TH117344A - กรรมวิธีการผลิตเอนไซม์นิวรามินิเดสในยีสต์ และการใช้ - Google Patents

Abstract

------24/11/2560------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ การประดิษฐ์นี้จึงเป็นการพัฒนากรรมวิธีการผลิตเอนไซม์นิวรามินิเดสจากเรือไวรัสไข้หวัดนกสาย พันธุเอ็ช 5 เอ็น 1 ที่ระบาดในปัจจุบันให้ได้ในปริมาณมากเพียงพอต่อการนำไปใช้ในงานด้านการ ตรวจสอบคัดกรองหาสารออกฤทธิ์ต่อเชื้อไวรัสไข้หวัดนกและนำไปใช้ในการศึกษาความเป็นไปได้เพื่อ นำมาพัฒนาต่อเป็นยาป้องกันการแพร่กระจายของเชื้อไวรัสไข้หวัดนก ด้วยวิธีการผลิตในยีสต์แทนการ สกัดจากเชื้อไวรัสโดยตรง ซึ่งกรรมวิธีในการประดิษฐ์นี้มีความปลอดภัยจากการติดเชื้อระหว่างทำสูงกว่า วิธีดั้งเดิมและเป็นวิธีที่สะดวก และเอ็นเอที่ผลิตได้มีประสิทธิภาพของเอ็นไซม์เหมือนเอ็นเอที่สกัดได้จาก เชื้อไวรัสโดยตรง ------------ การประดิษฐ์นี้จึงเป็นการพัฒนากรรมวิธีการผลิตเอนไซม์นิวรามินิเดสจากเชื้อไวรัสไข้หวัดนกสาย พันธุ์เอ็ช 5 เอ็น 1 ที่ระบาดในปัจจุบันให้ได้ปริมาณมากเพียงพอต่อการนำไปใช้ในงานด้านการ ตรวจสอบคัดกรองหารสารออกฤทธิ์ต่อเชื้อไวรัสไข้หวัดนกและนำไปใช้ในการศึกษาความเป็นไปได้เพื่อ นำมาพัฒนาต่อเป็นยาป้องกันการแพร่กระจายของเชื้อไวรัสไข้หวัดนก ด้วยวิธีการผลิตแทนการ สกัดจากเชื้อไวรัสโดยตรง ซึ่งกรรมวิธีในการประดิษฐ์นี้มีความปลอดภัยจากการติดเชื้อระหว่างทำสูงกว่า วิธีดั้งเดิมและเป็นวิธีที่สะดวก และเอ็นเอที่ผลิตได้ใประสิทธิภาพของเอนไซม์เหมือนเอ็นเอที่สกัดได้จาก เชื้อไวรัสโดยตรง

Claims (5)

ข้อถือสิทธฺ์ (ทั้งหมด) ซึ่งจะไม่ปรากฏบนหน้าประกาศโฆษณา :------24/11/2560------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า ข้อถือสิทธิ 1. กรรมวิธีการผลิตรคอมบิแนนท์เอนไซม์นิวรามินิเดสโดยยีสต์ทำได้โดย การนำเอ็นเอตั้งแต่คู่เบสของ กรดอะมิโนตำแหน่งที่ 63 ถึง 449 มาใส่ในพลาสมิดพาหะของยีสต์ที่มีลำดับเบสที่ช่วยในการหลั่ง ออกนอกเซลล์ลำดับเบสที่ช่วยในการติดตามผลการผลิตโปรตีนเอ็นเอและอยู่ภายใต้การควบคุม การผลิตโปรตีนโดยโปรโมเตอร์ AOX1 2. กรรมวิธีการผลิตรคอมบิแนนท์เอนไซม์นิวรามินิเดสโดยยีสต์ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ยีสต์ที่ถูกดัดแต่ง ให้ผลิตเอนไซม์นิวรามินิเดสถูกเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีกลีเซอรัล BMGY จนได้ OD600 เท่ากับ 5 - 6 แล้วจึงเลียงในอาหารที่มีส่วนผสมของ เมทธานอล BMMY เป็นเวลา 4 กัน 3. กรรมวิธีการตรวจดัดกรองหาสารออกฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์นิวรามินิเดส โดยใช้ รีคอมบิแนนท์เอ็นเอประกอบด้วยนั้นตอนดังนี้เอนไซม์นิวรามินิเดสปริมาณ 10 ไมโครลิตรมาผสม กับสารละลายบัฟเฟอร์ปริมาณ 10 ไมโครลิตรที่มีสารยับยั้งที่ต้องการทดสอบนำสารผสมไปปมที่ อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที เพื่อให้สารยับยั้งทำปฏิกิริยากับเอนไซม์นิวรามินิเดส จากนั้นจึงใส่สารตั้งต้น 2\'-(4-Methylumbellifery)-?-D-N-acetylneuraminic acid ทีมีความเข้มข้น 833 ไมโครโมล่าร์ในปริมาณ30ไมโครลิตรจากนั้นนำไปบ่มต่อที่อุณหภูมิ37องศาเซลเซียส เป็น เวลา 30 นาที เอนไซม์นิวรามินิเดสอิสระที่เหลือจากการยับยั้งด้วยสารทดสอบจะทำปฏิกริยากับสาร ตั้งต้นจนได้เป็นสารผลิตภัณฑ์เกิดขึ้น และเมื่อครบระยะเวลาที่กำหนดแล้วจึงใส่สารละลายหยุด ปฏิกิริยาปริมาณ 150 ไมโครลิตร จากนั้นนำสารผสมไปกัดค่าการเรืองแสงของสารผลิตภัณฑ์ ค่า การเรืองแสงที่วัดได้จะถูกนำไปคำนวณเป็นค่ากิจกรรมของเอ็นเอ (NA activity) และค่า IC50 ของ สารยับยั้ง ------------

