JP3773633B2

JP3773633B2 - Analysis method and reagent for E. coli O157

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Publication number: JP3773633B2
Application number: JP31612797A
Authority: JP
Inventors: 美佐子大田; 茂田代; 啓吾椛澤
Original assignee: 株式会社三菱化学ヤトロン
Priority date: 1997-10-31
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 2006-05-10
Anticipated expiration: 2017-10-31
Also published as: JPH11133029A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、大腸菌Ｏ１５７（腸管出血性大腸菌Ｏ１５７又は志賀毒素産生大腸菌Ｏ１５７ともいう）の分析方法及び分析用試薬に関する。本発明は、臨床材料又は食品中の大腸菌Ｏ１５７の分析に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
細菌性食中毒が発生した場合、食中毒原因細菌の検出あるいは分離は治療方針を決定する上でも、また、感染経路を解明する上でも不可欠であり、更に食中毒予防のためにも重要である。食品検体中に特定菌が存在することを知るために、幾つかの方法が行われている。
それらの食品検体や、便や尿などの臨床材料における細菌検査には、大きく分けて２つの方向がある。その一方は、ＤＮＡや免疫学的手法を用いて、検体中に特定菌が存在するか否かのみを確認する迅速検査方法である。この迅速検査方法には、例えば、特定菌の特異的ＤＮＡを増幅して検出するＰＣＲ法、更には、特定菌に特異的な抗原を免疫学的に検出するＥＬＩＳＡ法及びイムノクロマトグラフィー等がある。
他の一つは、目的菌に適した培地を用いて培養により原因菌を分離し、同定する方法である。すなわち、検体試料について、直接に（あるいは予め増菌培養した培養液から）分離培養を行い、分離培養における集落（コロニー）から疑わしい集落を選択して釣菌し、釣菌した集落について、生化学的及び／又は血清学的性状に基づいて菌を同定する方法である。
【０００３】
大腸菌Ｏ１５７の検査も、前記の２種の細菌検査に準じた方法で行われている。例えば、菌分離方法を利用する場合には、大腸菌Ｏ１５７を選択的に発育する分離培地による分離培養と、目的菌（すなわち、大腸菌Ｏ１５７）である可能性がある集落について、更に、生化学的試験及び／又は血清学的試験をもとに菌種を決定する操作が行われている。また、少量の病原菌汚染の場合には、分離培養の前に液体培地で前培養を行う必要がある。この前培養を行ってから菌種を決定するまでには、一般に、５日間以上の長時間が必要である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前記の迅速検査方法においても、抗原抗体反応を利用する菌検出検査があり、目的菌の存在を確認することはできるが、その目的菌を分離することはできないので、目的菌の存在確認後に薬剤耐性などの性状を詳細に分析することはできない。
また、培養を利用した従来の一般的細菌検査によって大腸菌Ｏ１５７を検索する場合には、夾雑菌の多い検体試料の中から大腸菌Ｏ１５７を分離すること自体が困難な操作であり、更に、目的菌である可能性がある集落を生化学的性状や血清学的性状により同定する操作が必要である。それらの操作を経て検査が終了するまでの所要時間は、早くても３〜４日間、あるいはそれ以上の日数を必要としている。
従って、臨床材料においても、また特に新鮮度を必要とする食品の場合でも、一層迅速に検査結果が得られ、しかも菌の分離が可能な分析手段が求められている。本発明は、これらの課題を解決することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記の課題は、本発明による大腸菌Ｏ１５７の分析方法であって、
（１）被検試料を予備培養する工程；
（２）大腸菌Ｏ１５７と特異的に結合する抗体を感作した磁気粒子と前記の予備培養被検試料とを接触させる工程；
（３）抗原抗体反応により生ずる前記磁気粒子の凝集の程度を分析する工程；
（４）前記磁気粒子を磁気を利用して捕捉することにより分離する工程；
（５）分離した前記磁気粒子を分離培地中で培養状態に置く工程；及び
（６）前記工程後で形成される集落について大腸菌Ｏ１５７であるか否かの同定を行う工程を含む、大腸菌Ｏ１５７の分析方法によって解決することができる。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明における被検試料は、大腸菌Ｏ１５７を含む可能性のある試料であれば特に限定されないが、特には、臨床材料若しくは食品、又はそれらの処理物である。臨床材料は、ヒト又は家畜などの動物からの臨床材料、例えば、便、尿、血液、あるいは家畜などの動物の器官や組織などである。これらの臨床材料の処理物とは、濃縮、濾過あるいは増菌処理した産物であり、例えば、遠心沈殿物あるいは増菌培養液等である。また、食品としては、例えば、乳（例えば、牛乳）若しくは乳製品（例えば、バターやチーズ）、肉若しくは肉製品（例えば、ハム）、魚介類若しくは魚介類製品（例えば、缶詰）、冷凍食品、日配食品（例えば、弁当）、飲料水、飼料及び飼料製品、菓子類、又は香辛料等を挙げることができる。これらの食品の処理物とは、濃縮、濾過あるいは増菌であり、例えば、遠心沈殿物あるいは増菌培養液等である。
本発明によれば、前記被検試料における大腸菌Ｏ１５７の分析、すなわち、大腸菌Ｏ１５７の存在の検出、又は大腸菌Ｏ１５７の定量的（特に、半定量的）測定を行うことができる。
【０００７】
被検試料が液体である場合には、そのまま、あるいは必要により適当な水性溶媒（例えば、水、生理食塩水又は緩衝液）によって希釈してから本発明方法に用いることができる。被検試料が固体である場合には、適当な水性溶媒（例えば、水、生理食塩水又は緩衝液）によってその被検試料に含まれる大腸菌Ｏ１５７を洗い出し、その洗出液を用いることができる。
【０００８】
本発明において用いる「大腸菌Ｏ１５７と特異的に結合する抗体」は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（抗血清）であることができる。大腸菌Ｏ１５７と特異的に結合する抗体は、大腸菌Ｏ１５７とのみ特異的に結合し、その他の大腸菌や、別の微生物と結合しない抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体の場合には、１種類のモノクローナル抗体を用いるか、又は２種以上のモノクローナル抗体を用いることもできる。
前記の抗体は、例えば、大腸菌Ｏ１５７の任意の株を加熱処理（例えば、１００℃にて２時間）して得た加熱菌体を免疫原として哺乳動物（例えば、マウス、ラット、又はウサギ）に免疫し、抗血清（ポリクローナル抗体）を得るか、あるいは同様に免疫した哺乳動物（例えば、マウス、ラット、又はウサギ）から採取した脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合させて確立したハイブリドーマを、動物の腹腔内に接種してモノクローナル抗体を得るか、あるいは前記ハイブリドーマの培養上清を精製してモノクローナル抗体を得ることができる。
本発明においては、大腸菌Ｏ１５７に対する抗原結合部位を含む抗体フラグメントを用いることもできる。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、又はＦｖを挙げることができる。これらのフラグメントは、前記の抗体を、常法、例えば、プロテアーゼによって消化し、続いてフラグメントを精製することによって得ることができる。
【０００９】
