SU952260A1

SU952260A1 - Method of producing diagnosticum for carrying out bentonite flocculation reaction

Info

Publication number: SU952260A1
Application number: SU813231719A
Authority: SU
Inventors: Зинаида Васильевна Пручкина; Георгий Павлович Сомов; Лидия Витальевна Краснова; Елена Николаевна Ненада
Original assignee: Владивостокский Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии И Микробиологии; Дальневосточный государственный университет
Priority date: 1981-01-04
Filing date: 1981-01-04
Publication date: 1982-08-23

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ БЕНТОНИТОВОЙ ФЛОКУЛЯЦИИ(54) METHOD FOR OBTAINING A DIAGNOSTICUM FOR CONDUCTING THE REACTION OF BENTONITE FLOCULATION

1one

Изобретение относитс к медицине и может быть использовано дл вы влени антигенов и антител.The invention relates to medicine and can be used to detect antigens and antibodies.

Известен способ получени диагностикума дл проведени реакции бетонитовой флокул ции путем адсорбции антигена или антител на частицах бетонита при инкубировании смеси с последующей отмывкой целевого продукта 1.A method for producing diagnosticum is known for carrying out a reaction of a concrete flocculation by adsorbing an antigen or antibodies on particles of concrete during incubation of the mixture, followed by washing of the target product 1.

Однако известный способ не позвол ет получить диагностикум, обладающий высокой чувствительностью реакции.However, the known method does not allow to obtain a diagnosticum with a high sensitivity reaction.

Целью изобретени вл етс повышение чувствительности реакции.The aim of the invention is to increase the sensitivity of the reaction.

Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу получени диагностикума дл проведени реакции бентонитовой флокул ции путем адсорбции антигена или антител на частицах бентонита при инкубировании смеси с последующей отмывкой целевого продукта, дл адсорбции используют частицы бентонита размером 0,0006 - 0,0009 мм в концентрации 1,7-1,9 мг/мл воды .The goal is achieved by the fact that according to the method of obtaining a diagnosticum for carrying out the reaction of bentonite flocculation by adsorbing antigen or antibodies on particles of bentonite during incubation of the mixture, followed by washing the target product, for adsorption use bentonite particles with a size of 0.0006 - 0.0009 mm in concentration 1 , 7-1.9 mg / ml water.

Способ осуществл ют следующим образом .The method is carried out as follows.

В качестве сырь лл получени бентонитового диагностикума используют бентонитовые глины различных месторождений СССР, а именно Устиновского (РСФСР), Огланлы (Таджикска ССР), Аскани (Грузинска ССР). Бентонит подвергают специальной обработке. Дл , разрушени карбонатов глину обрабатывают 1 н. сол ной кислотой, а затем 0,1 н. Образовавшиес растворимые соли и кварц удал ют путем отмывани дистиллированной водой. Дл Bentonite clays from various fields of the USSR, namely Ustinovsky (RSFSR), Oglanly (Tadzhiksk SSR), Askani (Georgian SSR), are used as raw materials for obtaining bentonite diagnosticum. Bentonite is subjected to special treatment. For the destruction of carbonates, clay is treated with 1N. hydrochloric acid, and then 0.1 n. The resulting soluble salts and quartz are removed by washing with distilled water. For

10 этого глину с помощью воды перенос т в вегетационные стаканы (20x12 см). На каждый стакан нанос т метки; перва на высоте 3 см от дна, втора на 7 см выше, треть на 7 см выше второй. Дистиллированную воду доливают до третьей метки, взмучивают 10 of this clay is transferred by water into growing glasses (20x12 cm). Each glass is labeled; the first is at a height of 3 cm from the bottom, the second is 7 cm higher, a third is 7 cm higher than the second. Distilled water is added to the third mark, stirred up.

15 в ней бентонит и оставл ют на 12 ч дл отстаивани . Когда тверда часть глины оседает, а над ней остаетс прозрачна жидкость , то последнюю удал ют сифоном и 2Q вновь наливают дистиллированной воды до верхней метки. Когда суспензи остаетс во взвешенном состо нии, приступают к отмучиванию частиц величиной 0,0006 - 0,0009 мм. Дл этого в стаканы наливают дистиллированную воду до верхней метки.15 therein is bentonite and allowed to settle for 12 hours. When the solid part of the clay settles and the clear liquid remains above it, the latter is siphoned off and 2Q is again poured into distilled water to the top mark. When the suspension remains in a suspended state, the particles with a size of 0.0006 - 0.0009 mm are started to be sprayed off. For this purpose, distilled water is poured into glasses to the top mark.

