JPWO2002065131A1

JPWO2002065131A1 - Methods and reagents for detecting Vibrio bacteria and antibodies used therefor

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Publication number: JPWO2002065131A1
Application number: JP2002564598A
Authority: JP
Inventors: 辰巳　宏樹; 宏樹辰巳; 福田　賢; 賢福田; 純男篠田; 伸一三好; 陽子前原
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 2001-02-09
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2004-09-09
Also published as: WO2002065131A1

Abstract

本発明は、（１）ビブリオ属細菌由来のレシチン依存性ヘモリシンと反応し得る抗体を、試料と接触させて抗原抗体反応を生じさせる第１工程及び（２）第１工程で得られる反応生成物を検出する第２工程、を含むことを特徴とする、試料中のビブリオ属細菌の検出法、ビブリオ属細菌由来のレシチン依存性ヘモリシンと反応し得る抗体を含むことを特徴とする、ビブリオ属細菌の検出用試薬及び上記検出法及び検出用試薬に使用されるビブリオ属細菌由来のレシチン依存性ヘモリシンと反応し得る抗体を提供する。The present invention relates to (1) a first step in which an antibody capable of reacting with lecithin-dependent hemolysin derived from a bacterium of the genus Vibrio is brought into contact with a sample to cause an antigen-antibody reaction, and (2) a reaction product obtained in the first step. A method for detecting a Vibrio bacterium in a sample, comprising an antibody capable of reacting with lecithin-dependent hemolysin derived from a Vibrio bacterium, comprising the steps of: And an antibody capable of reacting with lecithin-dependent hemolysin derived from a bacterium of the genus Vibrio used in the detection method and the detection reagent.