前記の抗体と結合させる不溶性粒子としては、凝集法で用いる任意の不溶性担体を用いることができる。不溶性粒子としては、例えば、赤血球、天然高分子、合成高分子、又はガラス等を挙げることができ、ラテックス粒子が好ましい。それらの粒径は、凝集反応に適用できる範囲（例えば０．０１〜１０μｍ）であれば特に限定されない。
【００１０】
本発明で用いる不溶性粒子は、抗原抗体反応によって凝集体を形成した後に、それらの凝集体を容易に分離することのできる性質を有するのが好ましい。例えば、不溶性粒子が磁性材料（特に、強磁性体、例えば、鉄）を含有していると、磁気を利用して凝集体を分離することができる。磁性材料を含有する不溶性粒子（すなわち磁気粒子）は既に多数市販されており、適宜選択して用いることができる。
【００１１】
前記で得た抗体を不溶性粒子に感作する方法は公知であり、例えば、疎水結合を利用した物理吸着法、あるいは活性化させたトシル基、カルボキシル基、アミノ基、又はチオール基等で共有結合させる化学結合法を用いることができる。抗体を感作した粒子は、例えばリン酸緩衝液等の適当な溶媒中で保存することができる。
【００１２】
本発明による大腸菌Ｏ１５７の第１の分析方法は、
（１）大腸菌Ｏ１５７と特異的に結合する抗体を感作した不溶性粒子と被検試料とを接触させる工程、及び
（２）抗原抗体反応により生ずる凝集の程度を分析する工程を含む。
前記の接触工程は、被検試料中に含まれている可能性のある大腸菌Ｏ１５７と前記抗体と抗原抗体反応が可能で、その結果として凝集が生じる条件下で実施する。
【００１３】
被検試料中に大腸菌Ｏ１５７が存在する場合には、抗原抗体反応により凝集が生ずる。続いて、前記の分析工程において、凝集の程度を目視あるいは光学的手段により検出する。このとき、凝集を一層鮮明にするために、抗原抗体反応によって凝集した粒子を反応系から単離することが好ましい。不溶性粒子として磁気粒子を用いた場合には、磁石によって粒子を捕捉（集菌）して、これを適当な溶液（例えば、リン酸緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、又はトリス緩衝液等の緩衝液）に再懸濁して凝集を検出することができる。また、不溶性粒子としてポリスチレン等のラテックスを用いた場合には、濾別又は遠心処理して凝集した粒子を集め、これを適当な溶液に再懸濁して凝集を検出することができる。
【００１４】
本発明による大腸菌Ｏ１５７の第２の分析方法は、
（１）大腸菌Ｏ１５７と特異的に結合する抗体を感作した不溶性粒子と被検試料とを接触させる工程、
（２）抗原抗体反応により生ずる凝集体を分離する工程、
（３）得られた凝集体を分離培地で培養して、大腸菌Ｏ１５７の同定を行う工程を含む。
前記の接触工程は、前記の第１分析方法と同様に実施することができる。
【００１５】
被検試料中に大腸菌Ｏ１５７が存在する場合には、抗原抗体反応により凝集体が形成される。続いて、前記の分離工程において、反応系から凝集体を分離する。分離は、前記と同様に、磁気粒子を用いた場合には磁石により、ポリスチレン等のラテックスを用いた場合には濾別又は遠心処理により、実施することができる。本発明による第２分析方法は、前記の第１分析方法で得られた凝集体をそのまま分離して、次の大腸菌Ｏ１５７の同定工程に使用することができる。
【００１６】
本発明による第２分析方法では、前記の分離工程に続いて、大腸菌Ｏ１５７の同定工程を行う。この同定工程は、一般的に、
（ａ）得られた凝集体を分離培地で培養する工程、
（ｂ）分離培地において、大腸菌Ｏ１５７の集落（コロニー）である可能性がある集落を選択する工程、
（ｃ）選択した集落の生化学的及び／又は血清学的性状に基づいて、集落の微生物が大腸菌Ｏ１５７であるか否かを決定する工程を含む。
【００１７】
前記の分離培養工程（ａ）では、大腸菌Ｏ１５７の選択的な増殖に有効な分離培地を用いるのが好ましい。こうした分離培地は、従来から培養を利用した一般的細菌検査によって大腸菌Ｏ１５７を検索する場合に使用されており、公知である。本発明方法においても、それらの公知の分離培地、例えば、マッコンキー寒天培地、ソルビットマッコンキー寒天培地（ＳＭＡＣ）、セフェキシム・テルル酸カリウム−ソルビットマッコンキー寒天培地（ＣＴ−ＳＭＡＣ）等を用いることができる。分離培地に、抗生物質例えば、セフェキシム（Ｃ）又はノボビオシン（Ｎ）や、テルル酸カリウム（Ｔ）を含有させると選択性が高まり釣菌が容易となるので好ましい。
【００１８】
前記の集落選択工程（ｂ）では、前記の分離培地において形成される集落（コロニー）の中から、大腸菌Ｏ１５７の集落（コロニー）である可能性がある集落を選択する。大腸菌Ｏ１５７の集落は、白色を帯びる特徴を有しているので、その点から選択することができる。
【００１９】
続いて、前記の決定工程（ｃ）では、選択した集落を、例えば、釣菌して各種の培地で増殖させ、確認培養を行うことによって、集落の微生物が大腸菌Ｏ１５７であるか否かを決定する。例えば、ＴＳＩ（ＴｒｉｐｌｅＳｕｇａｒＩｒｏｎ）によってブドウ糖からの酸産生及びガス産生、硫化水素産生、乳糖からの酸産生、及び白糖からの酸産生を判定することができ、ＬＩＭ寒天培地（ＬｙｓｉｎｅＩｒｏｎＡｇａｒ）によって硫化水素産生及びリシンデカルボキシラーゼの有無を判定することができ、ＶＰ（Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ）半流動培地によってブドウ糖からのアセトイン（アセチルメチルカルビノール）の産生を判定することができる。更に、大腸菌血清型別因子血清を使用して血清型別を確認することができる。
【００２０】
以上のように、本発明による第２分析方法では、前記の分離培養工程（ａ）、集落選択工程（ｂ）及び決定工程（ｃ）の操作それ自体は、培養を利用した一般的細菌検査によって大腸菌Ｏ１５７を検索する場合の従来法の操作と実質的に差異はないが、前記の分離培養工程（ａ）で用いる試料が、従来法では被検試料それ自体であるのに対し、本発明による第２分析方法では、不溶性粒子と被検試料との抗原抗体反応により形成させ、抗原抗体反応系から分離した凝集体を用いる点で異なる。
【００２１】
本発明で用いる試料では、大腸菌Ｏ１５７の汚染度は、一般細菌（例えば、その他の大腸菌群）の汚染度に比較して微量であるか、又は損傷を受けている場合があるので、本発明による前記の第１及び第２の分析方法において、前記の接触工程（１）を行う前に、場合により、被検試料を公知の方法により適当な前増菌培地で前増菌培養して、被検試料中の大腸菌Ｏ１５７の菌体数を増加させ、検出感度を上昇させるのが好ましい。大腸菌Ｏ１５７の前増菌培地としては、トリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）、普通ブイヨン、乳糖ブロス、緩衝ペプトン水、又はｍＥＣブイヨン等を挙げることができる。
また、必要により、前増菌の後で、更に、公知の方法により適当な選択増菌培地で増菌培養して、被検試料中の大腸菌Ｏ１５７の菌体数を増加させ、検出感度を上昇させるのが好ましい。増菌培地としては、公知のものを使用することができる。例えば、ノボビオシンあるいはテルル酸カリウム及び／又はセフェキシムを添加したｍＥＣブイヨン、緩衝ペプトン水、又はトリプチケースソイブイヨン等を挙げることができる。
【００２２】
本発明方法によって、例えば、精肉中の大腸菌Ｏ１５７を検査する場合には、最初に、菌体抗原（Ｏ抗原）によりウサギ等を免疫して得た抗血清と磁気粒子とを適当な緩衝液（例えば、ｐＨ９．５のホウ酸緩衝液等）中で混合して抗体を磁気粒子に感作し、感作反応後に磁石で感作磁気粒子を集め、適当な緩衝液（例えば、牛血清アルブミン０．１％を含むｐＨ７．４のリン酸緩衝液等）中に懸濁して、抗体感作磁気粒子懸濁液とする。続いて、前記精肉を２５〜５０ｇ程度に細かく切断し、ブイヨン等を加えて撹拌し、洗い出した液を６〜８時間、３７℃で培養する。その液を濾紙（例えば、東洋濾紙Ｎｏ．３、又はアドバンテック濾紙Ｎｏ．７等）で濾過し、試料液とする。この試料液の一定量（例えば、０．１〜３０ｍｌ）を採取し、例えば、試験管や反応ウェルに加え、そこに前記抗体感作磁気粒子懸濁液を加えて室温で５〜６０分間反応させる。次に、磁石を用い磁気粒子を一定部位（例えば、反応容器の底部等）に集め、上清を吸引除去する。このとき、抗体感作磁気粒子には目的大腸菌のみが吸着し、他の夾雑細菌や食品由来の浮遊物が取り除かれる。集めた粒子を適当量（例えば、５０ｕｌ〜１ｍｌ程度）の緩衝液に再懸濁し、室温で緩やかに回転させながら１〜１０分間反応させ、凝集の有無を判定する。判定した後の磁気粒子は、凝集の有無に関わらず、分離培地に塗抹接種し、培養により大腸菌Ｏ１５７を分離する。続いて、同定工程に移ることができる。
