SU960627A1 - Способ количественного определени гаптенов - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к иммунологии и может найти применение в медицине . Известен радиоиммунный способ определени  гаптенов, согласно которому к,известному количеству антител добавл ют известное количество меченого радиоактивной меткой (С,Н, , j) соответствующего ranteHa и неизвестное количество немеченого гаптена . Смесь инкубируют, затем выдел ют из реакционной среды фракцию антител , св завших гаптены, и регистрируют радиоактивность этой выделенной фракции или оставшейс  реакционной среды, по которой определ ют неизвестное количество гаптена lj. Недостатками этого способа  вл ютс  сложность и длительность процесса определени . Сложность обуслов лена необходимостью выполнени  мертехники безопасности при работе с ра диоактивными препаратами, выполнени  процедуры разделени  антител и маточ ного раствора содержащего гаптены, а также.использованием дорогосто щего оборудовани  дл  регистрации радиоактивности и меченых радиоактивной меткой препаратов. В целом на процедуру определени  затрачиваетс  ч. Наиболее близким к предлагаемому  вл етс  способ количественного определени  гаптенов путем торможени  гаптеном реакции антигена с антигаптеновым антителом, согласно которому используют конъюгирова нный на поверхности корпускул рной частицы эритроциты , частицы латекса или полимера антиген jj2J. Недостатками известного способа  вл ютс  длительность процесса (15 20 ч), обусловленна  низкой скоростью оседани  эритроцитов после их смешивани  с сывороткой, и сложность способа определени , обусловленна  необходимостью приготовлени  конъюгированного антигена на поверхности корпускул рной частицы и некоторой субъективностью учета реакции из-за индивидуальных особенностей воспри ти  форма осадка. Цель изобретени  - ускорение и упрощение способа определени  концен трации гаптенов. Цель достигаетс  тем, что при осуществлении способа количественного определени  гаптенов путем торможени  гаптеном реакции антигена с антигаптеновым антителом, в качестве антигена используют конъюгироваиный свободный антиген белок-гаптен, все операции определени  гаптенов провод т в ультразвуковом поле и количество гаптена определ ют по изменению скорости ультразвука в реакцио ной среде, Все операции провод т в ультразву ковом поле. К раствор J-гл обулиновой фракции (1-10 мг/мл белка) гап теновой антисыворотки в физиологическом растворе, приготовленном на фосфатном буфере рН 7, добавл ют известное количество гаптена, смесь перемешивают и инкубируют в течение 3 мин при . Затем к смеси добавл ют раствор конъюгированного антигена гаптен-белок в конценУрации 5 10 -10 мг/мл. Раствор перемешивают, термостатируют в течение 1,5 мин и определ ют скорость ультразвука в реакционной среде. Через 1-5 мин вновь регистрируют скорость ультразвука и рассчитывают разность этих скоростей. Операции повтор ют при использовании разных концентраций гаптена от 10 до 10 моль/л и стро т калибровочную кривую зависимости скорости ультразвука от концентрации добавленного гаптена. Дл  анализа неизвестной концентрации гаптена провод т все указанные операции, но вместо известной концентрации гаптена внос т в реакционную смесь анализируемую жидкость и рассчитывают изменение скорости ультразвука. По калибровочной кривой определ ют количество гаптена в анализируемой жидкости. На фиг. 1 изображена калибровочна  крива  зависимости изменени  ско рости ультразвука в реакционной среде ,.-Щс (мм/с) от количества гаптена в области концентраций 5-10 -5 10 моль/л. На фиг. 2 изображена калибровочна  крива  зависимости скорости ультразвука в реакционной среде ди (мм/с) от количества гаптена в области концентраций 51о-5-10 молЬ/л; П р и м ё р 1. Дл  .определенна  концентрации фенобарбитала (ФБ) в интервале 510 5-10 оль/л в растворе используют антйфенобарбиталовую сыворотку , полученную по известному способу, из которой выдел ют -глобулиновую фракцию, содержащую антитела к фенобарбиталу, с использованием сульфата аммони  О -ного насыщени  по известному способу. В качестве конъюгированного антигена используют конъюгат ФБ- ичный альбумин , полученный реакцией диазониевой соли аминофенобазобитала с  ичным альбумином по известному способу. Затем стро т калибровочную кривую дл  определени  неизвестной концентраций гаптена в интервале концентрации 5-10- 510 моль/л ФБ- ичный альбумин в концентрации 8,0-10 мг/мл, приготовленный в физиологическом растворе с фосфатным 0, 01 М буфером рН 7, На этомже растворителе готов т растворыгаптена ФБ с концентраци ми 5 X10 оль/л, М0 моль/л, Ч1(Гмоль/л; 510 оль/л, и-у глобулин с концентрацией 1 мг/мл белка. Далее к 10.0 мкл прогретого 25 С в акустическом резонаторе раствора3-глобулина добавл ют 10 мкл раствора ФБ с концентрацией 5-10 моль/л, перемешивают и инкубируют 3 мин. Затем к этой смеси добавл ют 10 мкл раствора конъюгата ФБ на  ичном альбумине , перемешивают и спуст  1,5 мин регистрируют скорость ультразвука и.,, а на п той минуте U . Разность полученных скоростей MJ занос т в таблицу. Далее перечисленные операции пбвто рют Со всеми при готовленными концентраци ми ФБ. Дл  контрол  неспецифического взаимодействи  р а ст вори т ел ь с глобул и ном (обоз н ачаетс  как нулева  концентраци ) операции повтор ют с добавлением растворител . Контролем на специфичность взаимодействи  с ФБ служит раствор адреналина с концентрацией 5-10 Изменение скорости ультразвука при различных концентраци х фенобар- битала Г с использованием фиксированной концентрации конъю гата ФБ ичный альбумин при показано в табл. 1.