содержимое перемешивают, через 24 ч погружают сифон на глубину 7 см и с его помощью суспензию переливают в стакан-приемник . Отмучивание продолжают до просветлени суспензии. В стаканы-приемники к каждой новой порции суспензии добавл ют 3-4 капли концентрированной сол ной кислоты дл коогул ции и осаждени суспензии . Фракцию отмывают дистиллированной водой, а затем высушивают в вод ной бане.the contents are stirred, after 24 hours the siphon is immersed to a depth of 7 cm, and with its help the suspension is poured into a receiving glass. Immobilization is continued until the suspension clears. To the receptacles, 3-4 drops of concentrated hydrochloric acid are added to each new portion of the suspension to coagulate and precipitate the suspension. The fraction is washed with distilled water and then dried in a water bath.

190 мг этого бентонита суспендируют в 100 мл дисталлированной воды, в результате , чего получают высокоактивную суспензию иммунноадсорбента.190 mg of this bentonite are suspended in 100 ml of distilled water, as a result of which a highly active suspension of the immunoabsorbent is obtained.

За счет удалени при отмывании из бентонита кварца и растворимых солей происходит увеличение процентного содержащи глинистой составл ющей (монтмориноллитовой фракции) до 80-90%, что обеспечивает повыщение адсорбционных свойств глины .By removing quartz and soluble salts from bentonite during washing, an increase in the percentage of the clay component (montmorinolite fraction) increases to 80-90%, which ensures an increase in the adsorption properties of the clay.

Приготавливают антигенный бентонитовый диагностикум на основе полученного иммунноадсорбента . В качестве антигена используют 10 млрд. взвесь суточной агаровой культуры шигеллы Флекснера и шигеллы Зонне, которую прогревают в вод ной бане в течение 2-4 ч при 100°С с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 1,5 ч. Бентонитовую суспензию смещивают с антигеном в соотноещнии 1:2 (5 мл суспензии и 10 мл антигена). Сенсибилизацию провод т при комнатной температуре в течение 30 мин, затем смесь центрифугируют при 2200 об/мин в течение 7 мин. Осадок дважды отмывают в 15 мл дистиллированной воды центрифугированием. Надосадочную жидкость удал ют, а осадок ресуспендируют в 5 мл дистиллированной воды , добавл ют 1 мл 0,1%-ного метиленового голубого и оставл ют на 5 мин. Дл удалени избытка красител к смеси добавл ют 10 мл дистиллированной воды и центрифугируют при 2200 об/мин в течение 7 мин, после чего осадок ресуспендируют в дистиллированной воде в объеме 5 мл. В качестве стабилизирующего агента используют 1% твин - 80, который добавл ют в количестве 0,5 мл.An antigenic bentonite diagnosticum is prepared on the basis of the obtained immune adsorbent. 10 billion are used as antigen. A suspension of daily agar culture of Shigella Flexner and Shigella Sonne, which is heated in a water bath for 2-4 hours at 100 ° C, followed by centrifugation at 4000 rpm for 1.5 hours. Bentonite suspension shift with antigen in a ratio of 1: 2 (5 ml of suspension and 10 ml of antigen). Sensitization is carried out at room temperature for 30 minutes, then the mixture is centrifuged at 2,200 rpm for 7 minutes. The precipitate is washed twice in 15 ml of distilled water by centrifugation. The supernatant was removed, and the precipitate was resuspended in 5 ml of distilled water, 1 ml of 0.1% methylene blue was added and left to stand for 5 minutes. To remove excess dye, 10 ml of distilled water is added to the mixture and centrifuged at 2,200 rpm for 7 minutes, after which the precipitate is resuspended in distilled water in a volume of 5 ml. 1% Tween - 80 is used as a stabilizing agent, which is added in an amount of 0.5 ml.

