SU946453A1

SU946453A1 - Способ получени пигмент-белкового комплекса из растений

Info

Publication number: SU946453A1
Application number: SU802892461A
Authority: SU
Inventors: Людмила Васильевна Пивоварова; Алия Сабуровна Казакова; Лия Федоровна Николаева; Александр Афанасьевич Кононенко
Original assignee: Московский Ордена Ленина И Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им.М.В.Ломоносова
Priority date: 1980-02-25
Filing date: 1980-02-25
Publication date: 1982-07-30

Description

Изобретение относитс к способам вьщелени биологических функций и может быть применено в биохимии, сельском хоз йстве, фитопатологии, растениеводстве. Известен способ вьоделени пигменТ-белкового комплекса (ПЕК) из растений путем гомогенизации растительной массы с трис-НС1-буфером и детергентом с последующей очистко дифференциальным центрифугированием и гель-электрофорезом О- Способ имеет следующие недостатки: длительность; нестабильность це левого продукта; необходимость использовани большого количества рас тительной массы. Известен также способ получени ПБК путем гомогенизировани растительно|й массы в смеси с трициновым буферам при рН 8,5, последующей обработки сульфатом аммони , диффере циальным центрифугированием при 16000g в течение 60 мин, ресуспенди ровани осадка, центрифугировани при 20000g в течение 90 мин и после дующей очисткой ПБК гельфильтрацией Недостатки способа - длительност , ( выделение ПБК занимает 18-19 час); громоздкость} кроме того, в известном способе высокое разбавление це- левого продукта. Цель изобретени - ускорение и упрощение способа получени ПБК из растений , обладаюр1его-ВЫСОКОЙ фотоактивностью . Эта цель достигаетс тем, что растительную массу гомогенизируют в среде следующего состава, Bec.%t 6,84-13,68 Сахароза 0,009-0,028 Магний хлористый Натриева соль этилендиаминтетра0 ,027-0,067 уксусной кислоты 0,05-0,1 Тритон Х-100 10-30 Глицерин Трис-HGl-буфер Остальное Кроме того, растительную массу берут в соотношении к среде выделени 1:1, а последующее центрифугирование провод т при 49000-510OOg в течение 25-35 мин. Предлагаемый способ занимает 6-7 ч, не требует большого количества растительной массы (не более Ii6-20 г), не громоздок, целевой продукт обладает стабильностью и высокой фотоактивностью.

Пример, Берут 18 г охлажденной растительной массы, растирают в среде выделени состава, вес.% Сахароза6,84

Магний хлористый 0,009 Натриева соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,027 Тритон Х-1000,05

Глицерин10

Трис-НС1-буфер Остальное Гомогейат фильтруют через шесть слоев капрона и центрифугируют при 49000g 25 мин. Осадок отбрасывают, а супернатант используют дл получени очищенного ПБК. Дл этого супернатант нанос т на колонку, заполненную сефадексом G-100 (размер колонки 35 X 3,0 см,, скорость тока 0,5 шт/ми объем фракций 5 мл).

Наличие пигмента во фракци х определ ют , записыва спектры низкотемпературной флуоресценции темновых и освещенных образцов. Затем фракции, содержащие ПБК, объедин ют и дл дальнейшей очистки пропускают через колонку с сефадексом G-200 (размер колонки 20 X 3,2 см, скорость тока 0,5 глп/мин, объем фракций 5 мл).

В качестве элюирующего раствора используют трис-НС1-буфер, 0,6%, рН 8,4, содержащий 1, КС1. В процессе очистки препаратов температуру колонок поддерживают при0 с помощью охлаждающей рубашки.

Все операции провод т на слабом зеленом свету при .

Добавл ют глицерин до 45% (по весу от среды выделени ), получают стабильный фотоактивный ПБК, который хран т при несколько недель, фотоактивность при этом не тер етс . П р и м е р 2. Берут 20 г охлажденной растительной массы, растирают в среде вьщелени состава, вес.%: Сахароза 13,68 . Магний хлористый 0,028 Натриева соль этилендиаминтетрауксусной кислоты0,067

Тритон Х-1000,1

Глицерин30

Трис-НС1-буфер Остальное Гомогенат фильтруют через шесть слоев капрона и центрифугируют при 51000g 35 мин. Осадок отбрасывают, а супернатант используют дл получени .очищенного ПБК. Дл этого супернатант нанос т на колонку, заполненную сефадексом G-100 (размер колонки 35 X 3,0 см, скорость тока 0,5 мл/ми объем фракций 5 мл).