т а 6 л и ц а 1

ли.

Концентраци  ФВСг

мм/с моль/л

16,1+0,5

О

-7 $;6iQ,2

5-10 ,-6

,9+0,3

10

-6

210 2,7+0,2

-6

3

10 1,5+0,3

-6

Ц

10 0,5+0,3

5

10 0,2+0,2

г 6 16,4+0, it

дреналин 10

По данным табл. 1 стро т калибровочную зависимость изменени  скорости ультразвука от величины концентрации гаптена (фиг. 1), Неизвестную концентрацию ФБ определ ют, провод  торможение реакции конъюгированного антигена с антителом изложенным способом и использу  калибровочную кривую.

П р и м е р 2. Дл  определени  концентрации фенобарбитала в интервале моль/л используют те же вещества, что в примере 1.

Дл  этого используют раствор конъюгата ФБ- ичньт альбумин в концентрации 8,0-КГ мг/мл, приготовленный в физиологическом растворе с фосфатным 0,01 М буфером рН 7,4. На этом же растворителе подготовл ют растворы гйптена ФБ с концентраци к 1 5 , 2 , . 4 .10 -, 510 и д глобулина с концентрацией 1 мг/мл белка.

Далее к 100 мкп прогретого до в акустическом резонаторе раствора у-глобулина добавл ют 10 мкл раствора ФБ с концентрацией 5 «10 моль/л, перемаиивают и инкубируют 3 мин. Затем к этой смеси добавл ют 10 мкл раствора конъкзгата ФБ на  ичном альбумине, перемешивают и спуст  1,5 мин регистрируют скорость ультразвука Цс, а затем на третьей минуте УЗ- Разность полученных скоростей ди занос т в таблицу. Далее перечисленные операции повтор ют со всеми приготовлен60627«

ными концентраци ми ФБ. Дл  контрол  неспецифического взаимодействи  растворител  Cv - глобулином (в таблице обозначаетс  как нулева  концен$ траци ) операции повтор ют с добавлением растворител . Контролем на специфичность взаимодействи  у-глобулина с ФБ служит раствор адреналина с концентрацией 5010 моль/л. 10 Изменение скорости ультразвука различных концентраци х фенобарбатала ГгЗ с использованием фиксированной концентрации конъюгата ФБ  ичный альбумин при .

Таблица2

По данным табл. 2 стро т калибровочную кривую зависимости изменени  скорости ультразвука от величины концентрации гаптена (фиг. 2).. Неизвестную концентрацию гаптена ФБ определ ют, провод  торможение реакции конъюгированного антигена и антителом изложенным способом и использу  калибровочную кривую.

Применение предлагаемого способа по сравнению с известнь1ми позвол ет ускорить процесс проведени  анализа в 60-80 раз, упростить процесс проведени  анализа за счет исключени  операций по получению одного из реагентов и повысить экономичность процесса за счет сокращени  числа реагентов и времени процесса.

V

Claims (2)

1. Формула изобретени 

   : Способ количественного опрёдёлени  гаптенов путем торможени  ranтеном реакции антигена с антигаптеновым антителом, отличающийс  тем, что, с целью ускорени  и упрощени  способа, в качестве антигена используют конъюгированный свободный антиген белок-гаптен , вс.е операции определени  гапте нов провод т в ультразвуковом поле и количество гаптена определ ют по изменению скорости ультразвука в ре акционной среде. .78 Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1. Фрайфелдер Д. Физическа  биохими . М., Мир, 1980, с. 257-267.
2. 2. V.P.Butler, Jhe Immunological assay of Drugs, G. of Pharmaology and Experimental Therapeoties, vol. 29, Vf 2, 1978, p.p. 116-121.

   ФМА