JP2006017554A - Magnetic bead and microbe detection method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、酵素免疫測定法により微生物を検出するための磁気ビーズ及び微生物検出方法に関する。 The present invention relates to a magnetic bead for detecting microorganisms by enzyme immunoassay and a method for detecting microorganisms.
飲食物がサルモネラ等に汚染されている場合には食中毒等の危険があるため、従来から、サルモネラの検出方法や、検出キットが多数開発されている（例えば、非特許文献１参照。）。
When food and drink are contaminated with Salmonella and the like, there is a risk of food poisoning and the like, so far, many detection methods and detection kits for Salmonella have been developed (see Non-Patent
サルモネラの検出には、酵素免疫測定法等を用いることができる。この酵素免疫測定法は、例えば、ウェルに固定化した抗体とサルモネラの抗原（鞭毛等の抗原）とを反応させ、さらに、酵素で標識された抗体をサルモネラに反応させ、その酵素に対する基質を添加し発色させる。 For detection of Salmonella, an enzyme immunoassay or the like can be used. In this enzyme immunoassay, for example, an antibody immobilized on a well is reacted with an antigen of Salmonella (an antigen such as flagella), an antibody labeled with the enzyme is reacted with Salmonella, and a substrate for the enzyme is added. And develop color.
また、免疫磁気分離法によりサルモネラを検出するためのキットが開発されている。この方法では、鉄粒子を含むポリスチレンビーズにサルモネラの特異抗体を結合させたものを用いて、液体培養したサルモネラを分離することができる。そして、分離したサルモネラを培養する。また、免疫磁気分離法と酵素免疫測定法とを併用して、免疫磁気分離法によりサルモネラを濃縮し、次いで、酵素免疫測定法によりサルモネラを検出する方法も開発されている。
しかし、上記の従来の酵素免疫測定法では、菌捕捉用固相としてプラスチック製ウェルを採用しているため、固定化できる捕捉用抗体量が制限され、検出感度や検出範囲が不十分である。また、検出系に発色法を採用しているため、検出感度が発光法に比べて劣っている。さらに、免疫測定用の抗原を増殖させるために、菌増殖用の培養工程の他に、免疫測定用の培養行程が必要である。 However, since the above conventional enzyme immunoassay employs plastic wells as the solid phase for capturing bacteria, the amount of capture antibody that can be immobilized is limited, and the detection sensitivity and detection range are insufficient. In addition, since the color development method is adopted in the detection system, the detection sensitivity is inferior to the light emission method. Furthermore, in order to proliferate the antigen for immunoassay, a culture process for immunoassay is required in addition to the culture process for bacterial growth.
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、より簡易かつ高感度に微生物の検出を行うための磁気ビーズ及び微生物検出方法を提供することにある。 The present invention has been made to solve the above problems, and an object of the present invention is to provide a magnetic bead and a microorganism detection method for detecting microorganisms more easily and with high sensitivity.
本発明の磁気ビーズは、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化し、前記リガンドと前記レセプタとの特異的な反応により前記微生物を捕捉可能である。これによれば、磁気ビーズに固定化されたリガンドと特異的に反応するレセプタを細胞表層に有する微生物を捕捉できる。 The magnetic beads of the present invention can immobilize a ligand that specifically reacts with a receptor that is a constituent component of a cell surface layer of a microorganism, and can capture the microorganism by a specific reaction between the ligand and the receptor. According to this, it is possible to capture a microorganism having a receptor on the cell surface layer that specifically reacts with a ligand immobilized on the magnetic beads.
この磁気ビーズにおいて、前記リガンドをポリミキシンＢとすることができる。これによれば、ポリミキシンＢと特異的に反応するレセプタを細胞表層に有する微生物を、磁気ビーズにより捕捉できる。 In this magnetic bead, the ligand can be polymyxin B. According to this, microorganisms having a receptor that specifically reacts with polymyxin B on the cell surface can be captured by the magnetic beads.
本発明の微生物検出方法は、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応をするリガンドを固定化した磁気ビーズを用いて、前記リガンドと前記レセプタとの特
異的な反応により前記磁気ビーズにより微生物を捕捉し、前記磁気ビーズを磁気ビーズ分離用磁石により分離し、分離された磁気ビーズに固定化されたリガンドにより捕捉されている微生物を発光法により検出する。これによれば、磁気ビーズに固定化されたリガンドと特異的に反応するレセプタを細胞表層に有する微生物を捕捉し、その微生物を分離できる。そして、その微生物を発光法により検出できる。従って、磁気ビーズと磁気ビーズ分離磁石とを用いることで、より簡単に微生物の捕捉や、未反応物質の除去や洗浄を行うことができるとともに、磁気ビーズを増やすことにより、多量の捕捉体で微生物の捕捉を行うことができる。また、捕捉された微生物の検出を発光法により行うため、発色法等と比べて、より高感度に検出を行うことができる。従って、微生物の検出を、より簡易かつ高感度に行うことができる。
The microorganism detection method of the present invention uses a magnetic bead on which a ligand that specifically reacts with a receptor, which is a constituent component of a cell surface layer of a microorganism, and uses the magnetic reaction by a specific reaction between the ligand and the receptor. Microorganisms are captured by the beads, the magnetic beads are separated by a magnetic bead separating magnet, and the microorganisms captured by the ligand immobilized on the separated magnetic beads are detected by a luminescence method. According to this, it is possible to capture a microorganism having a receptor on the cell surface that specifically reacts with a ligand immobilized on the magnetic beads, and to separate the microorganism. Then, the microorganism can be detected by a luminescence method. Therefore, by using magnetic beads and magnetic bead separation magnets, microorganisms can be captured more easily, unreacted substances can be removed and washed, and by increasing the number of magnetic beads, microorganisms can be captured with a large amount of captured substances. Can be captured. In addition, since the captured microorganisms are detected by the luminescence method, the detection can be performed with higher sensitivity than the color development method or the like. Therefore, microorganisms can be detected more easily and with high sensitivity.