Description

技術分野
本発明は、ビブリオ属細菌の検出法、およびビブリオ属細菌の検出用試薬ならびにこれらに使用する抗体に関する。
背景技術
ビブリオ属細菌の一種である腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、日本において夏期の魚介類による食中毒の大半の原因菌である。腸炎ビブリオが感染した生の魚介類はもとより、２次汚染された調理食品および飲料水も、食中毒の原因食品となる。安全性を評価するため、飲食品中の腸炎ビブリオの検査は必要不可欠である。
腸炎ビブリオの検出法としては、以下の方法が知られていた（食品衛生検査指針微生物編（社団法人日本食品衛生協会、１９９０年）による）。
まず、魚介類や飲食品等の試料を、食塩ポリミキシンブイヨン（日水社製）で３７℃、１８時間培養後、ＴＣＢＳ寒天培地（日水社製など）に塗抹し、３７℃、１８時間培養する。腸炎ビブリオはＴＣＢＳ寒天培地上で直径２ｍｍ内外の白糖非分解性の緑青色の集落を作る。しかし、白糖非分解のビブリオ属の細菌が、腸炎ビブリオと同色の類似した集落を形成する場合が多々あるので、それらと識別をするため１次確認テストおよび場合によっては２次確認テストが必要となる。
１次確認テストでは、以下の６種類の試験を用いて、括弧内に記載の性質を調べる
（１）１％ＮａＣｌ添加普通寒天（オキシダーゼ）
（２）１％ＮａＣｌ添加ＴＳＩ寒天（硫化水素、ガス、ブドウ糖発酵）
（３）１％ＮａＣｌ添加ＳＩＭ培地（インドール、インドールピルビン酸、運動性）
（４）１％ＮａＣｌ添加リシン培地（リシン・デカルボキシラーゼ）
（５）１％ＮａＣｌ添加ＶＰ半流動培地（Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ）
（６）０，３，８，１０％ＮａＣｌ添加ブイヨン（発育）
以上のテストで確認できない場合には、さらに次の４種の試験を用いる２次確認テストを行い、同定する。
（７）Ｏ−ニトロフェニル β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ，ＯＮＰＧ）
（８）１％ＮａＣｌ添加オルニチン培地
（９）１％ＮａＣｌ添加アルギニン培地
（１０）１％ＮａＣｌ添加糖分解テスト用培地（アラビノース、マルトース、イノシット、キシロース、サリシン、マンニット、マンノース、白糖）
以上の腸炎ビブリオ検出の確認テストは、多数の試験からなるため、手間、培地費用および時間がかかる。このため、これらの確認テストに代わる迅速、簡便、正確なテストが望まれていた。
レシチン依存性ヘモリシン（ＬｅｃｉｔｈｉｎＤｅｐｅｎｄｅｎｔＨｅｍｏｌｙｓｉｎ（ＬＤＨ））（別名ＴｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅＨｅｍｏｌｙｓｉｎ）は、易熱性の溶血毒で、ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＡ２）活性およびリソホスホリパーゼ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｐａｓｅ）活性を持つ蛋白質である（Ｓｈｉｎｏｄａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３７，２７０５（１９９１））。水口と谷口は、コロニーハイブリダイゼーション及びサザンブロットハイブリダイゼーションにより、調べた１２１株全ての腸炎ビブリオにＬＤＨ遺伝子が存在し、腸炎ビブリオ以外のビブリオ属細菌２２株にはＬＤＨ遺伝子が存在しないことを報告している（三輪谷俊夫、大橋誠監修、腸炎ビブリオ第ＩＩＩ集、１３１ページ、近代出版）。
近年、ベジ等（Ｂｅｊ，ｅｔ．ａｌ．）（Ｊ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，３６，２１５（１９９９））およびマッカーシー等（ＭｃＣａｒｔｈｙ，ｅｔ．ａｌ．）（Ｌｅｔｔ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ．２８，６６（１９９９））はそれぞれ、ＰＣＲ法、ＤＮＡハイブリダイゼーション法により、腸炎ビブリオからＬＤＨ遺伝子が検出され、非腸炎ビブリオからＬＤＨ遺伝子が検出されないことを示し、ＬＤＨ遺伝子が腸炎ビブリオの検出マーカーとして有用なことを示した。
しかしながら、ＬＤＨ遺伝子を検出マーカーとするハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法には、以下のような欠点が存在する。
・微生物のＤＮＡを扱うため操作が煩雑で時間を要する。
・特別の機器が必要
・類似のＤＮＡ配列を持つ非腸炎ビブリオと反応する可能性がある。
本発明は、従来技術の課題を解決できる、迅速、簡便かつ正確なビブリオ属細菌の検出法および検出用試薬の提供を目的とする。
本発明者らは上記課題について検討した結果、ビブリオ属細菌由来のＬＤＨと反応し得る抗体を用いて試料中のビブリオ属細菌が生産するＬＤＨを検出することにより、迅速、簡便かつ正確にビブリオ属細菌（特に、腸炎ビブリオまたはＶｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）が検出できることを見出し、本発明を完成した。
発明の要旨
即ち、本発明は、下記の方法および物を提供するものである。
１．（１）ビブリオ属細菌由来のＬＤＨと反応し得る抗体を、試料と接触させて抗原抗体反応を生じさせる第１工程、及び
（２）第１工程で得られる反応生成物を検出する第２工程
の工程を含むことを特徴とする、試料中のビブリオ属細菌の検出法。
２．第１工程に先立ち、試料を、ビブリオ属細菌用選択培地で培養することを特徴とする、上記１に記載のビブリオ属細菌の検出法。
３．抗体が、ビブリオ属細菌由来のＬＤＨを抗原として動物に免疫して得られる抗体である、上記１または２に記載の検出法。
４．ビブリオ属細菌が、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）またはビブリオ・アルギノリティカス（Ｖｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）である、上記１から３のいずれかに記載の検出法。
５．ビブリオ属細菌由来のＬＤＨと反応し得る抗体を含むことを特徴とする、ビブリオ属細菌の検出用試薬。
６．ビブリオ属細菌が、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）またはビブリオ・アルギノリティカス（Ｖｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）である、上記５に記載の検出用試薬。
７．ビブリオ属細菌由来のレシチン依存性ヘモリシンと反応し得る抗体。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について詳細に説明する。
１．ビブリオ属細菌の検出法
本発明のビブリオ属細菌の検出法は、以下に説明する第１および第２工程を含むことを特徴とする。
第１工程では、ビブリオ属細菌由来のＬＤＨと反応し得る抗体（以下「抗ＬＤＨ抗体」という）を、試料と接触させて抗原抗体反応を生じさせる。試料中にＬＤＨを生産するビブリオ属細菌が存在している場合、抗ＬＤＨ抗体と、細菌が生産するＬＤＨとが抗原抗体反応を起こす。
第２工程では、第１工程で得られる反応生成物を検出する。以上により試料中のビブリオ属細菌（特に腸炎ビブリオまたはＶｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）の検出が可能となる。
本発明において、抗原抗体反応（第１工程）および反応生成物の検出（第２工程）の方法は、特に限定されず、免疫反応を利用する公知の方法が利用可能である。本発明で利用可能な方法としては、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオ免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、電気化学免疫測定法、免疫凝集法、免疫クロマト法などが挙げられる。
本発明では、第１工程に先立ち、試料を培地で培養し、ビブリオ属細菌の菌数を増加させることが好ましい。これにより、ビブリオ属細菌の検出感度の向上が可能となる。培地は、ビブリオ属細菌が増殖可能なものであればとくに限定されないが、ビブリオ属細菌用選択培地を使用することが特に好ましい。選択培地を用いることにより、試料中のビブリオ属細菌を濃縮することができる。
実施例に示す通り、本発明の検出方法を用いると、試料中に存在する腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）またはビブリオ・アルギノリティカス（Ｖｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）を、迅速、簡便かつ正確に検出することができる。また、本発明の検出方法は、抗ＬＤＨ抗体と反応し得る他のビブリオ属細菌の検出法としても使用可能である。
本発明において、試料は特に限定されないが、例えば、生及び加工した魚介類、飲食品、海水、河川水、食器・調理器具等への付着物である。試料が液状の場合は、メンブランフィルターなどで試料を濾過し、フィルター上に微生物を捕捉したものを試料としても良い。また、食品や調理器具などに付着したビブリオ属細菌を検出する場合は、食品や調理器具などを、食塩水や緩衝液などをしみ込ませた綿棒でふき取り、得られた付着物を適当な緩衝液や培地に懸濁したものを試料としてもよい。さらに、ストマッカー等を用いて食品から微生物を抽出し、得られた抽出物を試料としてもよい。
「抗ＬＤＨ抗体」は、ビブリオ属細菌由来のＬＤＨと反応し得る限り、どのようなものであってもよく、例えば、ビブリオ属細菌由来のＬＤＨを抗原として動物に免疫して得られる抗体が使用できる。また、抗ＬＤＨ抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも使用可能である。さらに、抗ＬＤＨ抗体の遺伝子を用いて調製した組換え抗ＬＤＨ抗体も使用可能である。
ポリクローナル抗体は感作された動物の血清から得ることができる。感作は抗原であるＬＤＨ蛋白質を、哺乳類動物、好ましくはウサギ、山羊及び牛に注射することにより行うことができる。通常、最初の注射に続き、追加抗原注射を行い、免疫応答を最大にした後、感作された動物の血清を採取する。モノクローナル抗体は、細胞融合によって抗ＬＤＨ抗体の産生能を有するハイブリドーマを作出することにより得られる。
