Claims (9)
1.กรรมวิธีสำหรับการเตรียมสารผสมที่มี 70% ถึง 100% ของ N,O-ซัลเฟเทดเฮพาโรแซน ที่ประกอบด้วยโซ่หรือของผสมของโซ่ที่มีมวลโมเลกุลระหว่าง 1,500 และ 15,000 Da, กำหนดลักษณะเฉพาะโดยโครงสร้างไดแซ็กดาไรด์ที่ซ้ำกันของสูตร I: ซึ่ง -E แทนหมู่ แอซีทิล ใน 0 ถึง 80% ของหน่วยไดแซ็กคาไรด็ของ N.O-ซัลเฟเทด เฮพาโรแซน ดังกล่าว และหมู่ซัลเฟท และอาจจะไฮโดรเจน อะตอมในหน่วยไดแซ็กคาไรด์ที่เหลืออยู่ -G แทนไฮโดรเจน อะตอม และหมู่ซัลเฟท,ซื่งระดับในการทำให้เป็นซัลเฟต (sulfation,ซัลเฟตชั่น)นั้น,ได้บอกไว้เป็นสัดส่วนของหมู่ซัลเฟตต่อหมู่คาร์บอกซิลระหว่าง 1.5 ถึงง 3.0 และเกลือต่างๆที่ยอมรับได้ทางเภสัชกรรมของ N,O-ซัลเฟเทด เฮพาโรแซนดังกล่าว,กำหนดลักษณะเฉพาะที่ว่า มันประกอบด้วยลำดับของขั้นตอนต่อไปนี้ -ขั้นตอน a การเพาะสายเชื้อ Escherichea Coli(K5), -ขั้นตอน b แยกและทำให้บริสุทธิ์-ซื่งอาจถูกหรืออาจไม่ถูกนำหน้าโดยการทำให้บริสุทธิ์ขั้นต้น- -ของ N-แอซีทิลเฮพาโรแซน ที่เกิดขึ้นเพื่อให้ได้รับสารผสมที่มี 70% ถึง 100% ของ N-แอซีทิลเฮพาโรแซนที่ประกอบด้วยโซ่ หรือของผสมของโซ่ที่มีมวลโมเลกุลระหว่าง 1,500 และ 15,000 Da, กำหนดลักษณะเฉพาะโดยโครงสร้างไดแซ็กคาไรด์ที่ซ้ำกันของสูตร II : -ขั้นตอน C: ดีแอซีทิเลชันเป็นบางส่วนของสารผสมของ N-แอซีทิลเฮพาโรแซนนี้เพื่อให้ได้สารผสมที่มี 70% ถึง 100% ของเฮพาโรแซนที่ประกอบด้วยโซ่หรือของผสมของโซ่ที่มีมวลโมเลกุลระหว่าง 1,500 และ 15,000 Da กำหนดลักษณะเฉพาะโดยโครงสร้างไดแซ็กคาไรด์ที่ซ้ำกันของสูตร III: ซึ่ง R แทนหมู่แอซีทีลใน 0 ถึง 80% ของหน่วยไดแซ็กคาไรด์,และไฮโดรเจน อะตอมในหน่วยไดแซ็กคาไรด์ที่เหลืออยู่, -ขั้นตอน d:N,O-ซัลเฟชั่นบางส่วนของสารผสมของเฮพาโรแซนนี้ -หรือ N,O-ซัลเฟชันบางส่วนของสารผสมของเฮพาโรแซนนี้ติดตามด้วยขั้นตอนของ N-ซัลเฟชั่นทั้งหมด -หรือ N-ซัลเฟชันทั้งหมดหรือบางส่วน ติดตามด้วยขั้นตอนของ O-ซัลเฟชันทั้งหมดหรือบางส่วน และอย่างที่เลือกได้นำมาซื่งขั้นตอนของการดำเนินการแยกลำดับส่วนหนึ่งขั้นตอนหรือมากกว่าของมวลโมเลกุลที่เกิดขึ้นในช่วงท้ายของขั้นตอน a,b,c,หรือd1. The procedure for preparing mixtures containing 70% to 100% N,O-sulfated heparoxan, consisting of chains or mixtures of chains with molecular weights between 1,500 and 15,000 Da, is characterized by a repeating disaccharide structure of formula I: where -E represents the acetyl group in 0 to 80% of the disaccharide units of such N,O-sulfated heparoxan and the sulfate group and possibly hydrogen atoms in the remaining disaccharide units; -G represents the hydrogen atom and the sulfate group, the degree of sulfation of which is given as the ratio of sulfate group to carboxyl group between 1.5 and 3.0; and the various pharmaceutically acceptable salts of such N,O-sulfated heparoxan are characterized as follows: It consists of the following sequence of steps: -Step a: Culture of Escherichea coli (K5) bacteria, -Step b: Isolation and purification - which may or may not be preceded by primary purification - of N-acetylheparoxan, resulting in a mixture containing 70% to 100% of N-acetylheparoxan chains or a mixture of chains with a molecular weight between 1,500 and 15,000 Da, characterized by a repeating disaccharide structure of formula II: -Step c: Partial deacetylation of the mixture. This N-acetyl heparoxan is obtained to obtain a mixture containing 70% to 100% heparoxan