SU897766A1 - Способ получени арахидоновой кислоты - Google Patents

Description

Изобретение относится к усовершен-, ствованному способу получения арахидоновой кислоты.

Арахидоновая (цис-5, 8, 11, 14 эйкозатетраеновая) кислота входит в состав липидов клеточных мембран и является физиологически-активным веществом, кроме того она является предшественником простагландинов (ПГ), которые в последнее время находят все более широкое применение в качестве эффективных лекарственных препаратов. В связи с перспективностью использования ПГ в самых различных областях медицины и ветеринарии необходимы доступные методы получения как самих ПГ, так и их предшественников. В настоящее время для получения ПГ, наряду с химическим синтезом, представляющим сложный и многостадийный процесс, широко применяется их биосинтез из биологических предшественников с помощью ферментных препаратов простагландин-синтетазы,вы· деляемых из различных источников животного происхождения.

Для успешного протекания процесса биосинтеза арахидоновая кислота не должна содержать примесей других кислот, а также изомеров с иным расположением двойных связей, которые активно ингибируют ферментативный процесс превращения субстракта в целевые соединения.

Источником получения арахидоновой кислоты (АК) могут служить липиды' различного происхождения, в которых наряду с остатками АК содержатся радикалы других жирных кислот, отличающихся как количеством углеродных атомов, так и числом и расположением двойных связей.

Для получения ΛΚ из липидов известен ряд методов, основанных на различии физико-химических свойств липидов, таких как температуры плавления и кипения, растворимость в различных растворителях, утойчивость комплексов с различными комплексообразователями, стереохимические свойства молекул и другие характеристики.

Для разделения жирных кислот широко используют различные их производные, в 5 частности бром- и ртуть-производные ненасыщенных жирных кислот [Ί], а также соединения включения с мочевиной или тиомочевиной £2]. В последнее время для указанной цели все чаще применяют разнообразные хроматографические методы [3].

Однако применение какого-либо одного из указанных методов не дает возможности выделить из смеси сложного состава индивидуальное вещество, в частности арахидоновую кислоту.

Известен способ получения АК из липидов животного происхождения, включающий омыление липидов, фракционную низкотемпературную кристаллизацию полученной смеси жирных кислот, обработку концентрата ненасыщенных жирных кислот мочевиной и кристаллиза-. цию мочевинных комплексов, разложение соединений включения кислот с мочевиной, этерификацию и фракционную перегонку в вакууме, омыление и фракционирование в вакууме [4].

Совокупность выбранных приемов выделения и очистки не позволяет получить химически чистую АК, так как каждая из этих стадий основана лишь на незначительных различиях либо в растворимости, либо в стереохимии молекул, либо в температуре кипения.

Для получения концентратов с достаточно высоким процентным содержанием АК приходится несколько раз повторять отдельные операции, что приводит к большим потерям целевого соединения. Кроме того, указанными методами не удается полностью отделиться от изомеров АК, которые делают ее непригодной для использования в качестве субстрата в биосинтезе простагландинов.

Т^ким образом, к недостаткам данного метода следует отнести большую трудоемкость процесса, низкий выход (менее 30%) и неудовлетворительное качество получаемой арахидоновой кислоты .

Наиболее близким к предложенному является способ получения арахидоновой кислоты из липидов путем их омыления с использованием низкотемпературной кристаллизации при 0-(-5)°С, извлечения из жидкой фазы неомыляемой части липидов экстракцией петролейным эфиром. Оставшуюся жидкую фазу подкисляют минеральной кислотой , из полученной реакционной массы экстрагируют жирные кислоты петролейным эфиром^ экстракт подвергают кристаллизации при (-28) - (-ЗО)^С, а затем при (-75) - (-78)⁰ С, петролейный 10 эфир отгоняют, полученную смесь кислот подвергают кристаллизации в ацетоне при (-77) - (-78) ч с последующей его отгонкой.

Полученный при этом концентрат арахидоновой кислоты этерифицируют метиловым спиртом и очищают хроматографией на силикагеле, импрегнированном нитратом серебра, в колонке с использованием в качестве элюента ₂₀ гексана и/или диэтилового эфира, причем последний берут в количестве

- 100% от веса гексана. Из полученного концентрата метиловых эфиров выделяют арахидоновую кислоту путем испарения элюента с последующим щелочным гидролизом, экстракцией петролейным эфиром, подкислением полученной реакционной смеси минеральной кислотой и экстракцией арахидоновой кислоты петролейным эфиром [51Недостатком данного способа является сложность технологического процесса .