この微生物検出方法において、前記発光法は、前記微生物が有する抗原に特異的に反応するビオチン標識抗体を導入し、さらに、アビジン又はストレプトアビジンとルシフェラーゼの複合体を導入することにより、ルシフェリンを基質とする発光反応により検出を行うことによるものとすることができる。これによれば、より高感度に微生物を検出できる。 In this microorganism detection method, the luminescence method introduces a biotin-labeled antibody that specifically reacts with an antigen of the microorganism, and further introduces a complex of avidin or streptavidin and luciferase, whereby luciferin is used as a substrate. The detection can be performed by a luminescence reaction. According to this, microorganisms can be detected with higher sensitivity.
この微生物検出方法において、前記リガンドをポリミキシンＢとし、前記リガンドにより捕捉される微生物を、リポポリサッカライドを細胞表層の構成成分とする微生物とすることができる。これによれば、ポリミキシンＢが固定化された磁気ビーズを用いて、より簡易かつ高感度に、リポポリサッカライドを細胞表層の構成成分とする微生物を検出できる。 In this microorganism detection method, the ligand can be polymyxin B, and the microorganism captured by the ligand can be a microorganism having lipopolysaccharide as a constituent of the cell surface layer. According to this, using the magnetic beads on which polymyxin B is immobilized, microorganisms having lipopolysaccharide as a constituent of the cell surface layer can be detected more easily and with high sensitivity.
本発明によれば、より簡易かつ高感度に微生物の検出を行うことができる。 According to the present invention, microorganisms can be detected more easily and with high sensitivity.
以下、本発明を具体化した実施形態について説明する。
本発明における微生物検出方法では、酵素反応と免疫反応（抗原抗体反応）を利用する酵素免疫測定法により、微生物の検出を行う。本発明における微生物検出方法では、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化した磁気ビーズを用いて微生物を捕捉し、発光法により捕捉された微生物の検出を行う。この微生物検出方法では、（ａ）リガンドを固定化した磁気ビーズにより微生物を捕捉する工程、（ｂ）捕捉された微生物を分離する工程、（ｃ）捕捉された微生物を発光法により検出する工程を含む。
Hereinafter, embodiments embodying the present invention will be described.
In the microorganism detection method of the present invention, microorganisms are detected by an enzyme immunoassay using an enzyme reaction and an immune reaction (antigen-antibody reaction). In the microorganism detection method of the present invention, a microorganism is captured using a magnetic bead on which a ligand that specifically reacts with a receptor that is a component of the cell surface layer of the microorganism is immobilized, and the microorganism captured by the luminescence method is detected. . In this microorganism detection method, (a) a step of capturing a microorganism with magnetic beads on which a ligand is immobilized, (b) a step of separating the captured microorganism, and (c) a step of detecting the captured microorganism by a luminescence method. Including.
まず、リガンドを固定化した磁気ビーズについて説明する。
＜リガンドを固定化した磁気ビーズ＞
本発明では、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化した磁気ビーズを用いて微生物を捕捉する。従って、磁気ビーズに固定化するリガンドとしては、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に結合するものを用いる。なお、微生物の細胞膜と外膜又は細胞壁とをまとめて細胞表層と総称する。
First, magnetic beads on which a ligand is immobilized will be described.
<Magnetic beads with immobilized ligand>
In the present invention, microorganisms are captured using magnetic beads on which a ligand that specifically reacts with a receptor that is a constituent component of the cell surface layer of microorganisms is immobilized. Accordingly, a ligand that specifically binds to a receptor, which is a constituent component of the cell surface layer of a microorganism, is used as a ligand to be immobilized on the magnetic beads. The cell membrane of the microorganism and the outer membrane or cell wall are collectively referred to as the cell surface layer.