【００２３】
本発明による分析用試薬は、大腸菌Ｏ１５７と特異的に結合する抗体を感作した不溶性粒子を含む。この抗体は、前記と同様にモノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体（抗血清）又はそれらのフラグメントであることができ、大腸菌Ｏ１５７とのみ特異的に結合し、その他の大腸菌や、別の微生物と結合しない抗体（又はそれらのフラグメント）であることが好ましい。また、これらの抗体（又はそれらのフラグメント）は、前記と同様の方法で得ることができ、前記と同様の方法で、前記と同様の不溶性粒子（特には、磁性材料を含む不溶性粒子）に感作させることができる。
【００２４】
本発明による分析用試薬は、適当な液体、例えば、蒸留水、イオン交換水、又は緩衝液中に前記抗体感作不溶性粒子を懸濁させた懸濁液であることができる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、又はグリシン緩衝液を用いることができる。緩衝液には、その他の成分、例えば、防腐剤（アジ化ナトリウム、又はトップサイド等）を含有することができ、更に、分散剤あるいは安定化剤として界面活性剤を含有させることもできる。
前記の抗体感作不溶性粒子における抗体の感作量、懸濁液中に含まれる不溶性粒子の含有量は特には限定されず、抗体の力価や不溶性粒子の種類によって適宜選択することが可能である。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
本実施例では、大腸菌Ｏ１５７含有液体試料を用いて、磁気ビーズ凝集法及び培養法の検出感度を評価した。
（１）培養菌含有試料の調製
大腸菌Ｏ１５７実験室保存株（ＡＴＣＣ４３８８８から継代培養）をトリプチケースソイブイヨン（ＴＳＢ）中で３７℃にて１８時間培養した。この培養液を滅菌生理食塩水で、１０倍ずつ希釈して１０段階（１０^-1〜１０^-9）のシリーズからなる培養菌含有試料（生理食塩水希釈シリーズ）を調製した。なお、別途、上記培養液を滅菌生理食塩水で１０^-1〜１０^-9となるように希釈した各希釈液を調製し、その各希釈液をトリプチケースソイ寒天平板培地で培養し、最高希釈倍率で発育したコロニー数から培養原液の菌数を測定したところ、菌数は１０⁹ｍｌであった。
一方、市販牛ミンチ肉２５ｇをトリプチケースソイブイヨン（ＴＳＢ）２２５ｍｌで洗い出した液を、３７℃にて６時間培養した。その培養液を希釈液として、前記と同様の大腸菌Ｏ１５７培養液の１０段階（１０^-1〜１０^-9）の希釈シリーズ（ミンチ肉洗出液希釈シリーズ）を調製した。
【００２６】
（２）抗体感作磁気ビーズの調製
実験室保存の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株（ＡＴＣＣ４３８８８）をハートインフュージョン寒天培地（ＨＩＡ培地）で３７℃にて２０時間培養した後、生理食塩水に浮遊し、１００℃にて２時間加熱処理して得た加熱菌体抗原を１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、その懸濁液をウサギの耳静脈に投与した。１週間経過する毎に再度同様に免疫し、計４回の免疫操作を行った。免疫開始から５週目に採血して血清を分離し、抗血清を得た。
上記抗血清を、磁気粒子（外径＝２．８μｍ，ダイナル社）１０⁷〜１０⁸個／ｍｌを含むホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）と等量で混合し、３７℃で２４時間回転混和した。磁石で抗体感作磁気粒子を集め、上清を吸引除去し、抗体感作磁気粒子を、牛血清アルブミン０．１％を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で４回洗浄し、更に前記リン酸緩衝液を加えて４℃で一晩放置した。磁気粒子を磁石で集め、上清を吸引除去し、０．０２％アジ化ナトリウムと０．１％牛血清アルブミンとを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、抗体感作磁気粒子懸濁液とした。
【００２７】
（３）検出法
（３ａ）磁気ビーズ凝集法
反応管に抗体感作磁気粒子懸濁液３０μｌをとり、前項（１）で調製した各培養菌含有試料１ｍｌを加え、室温で１０分間、攪袢しながら反応させた。続いて、磁石で磁気粒子を集め、上清を吸引除去した。磁気粒子に、０．０５％ツイーン２０を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌを加え、磁気粒子を再懸濁した後、反応ウェルに移し、再び磁気粒子を集め、上清を吸引除去した後、０．０５％ツイーン２０を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１５０μｌを加えて緩やかに攪袢し、凝集の有無を肉眼で判定した。結果を以下の表１に示す。凝集が認められなかった場合を「−」で示し、凝集が認められた場合には、その程度に応じて３段階で、「＋＋＋」（著しく強い凝集）、「＋＋」（強い凝集）、そして「＋」（普通の凝集）でそれぞれ示す。
【００２８】
【表１】

【００２９】
表１に示すように、被検試料１ｍｌ中に大腸菌Ｏ１５７が１０⁵個以上存在すると、凝集が現れた。一般に、試料中の夾雑菌は、大腸菌Ｏ１５７の検出感度に影響を与えるが、ミンチ肉洗出液希釈シリーズの実験結果から明らかなように、本発明による磁気ビーズ凝集反応においては、夾雑菌が検出感度に影響を与えることはなかった。
【００３０】
（３ｂ）磁気ビーズ培養法
上記凝集反応の判定後に、凝集の有無に関わらず、磁気ビーズ懸濁液５０μｌをセフェキシム・テルル酸カリウム添加ソルビットマッコンキー寒天培地（ＣＴ−ＳＭＡＣ）で分離培養した。
培養菌含有試料が生理食塩水希釈シリーズである場合は、発育した集落の有無によって、大腸菌Ｏ１５７の有無を判定した。
培養菌含有試料がミンチ肉洗出液希釈シリーズである場合は、ＣＴ−ＳＭＡＣでの疑わしい集落について、従来法による培養試験を実施して、大腸菌Ｏ１５７の有無を判定した。すなわち、疑わしい集落を、大腸菌Ｏ１５７因子血清（デンカ生研）を用いスライド凝集反応を行い、凝集した集落をハートインフュージョン寒天培地（ＨＩＡ培地）で純培養し、ＴＳＩ寒天培地でブドウ糖からの酸産生及びガス産生、硫化水素産生、乳糖からの酸産生、及び白糖からの酸産生を判定し、ＬＩＭ確認培地で硫化水素産生及びリシンデカルボキシラーゼの有無を判定し、ＶＰ半流動寒天培地でブドウ糖からのアセトイン（アセチルメチルカルビノール）の産生を判定し、それらの諸性状が大腸菌特有であることを確認し、大腸菌Ｏ１５７の有無を判定した。
結果を以下の表２に示す。表２において、大腸菌Ｏ１５７が確認された場合を「＋」、大腸菌Ｏ１５７が確認されなかった場合を「−」で示す。
【００３１】
【表２】

【００３２】
本発明による磁気ビーズ培養法によれば、被検試料１ｍｌに大腸菌Ｏ１５７を１０個添加した場合でも培養して検出することが可能であった。また、夾雑菌が検出感度に影響を与えることはなかった。
【００３３】
【実施例２】
本実施例では、大腸菌Ｏ１５７実験室保存株で汚染させた牛ミンチ肉を検体として用い、食品における磁気ビーズ凝集法及び培養法の検出感度を評価した。
（１）陽性検体の調製
前記実施例１で使用した大腸菌Ｏ１５７実験室保存株のトリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）培養菌を滅菌生理食塩水で希釈し、その希釈液を１０ｃｆｕ（コロニー形成単位）及び１００ｃｆｕの量で市販の牛ミンチ肉２５ｇに添加し、陽性検体とした。なお、陽性検体をそれぞれ１０例ずつ用意した。
（２）増菌培養