Препарат сохран ет свою активность при хранении в услови х холодильника ( + 8 - - 10°С) в течение 20 мес.The drug retains its activity when stored in a refrigerator (+ 8 - - 10 ° C) for 20 months.

Пример 1. Способ постановки реакции торможени бентонитовой агглютинации (РТБа).Example 1. Method of setting the reaction of inhibition of bentonite agglutination (RTBa).

Дл индикации микробных антигенов используют искусственно инфицированные щигеллами Флекснера пробы воды, молока, овощей и фруктов, которые перед исследованием прогревают в вод ной бане при 100°С 30 мин, затем центрифугируют ив реакции используют надосадочную жидкость.To indicate microbial antigens, samples of water, milk, vegetables, and fruits, which are artificially infected with Flexner's flexer, are heated up in a water bath at 100 ° C for 30 minutes before being tested, then the supernatant is centrifuged and used for the reaction.

В РТБа примен ют коммерческую агглютинирующую неадсорбированную дизентерийную сыворотку к шигеллам ФлекснераIn TBA, commercial agglutinating non-adsorbed dysentery serum is applied to Shigella Flexner.

(титр 1:12800). Опытным путем устанавливают ее оптимальное рабочее разведение, равное 1:64.(titer 1: 12800). Empirically establish its optimal working dilution of 1:64.

Реакцию став т в полистироловых пластинках в объеме 0,3 мл. К 0,1 мл исследуемой жидкости добавл ют 0,1 мл рабочего разведени сыворотки, содержимое лунок перемещивают и оставл ют в термостате на 1,0-1,5 ч при 37°С. Затем во все лунки добавл ют 0,1 мл бентонитового дизентерийного диагностикума. Содержимое хорошо перемещивают и оставл ют при комнатной температуре.The reaction is placed in polystyrene plates in a volume of 0.3 ml. 0.1 ml of the working serum dilution is added to 0.1 ml of the test liquid, the contents of the wells are moved and left in the thermostat for 1.0-1.5 hours at 37 ° C. Then 0.1 ml of a bentonite dysenteric diagnosticum is added to all wells. The contents are well moved and left at room temperature.

Постановке реакции сопутствуют два контрол : контроль рабочего разведени сыворотки и контроль диагностикума.Two reactions are associated with the formulation of the reaction: control of the working serum dilution and control of the diagnosticum.

Учет результатов реакции провод т через 20-30 мин невооруженным глазом. Реакци считаетс положительной, когда частицы бентонита равномерно выстилают все дно лунки в виде круглого п тна голубого цвета. При отрицательной реакции частицы бентонита располагаютс на дне лунки в виде зонтика с выраженным фистончатым краем с полным просветлением надосадочной жидкости.Records of the results of the reaction are carried out after 20-30 minutes with the naked eye. The reaction is considered positive when the particles of bentonite evenly line the entire bottom of the well in the form of a blue round spot. In case of a negative reaction, the particles of bentonite are located at the bottom of the well in the form of an umbrella with a pronounced fistonchaty edge with full enlightenment of the supernatant.

Данна реакци позвол ет обнаружить 6-12 тыс. микробных тел в 1 мл исследуемой жидкости.JThis reaction can detect 6–12 thousand microbial cells in 1 ml of the test liquid.

С целью проверки специфичности РТБа, реакцию провод т с другими микробами: сальмонелла энтеритидис, щигелла Зонне, эщерихи коли, иерсини псевдотуберкулезис , иерсини энтероколитика. Положитель:Ных результатов с указанными антигенами в РТБа не получено.In order to verify the specificity of RTBa, the reaction was carried out with other microbes: Salmonella enteritis, Schighella Sonne, Eshirihi if, Yersini pseudotuberculosis, Yersini enterocolitis. Positive: There are no results with the indicated antigens in RTB.

Исследовани показывают, что чувствительность РТБа при использовании предложенного диагностикума размерами частиц составл ет 6-12 тыс. микробных тел в 1 мл, а в случае применени известного 50 млн. микробных тел.Studies show that the sensitivity of RTB using the proposed diagnostic particle size is 6-12 thousand microbial cells in 1 ml, and in the case of using the known 50 million microbial bodies.