本実施形態では、磁気ビーズに固定化するリガンドとして、ポリミキシンＢを用いる。このポリミキシンＢは、グラム陰性菌の外膜の構成成分であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）と特異的に結合することが知られている。従って、ポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズを用いれば、ポリミキシンＢとリポポリサッカライドとの特異的な結合により、細胞表層の構成成分にリポポリサッカライドを含む微生物を捕捉することができる。細胞表層の構成成分にリポポリサッカライドを含む微生物として、グラム陰性菌であるサルモネラ（Salmonella）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）や大腸菌（Escherichia coli）
等がある。
In this embodiment, polymyxin B is used as a ligand to be immobilized on the magnetic beads. This polymyxin B is known to specifically bind to lipopolysaccharide (LPS), which is a component of the outer membrane of Gram-negative bacteria. Therefore, if a magnetic bead on which polymyxin B is immobilized is used, microorganisms containing lipopolysaccharide as a constituent component of the cell surface layer can be captured by specific binding between polymyxin B and lipopolysaccharide. As microorganisms containing lipopolysaccharide as a component of cell surface layer, Gram-negative bacteria such as Salmonella, Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli
Etc.
また、黄色ぶどう球菌 (Staphylococcus aureus)の細胞壁の構成成分であるプロテインＡ（protein Ａ） と特異的に結合する特定の免疫グロブリン分子を固定化した磁気ビー
ズを用いれば、黄色ぶどう球菌の捕捉が可能となる。なお、プロテインＡは、ヒト、マウス、ウサギ等の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃフラグメントと特異的に結合することが知られている（ただし、ヒトＩｇＧ３とは結合しない）。
Capturing Staphylococcus aureus can be achieved by using magnetic beads immobilized with specific immunoglobulin molecules that specifically bind to protein A, which is a constituent of the cell wall of Staphylococcus aureus. It becomes. Protein A is known to specifically bind to an Fc fragment of immunoglobulin G (IgG) of human, mouse, rabbit, etc. (but does not bind to human IgG3).
磁気ビーズは、微生物を捕捉し分離するのに適した大きさであることが好ましい。例えば、サルモネラを捕捉し分離する場合、直径４．５μｍの磁気ビーズの方が、直径２．８μｍの磁気ビーズよりも適しているという実験結果が得られている。 The magnetic beads are preferably of a size suitable for capturing and separating microorganisms. For example, when capturing and separating Salmonella, experimental results have been obtained that magnetic beads having a diameter of 4.5 μm are more suitable than magnetic beads having a diameter of 2.8 μm.
＜微生物検出方法＞
次に、本発明の微生物検出方法を、図１を用いて説明する。なお、ここでは、ポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズを用いてサルモネラを捕捉し、サルモネラの検出を行う場合について説明するが、本発明における磁気ビーズに固定化するリガンド及び検出対象の微生物は、これに限定されるものではない。
<Microbe detection method>
Next, the microorganism detection method of the present invention will be described with reference to FIG. Here, the case of capturing Salmonella using magnetic beads immobilized with polymyxin B and detecting Salmonella will be described. However, the ligand immobilized on the magnetic beads and the microorganism to be detected in the present invention It is not limited to.
まず、サルモネラの検出を行うための培養液を用意し、自動分注装置を用いて、以下の（ａ），（ｂ），（ｃ−１），（ｃ−２）の工程を実行する。
（ａ）リガンドを固定化した磁気ビーズにより微生物を捕捉する工程
まず、自動分注装置を用いて、サルモネラの検出を行う培養液に、ポリミキシンＢ２２を固定化した磁気ビーズ２３（ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１）を添加して、例えば「３７℃で１５分間」の条件下でインキュベートする。ここで、サルモネラが含まれる培養液（サルモネラ培養液）にポリミキシンＢ固定化磁気ビーズを添加した状態を図１の（１）に示す。このように、自動分注装置の容器内のサルモネラ培養液中にサルモネラ２１と、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１が浮遊している状態となる。そして、例えば「３７℃で１５分間」という条件下でインキュベートすると、（２）に示すように、サルモネラ２１の細胞表層の構成成分であるリポポリサッカライドとポリミキシンＢ２２とが特異的に結合する。この結果、サルモネラ２１がポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉される。
First, a culture solution for detecting Salmonella is prepared, and the following steps (a), (b), (c-1), and (c-2) are performed using an automatic dispensing device.