前記陽性検体２５ｇをそれぞれＴＳＢ２２５ｍｌで洗い出し、その洗出液をストマフィルターで濾過し、得られた濾過液を３７℃で６時間培養した。陰性検体として、大腸菌Ｏ１５７で汚染処理を行わなかった市販の牛ミンチ肉２５ｇを用意し、陽性検体と同様にＴＳＢ２２５ｍｌで洗い出し、その洗出液をストマフィルターで濾過し、得られた濾過液を３７℃で６時間培養した。なお、陰性検体もそれぞれ１０例ずつ用意した。
【００３４】
（３）検出法
（３ａ）磁気ビーズ凝集法
前記実施例１の磁気ビーズ凝集法において、培養菌含有試料１ｍｌを用いる代わりに、前項（２）で得られた培養液１０ｍｌを用いること以外は、前記実施例１の磁気ビーズ凝集法と同様の操作を繰り返し、凝集の有無を肉眼で判定した。結果を以下の表３（大腸菌１０ｃｆｕ添加検体の場合）及び表４（大腸菌１００ｃｆｕ添加検体の場合）に示す。表３及び表４において、「無添加」欄は陰性検体の結果であり、「添加」欄は陽性検体の結果である（以下同様）。また、「−」、「＋＋＋」、「＋＋」、及び「＋」は、表１と同じ意味である。なお、「±」は、陰性とは判定できない凝集像が得られることを示す。
（３ｂ）磁気ビーズ培養法
前記実施例１と同様に、上記凝集反応の判定後に、磁気ビーズ懸濁液５０μｌをＣＴ−ＳＭＡＣで分離培養した。続いて、ＣＴ−ＳＭＡＣでの疑わしい集落について、前記実施例１と同様に、従来法による培養試験を実施して、大腸菌Ｏ１５７の有無を判定した。その結果を以下の表３（大腸菌１０ｃｆｕ添加検体の場合）及び表４（大腸菌１００ｃｆｕ添加検体の場合）に示す。大腸菌Ｏ１５７が確認された場合を「＋」、大腸菌Ｏ１５７が確認されなかった場合を「−」で示す。
【００３５】
（３ｃ）従来法による培養試験法
対照試験として、前記の陽性検体及び陰性検体に関し、前記の磁気ビーズ凝集法及び磁気ビーズ培養法を実施せずに、直接に従来法による培養試験を実施して、大腸菌Ｏ１５７の有無を判定した。
すなわち、前項（２）で得られた培養液５０μｌをＣＴ−ＳＭＡＣで分離培養し、疑わしい集落を、大腸菌Ｏ１５７因子血清（デンカ生研）を用いスライド凝集反応を行い、凝集した集落をＨＩＡ培地で純培養し、ＴＳＩ寒天培地でブドウ糖からの酸産生及びガス産生、硫化水素産生、乳糖からの酸産生、及び白糖からの酸産生を判定し、ＬＩＭ確認培地で硫化水素産生及びリシンデカルボキシラーゼの有無を判定し、ＶＰ半流動寒天培地でブドウ糖からのアセトイン（アセチルメチルカルビノール）の産生を判定し、それらの諸性状が大腸菌特有であることを確認し、大腸菌Ｏ１５７の有無を判定した。
結果を以下の表３（大腸菌１０ｃｆｕ添加検体の場合）及び表４（大腸菌１００ｃｆｕ添加検体の場合）の「直接法」の欄に示す。大腸菌Ｏ１５７が確認された場合を「＋」、大腸菌Ｏ１５７が確認されなかった場合を「−」で示す。
【００３６】
【表３】

【００３７】
【表４】

【００３８】
大腸菌１０ｃｆｕを添加して汚染した陽性検体試料（表３参照）では、直接法によって１０例中６例から大腸菌Ｏ１５７を検出することができた。また、磁気ビーズ凝集法でも同等の結果が得られたのに対して、磁気ビーズ培養法によれば、全ての検体から大腸菌Ｏ１５７を検出することができた。
大腸菌１００ｃｆｕを添加して汚染した陽性検体試料（表４参照）では、いずれの方法を用いても、大腸菌Ｏ１５７を検出することができた。
表３の結果から明らかなように、本発明による磁気ビーズ凝集法を用いることにより、検査を実施したその当日に、従来法（検査に３日間必要）による検出結果と同様の検出結果を得ることができる。また、本発明による磁気ビーズ培養法を用いることにより、極めて高感度の検出結果を得ることができる。しかも、そのような高感度の検出結果を得る期間が、従来法よりも１日短縮することができる。すなわち、従来法では、１日目に増菌培養を行い、２日目に分離培養を行い、３日目に確認培養を行い、そして４日目に判定を行っていた。これに対して、本発明の磁気ビーズ培養法では、１日目に約６時間の増菌培養を行うと共に、磁気ビーズ集菌と、分離培養とを行い、２日目に確認培養、そして３日目に判定を行うことができる。
【００３９】
【実施例３】
本実施例では、大腸菌Ｏ１５７実験室保存株で汚染させた健常便を検体として用い、臨床材料における磁気ビーズ凝集法及び培養法の検出感度を評価した。
（１）陽性検体の調製
前記実施例１で使用した大腸菌Ｏ１５７実験室保存株をＴＳＢにて３７℃で１８時間培養し、その培養液を滅菌生理食塩水で希釈し、希釈液を用意した。一方、健常人便を１０％（ｗ／ｖ）の割合で滅菌生理食塩水に浮遊させ、その便浮遊液を濾過（アドバンテック濾紙Ｎｏ．７）した。得られた濾過液１ｍｌに、前記の希釈液を、便溶液１ｍｌあたり０、１０、１０²、１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶、及び１０⁷となるように添加して、陽性検体とした。
【００４０】
（２）検出法
（２ａ）磁気ビーズ凝集法
前記実施例１の磁気ビーズ凝集法において、培養菌含有試料１ｍｌを用いる代わりに、前項（１）で得られた陽性検体１ｍｌを用いること以外は、前記実施例１の磁気ビーズ凝集法と同様の操作を繰り返し、凝集の有無を肉眼で判定した。結果を以下の表５に示す。表５において、「−」、「＋＋＋」、「＋＋」、及び「＋」は、表１と同じ意味である。
（２ｂ）磁気ビーズ培養法
前記実施例１と同様に、上記凝集反応の判定後に、磁気ビーズ懸濁液５０μｌをＣＴ−ＳＭＡＣで分離培養した。続いて、ＣＴ−ＳＭＡＣでの疑わしい集落（コロニー）５つを釣菌し、前記実施例１と同様に、従来法による培養試験を実施して、大腸菌Ｏ１５７であるか否かを判定した。その結果を以下の表５に示す。表５において、分母（５）は釣菌した集落（コロニー）数であり、分子は、大腸菌Ｏ１５７であることを同定した集落（コロニー）数である。
（２ｃ）従来法による直接培養法
対照試験（直接法）として、前項（２ａ）の磁気ビーズ凝集法を実施せずに、前項（１）で得られた陽性検体をそのまま直接にＣＴ−ＳＭＡＣで分離培養し、ＣＴ−ＳＭＡＣでの疑わしい集落（コロニー）５つを釣菌し、前記実施例１と同様に、従来法による培養試験を実施して、大腸菌Ｏ１５７であるか否かを判定した。その結果を以下の表５に示す。表５において、分母（５）は釣菌した集落（コロニー）数であり、分子は、大腸菌Ｏ１５７であることを同定した集落（コロニー）数である。
【００４１】
【表５】

【００４２】
従来法では、試料１ｍｌ中に大腸菌Ｏ１５７が１０００個以上存在する場合に、検出可能であるのに対して、本発明による磁気ビーズ培養法ではその１／１０量の菌数でも検出可能であった。しかも、分離培養での集落（コロニー）選択が容易になる。また、本発明による磁気ビーズ凝集法で検出可能な菌数は１０⁵〜１０⁷個であった。
【００４３】
【発明の効果】
大腸菌Ｏ１５７の従来の検査法においては、迅速検査法と、培養検査法とがあり、迅速検査法は、比較的早く結果が得られるものの、大腸菌Ｏ１５７が存在するか否かのみを検査するだけであり、培養検査法は、長時間が必要であった。しかもそれらは、全く別々の独立した操作が必要であった。
これに対して、本発明によれば、第１の分析方法の凝集によって迅速な検査が可能になり、しかもその凝集体をそのまま使用して第２の分析方法を実施して大腸菌Ｏ１５７を培養して単離することができる。また、第１の分析方法の分析感度は、従来の培養検査法の分析感度と同程度であり、第２の分析方法の分析感度は、従来の培養検査法の分析感度よりも極めて高感度である。更に、第２の分析方法の所要時間は、従来の培養検査法の所要時間よりも短くなる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for analyzing E. coli O157 (also referred to as enterohemorrhagic E. coli O157 or Shiga toxin-producing E. coli O157) and a reagent for analysis. The present invention is useful for the analysis of E. coli O157 in clinical materials or foods.