consisting of chains or a mixture of chains with a molecular weight between 1,500 and 15,000 Da, characterized by a repeating disaccharide structure of formula III: where R represents acetyl groups in 0 to 80% of the disaccharide units, and hydrogen atoms in the remaining disaccharide units, - a partial N,O-sulfation step d of this heparoxan mixture - or partial N,O-sulfation of this heparoxan mixture followed by a total N-sulfation step - or total or partial N-sulfation followed by a total or partial O-sulfation step, and, as selected, leads to a sequence separation action of one or more molecular weights occurring at the end of steps a, b, c, or d.
2.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 1, กำหนดลักษณะเฉพาะที่ว่าสายเชื้อ Escherichia Coli (K5)คือสายเชื้อ SEBR 8282 (ที่ฝากไว้ที่ CNCM ของ Pasteur Instiute,Paris France, ภายใต้เลขที่ I-1013)หรือมิวแทนท์ของสายเชื้อนี้ที่เกิดขึ้นเองหรือถูกกระตุ้น2. The procedure under claim 1, specifies that the Escherichia Coli (K5) strain is SEBR 8282 (deposited at the Pasteur Institute CNCM, Paris, France, under number I-1013) or a naturally occurring or induced mutation of this strain.
3.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 1,กำหนดลักษณะเฉพาะที่ว่าทำต่อเนื่องการเพาะของสายเชื้อ Escherichia Coli (K5) เป็นเวลาอย่างน้อยที่สุดสองชั่วโมงหลังจากการเจริญเติบโตของมวลชีวภาพได้หยุดลง3. The procedure under claim 1 specifies that the culture of Escherichia Coli (K5) strains must be continued for at least two hours after biomass growth has ceased.
4.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 1, กำหนดลักษณะเฉพาะที่ว่าการแยกและทำให้บริสุทธิ์ของ N-แอซีทิลเฮพาโรแซนมีอย่างน้อยที่สุดหนึ่งขั้นตอนของการตกตะกอนด้วยแอลกอฮอล์และอย่างน้อยที่สุดหนึ่งขั้นตอนของโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออน4. The procedure under Claim 1 is characterized as follows: the separation and purification of N-acetylheparoxane shall involve at least one step of alcohol precipitation and at least one step of ion-exchange chromatography.
5.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 1,กำหนดลักษณะเฉพาะที่ว่าดำเนินการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของ N-แอซีทิลเฮพาโรแซน โดยใช้กรรมวิธีที่นำมาซื่งลำดับของขั้นตอนต่อไปนี้ - ขั้นตอน a1: การตกตะกอนด้วยเอธานอล -ขั้นตอนb1: ไดอะลิซิส, -ขั้นตอนc1: การตกตะกอนด้วยเอธานอล,ติดตามด้วยการขจัดน้ำ และทำให้แห้ง, -ขั้นตอนd1: ทำให้บริสุทธิ์ โดยใครมาโทกราซีแลกเปลี่ยนไอออน, -ขั้นตอน e1: การตกตะกอนด้วยเอธานอลของสิ่งที่ได้จากการซะที่ได้มาในขั้นตอน d1,ขจัดน้ำ,ทำให้แห้งและบด ซื่งหนึ่งในขั้นตอน a1 หรือ c1 อาจจะถูกข้ามไป5. The procedure under claim 1 is specified as follows: separation and purification of N-acetylheparoxane are performed using a procedure consisting of the following sequence of steps: - Step a1: Ethanol precipitation; - Step b1: Dialysis; - Step c1: Ethanol precipitation, followed by dehydration and drying; - Step d1: Purification by ion-exchange chromatography; - Step e1: Ethanol precipitation of the byproduct from step d1, dehydration, drying, and grinding. One of steps a1 or c1 may be skipped.