ＬＤＨ蛋白質は腸炎ビブリオの培養物から精製できる。また、腸炎ビブリオのＬＤＨ遺伝子はすでに公知のものである（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，１，４２５，（１９８６））。該遺伝子を、適当な宿主細胞−ベクター系にて生産させることにより、ＬＤＨ蛋白質が生産され、これを精製することによりＬＤＨ蛋白質が単離できる。ＬＤＨ蛋白質を抗原として適当な動物を感作することにより、抗ＬＤＨ抗体が得られる。抗ＬＤＨ抗体の遺伝子を用いて大腸菌などの微生物を宿主として組換え抗体（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎＦｖやＦａｂ）を作製することができる。
抗原抗体反応（第１工程）および反応生成物の検出（第２工程）の方法に応じて、抗ＬＤＨ抗体は、化学修飾されていてもよい。第１および第２工程において、ビオチンとストレプトアビジンの反応を利用する方法を採用する場合、抗ＬＤＨ抗体は、公知の方法でビオチン化される。
以下に、本発明のビブリオ属細菌の検出法の具体例として、試料を培地で培養した後に、抗ＬＤＨ抗体を試料と接触させて抗原抗体反応を生じさせ、次いで反応生成物を検出する方法を説明する。
まず、試料を調製し、これを固体培地または液体培地に接種した後、適当な条件で培養する。魚介類や飲食品はそのまま試料とし、直接培地に接種できる。飲食品等から微生物を抽出して得られた抽出物を試料としてもよい。また、食品や調理器具に付着した微生物を綿棒でふき取り、次いで該微生物を培地に移して培養してもよい。メンブランフィルターなどで液体試料を濾過し、フィルター上に微生物を捕捉した場合は、該フィルターを固体培地上に設置するか、捕捉物を液体培地に懸濁することができる。
培地としてはビブリオ属細菌が増殖できるものであればとくに限定されないが、ビブリオ属細菌用選択培地を使用することにより、試料中のビブリオ属細菌を濃縮することができる。選択培地としては、ＴＣＢＳ寒天培地、ビブリオ寒天培地、食塩ポリミキシンブイヨン、アルカリ性ペプトン水（以上日水社製など）、１．５％食塩添加ハート・インフュージョン・ブロス（ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎＢｒｏｔｈ，以下ＨＩＢと略す、Ｄｉｆｃｏ社製）等が使用できる。選択培地を用いる場合、試料を直接、寒天培地に塗布しても良いし、また、試料を液体培地で培養しても良い。また、液体培養の後に寒天培地に塗布しても良い。なお、液体培地を用いる場合は、最確法で定量試験を行うこともできる。
ビブリオ属細菌の培養温度は１５℃〜４５℃、好ましくは３０℃〜４０℃程度である。培養時は通気しても密閉してもよく、また、液体培地を使用する場合は、必要により振とうしてもよい。
培養後に、抗ＬＤＨ抗体を培養物と接触させて抗原抗体反応を生じさせ（第１工程）、次いで反応生成物を検出する（第２工程）。これらの工程により試料中のＬＤＨが検出され、結果として、ＬＤＨを生産するビブリオ属細菌が検出される。
ＬＤＨは、培養物全体、培養上清、菌体、菌体の破砕物のいずれから検出しても良い。菌体の破砕方法はＬＤＨの抗体認識構造を変化させない方法であればいかなる方法でも良く、例えば、超音波処理、溶菌酵素または溶菌剤による処理、フレンチプレス等の方法が使用できる。また、培養物を一旦、ＴＣＢＳ寒天培地などの腸炎ビブリオの選択培地上で培養し、腸炎ビブリオであると疑われる集落から、直接または培地で培養後にＬＤＨを検出してもよい。
抗原抗体反応と反応生成物の検出は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオ免疫測定法（ＲＩＡ）、電気化学免疫測定法、免疫凝集法、免疫クロマト法等を用いて実施可能である。
例えば、酵素免疫測定法を採用する場合は、サンドイッチ法と競合法がある。サンドイッチ法の場合は、担体にまず抗ＬＤＨ抗体を結合させ、そののちサンプルと接触させ、次いで標識抗ＬＤＨ抗体（例えば、抗体−酵素の複合体、ビオチン化抗体）と接触させる。また、必要があれば最後に第２の標識物（例えば、ビオチン化ルシフェラーゼ−ストレプトアビジン複合体）と接触させる。標識物または第２標識物を、酵素反応により測定することによりＬＤＨが検出できる。
競合法の場合は担体に先ず抗ＬＤＨ抗体を結合させ、そののちサンプルと標識ＬＤＨ（例えば、ＬＤＨ−酵素の複合体、ビオチン化ＬＤＨ）を添加し、必要があれば第２の標識物（例えば、ビオチン化ルシフェラーゼ−ストレプトアビジン複合体）と接触させ、標識物または第２標識物を酵素反応により測定することにより、ＬＤＨが検出できる。
また、免疫凝集法を採用する場合は、まず、ラテックス粒子や金コロイドなどに抗ＬＤＨ抗体を感作させ、次いで試料と接触させる。その後に、反応生成物である凝集を検出することにより、ＬＤＨが検出できる。
以上の方法により、試料中のビブリオ属細菌、特に腸炎ビブリオまたはビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）が検出可能であるが、必要に応じて、更に公知の方法により確認試験を行う。
なお、試料中に腸炎ビブリオおよびビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）が共に存在する場合、本発明の検出方法では、両者が同時に検出される。腸炎ビブリオとビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）のいずれか１種のみを検出する必要がある場合には、抗原抗体反応の実施に先立って、両者を分別するために選択培地を用いて培養する。例えば、ビブリオ属細菌の選択培地であるＴＣＢＳ寒天培地（日水）上では、白糖非分解性である腸炎ビブリオは緑青色の集落を形成するが、白糖分解性であるビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）は黄色の集落を形成することが知られている。ＴＣＢＳ寒天培地を選択培地とすることにより、両者の識別が可能である。
２．ビブリオ属細菌の検出用試薬
本発明の検出用試薬は、抗ＬＤＨ抗体を含むことを特徴とする。該試薬は、本発明のビブリオ属細菌の検出法に使用される。該試薬には、抗ＬＤＨ抗体の他、ビブリオ属細菌の検出法に必要な他の成分、あるいは各反応工程を安定に進行させるための成分（防腐剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤等）が含まれていてもよい。本発明の検出用試薬の形状は、溶液状または固体状であってもよい。溶液状の試薬とは例えば、抗ＬＤＨ抗体を適当な溶媒に溶解した溶液である。また、固体状の試薬とは例えば、免疫測定用のウエルやラテックス粒子等の固相担体に、抗ＬＤＨ抗体を固定したものである。
実施例
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
実施例１
（１）ＬＤＨの調製
腸炎ビブリオのＬＤＨ遺伝子がクローニングされている大腸菌Ｃ６００ｐＨＬ５９１株（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，１，４２５（１９８６））を、ＨＩＢ５ｍＬにて３７℃で８時間振とう培養し、５００ｍＬのＨＩＢに接種後３７℃にて１６時間振とう培養した。７０００×ｇ、４０分間遠心分離を行い、菌体を回収した。この菌体からニュー（Ｎｅｕ）とネッペル（Ｎｅｐｐｅｌ）の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４０，３６８５（１９６５））に従い浸透圧ショック法によりペリプラズム分画を得た。
これに６５％飽和（４２０ｇ／Ｌ）となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で一晩放置後、７０００×ｇ、４０分間遠心分離して沈殿を回収した。得られた沈殿を０．１５ＭＮａＣｌ／２０ｍＭヒスチジン−塩酸（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）緩衝液（ｐＨ５．５）３ｍＬに溶かし、同緩衝液で一晩透析した後、遠心分離により不溶物を取り除いた。上清を０．１５ＭＮａＣｌ／２０ｍＭヒスチジン−塩酸（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化した陰イオン交換体ＭｏｎｏＱＨＲ５／５カラムに添加し、高速液体クロマトグラフィーを行った。すなわち、同緩衝液で未吸着蛋白質を洗浄後、０．９ＭＮａＣｌを含む同緩衝液で溶出し、ウマ赤血球溶血活性（すなわちＬＤＨ活性）のある画分を回収した。ウマ赤血球溶血活性は、サンプルを５０μｇ／ｍＬのレシチン存在下で０．５％ウマ赤血球と３７℃で２時間反応させて溶血の有無を確認した。対照としてレシチン非存在下での反応を行い、その差を判定した。
（２）抗ＬＤＨ抗体の作製、精製およびビオチン化
（１）で得られたＬＤＨを、完全フロインドアジュバンド
（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ）と混合してウサギに免疫し、抗ＬＤＨ抗血清を調製した。ついで、ＭａｂＴｒａｐＧＩＩキット（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて抗ＬＤＨ抗血清から抗ＬＤＨ抗体の精製を行い、ＰＤ−１０カラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて脱塩を行った。蛋白濃度はＢＣＡプロテインアッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社製）により測定した。１．５ｍＬの抗血清から、３．５ｍＬ（１．１ｍｇ／ｍＬ）の抗ＬＤＨ抗体（ポリクロナール抗体）を精製した。
精製抗体１ｍＬに、モル比で１０倍のビオチン化試薬（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ，Ｐｉｅｒｃｅ社製）を添加し、氷中にて２時間放置してビオチン化を行った。その後、ＰＤ−１０カラムにて未反応のビオチン化試薬を取り除いた。上記により得られたビオチン化抗ＬＤＨ抗体を、本発明の検出用試薬の１つとした。
（３）細菌を含む試料の調製