[0002]
[Prior art]
When bacterial food poisoning occurs, detection or isolation of bacteria causing food poisoning is indispensable for determining a treatment policy and elucidating an infection route, and is also important for preventing food poisoning. In order to know that a specific bacterium is present in a food sample, several methods have been performed.
There are two main directions for testing bacteria in food samples and clinical materials such as stool and urine. One of them is a rapid test method for confirming whether or not a specific bacterium is present in a sample using DNA or an immunological technique. Examples of the rapid test method include a PCR method in which specific DNA of a specific bacterium is amplified and detected, an ELISA method in which an antigen specific to the specific bacterium is immunologically detected, and immunochromatography.
The other is a method for isolating and identifying causative bacteria by culturing using a medium suitable for the target bacteria. In other words, the specimen sample is directly separated (or from a culture solution that has been enriched in advance), a suspicious colony is selected from the colony in the separation culture, and the fungus is collected. It is a method for identifying a bacterium based on its target and / or serological characteristics.
[0003]
The examination of E. coli O157 is also performed by a method according to the above-described two kinds of bacteria examination. For example, in the case of using a bacterial separation method, a biochemical test is further performed on a separation culture using a separation medium that selectively grows Escherichia coli O157 and a colony that may be a target microorganism (ie, Escherichia coli O157). And / or operation which determines a microbial species based on a serological test is performed. In addition, in the case of a small amount of pathogen contamination, it is necessary to perform preculture in a liquid medium before separation culture. In general, it takes a long time of 5 days or more to determine the species after performing this pre-culture.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Even in the rapid inspection method described above, there is a bacteria detection test utilizing an antigen-antibody reaction, and the presence of the target bacteria can be confirmed, but the target bacteria cannot be isolated. Properties such as tolerance cannot be analyzed in detail.
In addition, when searching for E. coli O157 by a conventional general bacterial test using culture, it is difficult to separate E. coli O157 from a sample sample containing a large number of contaminating bacteria. An operation to identify a potential settlement by biochemical or serological properties is necessary. The time required to complete the inspection through these operations requires at least 3 to 4 days or more.
Therefore, there is a need for an analytical means that can obtain test results more rapidly and can isolate bacteria even in clinical materials and particularly in the case of foods that require freshness. The present invention aims to solve these problems.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The above problem is in accordance with the present invention.An analysis method for E. coli O157,
(1) a step of pre-culturing a test sample;
(2) a step of bringing the magnetic particles sensitized with an antibody that specifically binds to E. coli O157 into contact with the precultured test sample;
(3) analyzing the degree of aggregation of the magnetic particles caused by the antigen-antibody reaction;
(4) A step of separating the magnetic particles by capturing them using magnetism;
(5) placing the separated magnetic particles in a culture state in a separation medium; and
(6) It can be solved by an analysis method for Escherichia coli O157, which includes a step of identifying whether or not the settlement formed after the step is Escherichia coli O157.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The test sample in the present invention is not particularly limited as long as it is a sample that may contain Escherichia coli O157. In particular, it is a clinical material or food, or a processed product thereof. The clinical material is clinical material from animals such as humans or domestic animals, such as feces, urine, blood, or organs or tissues of animals such as domestic animals. The treated product of these clinical materials is a product obtained by concentration, filtration or enrichment treatment, such as a centrifugal precipitate or an enrichment culture solution. Examples of food include milk (for example, milk) or dairy products (for example, butter and cheese), meat or meat products (for example, ham), seafood or seafood products (for example, canned foods), frozen foods, Daily foods (for example, lunch boxes), drinking water, feed and feed products, confectionery, or spices can be mentioned. These processed food products are concentrated, filtered or enriched, for example, centrifugal precipitates or enriched cultures.
According to the present invention, analysis of E. coli O157 in the test sample, that is, detection of the presence of E. coli O157, or quantitative (particularly semi-quantitative) measurement of E. coli O157 can be performed.
[0007]
When the test sample is a liquid, it can be used in the method of the present invention as it is or after being diluted with an appropriate aqueous solvent (for example, water, physiological saline or buffer) as necessary. When the test sample is solid, E. coli O157 contained in the test sample is washed out with an appropriate aqueous solvent (for example, water, physiological saline or buffer), and the washed solution can be used.
[0008]
The “antibody that specifically binds to E. coli O157” used in the present invention can be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody (antiserum). The antibody that specifically binds to E. coli O157 is preferably an antibody that specifically binds only to E. coli O157 and does not bind to other E. coli or other microorganisms. In the case of a monoclonal antibody, one type of monoclonal antibody can be used, or two or more types of monoclonal antibodies can also be used.
The above-mentioned antibody can be used, for example, in mammals (eg, mice, rats, or rabbits) using as an immunogen the heated cells obtained by heat-treating any strain of E. coli O157 (eg, 100 ° C. for 2 hours). The hybridoma established by fusing spleen cells and myeloma cells collected from mammals (eg, mice, rats, or rabbits) that have been immunized to obtain antisera (polyclonal antibodies) or similarly immunized is used. The monoclonal antibody can be obtained by inoculating intraperitoneally, or the culture supernatant of the hybridoma can be purified.
In the present invention, an antibody fragment containing an antigen binding site against E. coli O157 can also be used. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ', and F (ab').₂Or Fv. These fragments can be obtained by digesting the antibody with conventional methods, for example with proteases, followed by purification of the fragments.
[0009]
As the insoluble particles to be bound to the antibody, any insoluble carrier used in the aggregation method can be used. Examples of insoluble particles include erythrocytes, natural polymers, synthetic polymers, or glass, and latex particles are preferred. Those particle sizes are not particularly limited as long as they are in a range applicable to the aggregation reaction (for example, 0.01 to 10 μm).