(A) Step of Capturing Microorganisms with Magnetic Beads Immobilized with Ligand First, magnetic beads 23 (polymyxin B-immobilized magnetism) with polymyxin B22 immobilized in a culture solution for detecting Salmonella using an automatic dispensing device. Add beads 31) and incubate under conditions of, for example, “37 ° C. for 15 minutes”. Here, a state in which polymyxin B-immobilized magnetic beads are added to a culture solution (Salmonella culture solution) containing Salmonella is shown in FIG. Thus, the
（ｂ）捕捉された微生物を分離する工程
次に、（３）に示すように、自動分注装置の磁気ビーズ分離用磁石２５により、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１を集める。具体的には、磁気ビーズ分離用磁石２５を、サルモネラ培養液が入れられた容器の壁側に近づける。これにより、磁気ビーズ分離用磁石２５にポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１が引き寄せられ、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１を容器の壁面に集めることができる。
(B) Step of separating the captured microorganisms Next, as shown in (3), the polymyxin B-immobilized
そして、反応液を廃棄することによりポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１を回収できる。これにより、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１により捕捉されたサルモネラ２１が分離される。
Then, the polymyxin B-immobilized
そして、洗浄液を注入して、サルモネラ２１が捕捉されたポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１を洗浄する。これにより、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されていないサルモネラ２１等を含むサルモネラ培養液が除去される。
And a washing | cleaning liquid is inject | poured and the polymyxin B fixed
（ｃ）捕捉された微生物を発光法により検出する工程
（ｃ−１）ビオチン修飾抗体を反応させる工程
次に、洗浄後の、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されたサルモネラ２１に
、（４）に示すビオチン標識抗体３２を加える。このビオチン標識抗体３２は、抗体２６にビオチン２７が標識されている。このビオチン標識抗体３２は、サルモネラの表面に存在する抗原（例えば、細胞表層の構成成分）と特異的に結合する抗体である。なお、この反応液中では、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されたサルモネラ２１は、磁気ビーズ分離用磁石２５に引き寄せられて、容器の壁側に集められている。
(C) Step of detecting captured microorganisms by luminescence method (c-1) Step of reacting biotin-modified antibody Next, after washing, the
この反応液を、例えば「３７℃で１５分間」という条件下でインキュベートする。これにより、ビオチン標識抗体３２と、サルモネラ２１の表面の抗原とが特異的に結合する。この抗原とビオチン標識抗体３２との結合により、（４）に示すように、サルモネラ２１の表面にビオチン標識抗体３２が結合される。
This reaction solution is incubated, for example, under the condition of “15 ° C. for 15 minutes”. As a result, the biotin-labeled
そして、上記のようにインキュベートを行った後、反応液を廃棄し、洗浄液を注入して、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されたサルモネラ２１を洗浄する。これにより、未反応のビオチン標識抗体３２等が除去される。
After the incubation as described above, the reaction solution is discarded, and a washing solution is injected to wash the
（ｃ−２）アビジン・ルシフェラーゼ複合体を反応させる工程
次に、洗浄後の、ビオチン標識抗体３２が結合したサルモネラ２１に、図１の（５）に示すアビジン・ルシフェラーゼ複合体３３を含む検出試薬を添加する。なお、この反応液中では、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉された、ビオチン標識抗体３２が結合したサルモネラ２１は、磁気ビーズ分離用磁石２５に引き寄せられ、容器の壁面に集められている。図１の（５）に示すように、アビジン・ルシフェラーゼ複合体３３は、アビジン２８とルシフェラーゼ２９とを含む複合体である。
(C-2) Step of reacting the avidin-luciferase complex Next, the detection reagent containing the avidin-
なお、アビジンとルシフェラーゼとを含む複合体におけるアビジンとルシフェラーゼとの結合については特に限定されるものではない。例えば、アビジンにビオチンを介してルシフェラーゼを結合させたアビジン・ビオチン結合ルシフェラーゼを用いる。また、アビジンに代えてストレプトアビジンを用いた、ストレプトアビジンとルシフェラーゼとの複合体を用いてもよい。 Note that the binding of avidin and luciferase in a complex containing avidin and luciferase is not particularly limited. For example, avidin / biotin-linked luciferase obtained by binding avidin to luciferase via biotin is used. Further, a complex of streptavidin and luciferase using streptavidin instead of avidin may be used.
そして、このアビジン・ルシフェラーゼ複合体３３を含む検出試薬を添加した反応液を、例えば「３７℃で１５分間」という条件下でインキュベートする。これにより、図１の（５）に示すように、アビジン・ルシフェラーゼ複合体３３のアビジン２８と、ビオチン標識抗体３２のビオチン２７とが結合する。
Then, the reaction solution to which the detection reagent containing the avidin-
そして、上記のようにインキュベートを行った後、反応液を廃棄し、洗浄液を注入して、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されたサルモネラ２１を洗浄する。ここで、未反応のアビジン・ルシフェラーゼ複合体３３等が除去される。
After the incubation as described above, the reaction solution is discarded, and a washing solution is injected to wash the
（ｃ−３）酵素基質を含む発光試薬を反応させる工程
次に、酵素基質を含む発光試薬を添加する。この発光試薬は、ルシフェリン（基質）、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋を含む。これにより、公知の反応機構（生化学辞典 第２版，東京化学同人，１４４０ページ（１９９０））により生物発光が生じる。
(C-3) Step of reacting a luminescent reagent containing an enzyme substrate Next, a luminescent reagent containing an enzyme substrate is added. This luminescent reagent contains luciferin (substrate), ATP, Mg 2+ . Thereby, bioluminescence is generated by a known reaction mechanism (Biochemical Dictionary, 2nd edition, Tokyo Kagaku Dojin, page 1440 (1990)).
（ｃ−４）測光工程
この生物発光の発光量を公知の手段を用いて測定する。例えば、発光量の測定によりＡＴＰの測定を行う機能を有するＡＴＰアナライザを用いる。本実施形態では測定時間として１５秒を用いる。培養液中にサルモネラが存在する場合、この測光工程において発光が測定されることでサルモネラが検出される。
(C-4) Photometry step The amount of bioluminescence is measured using a known means. For example, an ATP analyzer having a function of measuring ATP by measuring light emission is used. In this embodiment, 15 seconds are used as the measurement time. When Salmonella is present in the culture solution, Salmonella is detected by measuring luminescence in this photometric step.