Цель изобретения - упрощение процесса и повышение качества целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения арахидоновой кислоты из липидов путем их омыления, низкотемпературной кристаллизации полученной при этом смеси высших жирных кислот, этерификации алканолом, хроматографической очистки на колонке с селикагелем, импрегни⁴⁵ рованным азотнокислым серебром, щелочного' гидролиза полученного эфира арахидоновой кислоты и выделения целе вого продукта экстракцией петролейным эфиром кристаллизацию смеси высших ⁵⁰ жирных кислот осуществляют из диэтилового эфира при (-50) - (-25)°С, полученную после этерификации смесь низ ших алкиловых эфиров жирных кислот подвергают фракционной вакуумной пере 55 гонке при остаточном давлении 0,05 ~ 0,1 мм рт.ст. и последующую хроматографическую очистку соответствующего эфира арахидоновой кислоты проводят с использованием в качестве элюента системы толуол-ацетон.

Основу данного способа выделения АК составляет хроматографическое разделение на колонке с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра. Для выделения на колонке в системе толуол-ацетон можно использовать сравнительно бедные смеси, содержащие только 20%АК. Поэтому в большинстве случаев необходимо лишь небольшое обогащение арахидоновой кислотой смеси жирных кислот, получаемой из исходного сырья. Обычно это обогащение достигается уже после отделения насыщенных и части ненасыщенных кислот низкотемпературной кристаллизацией и перегонкой смеси эфиров жирных кислот в вакууме. В случае же использования сырья, содержащего сравнительно большое количество АК (печень млекопитающих, жир некоторых рыб и т.п. ), можно ограничиться лишь отделением насыщенных кислот низкотемпературной кристиллизацией их из раст вора в подходящем растворителе.

Химически чистую арахидоновую кислоту получают следующим образом.

Метиловый эфир АК, полученный после выделения на колонке, омыляют по известному методу водные раствором щелочи в спирте. Проведение указанное го процесса в атмосфере инертного газа и при низкой температуре (40-50°) не вызывает каких-либо изменений в структуре АК, что подтверждается различными методами (ПМР, Уф- и ИК-спектроскопия, элементный анализ, кулонометрия и т. п.) .

Пример 1 . Использование отходов производства инсулина.

К 1000,0 г водной эмульсии липидов приливают 500 мл этилового спирта, добавляют 250,0 г ацетата калия и смесь перемешивают в токе азота при 40°С в течение 1 ч, после чего растворитель отгоняют в вакууме (1520 мм). Остаток после охлаждения до 18 - 20°С подкисляют 2000,0 мл разбавленной соляной кислоты (d^ 1,03) и выделившуюся смесь жирных кислот извлекают хлороформом (2 раза по 500 мп), хлороформ упаривают в вакууме (15-20 мм), а остаток растворяют в 2000,0 мл серного эфира и подвергают низкотемпературной кристаллизации при (~30) - (-25)’С в течение •1,5 - 2 ч с последующим обратным фи

897766 « льтрованием. Осадок смешивают с 250мл серного эфира и снова охлаждают при (-30) - (-25)°С в течение 1,5м. Смесь фильтруют, а объединенные маточные растворы подвергают дальнейшей кристаллизации при 50^вС в течение 1,5*2ч. Выпавший осадок отделяют тем же способом. Фильтрат упаривают в вакууме (15 - 20 мм), а остаток растворяют в 250 мл метанола, добавляют 1 мл хлористого ацетила и нагревают при кипении в течение 30 мин, после чего отгоняют избыток метанола и образовавшийся метилацетат. К остатку после охлаждения до 20 - 25°С добавляют 200 мл петролейного эфира. Полученный раствор промывают насыщенным водным раствором хлористого натрия, после чего его пропускают через слой силикагеля (50 г, высота слоя 5 см/, сушат сернокислым натрием, растворитель удаляют в вакууме 15 ~ 20 мм , а остаток 51,0 г подвергают фракционной перегонке при остаточном давлении 0,05 мм. Отбирают фракцию (9,2 г) с т.кип. 126 - 131 °C (в парах) , которую хроматографируют на колонке с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра.

Адсорбент готовят следующим образом.

К смеси 150 г силикагеля Л 100/160 меш и 15»0 г нитрата серебра добавляют при интенсивном перемешивании 150 мл дистиллированной воды. Полученную пастообразную массу сушат и затем активируют при 120 - 130°С в течение 4 ч. Затем адсорбент охлаждают до 20 - 25°С и добавляют 200 мл толуола при перемешивании, после чего смесь переносят в хроматографическую колонку длиной 800 и диаметром 35 Ам. Смесь метиловых эфиров высших жирных кислот (9,2 г), выделенных при фракционной перегонке, растворяют в 10 мл толуола и наносят на колонку обычным способом. В качестве элюента используют смесь толуол-ацетон (9:1)· Отбирают фракции по 10 мл, состав которых определяют с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра, или с помощью метода ГЖХ. Фракции, содержащие хроматографически чистый метиловый эфир АК, объединяют, растворитель удаляют в вакууме (15 - 20 мл), а остаток растворяют в 25 мл петролейного эфира. Полученный раствор промывают последовательно водой (50 мл),

0,5 И раствором соляной кислоты (50 мл) и вновь водой (2 раза по 50 мл). Эфирный раствор сушат сульфатом натрия', фильтруют, растворитель удаляют в вакууме (15 - 20 мм) и получают 1,62 г химически чистого метилового эфира ЛК, чистоту которого проверяют методом ГЖХ.