腸炎ビブリオ８株、腸炎ビブリオ以外のビブリオ属の細菌２２株（表１、表２）を、１．５％食塩を添加したＨＩＢ寒天に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。単一集落を１．５％食塩を含むＨＩＢ液体培地２ｍＬにて５時間振とう培養し、培養物１ｍＬをマイクロチューブに移し、遠心分離により培養上清を得た。該培養上清を試料とした。
ビブリオ属以外の細菌２１株（表３）はＨＩＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。単一集落をＨＩＢ液体培地２ｍＬにて５時間振とう培養し、培養物１ｍＬをマイクロチューブに移し、遠心分離により培養上清を得た。該培養上清を試料とした。
（４）酵素免疫測定法によるビブリオ属細菌の検査
抗ＬＤＨ抗体を１０μｇ／ｍＬの濃度で含む６０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）を調製し、１００μＬずつを、Ｃ８・マキシ・ブレイクアパート・ヌンク−イミュノ・モジュール（Ｃ８ＭＡＸＩＢＲＥＡＫＡＰＡＲＴＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯＭＯＤＵＬＥ、Ｎｕｎｃ社製）のウエルに添加し、４℃にて１８時間放置し、抗ＬＤＨ抗体のウエルへの吸着を行った。抗体が吸着したウエルを、本発明のビブリオ属細菌の検出用試薬の１つとした。
０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水（ＴｒｉｓＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（以下「ＴＢＳ」と略す））で３回洗浄後、３μＬの２５％ブロックエース（大日本製薬社製）を添加し、３７℃にて１時間放置し、ウエルのブロッキングを行った。０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、（３）で調整した試料用１００μＬまたは対照としてＨＩＢ１００μＬを添加し、３７℃で１時間放置し、固相抗体と試料中のＬＤＨの反応を行った。
０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、１０％ブロックエースで３，０００倍に希釈したビオチン化抗ＬＤＨ抗体（（２）で調製したもの）を１００μＬ添加し、３７℃で１時間放置し、固相抗体に結合したＬＤＨとビオチン化抗ＬＤＨ抗体の反応を行った。０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、生物発光測定用試薬キット（商品名：ＩｎｔｅｌｉｔｅＡＢ、キッコーマン社製）のビオチン化ルシフェラーゼ−ストレプトアビジン複合体溶液（複合体）１００μＬを添加し、３７℃にて３０分放置し、ビオチン化抗ＬＤＨ抗体と複合体との反応を行った。０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、Ｃ８・マキシ・ブレイクアパート・ヌンク−イミュノ・モジュール（Ｃ８ＭＡＸＩＢＲＥＡＫＡＰＡＲＴＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯＭＯＤＵＬＥ、Ｎｕｎｃ社製）のウエルを切り離し、発光測光用チューブ（ルミチューブ，キッコーマン社製）に装着した。インテライトＡＢ（ＩｎｔｅｌｉｔｅＡＢ）の発光基質溶液１００μＬを添加し、発光検出器ルミテスターＫ２１０（キッコーマン社製）で発光量を測定した。対照であるＨＩＢの２倍以上の発光値を示した試料を陽性、２倍未満の発光量を示した試料を陰性と判定した。
その結果、すべての腸炎ビブリオおよびビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）が陽性となり、一方、これら２種以外のビブリオ属の細菌および非ビブリオ属の細菌はすべて陰性となった（表１〜３）。すなわち、抗ＬＤＨ抗体を用いた酵素免疫測定法により、用いた細菌の中から、腸炎ビブリオとビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）の２種のみが特異的に検出できることが示された。
実施例２ラテックス凝集法によるビブリオ属細菌の検出
ラテックス凝集法によるビブリオ属細菌の検出は、以下の方法により実施可能である。
まず、ラテックス粒子への抗体の感作を行う。ラテックス粒子としてポリビーズ・ポリスチレン・マイクロスフェアーズ（Ｐｏｌｙｂｅａｄｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，直径１μｍ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．製）を用いる。ラテックス粒子２．５％懸濁液０．５ｍＬをマイクロチューブに入れ、１ｍＬのホウ酸緩衝液（０．１ＭＢｏｒａｔｅ，ｐＨ８．５）を加え、混濁後、遠心分離によりラテックス粒子を回収する。これをホウ酸緩衝液１ｍＬに再懸濁して遠心分離する操作を２回繰り返したのち、１ｍＬのホウ酸緩衝液に懸濁する。実施例１（２）で得られた抗ＬＤＨ抗体を２５μｇ／ｍＬとなるように加え、室温にて１６時間、２０ｒｐｍの振とう下で放置する。
遠心分離によりラテックス粒子を回収した後、１ｍＬの１％牛血清アルブミン入りのホウ酸緩衝液に懸濁し、室温にて２０ｒｐｍの振とう下で３０分間放置する。この操作を更に２回繰り返した後、遠心分離によりラテックス粒子を回収し、１ｍＬの貯蔵緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム，１５０ｍＭＮａＣｌ，１％ＢＳＡ，５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．１％ＮａＮ_３，ｐＨ７．４）に懸濁する。上記で得られる、抗ＬＤＨ抗体を感作させたラテックス粒子は本発明の検出用試薬の１つである。
実施例１（３）で調製した試料および上述の抗ＬＤＨ抗体を感作させたラテックス粒子を希釈液（０．５％牛血清アルブミンと０．１％ＮａＮ_３を含むリン酸塩緩衝食塩水）にてそれぞれ１０倍希釈を行う。希釈した試料のそれぞれ２５μＬずつをＶ型マイクロプレート（コースター社製）の各ウエルに滴下する。ついで、希釈したラテックス粒子２５μＬずつをその上に滴下し、マイクロプレート用ミキサーで振とう攪拌した後、室温にて１８時間静置し、各ウエルの凝集を観察する。
腸炎ビブリオおよびビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）の培養上清はラテックス凝集を起こすが、その他の培養上清はラテックス凝集を起こさない。すなわち、抗ＬＤＨ抗体を感作させたラテック粒子を用いることにより、腸炎ビブリオおよびビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ，ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉ−ｃｕｓ）を効率よく検出することができる。
実施例３選択培養の後に抗原抗体反応を実施する方法
上述の酵素免疫測定法およびラテックス凝集法では、ＬＤＨを生産する腸炎ビブリオおよびビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）のみを検出することが可能である。腸炎ビブリオは食中毒の原因となり食品衛生上管理を必要とする細菌であるが、ビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉ−ｃｕｓ）は食中毒の原因とはならないため、両者を区別することが望ましい。
ビブリオ属細菌の選択培地であるＴＣＢＳ寒天培地（日水社製）上では白糖非分解性である腸炎ビブリオは緑青色の集落を形成するが、白糖分解性であるビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）は黄色の集落を形成することが知られている。このため、両者の識別が容易である。そこで、実施例１（４）で使用したビブリオ属細菌および非ビブリオ属細菌の、ＴＣＢＳ寒天培地上での集落の形状を調べた（表１〜３）。
１．５％食塩を添加したＨＩＢ培地（ビブリオ属細菌）またはＨＩＢ培地（非ビブリオ属細菌）２ｍＬでそれぞれの株を３７℃、２４時間培養した後、ＴＣＢＳ寒天培地に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。ＴＣＢＳ寒天培地上での成育の有無および集落の色を観察した。ＴＣＢＳ寒天培地上では、用いた８株すべての腸炎ビブリオが緑青色の集落を形成し、用いた３株すべてのビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）が黄色の集落を形成した（表１）。腸炎ビブリオとビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）以外のビブリオ属細菌の大部分はＴＣＢＳ寒天培地上で成育し、緑青色または黄色の集落を形成した（表１、表２）。用いた全ての非ビブリオ属細菌は、ＴＣＢＳ寒天培地上では成育しないかまたは成育しても著しく小さい集落しか形成せず、腸炎ビブリオやビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）とは容易に識別可能であった（表３）。
ＴＣＢＳ寒天培地で成育したビブリオ属細菌の単一集落を、１．５％食塩を含むＨＩＢ液体培地２ｍＬに懸濁し、３７℃にて６時間培養した後、培養物１ｍＬをマイクロチューブに移し、遠心分離により培養上清を調製した。この培養上清を実施例１（４）記載の免疫測定法により検査したところ、腸炎ビブリオおよびビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）は陽性となり、これらの株以外はすべて陰性であった。また、上記の腸炎ビブリオおよびビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）の選択培養は、実施例２記載のラテックス凝集法に先立って実施することも可能である。
ＴＣＢＳ寒天上での選択培養を行なった後に、抗ＬＤＨ抗体を用いた検出法を実施することにより腸炎ビブリオとビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）をそれぞれ同定することが可能であることが示された。