上記実施形態によれば、以下に示す効果を得ることができる。
・ 上記実施形態では、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化した磁気ビーズを用いる。このため、磁気ビーズに固定化されたリガンドと反応するレセプタを細胞表層に有する微生物を、磁気ビーズにより捕捉できる。
According to the above embodiment, the following effects can be obtained.
In the above embodiment, magnetic beads on which a ligand that specifically reacts with a receptor that is a constituent component of a cell surface layer of a microorganism is used. For this reason, microorganisms having a receptor on the cell surface that reacts with a ligand immobilized on the magnetic beads can be captured by the magnetic beads.
・ 上記実施形態では、サルモネラ等のグラム陰性菌の細胞表層の構成成分であるリポポリサッカライドと特異的に反応するポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズを用いる。このため、サルモネラ等のグラム陰性菌を磁気ビーズにより捕捉できる。 In the above embodiment, magnetic beads on which polymyxin B that specifically reacts with lipopolysaccharide, which is a constituent of the cell surface layer of Gram-negative bacteria such as Salmonella, are used. For this reason, Gram-negative bacteria such as Salmonella can be captured by magnetic beads.
・ 上記実施形態では、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化した磁気ビーズを用いて、その磁気ビーズにより微生物を捕捉する。そして、その磁気ビーズを磁気ビーズ分離用磁石により分離し、分離された磁気ビーズにより捕捉されている微生物を発光法により検出する。このため、磁気ビーズと磁気ビーズ分離磁石とを用いることで、より簡単に微生物の分離や、未反応物質の除去や洗浄を行うことができるとともに、磁気ビーズを増やすことにより、多量の捕捉体で微生物の捕捉を行うことができる。また、捕捉された微生物の検出を発光法により行うため、発色法等と比べて、より高感度に検出を行うことができる。従って、微生物の検出を、より簡易かつ高感度に行うことができる。 In the above embodiment, the magnetic beads are used to capture the microorganism using the magnetic beads on which the ligand specifically reacting with the receptor that is a component of the cell surface layer of the microorganism is immobilized. Then, the magnetic beads are separated by a magnetic bead separating magnet, and microorganisms captured by the separated magnetic beads are detected by a luminescence method. For this reason, by using magnetic beads and magnetic bead separation magnets, it is possible to more easily separate microorganisms, remove unreacted substances, and wash, and by increasing the number of magnetic beads, Microbial capture can be performed. In addition, since the captured microorganisms are detected by the luminescence method, the detection can be performed with higher sensitivity than the color development method or the like. Therefore, microorganisms can be detected more easily and with high sensitivity.
・ 上記実施形態では、前記微生物が有する抗原に特異的に反応するビオチン標識抗体を導入し、さらに、アビジン・ルシフェラーゼ複合体を導入することにより、ルシフェリンを基質とする発光反応により検出を行う。このため、捕捉された微生物を、この微生物とビオチン標識抗体を介して結合したアビジン・ルシフェラーゼ複合体のルシフェラーゼにより触媒されるルシフェリンを基質とする発光反応により検出できる。従って、より高感度に微生物を検出できる。 In the above embodiment, detection is performed by a luminescence reaction using luciferin as a substrate by introducing a biotin-labeled antibody that reacts specifically with the antigen of the microorganism and further introducing an avidin-luciferase complex. For this reason, the captured microorganism can be detected by a luminescence reaction using luciferin catalyzed by luciferase of an avidin-luciferase complex bound to this microorganism via a biotin-labeled antibody. Therefore, microorganisms can be detected with higher sensitivity.
・ 上記実施形態では、サルモネラ等のグラム陰性菌の細胞表層の構成成分であるリポポリサッカライドと特異的に反応するポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズ（ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ）を用いて、サルモネラ等のグラム陰性菌を捕捉する。そして、そのポリミキシンＢ固定化磁気ビーズを磁気ビーズ分離用磁石により分離し、分離されたポリミキシンＢ固定化磁気ビーズに捕捉されているサルモネラ等のグラム陰性菌を発光法により検出する。このため、磁気ビーズと磁気ビーズ分離磁石とを用いることで、より簡単にサルモネラの分離や、未反応物質の除去や洗浄を行うことができるとともに、磁気ビーズを増やすことにより、多量の捕捉体でサルモネラの捕捉を行うことができる。また、捕捉されたサルモネラの検出を発光法により行うため、発色法等と比べて、より高感度に検出を行うことができる。従って、サルモネラの検出を、より簡易かつ高感度に行うことができる。 In the above embodiment, using magnetic beads (polymyxin B-immobilized magnetic beads) immobilized with polymyxin B that specifically reacts with lipopolysaccharide, which is a constituent of the cell surface of Gram-negative bacteria such as Salmonella, Salmonella Capture Gram-negative bacteria such as Then, the polymyxin B-immobilized magnetic beads are separated by a magnetic bead separating magnet, and Gram-negative bacteria such as Salmonella trapped on the separated polymyxin B-immobilized magnetic beads are detected by a luminescence method. For this reason, by using magnetic beads and magnetic bead separation magnets, salmonella can be more easily separated, unreacted substances removed and washed, and by increasing the number of magnetic beads, Salmonella can be captured. In addition, since the captured Salmonella is detected by the luminescence method, the detection can be performed with higher sensitivity than the color development method or the like. Therefore, Salmonella can be detected more easily and with high sensitivity.