Таким образом, РТБа характеризуетс специфичностью и высокой чувствительностью , котора превышает чувствительность реакции торможени непр мой гемагглютинации на 5-6 пор дков и сокращает врем исследовани в 7-10 раз. Результаты реакции хорошо воспроизвод тс после неоднократного перемешивани содержимого лунок {встр хивани(е не мешает повторному воспроизведению реакции), это позвол ет использовать предлагаемый текст РТБа дл экспресс-диагностики в полевых услови х.Thus, RTBa is characterized by specificity and high sensitivity, which exceeds the sensitivity of the reaction of inhibition of indirect hemagglutination by 5-6 orders of magnitude and reduces the time of the study by 7-10 times. The results of the reaction are well reproduced after repeatedly mixing the contents of the wells {shaking (it does not interfere with the reproduction of the reaction), this allows the use of the proposed RTB text for express diagnostics in field conditions.

Пример 2. Способ постановки реакции бентонитовой агглютинации (РБа). Example 2. The method of setting the reaction of bentonite agglutination (RBA).

При постановке реакции используют агглютинирующую неадсорбированную дизентерийную сыворотку к шигеллам Флекснера и Зонне.In the formulation of the reaction, agglutination non-adsorbed dysentery serum to Shigella Flexner and Sonne is used.

Claims

The serum is inactivated in a water bath at 56 ° C for 30–40 min. In polystyrene plates, serial two-fold serum dilution in saline (pH 7.2) in a volume of 0.1 ml is prepared. 0.1 ml of a bentonite diagnosticum is added to each well, the mixture is thoroughly shaken and left at room temperature. The reaction is accompanied by the production of controls for the absence of spontaneous agglutination of the suspension. The results of the reaction are taken into account with the naked eye after 20 minutes. The reaction is considered positive when the particles of bentonite are located at the bottom of the well in the form of an "umbrella" (as well as in the ordinary reaction of indirect hemagglutination), with a pronounced fistone edge and complete clarification of the supernatant. In the case of a negative reaction, bentonite particles uniformly line the entire bottom of the well in the form of a blue spot. To check the specificity of RBa, the reaction was performed with unadsorbed sera to Shigella Sonne, Titer 1: 3200 (in case of using the Shigella flexner antigen); to Shigella Flexner, titer 1: 12800 (when using antigen from Shigella Sonne; to Salmonella enteritidis, titer to pseudotuberculosis microbe, 1: 12800. Nonspecific reactions are noted only with serums to Shigella Sonne at a dilution of 1: 8 - 1:16 (specific titer 1: 3200). In comparison with the sensitivity of a similar reaction, set by a known method, the proposed RBA is more effective by 7-8 serum dilutions (1: 262144 and 1: 256). The sensitivity of the RBA in detecting antibodies is 10 times higher than the sensitivity of dry and liquid erythrocytes Thus, the positive results of RBa with dry donkey non-adsorbed serum to Shigella Flexner (titer 1: 12800, series 221) are observed at a dilution of 1: 131072 - 1: 262144, while in the RNG only at 1: 6400 - 1: 12800. Thus, RBa using a bentonite diagnosticum is characterized by specificity and high sensitivity. Thermostat conditions are not required to carry out this reaction, the study time is shortened by a factor of 7-10 compared to XRD. The reaction results are well replicated, after vigorously shaking the contents of the wells. Diagnosticum for conducting the reaction of bentonite flocculation is characterized by specificity, high sensitivity, exceeding the sensitivity of the known diagnostics by 7-8 orders of magnitude, allows shortening the study time by 7-10 times and can be used for express diagnostics of dysentery in the work of bacteriological laboratories of sanitary epidemiological stations. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION A method for producing a diagnosticum for carrying out a bentonite flocculation reaction by adsorbing an antigen or antibodies on bentonite particles during incubation of the mixture followed by washing the target product, characterized in that, in order to increase the sensitivity of the reaction, bentonite particles 0,0006-0 , 0009 mm at a concentration of 1.7-1.8 mg / ml of water. Sources of information taken into account in the examination 1. R. Wallace et al. “The Bentonile Floculation test in the assay of Neisseria antiBody, 1970, 16, No. 8, p. 655-659.