産業上の利用可能性
本発明により、ビブリオ属細菌由来のＬＤＨと反応し得る抗体を用いて試料中のビブリオ属細菌が生産するＬＤＨを検出することにより、迅速、簡便かつ正確にビブリオ属細菌（特に、腸炎ビブリオまたはＶｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）が検出できることが示された。また、本発明により、ビブリオ属細菌由来のＬＤＨと反応し得る抗体を含むことを特徴とする、ビブリオ属細菌の検出用試薬が提供された。
食品衛生検査指針による従来の方法では、選択寒天培地上の腸炎ビブリオと疑わしい集落を同定する場合、１次確認テスト（６種類）に１日、２次確認テスト（４種類）に１日、合計で２日（１０種類の試験）必要であった。
これに対し、実施例１および３記載の酵素免疫測定法では、選択寒天培地上の集落から１種類の試験でその日のうちに、腸炎ビブリオおよびビブリオ・アルギノリティカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）を同定可能である。また、実施例２および３記載のラテックス凝集法では、選択寒天培地上の集落から１種類の試験で翌日に同定可能である。本発明の方法を用いることで、従来法より操作が簡便になり、検査時間が１−２日間短縮されることが示された。
本発明は、食品衛生、医療、ビブリオ属細菌の学術研究等の分野において有用である。Technical field
The present invention relates to a method for detecting a bacterium of the genus Vibrio, a reagent for detecting a bacterium of the genus Vibrio, and an antibody used therefor.
Background art
Vibrio parahaemolyticus, a member of the genus Vibrio, is the causative bacterium of food poisoning caused by seafood in summer in Japan. In addition to raw fish and shellfish infected with Vibrio parahaemolyticus, cooked food and drinking water contaminated with secondary contamination also become food-causing foods. Testing for Vibrio parahaemolyticus in foods and drinks is essential to assess safety.
The following method has been known as a method for detecting Vibrio parahaemolyticus (according to Food Sanitation Inspection Guideline Microorganisms (Japan Food Hygiene Association, 1990)).
First, a sample of seafood, food and drink, etc. is cultured in saline polymyxin broth (manufactured by Nissui) at 37 ° C. for 18 hours, and then spread on a TCBS agar medium (manufactured by Nissui) and cultured at 37 ° C. for 18 hours. I do. Vibrio parahaemolyticus forms a non-sucrose non-degradable green-blue colony of about 2 mm in diameter on TCBS agar medium. However, in many cases, vibrio bacteria that are not degraded by sucrose form similar colonies of the same color as Vibrio parahaemolyticus, so that a primary confirmation test and, in some cases, a secondary confirmation test are required to distinguish them from each other. Become.
In the primary confirmation test, the properties described in parentheses are examined using the following six types of tests.
(1) 1% NaCl added ordinary agar (oxidase)
(2) 1% NaCl added TSI agar (hydrogen sulfide, gas, glucose fermentation)
(3) SIM medium supplemented with 1% NaCl (indole, indolepyruvate, motility)
(4) Lysine medium supplemented with 1% NaCl (lysine decarboxylase)
(5) VP semi-fluid medium supplemented with 1% NaCl (Vogues-Proskauer)
(6) Broth with 0,3,8,10% NaCl added (growth)
If the test cannot be confirmed by the above test, a secondary confirmation test using the following four types of tests is further performed and identification is performed.
(7) O-nitrophenyl β-D-galactopyranoside (O-nitrophenyl β-D-galactopyranoside, ONPG)
(8) Ornithine medium supplemented with 1% NaCl
(9) Arginine medium supplemented with 1% NaCl
(10) 1% NaCl-added medium for sugar degradation test (arabinose, maltose, inosit, xylose, salicin, mannitol, mannose, sucrose)
Since the above confirmation test for detection of Vibrio parahaemolyticus consists of a large number of tests, it requires labor, medium cost and time. For this reason, a quick, simple, and accurate test replacing these confirmation tests has been desired.
Lecithin-dependent hemolysin (LDH) (also known as Thermolabile Hemolysin) is a heat-labile hemolysin, and has a phospholipase A2 activity and a lysophospholipase (lysophospoa-protein having a lysophospholipase (lysophospoa) activity). al., J. Gen. Microbiol., 137, 2705 (1991)). Mizuguchi and Taniguchi reported that, by colony hybridization and Southern blot hybridization, the LDH gene was present in Vibrio parahaemolyticus in all 121 strains examined and the LDH gene was not present in 22 Vibrio spp. Bacteria other than Vibrio parahaemolyticus. (Toshio Miwaya, Makoto Ohashi, Vibrio parahaemolyticus III, p. 131, Modern Publishing).
Recently, Vej et al. (J. Microbiological Methods, 36, 215 (1999)) and McCarthy, et. Al. (Lett, Appl. Micro-biol. 28, 66 (1999)). )) Indicates that the LDH gene is detected from Vibrio parahaemolyticus and not from Vibrio parahaemolyticus by PCR and DNA hybridization, respectively, indicating that the LDH gene is useful as a marker for detecting Vibrio parahaemolyticus. Was.
However, the hybridization method and the PCR method using the LDH gene as a detection marker have the following disadvantages.
-The operation is complicated and takes time to handle the DNA of the microorganism.
・ Special equipment required
-May react with non-enteritis vibrio having a similar DNA sequence.
An object of the present invention is to provide a method for quickly and simply and accurately detecting a bacterium of the genus Vibrio and a reagent for detection capable of solving the problems of the prior art.
The present inventors have studied the above problems, and as a result, detecting LDH produced by Vibrio spp. Bacteria in a sample using an antibody capable of reacting with LDH derived from Vibrio spp. The present inventors have found that bacteria (particularly, Vibrio parahaemolyticus or Vibrio arginolyticus) can be detected, and completed the present invention.
Summary of the invention
That is, the present invention provides the following methods and products.
1. (1) a first step of bringing an antibody capable of reacting with LDH derived from a genus Vibrio into contact with a sample to generate an antigen-antibody reaction, and
(2) Second step of detecting the reaction product obtained in the first step
A method for detecting a bacterium of the genus Vibrio in a sample, comprising the step of:
2. 2. The method for detecting a bacterium of the genus Vibrio according to the above 1, wherein the sample is cultured in a selective medium for a bacterium of the genus Vibrio prior to the first step.
3. 3. The detection method according to the above 1 or 2, wherein the antibody is an antibody obtained by immunizing an animal with LDH derived from a bacterium of the genus Vibrio as an antigen.
4. 4. The detection method according to any one of the above items 1 to 3, wherein the Vibrio bacterium is Vibrio parahaemolyticus or Vibrio arginolyticus.
5. A reagent for detecting a bacterium of the genus Vibrio, comprising an antibody capable of reacting with LDH derived from a bacterium of the genus Vibrio.
6. 6. The detection reagent according to the above item 5, wherein the Vibrio bacterium is Vibrio parahaemolyticus or Vibrio arginolyticus.
7. An antibody capable of reacting with lecithin-dependent hemolysin derived from a bacterium of the genus Vibrio.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Detection of Vibrio spp.
The method for detecting a bacterium of the genus Vibrio according to the present invention is characterized by including first and second steps described below.
In the first step, an antibody capable of reacting with LDH derived from a bacterium of the genus Vibrio (hereinafter referred to as “anti-LDH antibody”) is brought into contact with a sample to generate an antigen-antibody reaction. When a Vibrio bacterium that produces LDH is present in a sample, an anti-LDH antibody and an LDH produced by the bacterium cause an antigen-antibody reaction.
In the second step, the reaction product obtained in the first step is detected. As described above, it is possible to detect bacteria of the genus Vibrio (particularly Vibrio parahaemolyticus or Vibrio arginolyticus) in the sample.
In the present invention, the method of the antigen-antibody reaction (first step) and the method of detecting the reaction product (second step) are not particularly limited, and a known method utilizing an immune reaction can be used. Examples of the method that can be used in the present invention include enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), electrochemical immunoassay, immunoagglutination, and immunochromatography. No.
In the present invention, prior to the first step, the sample is preferably cultured in a medium to increase the number of Vibrio bacteria. This makes it possible to improve the detection sensitivity of bacteria of the genus Vibrio. The medium is not particularly limited as long as it is capable of growing Vibrio bacteria, but it is particularly preferable to use a selective medium for Vibrio bacteria. By using the selection medium, the bacteria of the genus Vibrio in the sample can be concentrated.
As shown in the Examples, the use of the detection method of the present invention enables rapid, simple, and accurate detection of Vibrio parahaemolyticus or Vibrio arginoliticus present in a sample. Further, the detection method of the present invention can also be used as a method for detecting other Vibrio bacteria that can react with an anti-LDH antibody.
In the present invention, the sample is not particularly limited, but is, for example, raw or processed fish and shellfish, food and drink, seawater, river water, dishes and cooking utensils, and the like. When the sample is in a liquid state, the sample may be filtered with a membrane filter or the like, and a sample obtained by capturing microorganisms on the filter may be used as the sample. When detecting Vibrio spp. Attached to food or cooking utensils, wipe the food or cooking utensils with a cotton swab impregnated with saline or buffer solution, and remove the resulting adhering substance with an appropriate buffer solution. Or a suspension in a medium may be used as a sample. Furthermore, microorganisms may be extracted from food using a stomacher or the like, and the resulting extract may be used as a sample.