[0010]
The insoluble particles used in the present invention preferably have the property of easily separating the aggregates after forming the aggregates by an antigen-antibody reaction. For example, when the insoluble particles contain a magnetic material (in particular, a ferromagnetic material such as iron), the aggregates can be separated using magnetism. Many insoluble particles (that is, magnetic particles) containing a magnetic material are already commercially available, and can be appropriately selected and used.
[0011]
Methods for sensitizing the antibody obtained above to insoluble particles are known, for example, a physical adsorption method using a hydrophobic bond, or a covalent bond using an activated tosyl group, carboxyl group, amino group, or thiol group. The chemical bonding method can be used. The particles sensitized with the antibody can be stored in an appropriate solvent such as a phosphate buffer.
[0012]
The first method for analyzing E. coli O157 according to the present invention is as follows:
(1) a step of contacting an insoluble particle sensitized with an antibody specifically binding to Escherichia coli O157 with a test sample; and
(2) including a step of analyzing the degree of aggregation caused by the antigen-antibody reaction.
The contact step is carried out under conditions that allow antigen-antibody reaction with E. coli O157 and the antibody that may be contained in the test sample, resulting in aggregation.
[0013]
When E. coli O157 is present in the test sample, aggregation occurs due to the antigen-antibody reaction. Subsequently, in the analysis step, the degree of aggregation is detected visually or by optical means. At this time, in order to further clarify the aggregation, it is preferable to isolate particles aggregated by the antigen-antibody reaction from the reaction system. When magnetic particles are used as insoluble particles, the particles are captured (collected) with a magnet, and the appropriate solution (for example, phosphate buffer, Good buffer, glycine buffer, or Tris buffer, etc.) is used. Aggregation) can be detected. When latex such as polystyrene is used as the insoluble particles, the aggregated particles can be collected by filtration or centrifugation, and the aggregated particles can be resuspended in an appropriate solution to detect aggregation.
[0014]
The second method for analyzing E. coli O157 according to the present invention is as follows:
(1) a step of contacting an insoluble particle sensitized with an antibody that specifically binds to E. coli O157 with a test sample;
(2) a step of separating an aggregate produced by an antigen-antibody reaction;
(3) A step of culturing the obtained aggregate in a separation medium to identify E. coli O157 is included.
The contact step can be performed in the same manner as the first analysis method.
[0015]
When E. coli O157 is present in the test sample, an aggregate is formed by the antigen-antibody reaction. Subsequently, in the separation step, the aggregate is separated from the reaction system. The separation can be performed by a magnet when magnetic particles are used, and by filtration or centrifugation when latex such as polystyrene is used, as described above. In the second analysis method according to the present invention, the aggregate obtained by the first analysis method can be separated as it is and used in the next identification step of E. coli O157.
[0016]
In the second analysis method according to the present invention, the identification step of E. coli O157 is performed subsequent to the separation step. This identification process generally consists of
(A) culturing the obtained aggregate in a separation medium,
(B) a step of selecting a colony that may be a colony of E. coli O157 in the separation medium;
(C) including the step of determining whether the microorganism of the village is E. coli O157 based on the biochemical and / or serological properties of the selected village.
[0017]
In the separation culture step (a), it is preferable to use a separation medium effective for selective growth of E. coli O157. Such a separation medium has been conventionally used when searching for E. coli O157 by a general bacterial test using culture. Also in the method of the present invention, those known separation media such as McConkey agar medium, Sorbit McConkey agar medium (SMAC), Cefexim potassium tellurate-sorbit McConkey agar medium (CT-SMAC) and the like can be used. It is preferable to add an antibiotic such as cephexime (C) or novobiocin (N) or potassium tellurate (T) to the separation medium, since the selectivity is enhanced and fishing is facilitated.
[0018]
In the village selection step (b), a colony that may be a colony of E. coli O157 is selected from the colonies formed in the separation medium. The colony of E. coli O157 has a characteristic of being white and can be selected from that point.
[0019]
Subsequently, in the determination step (c), for example, the selected microorganism is picked and grown on various media, and confirmation culture is performed to determine whether the microorganism of the colony is E. coli O157. To do. For example, acid production from glucose and gas production, hydrogen sulfide production, acid production from lactose, and acid production from sucrose can be determined by TSI (Triple Sugar Iron), and by LIM agar medium (Lysine Iron Agar) The presence or absence of hydrogen sulfide production and lysine decarboxylase can be determined, and the production of acetoin (acetylmethylcarbinol) from glucose can be determined by VP (Voges-Proskauer) semi-fluid medium. Furthermore, serotype classification can be confirmed using E. coli serotype factor serum.
[0020]
As described above, in the second analysis method according to the present invention, the operations of the separation culture step (a), the village selection step (b), and the determination step (c) are performed by a general bacterial test using culture. Although there is no substantial difference from the operation of the conventional method when searching for E. coli O157, the sample used in the separation culture step (a) is the test sample itself in the conventional method, whereas according to the present invention. The second analysis method is different in that an aggregate formed by an antigen-antibody reaction between an insoluble particle and a test sample and separated from the antigen-antibody reaction system is used.
[0021]
In the sample used in the present invention, the contamination degree of Escherichia coli O157 is very small compared to the contamination degree of general bacteria (for example, other coliforms) or may be damaged. In the first and second analysis methods described above, before performing the contact step (1), in some cases, a test sample is pre-enriched and cultured in a suitable pre-enrichment medium by a known method, It is preferable to increase the number of Escherichia coli O157 cells in the test sample to increase the detection sensitivity. Examples of the pre-enrichment medium for E. coli O157 include trypticase soy broth (TSB), normal broth, lactose broth, buffered peptone water, or mEC broth.
In addition, if necessary, after pre-enrichment, further increase the number of cells of Escherichia coli O157 in the test sample by increasing the number of cells in a suitable selective enrichment medium by a known method, thereby increasing the detection sensitivity. It is preferable to do so. A known medium can be used as the enrichment medium. For example, mEC bouillon to which novobiocin or potassium tellurate and / or cephexime is added, buffered peptone water, or trypticase soy bouillon can be used.
[0022]
For example, when examining E. coli O157 in meat by the method of the present invention, first, antiserum obtained by immunizing a rabbit or the like with a bacterial cell antigen (O antigen) and magnetic particles are mixed with an appropriate buffer ( For example, the antibody is sensitized to magnetic particles by mixing in a borate buffer solution of pH 9.5, and the sensitized magnetic particles are collected with a magnet after the sensitization reaction, and an appropriate buffer solution (for example, bovine serum albumin 0) is used. The suspension is suspended in a phosphate buffer solution (pH 7.4 containing 1%) to obtain an antibody-sensitized magnetic particle suspension. Subsequently, the meat is finely cut into about 25 to 50 g, bouillon or the like is added and stirred, and the washed liquid is cultured at 37 ° C. for 6 to 8 hours. The liquid is filtered through a filter paper (for example, Toyo filter paper No. 3 or Advantech filter paper No. 7) to obtain a sample solution. A certain amount (for example, 0.1 to 30 ml) of this sample solution is collected and added to, for example, a test tube or a reaction well, and the antibody-sensitized magnetic particle suspension is added thereto and reacted at room temperature for 5 to 60 minutes. Let Next, using a magnet, the magnetic particles are collected at a certain site (for example, the bottom of the reaction vessel) and the supernatant is removed by suction. At this time, only the target Escherichia coli is adsorbed on the antibody-sensitized magnetic particles, and other contaminant bacteria and food-derived suspended matters are removed. The collected particles are resuspended in an appropriate amount (for example, about 50 ul to 1 ml) of a buffer solution and reacted for 1 to 10 minutes while gently rotating at room temperature to determine the presence or absence of aggregation. Regardless of the presence or absence of aggregation, the magnetic particles after the determination are smeared on a separation medium, and E. coli O157 is separated by culture. Then, it can move to an identification process.