・ 上記実施形態では、ビオチン標識抗体と結合する抗原として、ビオチン標識抗体が微生物の表面に結合可能な状態の抗原、例えば、細胞表層の構成成分である抗原を用いる。これにより、免疫測定用の培養工程が不要となり、より簡易に微生物の検出を行うことができる。 In the above-described embodiment, an antigen in a state where the biotin-labeled antibody can bind to the surface of the microorganism, for example, an antigen that is a constituent component of the cell surface layer is used as the antigen that binds to the biotin-labeled antibody. Thereby, the culture | cultivation process for immunoassay becomes unnecessary and it can detect a microorganism more easily.
以下、実施例により、本発明の酵素免疫測定法による微生物検出方法について、具体的に説明する。なお、本発明は、これによって限定されるものではない。ここでは、鶏肉及び液卵由来の培養液を用いて、食品衛生検査指針に基づくいわゆる公定法と、本発明の微生物検出方法とにより、それぞれ微生物の検出を行い、本発明の酵素免疫測定法による微生物検出方法の評価を行った。 Hereinafter, the microorganism detection method by the enzyme immunoassay method of the present invention will be specifically described by way of examples. In addition, this invention is not limited by this. Here, using a culture solution derived from chicken and liquid egg, microorganisms are detected by the so-called official method based on food hygiene inspection guidelines and the microorganism detection method of the present invention, respectively, and the enzyme immunoassay method of the present invention is used. The microorganism detection method was evaluated.
（培養液の調整）
まず、測定に用いる鶏肉及び卵液を用意した。具体的には、表１に示すように、鶏肉については１０種類の製品をサンプルとした。また、卵液については、５種類の異なる殺菌条件でそれぞれ殺菌した検体をサンプルとし、さらに、３種類の異なる殺菌条件でそれぞれ殺菌しサルモネラを接種した検体をサンプルとした。そして、これらの鶏肉及び液卵について、ＢＰＷ（緩衝化されたペプトン水（Buffered Peptone Water））と、ＲＶ（ラパポルト−バシリアディス（Rappaport- Vassiliadis））とを用いて２段階培養を行った。
(Adjustment of culture solution)
First, chicken and egg liquid used for measurement were prepared. Specifically, as shown in Table 1, 10 kinds of products were used as samples for chicken. Moreover, about the egg liquid, the sample sterilized by each of five different sterilization conditions was used as a sample, and the sample sterilized by each of three different sterilization conditions and inoculated with Salmonella was used as a sample. Then, these chickens and liquid eggs were subjected to two-stage culture using BPW (buffered peptone water) and RV (Rappaport-Vassiliadis).
（本発明の微生物検出方法の各工程の実施）
次に、自動分注装置を用いて、以下の作業を行った。
各培養液について1.0ｍｌずつ採取して容器に注入し、それぞれポリミキシンＢ固定化
磁気ビーズ20μｌを加えた。そして、各培養液を３７℃で１５分間インキュベートした。そして、自動分注装置に備えられた磁気ビーズ分離用磁石により、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズを分離し、培養液を廃棄して、洗浄液1.0ｍｌを注入して洗浄した。なお、こ
こでは、１回のみ洗浄を行った。
(Implementation of each step of the microorganism detection method of the present invention)
Next, the following operations were performed using an automatic dispensing device.
1.0 ml of each culture solution was collected and injected into a container, and 20 μl of polymyxin B-immobilized magnetic beads were added to each culture solution. Each culture was incubated at 37 ° C. for 15 minutes. Then, the magnetic beads separating magnet provided in the automatic dispensing device was used to separate the polymyxin B-immobilized magnetic beads, the culture solution was discarded, and 1.0 ml of the washing solution was injected and washed. Here, cleaning was performed only once.
次に、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズが磁気ビーズ分離用磁石により分離されている各容器から、洗浄液を廃棄し、この容器に、ビオチン修飾抗体0.5ｍｌを注入した。そし
て、各容器の溶液を、３７℃で１５分間インキュベートした。そして、各容器中の溶液を廃棄し、洗浄液1.0ｍｌを注入して、合計２回、洗浄を繰り返した。
Next, the washing solution was discarded from each container in which the polymyxin B-immobilized magnetic beads were separated by a magnetic bead separating magnet, and 0.5 ml of a biotin-modified antibody was injected into this container. And the solution of each container was incubated at 37 degreeC for 15 minutes. Then, the solution in each container was discarded, 1.0 ml of the cleaning solution was injected, and the cleaning was repeated twice in total.
次に、各容器の洗浄液を廃棄し、アビジン・ビオチン結合ルシフェラーゼを含む検出試薬0.2ｍｌをそれぞれ注入した。そして、そして、各容器の溶液を、３７℃で１５分間イ
ンキュベートした。そして、各容器中の溶液を廃棄し、洗浄液1.0ｍｌを注入して、合計
２回、洗浄を繰り返した。
Next, the washing solution in each container was discarded, and 0.2 ml of a detection reagent containing avidin / biotin-conjugated luciferase was injected. The solution in each container was then incubated at 37 ° C. for 15 minutes. Then, the solution in each container was discarded, 1.0 ml of the cleaning solution was injected, and the cleaning was repeated twice in total.