The “anti-LDH antibody” may be any antibody as long as it can react with LDH derived from Vibrio sp., For example, an antibody obtained by immunizing an animal with LDH derived from Vibrio sp. As an antigen is used. it can. As the anti-LDH antibody, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used. Furthermore, a recombinant anti-LDH antibody prepared using the anti-LDH antibody gene can also be used.
Polyclonal antibodies can be obtained from the sera of sensitized animals. The sensitization can be performed by injecting LDH protein as an antigen into mammals, preferably rabbits, goats and cattle. Normally, the first injection is followed by a booster injection to maximize the immune response before sera from the sensitized animals are collected. A monoclonal antibody can be obtained by producing a hybridoma capable of producing an anti-LDH antibody by cell fusion.
LDH protein can be purified from a culture of Vibrio parahaemolyticus. The LDH gene of Vibrio parahaemolyticus is already known (Taniguchi et al., Microb. Pathog., 1, 425, (1986)). The LDH protein is produced by producing the gene in a suitable host cell-vector system, and the LDH protein can be isolated by purifying the LDH protein. By sensitizing an appropriate animal using the LDH protein as an antigen, an anti-LDH antibody can be obtained. Using the gene of the anti-LDH antibody, a recombinant antibody (single chain Fv or Fab) can be prepared using a microorganism such as Escherichia coli as a host.
The anti-LDH antibody may be chemically modified depending on the method of the antigen-antibody reaction (first step) and the detection of the reaction product (second step). In the case where a method utilizing the reaction between biotin and streptavidin is employed in the first and second steps, the anti-LDH antibody is biotinylated by a known method.
Hereinafter, as a specific example of the method for detecting a Vibrio bacterium of the present invention, a method of culturing a sample in a medium, contacting an anti-LDH antibody with the sample to generate an antigen-antibody reaction, and then detecting a reaction product is described. explain.
First, a sample is prepared, inoculated on a solid medium or a liquid medium, and cultured under appropriate conditions. Fish and shellfish and food and drink can be directly used as samples and inoculated directly into the culture medium. An extract obtained by extracting microorganisms from food or drink may be used as a sample. Alternatively, microorganisms adhering to food or cooking utensils may be wiped off with a cotton swab, and then the microorganisms may be transferred to a culture medium and cultured. When the liquid sample is filtered with a membrane filter or the like and the microorganisms are captured on the filter, the filter can be placed on a solid medium or the captured matter can be suspended in the liquid medium.
The medium is not particularly limited as long as it is capable of growing Vibrio bacteria, but by using a selective medium for Vibrio bacteria, the Vibrio bacteria in the sample can be concentrated. Examples of the selective medium include TCBS agar medium, Vibrio agar medium, salt polymyxin broth, alkaline peptone water (manufactured by Nissui, etc.), and 1.5% salt-added Heart Infusion Broth (hereinafter abbreviated as HIB). , Manufactured by Difco). When a selective medium is used, the sample may be directly applied to an agar medium, or the sample may be cultured in a liquid medium. After the liquid culture, it may be applied to an agar medium. When a liquid medium is used, a quantitative test can be performed by the most probable method.
The culture temperature of the genus Vibrio is 15 ° C to 45 ° C, preferably about 30 ° C to 40 ° C. During the culture, the culture may be aerated or sealed. If a liquid medium is used, the culture may be shaken if necessary.
After the culture, an anti-LDH antibody is brought into contact with the culture to cause an antigen-antibody reaction (first step), and then the reaction product is detected (second step). By these steps, LDH in the sample is detected, and as a result, a genus Vibrio that produces LDH is detected.
LDH may be detected from any of the whole culture, the culture supernatant, the cells, and the disrupted cells. The method of disrupting the cells may be any method as long as the method does not change the antibody recognition structure of LDH, such as ultrasonic treatment, treatment with a lytic enzyme or a lytic agent, and French press. Alternatively, the culture may be cultured once on a selective medium for Vibrio parahaemolyticus such as TCBS agar medium, and LDH may be detected directly from the colony suspected of Vibrio parahaemolyticus or after culturing in the medium.
The antigen-antibody reaction and the detection of the reaction product can be performed using an enzyme immunoassay (EIA), a radioimmunoassay (RIA), an electrochemical immunoassay, an immunoagglutination method, an immunochromatography method, or the like.
For example, when an enzyme immunoassay is employed, there are a sandwich method and a competitive method. In the case of the sandwich method, an anti-LDH antibody is first bound to a carrier, and then contacted with a sample, and then contacted with a labeled anti-LDH antibody (for example, an antibody-enzyme complex, a biotinylated antibody). In addition, if necessary, finally, it is brought into contact with a second label (for example, a biotinylated luciferase-streptavidin complex). LDH can be detected by measuring the label or the second label by an enzyme reaction.
In the case of the competitive method, an anti-LDH antibody is first bound to a carrier, and then a sample and a labeled LDH (eg, an LDH-enzyme complex, biotinylated LDH) are added. If necessary, a second labeled substance (eg, , Biotinylated luciferase-streptavidin complex) and measuring the labeled substance or the second labeled substance by an enzymatic reaction, whereby LDH can be detected.
When the immunoagglutination method is employed, first, an anti-LDH antibody is sensitized to latex particles, colloidal gold, or the like, and then the sample is brought into contact with a sample. Thereafter, LDH can be detected by detecting agglutination, which is a reaction product.
By the above method, Vibrio bacteria in the sample, particularly Vibrio parahaemolyticus or V. alginolitisus, can be detected. However, if necessary, a confirmation test is further performed by a known method.
In the case where both Vibrio parahaemolyticus and V. alginolyticus are present in the sample, both are simultaneously detected in the detection method of the present invention. When it is necessary to detect only one of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio arginolyticus (V. alginolyticus), culture using a selective medium to separate the two prior to performing the antigen-antibody reaction. I do. For example, on a TCBS agar medium (Nissui), which is a selective medium for Vibrio spp., Vibrio parahaemolyticus which is non-degradable by sucrose forms a green-blue colony, whereas Vibrio arginolyticus (V) is degradable by sucrose. .Alginolyticus) is known to form yellow colonies. By using a TCBS agar medium as a selective medium, both can be distinguished.
2. Reagent for detecting Vibrio spp.
The detection reagent of the present invention is characterized by containing an anti-LDH antibody. The reagent is used in the method for detecting a bacterium of the genus Vibrio of the present invention. The reagent includes, in addition to the anti-LDH antibody, other components necessary for the method for detecting Vibrio spp. Bacteria, or components for stably proceeding each reaction step (preservatives, pH adjusters, antioxidants, etc.). May be included. The shape of the detection reagent of the present invention may be a solution or a solid. The reagent in the form of a solution is, for example, a solution in which an anti-LDH antibody is dissolved in an appropriate solvent. Further, the solid reagent is, for example, one in which an anti-LDH antibody is immobilized on a solid support such as a well for immunoassay or latex particles.
Example
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
Example 1
(1) Preparation of LDH
Escherichia coli C600pHL591 strain (Taniguchi et al., Microb. Pathog., 1,425 (1986)) in which the LDH gene of Vibrio parahaemolyticus has been cloned is cultured with shaking in 5 mL of HIB at 37 ° C. for 8 hours, and 500 mL of HIB. After inoculation, the cells were shake-cultured at 37 ° C. for 16 hours. The cells were centrifuged at 7,000 × g for 40 minutes to collect the cells. A periplasmic fraction was obtained from the cells by an osmotic shock method according to the method of Neu and Neppel (J. Biol. Chem., 240, 3685 (1965)).
Ammonium sulfate was added to this so as to obtain a 65% saturation (420 g / L), and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight, and then centrifuged at 7,000 × g for 40 minutes to collect a precipitate. The obtained precipitate was dissolved in 3 mL of a 0.15 M NaCl / 20 mM histidine-HCl buffer (pH 5.5), dialyzed with the same buffer overnight, and centrifuged to remove insolubles. The supernatant was added to an anion exchanger Mono Q HR5 / 5 column equilibrated with a 0.15 M NaCl / 20 mM histidine-HCl buffer (pH 5.5), and high-performance liquid chromatography was performed. That is, after the unadsorbed protein was washed with the same buffer, the protein was eluted with the same buffer containing 0.9 M NaCl, and a fraction having horse erythrocyte hemolytic activity (ie, LDH activity) was collected. The equine erythrocyte hemolytic activity was determined by reacting the sample with 0.5% equine erythrocytes in the presence of 50 μg / mL lecithin at 37 ° C. for 2 hours to determine the presence or absence of hemolysis. As a control, a reaction was performed in the absence of lecithin, and the difference was determined.