[0023]
The analytical reagent according to the present invention contains insoluble particles sensitized with an antibody that specifically binds to E. coli O157. This antibody can be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody (antiserum) or a fragment thereof as described above, and specifically binds only to E. coli O157 and does not bind to other E. coli or other microorganisms ( Or a fragment thereof). These antibodies (or fragments thereof) can be obtained by the same method as described above, and the same method as described above is used to detect insoluble particles (particularly, insoluble particles containing a magnetic material) as described above. You can make it.
[0024]
The analytical reagent according to the present invention can be a suspension in which the antibody-sensitized insoluble particles are suspended in a suitable liquid, for example, distilled water, ion-exchanged water, or a buffer solution. As the buffer solution, for example, a phosphate buffer solution, a Tris buffer solution, or a glycine buffer solution can be used. The buffer solution may contain other components such as a preservative (sodium azide, topside, etc.), and may further contain a surfactant as a dispersant or stabilizer.
The amount of antibody sensitization in the antibody-sensitized insoluble particles and the content of insoluble particles contained in the suspension are not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the antibody titer and the type of insoluble particles. is there.
[0025]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
[Example 1]
In this example, the detection sensitivity of the magnetic bead aggregation method and the culture method was evaluated using a liquid sample containing E. coli O157.
(1) Preparation of culture-containing sample
E. coli O157 laboratory stock (subcultured from ATCC 43888) was cultured in trypticase soy bouillon (TSB) at 37 ° C. for 18 hours. This culture solution is diluted 10-fold with sterilized physiological saline 10 times (10^-1-10^-9) -Cultured sample (series diluted with physiological saline) was prepared. Separately, the above culture solution was sterilized with sterile saline.^-1-10^-9Each diluted solution was prepared, and each diluted solution was cultured on trypticase soy agar plate medium. The number of bacteria in the culture stock solution was measured from the number of colonies grown at the highest dilution ratio. 10⁹ml.
On the other hand, a solution obtained by washing 25 g of commercially available beef minced meat with 225 ml of trypticase soy bouillon (TSB) was cultured at 37 ° C. for 6 hours. Using the culture broth as a diluent, 10 steps (10^-1-10^-9) Dilution series (minced meat wash liquor dilution series).
[0026]
(2) Preparation of antibody-sensitized magnetic beads
E. coli O157: H7 strain (ATCC 43888) stored in the laboratory was cultured for 20 hours at 37 ° C. on a heart infusion agar medium (HIA medium), then suspended in physiological saline and heat-treated at 100 ° C. for 2 hours. The obtained heated cell antigen was suspended in 1/15 M phosphate buffer (pH 7.4), and the suspension was administered to the rabbit ear vein. Immunization was repeated in the same manner every time one week passed, and a total of four immunizations were performed. Blood was collected 5 weeks after the start of immunization, and the serum was separated to obtain antiserum.
The antiserum was mixed with magnetic particles (outer diameter = 2.8 μm, Dynal) 10⁷-10⁸A borate buffer solution (pH 9.5) containing pcs / ml was mixed in an equal amount and mixed by rotation at 37 ° C. for 24 hours. The antibody-sensitized magnetic particles are collected with a magnet, the supernatant is removed by suction, and the antibody-sensitized magnetic particles are washed four times with a phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.1% bovine serum albumin. Phosphate buffer was added and left overnight at 4 ° C. The magnetic particles are collected with a magnet, the supernatant is removed by suction, suspended in a phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.02% sodium azide and 0.1% bovine serum albumin, and antibody-sensitized magnetic particles A suspension was formed.
[0027]
(3) Detection method
(3a) Magnetic bead aggregation method
To the reaction tube, 30 μl of the antibody-sensitized magnetic particle suspension was added, 1 ml of each culture-containing sample prepared in the preceding item (1) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 10 minutes with stirring. Subsequently, magnetic particles were collected with a magnet, and the supernatant was removed by suction. Add 1 ml of 0.01 M phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.05% Tween 20 to the magnetic particles, resuspend the magnetic particles, transfer to the reaction well, collect the magnetic particles again, collect the supernatant Then, 150 μl of 0.01M phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.05% Tween 20 was added and gently stirred, and the presence or absence of aggregation was judged with the naked eye. The results are shown in Table 1 below. The case where aggregation is not recognized is indicated by “−”, and when aggregation is recognized, “++” (remarkably strong aggregation), “++” (strong aggregation), and in three stages depending on the degree, Indicated by “+” (ordinary aggregation).
[0028]
[Table 1]

[0029]
As shown in Table 1, 10 ml of E. coli O157 was contained in 1 ml of the test sample.^FiveWhen more than one existed, aggregation appeared. In general, contaminants in the sample affect the detection sensitivity of Escherichia coli O157. As is clear from the experimental results of the minced meat washing solution dilution series, contaminants are detected in the magnetic bead agglutination reaction according to the present invention. There was no effect on sensitivity.
[0030]
(3b) Magnetic bead culture method
After the determination of the agglutination reaction, 50 μl of the magnetic bead suspension was separated and cultured on Cepoxime / potassium tellurate-added Sorbit McConkey agar medium (CT-SMAC) regardless of the presence or absence of aggregation.
When the culture-containing sample was a physiological saline dilution series, the presence or absence of E. coli O157 was determined based on the presence or absence of the grown colonies.
When the culture-containing sample was a minced meat washing liquid dilution series, a culturing test by a conventional method was carried out for a suspected colony in CT-SMAC to determine the presence or absence of E. coli O157. That is, a suspicious colony was subjected to a slide agglutination reaction using Escherichia coli O157 factor serum (Denka Biotechnology), the aggregated colony was purely cultured on a heart infusion agar medium (HIA medium), and acid production from glucose and TSI agar medium. Gas production, hydrogen sulfide production, acid production from lactose and acid production from sucrose are judged, hydrogen sulfide production and the presence or absence of lysine decarboxylase are judged in LIM confirmation medium, and acetoin from glucose in VP semi-fluid agar medium The production of (acetylmethylcarbinol) was determined, and it was confirmed that these properties were unique to E. coli, and the presence or absence of E. coli O157 was determined.
The results are shown in Table 2 below. In Table 2, the case where E. coli O157 is confirmed is indicated by “+”, and the case where E. coli O157 is not confirmed is indicated by “−”.
[0031]
[Table 2]

[0032]
According to the magnetic bead culture method of the present invention, even when 10 E. coli O157 were added to 1 ml of a test sample, it was possible to culture and detect. In addition, contamination bacteria did not affect the detection sensitivity.
[0033]
[Example 2]
In this example, beef minced meat contaminated with E. coli O157 laboratory-preserved strain was used as a specimen, and the detection sensitivity of the magnetic bead aggregation method and the culture method in food was evaluated.
(1) Preparation of positive specimen
The trypticase soy broth (TSB) culture of the E. coli O157 laboratory stock used in Example 1 was diluted with sterile physiological saline, and the diluted solution was commercially available in amounts of 10 cfu (colony forming unit) and 100 cfu. It was added to 25 g of beef minced meat and used as a positive specimen. Ten positive specimens were prepared for each.
(2) Enrichment culture
Each 25 g of the positive specimen was washed out with 225 ml of TSB, the washed solution was filtered with a stoma filter, and the obtained filtrate was cultured at 37 ° C. for 6 hours. As a negative sample, 25 g of commercially available beef minced meat that was not contaminated with Escherichia coli O157 was prepared, washed with 225 ml of TSB in the same manner as the positive sample, and the washed solution was filtered with a stoma filter. Culturing was carried out for 6 hours at 0 ° C. In addition, 10 negative samples were prepared for each.