6.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 1,กำหนดลักษณะเฉพาะที่ว่าดำเนินการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของ N-แอซีทิลเฮพาโรแซนโดยใช้กรรมวิธีที่นำมาซื่งลำดับขั้นตอนต่อไปนื้ -ขั้นตอน a1:ไดอะลิซิส, -ขั้นตอน b1: ทำให้บริสุทธิ์ในตัวกลางที่เป็นกรด ขจัดสารเจือปนที่ไม่ละลายในสารละลายในน้ำที่มีค่าพีเอช 3.5 และค่าพีเอช1.8 -ขั้นตอน c1: การตกตะกอนด้วยเอธานอล, ติดตามด้วยการขจัดน้ำ และทำให้แห้ง -ขั้นตอน d1: ไฮโดรลิซิสด้วยด่างและไดอะลิซิส, -ขั้นตอน e1:ทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออน -ขั้นตอน f1:ทำให้บริสุทธิ์โดยเอ็กซ์ดลูซัน โดรมาโทกราฟี6. The procedure under claim 1 specifies that the separation and purification of N-acetylheparoxane shall be carried out using a procedure consisting of the following steps: - Step a1: Dialysis; - Step b1: Purification in an acidic medium, removal of insoluble impurities in aqueous solutions with pH 3.5 and pH 1.8; - Step c1: Ethanol precipitation, followed by dehydration and drying; - Step d1: Alkaline hydrolysis and dialysis; - Step e1: Purification by ion-exchange chromatography; - Step f1: Purification by exclusivity chromatography.
7.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 1, กำหนดลักษณะเฉพาะที่ว่านำ N-แอซีทิลเฮพาโรแชน ที่ได้รับจากการเพาะของสายเชื้อ Escherichia Coli (K5) มาทำให้บริสุทธิ์ขั้นต้นก่อนการแยกและทำให้บริสุทธิ์ ดำเนินการโดยใช้กรรมวิธีซื่งนำมาซื่งลำดับของขั้นตอนต่อไปนี้ -ขั้นตอน a1 ปั่นเหวี่ยงสารแขวนลอยที่ได้รับที่จุดสิ้นสุดของการเพาะ -ขั้นตอน b1 นำส่วนลอยมาสัมผัสกับสารละลายด่าง -ขั้นตอน c1 ทำการกรองล่วงหน้า -ขั้นตอน g1 ทำให้เข้มข้นโดยใช้เมฆเบรนที่มีขีดเริ่มเปลี่ยนในการตัดออกที่เฉพาะ -ขั้นตอน e1 ไดอะลิซิส, ซื่งอาจจะข้ามขั้นตอน e1 ไป7. The procedure under claim 1 is characterized as the preliminary purification of N-acetylheparochane obtained from the culture of Escherichia Coli (K5) before isolation and further purification. This is carried out using a procedure consisting of the following sequence of steps: - Step a1: Centrifugation of the suspension obtained at the end of the culture; - Step b1: Immediate contact of the suspension with an alkaline solution; - Step c1: Pre-filtration; - Step g1: Concentration using a brain with a specific cut-off threshold; - Step e1: Dialysis, which may be skipped.
8.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 1, กำหนดลักษณะเฉพาะที่ว่าทำตามหลังขั้นตอนของ N,O-ซัลเฟชันบางส่วนด้วย N-ซัลเฟชันทั้งหมด ดำเนินการด้วยสารเชิงซ้อนของซัลฟิวริดแอนไฮไดรด์กับเบสอินทรีย์ในตัวทำละลายในน้ำที่มีค่าพีเอชเป็นด่าง8. The procedure under claim 1 is characterized as being performed following partial N,O-sulfation with total N-sulfation, carried out with a complex of sulfuric anhydride and an organic base in an aqueous solvent with an alkaline pH.
9.กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 1, กำหนดลักษณะเฉพาะที่ว่าทำตามหลังขั้นตอนของ N-ซัลเฟชันทั้งหมดด้วยการแยกลำดับส่วนมวลโมเลกุล9. The procedure under claim 1 is characterized as being performed after all N-sulfation steps by molecular weight sequence separation.