SU955865A3 - Штамм аDRовастеRIUм тUмеFасIеNS NRRL в-11394-продуцент глюкозоизомеразы - Google Patents

Description

Изобретение относится к микробиологической. промышленности, б именно к новому Штамму - продуценту глю-. козоиэомеразы, используемому для получения фруктозы.

Известны различные штаммы бактерий, НапримерAerobacter cloacae 334, способные продуцировать глюкозоизомеразу [1].

Цель изобретения - расширение источников - продуцентов глюкозоиэомеразы.

Изобретение представляет собой. штамм Aerobacter tumefaciens NRRL В-11394-(коллекция культур Северной Региональной Исследовательской Лаборатории, Пеория, США) - продуцент глюкозоиэомеразы.

Указанный штамм выделен из почвы. Характеристика штамма.

Культурально-морфологические признаки .

Единичные, иногда в парах, палочки размером 0,8-2,0 микрона грамотрицательные, не образуют капсул и ₂₅ спор, подвижные перитрихи с 4-6 жгутиками.

Колонии на агаризованной питательной среде (Difco): приподнятые, с четким краем, кремовые, прозрач2 ные, гладкие 0,5-1 мм в диаметре, обильный рост наблюдается на кальциево-глицерофосфатном-маннито-нитратном агаре с образованием коричневого пигмента и ореола.

Биохимические признаки.

Растет при 4-39°С на всех простых средах, не нуждаясь в факторах роста. В качестве источника азота использует NH^NOj или аминокислоты.

Оксидаза: положительная. Каталаза: положительная. Восстанавливает нитраты до нитритов.

Не гидролизует:

Казеин, желатин, целлюлозу, крахмал,- агар. ' °

Образует 3-кетогликозиды. Абсорбирует краситель на магнит-, ном агаре с анилиновым синим. Изменяет цвет молока с Rocell a tenctoria в серо-коричневый.

потребление”: углеводов окислительное .· Использует в качестве источника углерода; *D(+) глюкозу, L( + ) арабинозу, 0(+)ксилоэу, D(♦)треалозу, D(-) рибозу, Ц+)-рамнозу, лактозу, целлобиозу, мальтозу, цитрат, ацетат, . лактат, пропионат, L-аспарагиновую кислоту, L-аспарагин,. L-гистидин,

L-аланин, L-аргинин.
Вызывает новообразования	•в дисках
корнях моркови.
Пример!. Готовят питательную
среду следующего состава:	<	5
Глюкоза, г/л	5
Ксилоза, г/л	5
ΚΗ^ΡΟψ,г/л	13
( NH4)2LS04 ,г/л‘	2
Mg SQf7Hg0 , г/л	0,4 -	10
FeS04‘7H2.0-,Mr/n	10	'*
CaC 1α· 6H7O,мг/л	40
MnS04·5Н7О,мг/л	5
ZnSO,,.· 7Нг0,мг/л '	5
CuSQf· $Нг0,мг/л СоС I7- бНг0,мг/л	1 .1	15

С помощью NaOH устанавливают pH

7,2 и разливают по 100 мл в 500 мл колбы Эрленмейера. После стерилиза- 20 ции в течение 30 мин при 110°С колбы засевают культурой Agrobacterium tumefaciens NRRL В—11394 из скошенного агара, содержащего ту же самую среду с 2% агаром'(0ifсо) и инкубиру~25 ют в течение 24 ч при 30°С с вращательным перемешиванием со скоростью 220 об/мин. Клетки затем'собирают центрифугированием и Промывают буферным раствором (Na^SOj, 0,1 М, рН-7, эд содержащим 1-10'⁴ молей COt⁺и 5-103 молей Mg⁺⁺) . С одной колбы получают 2 г влажных клеток. Эти клетки снова суспендируют в 20 мл буферного раствора, указанного выше, и клеточ- _ ную пульпу подвергают дезинтеграфии ³³ на френг-прессе. В дезинтеграте/ полученном таким образом, определяют ферментную активность: 1 г влажных клеток содержат 560 ферментных единиц. 40

Ферментную активность определяют следующим образом.

К реакционной смеси, содержащей

4,5 мл раствора питательной среды ' 4э (0 - глюкоза 3,67 молярная,Mg⁺⁺ 5-10⁴ молей, С0⁺⁺1СГ⁴молей и Na^SOj 0,1 молярный в деионизированной воде, pH 7,0).добавляют 0,5 мл неочищенного экстракта. Смесь инкубируют в 50 течение 2 ч на паровой бе.не. при 60°С. Реакцию прерывают охлаждением смеси до 0°С. Оптическое вращение образца (cLj/час) и образца оригинала (cL₀) измеряют при комнатной 55 температуре на поляриметре Parkins blmer 141, линия Na (549 нанометров), оптический путь кюветы 0,1 дм.

2>а единицу SNAflPROGETT I принято количество порции фермента, которая 60 дает-1 мг фруктозы за один час в условиях испытания, приведенных выш’е, то число единиц 'фермента на грамм влажных клеток может быть выражено следующей формулой:.

Количество единиц- в 1 г влажных в которойd_глнгк = + 54,16° ^фрукт ⁼ -9-8,35°

С - концентрация в г глюкозы на мл раствора

0,1 = оптический путь, дм.

Пример 2. Питательную среду для культивирования готовят, как в примере 1. Из 500 мл питательной среды получают 10,2 г влажных клеток, которые -суспендируют в 40 мл буфер. ного раствора (Na^SO^ 0,1 молярный, pH 7) и добавляют, перемешивая при -10°С, к 200 мл ацетона. После 15 мин обработки клетки собирают на бумажном фильтре, промывают ацетоном, собирают и сушат в вакууме при комнатной, температуре. Таким образом, получают 1,9 г сухих клеток.

Активность одного -грамма ацетоново го порошка,полученного таким образом, составляет 2,200 единиц.

Пример 3. Клетки штамма Agrobacterium tumefaciens NRRL В-11394 получают как в примере 1 и обрабатывают ацетоном, как в примере 2. Клетки, обработанные ацетоном, используют для определения процента изомеризации глюкозы в реакционной смеси как функцию времени.

Условия испытания следующие: клетки, обработанные ацетоном, 10 г; объем питательной среды 1 л; температура протекания реакции 60°С.

Питательная среда имеет следующий состав: глюкоза 60 % (вес/объем,Мд⁺⁺: 5 миллимолей, СО⁺⁺: 0,1 миллимолей), Na^SOj': 100 миллимолей - рн 7,0.

Проценты изомеризации имеют еле-
дующие значения. Время,, ч	Превращение,%
3 · е	12,5 ..
6	20,8
9	27,8
ь 12	32,3
т 15	37,7
18 . .	40,6
23 ·	44,8
Таким образом, штамм Agrobacte- , rium tumefaciens NRRL B-l1394 является новым штаммом, способным

продуцировать глюкозоизомераэу.

Claims (1)

1. Авторское свидетельство СССР 534490, кл. -С 12 N 9/92, 1975.