上記の作業を行った後、手動で、酵素基質を含む発光試薬0.1ｍｌを各容器の溶液に注
入した。そして、ＡＴＰアナライザを用いて、発光量の測定を行った。
（実験結果）
実験結果を表１に示す。
After performing the above operation, 0.1 ml of the luminescent reagent containing the enzyme substrate was manually injected into the solution in each container. And the amount of emitted light was measured using the ATP analyzer.
(Experimental result)
The experimental results are shown in Table 1.
卵液に関しては、殺菌を行った５つのサンプル（１，２，３，４，５）は、いずれの殺菌条件とも、本発明の微生物検出方法による発光量の測定結果（Immuno Assay（信号値）
）は、低い数値を示した。つまり、異なる殺菌条件により殺菌を行った５つのサンプルについては、検出結果は、いずれも陰性となった。また、サルモネラを接種した３つのサンプル（６，７，８）は、発光量の測定結果は、いずれも高い数値を示した。つまり、この３つのサンプルについては、検出結果は、いずれも陽性となった。
Regarding the egg liquid, the sterilized five samples (1, 2, 3, 4, 5) were measured for the amount of luminescence by the microorganism detection method of the present invention (Immuno Assay (signal value)) under any sterilization conditions.
) Showed a low number. That is, for the five samples that were sterilized under different sterilization conditions, the detection results were all negative. In addition, the three samples (6, 7, 8) inoculated with Salmonella all showed high numerical values for the measurement results of the luminescence. That is, for these three samples, the detection results were all positive.
公定法による検出結果も、異なる殺菌条件により殺菌を行った５つのサンプル（１，２，３，４，５）は、いずれの殺菌条件とも、陰性となり、サルモネラを接種した３つのサンプル（６，７，８）は、いずれも陽性となった。つまり、卵液を用いた測定においても、本発明の微生物検出方法による発光量の測定結果に基づく検出結果と、公定法による検出結果との一致率は１００％となった。なお、ネガティブコントロールとして、ＲＶを用いて６回発光量の測定を行ったが、信号値は、いずれも低い数値を示した。 As for the detection results by the official method, five samples (1, 2, 3, 4, 5) sterilized under different sterilization conditions were negative in any sterilization conditions, and three samples (6, 6) inoculated with Salmonella 7 and 8) were all positive. That is, also in the measurement using egg liquid, the coincidence rate between the detection result based on the measurement result of the luminescence amount by the microorganism detection method of the present invention and the detection result by the official method was 100%. Note that, as a negative control, RV was used to measure the amount of luminescence six times, but the signal values were all low.
以上の実験結果により、本発明の微生物検出方法により、従来の公定法の場合と同様に、サルモネラを検出可能であることが示された。
次に、上記実施形態から把握できる請求項に記載した発明以外の技術的思想について、効果とともに以下に記載する。
From the above experimental results, it was shown that Salmonella can be detected by the microorganism detection method of the present invention as in the case of the conventional official method.
Next, technical ideas other than the invention described in the claims that can be grasped from the above embodiment will be described below together with effects.
（１） 前記磁気ビーズに固定化されたリガンドはプロテインＡと特異的に反応する特定の免疫グロブリン分子であり、前記レセプタはプロテインＡであり、前記リガンドにより捕捉される微生物は黄色ぶどう球菌であることを特徴とする請求項３又は４に記載の微生物検出方法。
(1) The ligand immobilized on the magnetic beads is a specific immunoglobulin molecule that reacts specifically with protein A, the receptor is protein A, and the microorganism captured by the ligand is Staphylococcus aureus. The microorganism detection method according to
これによれば、プロテインＡと特異的に反応する特定の免疫グロブリン分子が固定化された磁気ビーズを用いて、より簡易かつ高感度に黄色ぶどう球菌を検出できる。 According to this, Staphylococcus aureus can be detected more easily and with high sensitivity by using magnetic beads on which specific immunoglobulin molecules that specifically react with protein A are immobilized.
２１…サルモネラ、２５…磁気ビーズ分離用磁石、３１…ポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズとしてのポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ、３２…ビオチン標識抗体、３３…アビジン又はストレプトアビジンとルシフェラーゼの複合体としてのアビジン・ルシフェラーゼ複合体。
DESCRIPTION OF
Claims (5)
前記微生物が有する抗原に特異的に反応するビオチン標識抗体を導入し、さらに、アビジン又はストレプトアビジンとルシフェラーゼの複合体を導入することにより、ルシフェリンを基質とする発光反応により検出を行うことを特徴とする請求項３に記載の微生物検出方法。 The luminous method is
Introducing a biotin-labeled antibody that specifically reacts with an antigen possessed by the microorganism, and further introducing a complex of avidin or streptavidin and luciferase, thereby detecting by a luminescent reaction using luciferin as a substrate. The microorganism detection method according to claim 3.