(2) Preparation, purification and biotinylation of anti-LDH antibody
LDH obtained in (1) is completely Freund's adjuvant
(Freund's complete adjuvant), and immunized rabbits to prepare anti-LDH antiserum. Next, the anti-LDH antibody was purified from the anti-LDH antiserum using a MabTrap GII kit (Amersham Pharmacia Biotech), and desalted using a PD-10 column (Amersham Pharmacia Biotech). The protein concentration was measured with a BCA protein assay reagent (Pierce). 3.5 mL (1.1 mg / mL) of anti-LDH antibody (polyclonal antibody) was purified from 1.5 mL of antiserum.
A biotinylated reagent (Sulfo-NHS-LC-Biotin, manufactured by Pierce) at a molar ratio of 10 was added to 1 mL of the purified antibody, and the mixture was allowed to stand on ice for 2 hours to perform biotinylation. Then, the unreacted biotinylation reagent was removed with a PD-10 column. The biotinylated anti-LDH antibody obtained above was used as one of the detection reagents of the present invention.
(3) Preparation of sample containing bacteria
Eight strains of Vibrio parahaemolyticus and 22 strains of Vibrio spp. Other than Vibrio parahaemolyticus (Tables 1 and 2) were spread on HIB agar supplemented with 1.5% sodium chloride and cultured at 37 ° C. for 18 hours. The single colony was cultured with shaking in 2 mL of HIB liquid medium containing 1.5% salt for 5 hours, 1 mL of the culture was transferred to a microtube, and a culture supernatant was obtained by centrifugation. The culture supernatant was used as a sample.
21 strains of bacteria other than the genus Vibrio (Table 3) were spread on a HIB agar medium and cultured at 37 ° C for 18 hours. The single colony was cultured with shaking in 2 mL of HIB liquid medium for 5 hours, 1 mL of the culture was transferred to a microtube, and a culture supernatant was obtained by centrifugation. The culture supernatant was used as a sample.
(4) Testing for Vibrio spp. By enzyme immunoassay
A 60 mM sodium carbonate buffer (pH 9.6) containing an anti-LDH antibody at a concentration of 10 μg / mL was prepared, and 100 μL of each was added to C8 MAXI BREAKAPART NUNC-IMMUNO MODULE, (Manufactured by Nunc) and left at 4 ° C. for 18 hours to adsorb the anti-LDH antibody to the wells. The well to which the antibody was adsorbed was used as one of the reagents for detecting Vibrio bacteria of the present invention.
After washing three times with Tris-buffered saline (Tris Buffered Saline (hereinafter abbreviated as “TBS”)) containing 0.1% Tween 20, 3 μL of 25% Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was added, and 37 ° C. For 1 hour to block the wells. After washing three times with TBS containing 0.1% Tween 20, 100 μL of the sample prepared in (3) or 100 μL of HIB as a control was added thereto, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour to remove solid phase antibodies and LDH in the sample. The reaction was performed.
After washing three times with TBS containing 0.1% Tween 20, 100 μL of a biotinylated anti-LDH antibody (prepared with (2)) diluted 3,000-fold with 10% Block Ace was added, and the mixture was added at 37 ° C. The mixture was allowed to stand for 1 hour, and the reaction between the LDH bound to the solid phase antibody and the biotinylated anti-LDH antibody was performed. After washing three times with TBS containing 0.1% Tween 20, 100 μL of a biotinylated luciferase-streptavidin complex solution (complex) of a bioluminescence measurement reagent kit (trade name: IntelliteAB, manufactured by Kikkoman) was added, and The mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes to react the biotinylated anti-LDH antibody with the complex. After washing three times with TBS containing 0.1% Tween 20, the wells of C8 MAXI BREAKAPART NUNC-IMMUNO MODULE, manufactured by Nunc, were cut off, and a tube for emission photometry ( Lumitube, manufactured by Kikkoman Corporation). 100 μL of a luminescent substrate solution of Intellite AB (Intellite AB) was added, and the amount of luminescence was measured with a luminescence detector Lumitester K210 (manufactured by Kikkoman Corporation). A sample showing a luminescence value more than twice that of the control HIB was determined as positive, and a sample showing less than twice the luminescence value was judged negative.
As a result, all Vibrio parahaemolyticus and V. alginolyticus were positive, while all bacteria of the genus Vibrio and non-vibrio other than these two species were negative (Tables 1-3). ). That is, the enzyme immunoassay using an anti-LDH antibody showed that only two species of Vibrio parahaemolyticus and V. alginolyticus could be specifically detected from the bacteria used.
Example 2 Detection of Vibrio spp. By latex agglutination method
Detection of Vibrio spp. Bacteria by the latex agglutination method can be performed by the following method.
First, the antibody is sensitized to the latex particles. Polybead polystyrene microspheres (diameter: 1 μm, manufactured by Polysciences, Inc.) are used as latex particles. 0.5 mL of a 2.5% latex particle suspension is placed in a microtube, and 1 mL of a borate buffer (0.1 M Borate, pH 8.5) is added. After turbidity, latex particles are collected by centrifugation. The operation of resuspending this in 1 mL of borate buffer and centrifuging is repeated twice, and then suspended in 1 mL of borate buffer. The anti-LDH antibody obtained in Example 1 (2) is added to a concentration of 25 μg / mL, and left at room temperature for 16 hours under shaking at 20 rpm.
After collecting the latex particles by centrifugation, the suspension is suspended in 1 mL of borate buffer containing 1% bovine serum albumin and left at room temperature for 30 minutes under shaking at 20 rpm. After repeating this operation twice more, the latex particles were collected by centrifugation, and 1 mL of a storage buffer (20 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, 1% BSA, 5% glycerol, 0.1% NaN) was added. ₃ , PH 7.4). The latex particles sensitized with the anti-LDH antibody obtained above are one of the detection reagents of the present invention.
The sample prepared in Example 1 (3) and the latex particles sensitized with the anti-LDH antibody described above were diluted with a diluent (0.5% bovine serum albumin and 0.1% NaN). ₃ In phosphate-buffered saline containing the same). 25 μL of each diluted sample is dropped into each well of a V-type microplate (manufactured by Coaster). Then, 25 μL of the diluted latex particles are dropped on the mixture, and the mixture is shaken and stirred with a mixer for a microplate, and then left at room temperature for 18 hours to observe aggregation of each well.
Culture supernatants of Vibrio parahaemolyticus and V. alginolyticus cause latex aggregation, whereas other culture supernatants do not. That is, by using the latex particles sensitized with the anti-LDH antibody, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio arginoliticus (V, alginolytic-cus) can be efficiently detected.
Example 3 Method of performing antigen-antibody reaction after selective culture
In the enzyme immunoassay and latex agglutination described above, it is possible to detect only Vibrio parahaemolyticus and V. alginolyticus that produce LDH. Vibrio parahaemolyticus is a bacterium that causes food poisoning and requires food hygiene management. However, V. arginoliticus does not cause food poisoning, so it is desirable to distinguish between the two.
Vibrio parahaemolyticus which is non-degradable by sucrose forms a green-blue colony on a TCBS agar medium (manufactured by Nissui Co., Ltd.) which is a selective medium for bacteria belonging to the genus Vibrio. alginolyticus is known to form yellow colonies. For this reason, both can be easily identified. Therefore, the shapes of the colonies of the genus Vibrio and the non-Vibrio bacteria used in Example 1 (4) on the TCBS agar medium were examined (Tables 1 to 3).
Each strain was cultured at 37 ° C. for 24 hours in 2 mL of HIB medium (Vibrio bacterium) or HIB medium (non-Vibrio bacterium) supplemented with 1.5% salt, and then applied to TCBS agar medium, and then applied at 37 ° C. Incubated for 18 hours. The presence or absence of growth on TCBS agar medium and the color of the colonies were observed. On the TCBS agar medium, all eight strains of Vibrio parahaemolyticus used formed green-blue colonies, and all three strains of Vibrio alginolyticus used formed yellow colonies (Table 1). . The majority of Vibrio spp. Bacteria other than Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus grew on TCBS agar, forming green-blue or yellow colonies (Tables 1 and 2). All the non-Vibrio bacteria used did not grow on TCBS agar medium or formed very small colonies when grown, and were easily distinguishable from Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus (V. alginolyticus). (Table 3).
A single colony of Vibrio spp. Grown on TCBS agar medium was suspended in 2 mL of HIB liquid medium containing 1.5% sodium chloride, cultured at 37 ° C. for 6 hours, and 1 mL of the culture was transferred to a microtube and centrifuged. A culture supernatant was prepared by separation. When the culture supernatant was examined by the immunoassay described in Example 1 (4), Vibrio parahaemolyticus and V. alginolyticus (V. alginolyticus) were positive, and all strains other than these strains were negative. The selective culture of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus (V. alginolyticus) can also be carried out prior to the latex agglutination method described in Example 2.
It is shown that it is possible to identify Vibrio parahaemolyticus and V. alginolyticus by performing a detection method using an anti-LDH antibody after selective culture on TCBS agar. Was done.