Для приготовления арахидоновой кислоты полученный метиловый эфир ее (1,62 г) растворяют в 20 мл метанола (или этанола), добавляют 4 мл 50%ного водного раствора КОН и смесь перемешивают в токе азота при 40-50°С в течение 15 мин. После охлаждения до 25 - 30^йС к смеси при перемешивании в токе азота добавляют 50 мл разбавленной соляной кислоты (с1д°1 ,05) и ЛК экстрагируют петролейным эфиром (3 раза по 50 мл). Объединенные эфирные экстракты сушат сульфатом натрия, фильтруют, растворитель удаляют в вакууме (10 - 15 мм), а остаток досушивают при остаточном давлении 0,05 - 0,Об мм рт.ст. в течение 30 мин. Получают 1,48 г арахидоновой кислоты в виде прозрачного желтоватого масла с выходом 42,2%, считая ^:на исходные липиды.

Показатель преломления полученного образца АК составляет rij^l,4915 (по литературным данным п2.°1,4901) , иодное число 333,50 (среднее по результатам трех измерений), что совпадает с расчетным.

Число двойных связей в расчете на одну молекулу полученной АК по данным кулонометрического титрования (среднее по результатам трех измерений) и по значению иодного числа - 4,0.

По данным УФ- и ПМР-спектров полученный продукт представляет собой химически чистую арахидоновую кислоту.

По данным ГЖХ в стандартных условиях метилового эфира АК, приготовленного обработкой 5 мг АК диазометаном в эфирном раствора, содержание примесей в целевом продукте составляет менее 0,1% (в качестве внутреннего стандарта использовали метиловый эфир линолевой кислоты).

Аналогичные результаты были получены при использовании на стадии омыления метилового, пропилового и изопропилового спирта.

. Пример 2 . Использование отходов производства препарата Арахиден.

К 63, 4 отходов, представляющих смесь этиловых эфиров высших жирных кислот и содержащих по данным ГЖХ 3,2% этилового эфира АК, приливают 70 мл этилового спирта и раствор 10 г КОН в 20 мл воды. Смесь перемешивают в токе азота при 80°С в течение 1 ч,. затем отгоняют 50 мл спирта, а к остатку после охлаждения до 25 30°С при перемешивании добавляют 100 мл разбавленной соляной кислоты (d^°1,05) и извлекают смесь жирных кислот петролейным эфиром (2 раза по 100 мл). Объединенные экстракты промывают водой (2 раза по 150 мл), после чего сушат сульфатом натрия. Петролейный эфир удаляют в вакууме (10 - 15 мм), к остатку добавляют 300 мл серного эфира и полученную смесь подвергают кристаллизации при (~55) - (^_50)°С в течение 2 ч. Выдавший осадок отделяют обратным фильтрованием. От маточного раствора отгоняют растворитель в вакууме (10 - 15 мм), а остаток нагревают при кипении со 100 мл метанола в токе азота в присутствии 1 мл хлористого ацетила в течение 2 ч. Реакционную массу затем обрабатывают по методике, приведенной в примере 1. После фракционной перегонки в вакууме (0,05 “ 0,06 мм) выделяют фракцию с т. кип. 126 - 131°С (в парах), из которой получают 1,02 г химически чистой АК с помощью хроматографии на колонке с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра, и последующим омылением метилового эфира в условиях, описанных в примере 1.

Выход арахидоновой кислоты составляет 50%, считая на исходную смесь этиловых эфиров высших жирных кислот.

Чистоту полученного образца АК доказывают методами, указанными в примере 1.

Характеристики продукта идентичны полученным в примере 1.

Аналогичные результаты были получены при использовании на стадии омыления метилового, пропилового и изопропилового спиртов.

Применение предложенного способа получения АК позволяет использовать большое количество липидных отходов производства эндокринных препаратов.

Claims (3)

1.Хроматографи  в тонких сло х. Под ред. Э. Штал . М., Мир, 1970, с. 236 - .

2.Физер Л., Физер М, Реагенты дл  органического синтеза, т. 2, М., Мир, 1970, с. 316 - 321.

3.Кей.тс М. Техника липидологии. М., MиpJ, 1375, с. 128 - 136.

k. Авторское свидетельство СССР по за вке № 2339+52/23flt, кл. С 07 С 57/02, 1976.

5- Авторское свидетельство СССР по за вке № 2 03863, кл. С 07 С 57/02, 1976 (прототип).