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009534666A (en) * | 2006-04-18 | 2009-09-24 | ウェルスタット バイオロジックス コーポレイション | Detection of circulating endothelial cells |
| JP2011504236A (en) * | 2007-11-20 | 2011-02-03 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | Method for analyzing bacterial samples using a polymer sensor containing diacetylene |
| CN102928590A (en) * | 2012-11-22 | 2013-02-13 | 上海师范大学 | Kit adopting fluorescent quantum dots to quickly screen, separate and detect salmonella |
| US8409706B2 (en) | 2008-05-02 | 2013-04-02 | Sony Corporation | Preparation process of microbeads, and microbeads |
| CN103293297A (en) * | 2013-06-05 | 2013-09-11 | 南昌大学 | Method for quickly separating salmonella |
| CN109557303A (en) * | 2018-12-26 | 2019-04-02 | 陕西师范大学 | A kind of polymyxin B magnetic bead, preparation method and applications |
| CN109655420A (en) * | 2018-12-28 | 2019-04-19 | 重庆博蓝鹰生物技术有限公司 | Multi objective is combined the method for comparing immobilization streptavidin separating property |
| CN111257559A (en) * | 2020-02-27 | 2020-06-09 | 青岛农业大学 | Kit for rapid qualitative and quantitative determination of microorganisms and rapid qualitative and quantitative determination method |
| CN111624186A (en) * | 2020-06-24 | 2020-09-04 | 江南大学 | Enterotoxin spectral analysis method based on fluorescence and Raman double-signal enhancement |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07151758A (en) * | 1993-05-30 | 1995-06-16 | Masashi Funayama | Method for immobilizing antibiotic by photochemical reaction on carrier, and lps, microorganism catching method, and determining method using the carrier |
| JPH1128099A (en) * | 1997-05-12 | 1999-02-02 | Kikkoman Corp | Detection of staphylococcus aureus |
| JP2002181823A (en) * | 2000-12-11 | 2002-06-26 | Sumitomo Electric Ind Ltd | Detection method for microorganism |
| WO2002065131A1 (en) * | 2001-02-09 | 2002-08-22 | Kikkoman Corporation | Method of detecting bacterium belonging to the genus vibrio, detection reagent and antibody to be used therein |
-
2004
- 2004-06-30 JP JP2004194809A patent/JP2006017554A/en active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07151758A (en) * | 1993-05-30 | 1995-06-16 | Masashi Funayama | Method for immobilizing antibiotic by photochemical reaction on carrier, and lps, microorganism catching method, and determining method using the carrier |
| JPH1128099A (en) * | 1997-05-12 | 1999-02-02 | Kikkoman Corp | Detection of staphylococcus aureus |
| JP2002181823A (en) * | 2000-12-11 | 2002-06-26 | Sumitomo Electric Ind Ltd | Detection method for microorganism |
| WO2002065131A1 (en) * | 2001-02-09 | 2002-08-22 | Kikkoman Corporation | Method of detecting bacterium belonging to the genus vibrio, detection reagent and antibody to be used therein |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009534666A (en) * | 2006-04-18 | 2009-09-24 | ウェルスタット バイオロジックス コーポレイション | Detection of circulating endothelial cells |
| JP2011504236A (en) * | 2007-11-20 | 2011-02-03 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | Method for analyzing bacterial samples using a polymer sensor containing diacetylene |
| US8409706B2 (en) | 2008-05-02 | 2013-04-02 | Sony Corporation | Preparation process of microbeads, and microbeads |
| CN102928590A (en) * | 2012-11-22 | 2013-02-13 | 上海师范大学 | Kit adopting fluorescent quantum dots to quickly screen, separate and detect salmonella |
| CN103293297A (en) * | 2013-06-05 | 2013-09-11 | 南昌大学 | Method for quickly separating salmonella |
| CN109557303A (en) * | 2018-12-26 | 2019-04-02 | 陕西师范大学 | A kind of polymyxin B magnetic bead, preparation method and applications |
| CN109655420A (en) * | 2018-12-28 | 2019-04-19 | 重庆博蓝鹰生物技术有限公司 | Multi objective is combined the method for comparing immobilization streptavidin separating property |
| CN109655420B (en) * | 2018-12-28 | 2021-08-03 | 重庆博蓝鹰生物技术有限公司 | Method for comparing separation performance of immobilized streptavidin by using multi-index combination |
| CN111257559A (en) * | 2020-02-27 | 2020-06-09 | 青岛农业大学 | Kit for rapid qualitative and quantitative determination of microorganisms and rapid qualitative and quantitative determination method |
| CN111257559B (en) * | 2020-02-27 | 2023-08-08 | 青岛农业大学 | Kit for quick qualitative and quantitative detection of microorganisms and quick qualitative and quantitative detection method |
| CN111624186A (en) * | 2020-06-24 | 2020-09-04 | 江南大学 | Enterotoxin spectral analysis method based on fluorescence and Raman double-signal enhancement |
| CN111624186B (en) * | 2020-06-24 | 2021-03-16 | 江南大学 | Enterotoxin spectral analysis method based on fluorescence and Raman double-signal enhancement |
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