นผงละเอียด สีเขียวอ่อน1. The process of extracting bioactive compounds from semi-purified extracts of Moringa oleifera leaves consists of the following steps: a. Select Moringa oleifera leaves, wash them thoroughly, and dry them in an oven at 60-75°C. The dried leaves are then finely ground. b. The finely ground dried leaves from step a are soaked in a solvent at 25-28°C for 3-15 days. The solids are then filtered, and the solvent is evaporated from the resulting solution at 40-45°C. This yields a crude extract from Moringa oleifera leaves. c. Coarse silica gel is packed into a column and wetted with hexane (C6H14). This results in a silica gel column. d. The crude extract from step b is dissolved in a solvent. The coarse silica gel is then added to the crude extract solution and stirred until it dries into a loose powder. This powder is then slowly transferred into the column to maintain a smooth silica gel surface. Finally, a hexane-ethyl acetate solvent mixture is used. The semi-purified extract is obtained from the column in the following order: Step D yields a semi-purified extract containing rhodomyrtone. The semi-purified extract containing rhodomyrtone obtained from step E is further separated using column chromatography with a hexane-ethyl acetate mixture as a solvent. It is then evaporated using a rotary evaporator, yielding a sub-extract of rhodomyrtone in the form of a fine, dark green to black powder. Step F involves further separating the sub-extract of rhodomyrtone obtained from step E using column chromatography with a solvent mixture of hexane, dichloromethane, and methanol. It is then evaporated using a rotary evaporator, yielding a semi-purified extract with rhodomyrtone as the main component, which is a fine, light green powder.
2. กระบวนการสกัดสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากสารสกัดกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุ ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง ในขั้นตอน ข ตัวทำละลาย เลือกได้จาก อะซีโตน (C3H6O) เอทานอล ( CH3CH2OH) หรือ อะซิโตน2. The process of extracting bioactive compounds from the semi-purified extract of *Kratu* leaves, as per claim 1, where in step b the solvent can be selected from acetone (C3H6O), ethanol (CH3CH2OH), or acetone.
3. กระบวนการสกัดสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากสารสกัดกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุ ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง ในขั้นตอน ข อาจจะเปลี่ยนตัวทำละลายทุกๆ 3 วัน แทนการแช่สารละลายเป็นเวลา 3-15 วัน3. The process of extracting bioactive compounds from the semi-purified extract of *Kratuek* leaves, as per claim 1, where in step B the solvent may be changed every 3 days instead of soaking the solution for 3-15 days.
4. กระบวนการสกัดสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากสารสกัดกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุ ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง ในขั้นตอน ง ตัวทำละลาย เลือกได้จาก คลอโรมีเทน (CH2Cl2) หรือ เอทิลอะซิเตท (C4H8O2)4. The process of extracting bioactive compounds from the semipurified extract of *Kratu* leaves, as per claim 1, where in step d the solvent can be selected from chloromethane (CH2Cl2) or ethyl acetate (C4H8O2).
5. กระบวนการสกัดสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากสารสกัดกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุ ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง อัตราส่วนระหว่างตัวทำละลายเฮกเซนและเอทิลอะซิเตตในขั้นตอน ง คือ อัตราส่วน 80-96 ต่อ 4-20 %โดยปริมาตร5. The process for extracting bioactive compounds from semi-purified extracts of Garcinia cambogia leaves, as per claim 1, where the ratio of hexane and ethyl acetate solvents in step 3 is 80-96% to 4-20% by volume.
6. กระบวบการสกัดสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากสารสกัดกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุ ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง อัตราส่วนระหว่างตัวทำละลายเฮกเซนและเอทิลอะซิเตตในขั้นตอน จ คือ อัตราส่วน 94 ต่อ 6 %โดย ปริมาตร หน้า 2 ของจำนวน 2 หน้า6. The process of extracting bioactive compounds from the semipurified extract of *Kratu* leaves according to claim 1, where the ratio of hexane and ethyl acetate solvents in step 4 is 94 to 6% by volume. (Page 2 of 2)
7.กระบวนการสกัดสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากสารสกัดกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุ ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง อัตราส่วนตัวทำละลายผสมเฮกเซน-ไดคลอโรมีเทน-เมนทานอล ในขั้นตอน ฉ คือ อัตราส่วน 80 ต่อ 16 ต่อ 4 %โดยป'ริมาตร7. The process of extracting bioactive compounds from the semi-purified extract of *Kratu* leaves, as per claim 1, where the solvent ratio of hexane-dichloromethane-mentanol in step 4 is 80:16:4% by volume.
8.กระบวนการสกัดสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากสารสกัดกึ่งบริสุทธิ์จากใบกระทุ ตามข้อถือสิทธิ 1-5 ข้อ ใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง สามารถเพิ่มเติมขั้นตอนการทดสอบปริมาณสารสกัด ตังนี้ ซ. นำ 100 % ไดคลอโรมีเทนมาเป็นเฟสเคลื่อนที่ ทำการตรวจสอบสารละลายที่ถูกซะออกมาด้วย ทินเลเยอร์โครมาโตกราฟที่มีซิสิกาเจลเป็นเฟสอยู่กับที่และทำการรวมสารละลายที่มีลักษณะของจุดสาร บนทินเสเยอร์โครมาโตกราฟที่คล้ายกันเข้าด้วยกัน จากสารสกัดไดคลอโรมีเทนให้ได้สารกึ่งบริสุทธิ์ ใช้ เครื่องโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสูงวิเคราะห์ปริมาณสารโรโดไมรโทนในสารสกัดย่อยกึ่งบริสุทธิ์ เทียบกับสารโรโดไมรโทนบริสุทธิ์ที่ทำการวิเคราะห์หาสูตรโครงสร้างด้วย เอ็นเอ็มอาร์ สเปคโทรสโคปี (1D และ 2D NMR spectroscopy) และแมส สเปกโทรสโครปี (mass spectroscopy)8. The process of extracting bioactive compounds from the semi-purified extract of *Kratuek* leaves, according to any one of claims 1-5, may include additional steps for quantifying the extract as follows: 1. Use 100% dichloromethane as the mobile phase. The extracted solution is examined using a thin-layer chromatograph with sesica gel as the stationary phase. Solutions with similar spot characteristics on the thin-layer chromatograph are combined to obtain a semi-purified dichloromethane extract. The rhodomyrtone content in the semi-purified sub-extract is then analyzed using a high-performance liquid chromatograph, comparing it to the pure rhodomyrtone analyzed for structural formula using 1D and 2D NMR spectroscopy and mass spectroscopy.