Наличие пигмента во фракци х определ5пот , записыва спектры низкотемпературной флуоресценции темновых и освещенных образцов.

Затем фракции, содержание ПБК, объедин ют и дл дальнейшей очистки

пропускают через колонку с сефадексом G-200 (размер колонки 20 х 3,2 с скорость тока 0,5 мл/минобъем фракций 5 мл). В качестве элюирующего раствора используют 0,6%-ный трис-НС1-буфер , рН 9,0, содержащий 1,4% КС1.

В процессе очистки препаратов т емпературу колонок поддерживают при О- с помощью охлаждающей рубашки. Все операции, св занные с получением ПБК, провод т на слабом зеленом свету при 0-4С.

Добавл ют глицерин до 55вес.% от среды выделени . Получают стабильный фотоактивный ПБК, который хран т при несколько недель, фотоактивность при этом не тер етс .

П р и м е р 3. Берут 20 г охлажденной растительной массы, растирают в среде выделени состава, вес.%: Сахароза10,26

Магний хлористый 0,019 Натриева соль этилендиаминтетрауксусной кислоты0,033

Тритон Х-1000,06

Глицерин20

Трис-НС1-буфер Остальное Гомогенат фильтруют через шесть слоев капрона и центрифугируют при 50000g 30 мин.

Осадок отбрасывают, а супернатант используют дл получени очищенного ПБК. Дл этого супернатант нанос т на колонку, заполненную сефадексом G-100 (размер колонки 35 х 3,0 см, скорость тока 0,5 мл/мин, объем фракции 5 мл) .

Наличие пигмента во фракци х определ ют , записыва спектры низкотемпературной флуоресценции темновых и освещенных образцов. Затем фракции содержащие ПБК, объедин ют и дл .дальнейшей очистки пропускают через колонку с сефадексом-С-200 (размер колонки 20 X 3,2 см, скорость тока 0,5 мл/мин, объем фракций 5 мл). В кчестве э.шоирующего раствора используют 0,6%-ный трис-НС1-буфер, рН 8,6,. содержащий 1,4% КС1. В процессе очиски препаратов температуру колонок поддерживают при с помощью охлаждающей рубашки.

Сбор материала и все операции, свзанные с получением ПБК, провод т на слабом зеленом свету при температуре

P-tfc.

Добавл ют глицерин до 50 вес.% от среды выделени .

Получают стабильный фотоактивньтй ПБК, который хран т при -18°С. несколько недель. Фотоактивность при этом не тер етс .

Фоомула изобретени 1, Способ получени пигмент-белкового комплекса из растений, включаюций гомогенизирование растительной массы с добавлением буфера, фильтрование , центрифугирование и очистку при низкой температуре пропусканием через колонки с сефадексом, концентрирование с последующим добавлением глицерина, отличающийс тем, что, с целью ускорени и упрощени способа, гомогенизирование провод т в среде выделени состава, вес.%1 Cajjapoaa 6,84-13,63 Магний хлористьй 0,009-0,028 Натриева соль этилендиаминтетрауксусной кислоты0 ,027-0,067 Тритор Х-100 0,05-0,1 Глицерин10-30 Трис-НС1-буфер Остальное

2. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и и с тем, что растительную массу берут в соотношении к среде выделени 1:1- 1:1,3, а последующее 1хентрифугирование провод т при 49000-51000g в течение 25-35 мин.

Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

1.0га. D. Canaaris. Analysis of the Subunit Srtucture of Protochlorophyllide Holochrome by Sodiiun Dodecyl Sulphate-Polyocrilamide Electrophoresis . Plant-Physiology 60, 422-429, 1977.

2. H6nningzen K. W., Kahn A. Photoactive Subunits of Protochlorophillide Holochrome. Plaut-Physiology 47, 685-690, 1971.

Claims

1, Способ получения пигмент-белкового комплекса из растений, включа5 ющий гомогенизирование растительной массы с добавлением буфера, фильтрование, центрифугирование и очистку при низкой температуре пропусканием через колонки с сефадексом, концентрирование с последующим добавлением 5 глицерина, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа,· гомогенизирование проводят в среде выделения состава, вес.%: Сахароза 6,84-13,63 10

Магний хлористый 0,009-0,028 Натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,027-0,067 15

Тритор Х-100 0,05-0,1

Глицерин 10-30

Трис-НС1-буфер Остальное

2. Способ по π. 1, отличающийся тем, что растительную массу берут в соотношении к среде выделения 1:1 - 1:1,3, а последующее центрифугирование проводят при 49000-51000g в течение 25-35 мин..