1. กรรมวิธีการผลิตรีคอมบิแนนท์เอนไซม์นิวรามินิเดสโดยยีสต์ที่ถูกตัดแต่งให้ประกอบด้วยลำดับเบส ของยีนเอ็นเอที่พบในไวรัสไข้หวัดนก เอ็ช 5 เอ็น 1 ที่คู่เบสของกรดอะมิโนตำแหน่งที่ 63 ถึง 449

2. กรรมวิธีการผลิตรีคอมบิแนนท์เอนไซม์นิวรามินิเดสโดยยีสต์ ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่มีลักษณะเฉพาะคือ การนำลำดับเบสของยีนเอ็นเอมาใส่ในพลามิดพาหะของยีสต์ที่ประกอบด้วยลำดับเบสที่ช่วยใน การหลั่งออกนอกเซลล์ ลำดับเบสที่ช่วยในการติดตามผลการผลิตโปรตีนเอ็นเอ และอยู่ภายใต้การ ควบคุมการผลิตโปรตีนโดยโปรโมเตอร์

3. กรรมวิธีการผลิตรีคอมบิแนนท์เอนไซม์นิวรามินิเดสโดยยีสต์ ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ยีสต์ที่ถูกตัดแต่ง ให้ผลิตเอนไซม์นิวรามินิเดสถูกเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีกลีเซอรัล BMGY จนได้ OD600 ประมาณ 5-6 แล้วจึงเลี้ยงในอาหารที่มีส่วนผสมของ เมทธานอล BMMY เป็นเวลาอย่างน้อย 4 วัน

4. กรรมวิธีการตรวจคัดกรองหาสารออกฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์นิวรามินิเดส โดยใช้รีคอม บิแนนท์เอ็นเอ ประกอบด้วยขั้นตอนดังนี้ เอนไซม์นิวรามินิเดสปริมาณ 10 ไมโครลิตร มาผสมกับ สารละลายบัฟเฟอร์ปริมาณ 10 ไมโครลิตร ที่มีสารยับยั้งที่ต้องการทดสอบในปริมาณความเข้มข้น ต่างๆ นำสารผสมไปบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที เพื่อให้สารยับยั้งทำ ปฏิกิริยากับเอนไซม์นิวรามินิเดส จากนั้นจึงใส่สารตั้งต้น 2\'-(4-Methylumbelliferyl)-(สูตร)-D-N- acetylneuraminic acid ที่มีความเข้มข้นประมาณ 833 ไมโครโมลาร์ ในปริมาณ 30 ไมโครลิตร จากนั้นนำไปบ่มต่อที่อุณหภูมิ 37 องศาเซสเซียส เป็นเวลา 30 นาที เอนไซม์นิวรามินิเดสอิสระที่ เหลือจากการยับยั้งด้วยสารทดสอบจะทำปฏิกิริยากับสารตั้งต้นจนได้เป็นสารผลิตภัณฑ์เกิดขึ้น และ เมื่อครบระยะเวลาที่กำหนดแล้วจึงใส่สารละลายหยุดปฏิกิริยาปริมาณ 150 ไมโครลิตร จากนั้นนำ สารผสมไปวัดค่าการเรืองแสงของสารผลิตภัณฑ์ ค่าการเรืองแสงที่วัดได้จะถูกนำไปคำนวณเป็นค่า กิจกรรมของเอ็นเอ (NA activity) และค่า IC50 ของสารยับยั้ง

5. การใช้รีคอมบิแนนท์เอ็นเอในการตรวจคัดกรองหาสารออกฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์นิวรา มินิเดส และเพื่อนำมาพัฒนาต่อเป็นยาป้องกันการแพร่กระจายของเชื้อไวรัสไข้หวัดนก