[0034]
(3) Detection method
(3a) Magnetic bead aggregation method
In the magnetic bead agglutination method of Example 1, the same procedure as in the magnetic bead agglutination method of Example 1 was used, except that 10 ml of the culture solution obtained in (2) above was used instead of using 1 ml of the culture-containing sample. The operation was repeated and the presence or absence of aggregation was judged with the naked eye. The results are shown in Table 3 below (in the case of E. coli 10 cfu added sample) and Table 4 (in the case of E. coli 100 cfu added sample). In Tables 3 and 4, the “no addition” column is the result of the negative sample, and the “addition” column is the result of the positive sample (the same applies hereinafter). “−”, “++++”, “++”, and “+” have the same meaning as in Table 1. “±” indicates that an aggregated image that cannot be determined as negative is obtained.
(3b) Magnetic bead culture method
In the same manner as in Example 1, 50 μl of the magnetic bead suspension was separated and cultured with CT-SMAC after the determination of the aggregation reaction. Subsequently, the suspicious settlement in CT-SMAC was subjected to a culture test by a conventional method in the same manner as in Example 1 to determine the presence or absence of E. coli O157. The results are shown in Table 3 below (in the case of a specimen added with E. coli 10 cfu) and Table 4 (in the case of a specimen added with E. coli 100 cfu). The case where E. coli O157 is confirmed is indicated by “+”, and the case where E. coli O157 is not confirmed is indicated by “−”.
[0035]
(3c) Conventional culture test method
As a control test, the presence or absence of Escherichia coli O157 was determined on the positive sample and the negative sample by directly performing a conventional culture test without performing the magnetic bead aggregation method and the magnetic bead culture method.
That is, 50 μl of the culture solution obtained in (2) above was separated and cultured with CT-SMAC, the suspected colony was subjected to a slide agglutination reaction using Escherichia coli O157 factor serum (Denka Seiken), and the aggregated colony was purified with HIA medium. Cultivate and determine acid production from glucose and gas production, hydrogen sulfide production, acid production from lactose, and acid production from sucrose on TSI agar medium, and hydrogen sulfide production and presence or absence of lysine decarboxylase on LIM confirmation medium Then, the production of acetoin (acetylmethyl carbinol) from glucose was determined on a VP semi-fluid agar medium, and it was confirmed that these properties were unique to E. coli, and the presence or absence of E. coli O157 was determined.
The results are shown in the “Direct Method” column of Table 3 (in the case of E. coli 10 cfu added sample) and Table 4 (in the case of E. coli 100 cfu added sample). The case where E. coli O157 is confirmed is indicated by “+”, and the case where E. coli O157 is not confirmed is indicated by “−”.
[0036]
[Table 3]

[0037]
[Table 4]

[0038]
In a positive specimen sample (see Table 3) contaminated with E. coli 10cfu, E. coli O157 could be detected from 6 out of 10 cases by the direct method. In addition, the same results were obtained by the magnetic bead aggregation method, whereas E. coli O157 could be detected from all specimens by the magnetic bead culture method.
In a positive specimen sample (see Table 4) contaminated with E. coli 100cfu, E. coli O157 could be detected using either method.
As is apparent from the results in Table 3, by using the magnetic bead agglutination method according to the present invention, the detection result similar to the detection result by the conventional method (3 days required for the inspection) is obtained on the day of the inspection. Can do. In addition, by using the magnetic bead culture method according to the present invention, extremely sensitive detection results can be obtained. Moreover, the period for obtaining such a highly sensitive detection result can be shortened by one day compared with the conventional method. That is, in the conventional method, the enrichment culture was performed on the first day, the separation culture was performed on the second day, the confirmation culture was performed on the third day, and the determination was performed on the fourth day. In contrast, in the magnetic bead culture method of the present invention, enrichment culture for about 6 hours is performed on the first day, magnetic bead collection and separation culture are performed, confirmation culture is performed on the second day, and 3 Judgment can be made on the day.
[0039]
[Example 3]
In this example, healthy stool contaminated with E. coli O157 laboratory stock was used as a specimen, and the detection sensitivity of the magnetic bead aggregation method and the culture method in clinical materials was evaluated.
(1) Preparation of positive specimen
The E. coli O157 laboratory-preserved strain used in Example 1 was cultured at 37 ° C. for 18 hours in TSB, and the culture was diluted with sterile physiological saline to prepare a diluted solution. On the other hand, healthy human stool was suspended in sterile physiological saline at a rate of 10% (w / v), and the stool suspension was filtered (Advantech filter paper No. 7). 1 ml of the obtained filtrate is mixed with the above-mentioned diluted solution at 0, 10, 10 per ml of stool solution.²10^Three10^Four10^Five10⁶And 10⁷Was added to obtain a positive sample.
[0040]
(2) Detection method
(2a) Magnetic bead aggregation method
In the magnetic bead agglutination method of Example 1, the same procedure as in the magnetic bead agglutination method of Example 1 was used except that 1 ml of the positive specimen obtained in (1) above was used instead of 1 ml of the culture-containing sample. The operation was repeated and the presence or absence of aggregation was judged with the naked eye. The results are shown in Table 5 below. In Table 5, “−”, “++++”, “++”, and “+” have the same meaning as in Table 1.
(2b) Magnetic bead culture method
In the same manner as in Example 1, 50 μl of the magnetic bead suspension was separated and cultured with CT-SMAC after the determination of the aggregation reaction. Subsequently, five suspicious settlements (colonies) in CT-SMAC were fished, and a culture test by a conventional method was carried out in the same manner as in Example 1 to determine whether or not it was Escherichia coli O157. The results are shown in Table 5 below. In Table 5, the denominator (5) is the number of colonies colonized, and the numerator is the number of colonies identified as E. coli O157.
(2c) Direct culture method by conventional method
As a control test (direct method), the positive specimen obtained in the previous item (1) was directly separated and cultured in CT-SMAC without performing the magnetic bead aggregation method in the previous item (2a). Five suspicious settlements (colonies) were fished, and a culture test according to a conventional method was carried out in the same manner as in Example 1 to determine whether or not it was Escherichia coli O157. The results are shown in Table 5 below. In Table 5, the denominator (5) is the number of colonies colonized, and the numerator is the number of colonies identified as E. coli O157.
[0041]
[Table 5]

[0042]
In the conventional method, it can be detected when 1000 or more E. coli O157 are present in 1 ml of the sample, whereas the magnetic bead culture method according to the present invention can detect even 1/10 of the number of bacteria. . Moreover, it becomes easy to select colonies in the separation culture. In addition, the number of bacteria that can be detected by the magnetic bead aggregation method according to the present invention is 10^Five-10⁷It was a piece.
[0043]
【The invention's effect】
In the conventional test method of E. coli O157, there are a rapid test method and a culture test method. Although the quick test method can obtain a result relatively quickly, it only tests whether E. coli O157 exists. Yes, the culture test required a long time. Moreover, they required a completely separate and independent operation.
On the other hand, according to the present invention, rapid examination is possible by the aggregation of the first analysis method, and the second analysis method is carried out using the aggregate as it is to culture E. coli O157. Can be isolated. The analysis sensitivity of the first analysis method is comparable to the analysis sensitivity of the conventional culture inspection method, and the analysis sensitivity of the second analysis method is extremely higher than the analysis sensitivity of the conventional culture inspection method. is there. Furthermore, the time required for the second analysis method is shorter than the time required for the conventional culture inspection method.

Claims

An analysis method for E. coli O157,
(1) a step of pre-culturing a test sample;
(2) a step of bringing the magnetic particles sensitized with an antibody that specifically binds to E. coli O157 into contact with the precultured test sample;
(3) analyzing the degree of aggregation of the magnetic particles caused by the antigen-antibody reaction;
(4) A step of separating the magnetic particles by capturing them using magnetism;
(5) placing the separated magnetic particles in a culture state in a separation medium; and
(6) A step of identifying whether the village formed after the step is Escherichia coli O157 or not
A method for analyzing E. coli O157.