Industrial applicability
According to the present invention, by detecting LDH produced by a Vibrio bacterium in a sample using an antibody capable of reacting with LDH derived from a Vibrio bacterium, a Vibrio bacterium (particularly, Vibrio parahaemolyticus or Vibrio) can be detected quickly, simply and accurately. alginoliticus) could be detected. Further, the present invention provides a reagent for detecting Vibrio bacteria, which comprises an antibody capable of reacting with LDH derived from Vibrio bacteria.
According to the conventional method based on the food hygiene inspection guideline, when identifying a suspicious colony with Vibrio parahaemolyticus on a selective agar medium, 1 day for the first confirmation test (6 types) and 1 day for the second confirmation test (4 types) 2 days (10 tests).
On the other hand, in the enzyme immunoassay described in Examples 1 and 3, it is possible to identify Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus in one day from a colony on a selective agar medium in one test. It is. In the latex agglutination method described in Examples 2 and 3, it is possible to identify from the colonies on the selective agar medium by one type of test on the next day. It was shown that the use of the method of the present invention makes the operation simpler than the conventional method, and the inspection time is shortened by 1-2 days.
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful in fields such as food hygiene, medical treatment, and scientific research on bacteria of the genus Vibrio.

Claims

(1) a first step in which an antibody capable of reacting with lecithin-dependent hemolysin derived from a bacterium of the genus Vibrio is brought into contact with a sample to generate an antigen-antibody reaction; and (2) a reaction product obtained in the first step is detected. The second step,
A method for detecting a Vibrio bacterium in a sample, comprising:

2. The method for detecting a bacterium of the genus Vibrio according to claim 1, wherein the sample is cultured in a selective medium for a bacterium of the genus Vibrio prior to the first step.

The detection method according to claim 1, wherein the antibody is an antibody obtained by immunizing an animal with lecithin-dependent hemolysin derived from a genus Vibrio as an antigen.

The detection method according to claim 2, wherein the antibody is an antibody obtained by immunizing an animal with lecithin-dependent hemolysin derived from a bacterium of the genus Vibrio as an antigen.

The detection method according to any one of claims 1 to 4, wherein the Vibrio bacterium is Vibrio parahaemolyticus or Vibrio arginolyticus.

A reagent for detecting a bacterium of the genus Vibrio, comprising an antibody capable of reacting with lecithin-dependent hemolysin derived from a bacterium of the genus Vibrio.

The detection reagent according to claim 6, wherein the bacterium of the genus Vibrio is Vibrio parahaemolyticus or Vibrio arginolitis.

An antibody capable of reacting with lecithin-dependent hemolysin from Vibrio sp.