SU840107A1

SU840107A1 - Способ получени -гомосерина

Info

Publication number: SU840107A1
Application number: SU782601783A
Authority: SU
Inventors: Зинаида Михайловна Зайцева; Иван Димов Мургов; Сос Исаакович Алиханян; Леонид Афанасьевич Музыченко; Нелли Исааковна Жданова; Иван Кузьмич Черемухин; Борис Борисович Васильев; Александр Михайлович Лужков; Валерий Семенович Роговер; Наталья Кирилловна Краева; Галина Александровна Великжанина; Виктор Узович Рошаль
Original assignee: Всесоюзный Научно-Исследовательскийинститут Генетики И Селекции Промыш-Ленных Микроорганизмов
Priority date: 1978-04-04
Filing date: 1978-04-04
Publication date: 1981-06-23
Also published as: FR2421943B1; YU80879A; IT7921548A0; FR2421943A1

Description

{

Изобретение относитс к микробиологической промышленности, а именно к способу получени Ь-гомосерина, вЛ5пощегос промежуточным продуктом биосинтеза метионина, треонина и изолейцина во всех живых организмах и используемого в парфюмерной промышленности в качестве важного компонента косметических кремов ОЛЯ увлажнени кожи.

Известен способ -получени L -гомосерина с использованием треонинзависимого мутанта h d ocarЪoc6cJst 1)$ утилизирующего углеводороды С - С в присутствии необходимых ростовых факторов (треонин, биотин, тиамин) и солей (фосфора, магни , микроэлементов). В культуральний жидкости накапливаетс до 6,5 г/л гомосерина l .

Недостаток указанноги микробиологического способа получени Ь -гомосерина заключаетс в том, что при осуществлени его микроорганизмы вьфашивают на питательных средах с чистыми сахарами (глюкоза, мальтоза), а в качестве источника ростовых факторов испсшьзуют либо чистые аминокислоты (треонин) и витамины (биотин, тиамин), либо содержащие их дорогосто щие и дефицитньте препараты, например экстракт печени.

Известен также способ получени U гомосерина путем глубинного культивирс вагш продуцирующих его треонинзависимых микроорганизмов вида BrevitoCteHuwi Ес«ии1или Cc«r: «et)acteHuni ybutatflicum в услови х аэрации на питательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, минеральный азот и другие необходимые соли в присутствии источника ростовых веществ. Используемые щтам мы по этому способу выращивают в колбах на качалке на питательней среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу или мальтозу, а в качестве источников ростовых факторов - экстракт печени, . -амннили чистые аминокислоты (треонин) и витамины (биотин). Па синтетической питательной, среде с чистыми препаратами треонина и биотина мак38 симальиый уровень накоплени гомосерина составл ет - 12,4 г/л, на полусиНтетической (с применением экстракта печени и NZ -амина) - 7,3 г/л. Полученный гомосерин выдел ют с помощью ионообменных смол. Выход проаукта составл ет 61 % 2j. Недостатком способа вл етс использование в.качестве источников углерода чистых углеводш (глюкоза мальтоза), а в качестве источника ростовых факторов - дорогосто щих комплексных препар тов NZ-амина (фирменный препарат) и . экстракта печени. Цель изобретени - повышение рыхода Z-гомосерина. Поставленна цель достигаетс теМ; что в качестве треонинзависимых микро- организмов - пропуцентов из видаБУбУ boct-eriuvniCavuwi используют штампBi evibacteriurv fBavuwi В-1О06, или из видаСоп- пеЪасЬеучиуи «yCutaw-ik.um штамм Сог5 пеЪас-ьег1ип Cutctm-iltum вНИИгенетика 49-7, При этом культивирование вепут на пйтате ьной среде, содержащей в качестве ассимилир;55 емых источников углерода мелассу, гипрол, сахар, ацетат или уксус ную Кислоту, а Б качестве источника рос 7 товых веществ используют кукурузный экстракт или гидропиааты растительного, животного или микробного белка, или авто- лизаты или гидролизаты дрожжей. В качестве штаммов-продуцентов примен ютс треонинзависимые мутанты ВлгiBavuwi В-10О6 и Cor-g-eutawcuw ВНИИгенетика 49-7, В отличие от извест ных продуцентов предтагаемые культуры характеризуютс способносты 5 накапливать на синтетической среде до2О-21г/д L -гомосерина. Культуры хран тс в музее промышленных культур микроорганизмов ВНИИгенетика и имеют регистрационный номер. 1006 и 1505, соответственно. Мутант Br.f Вшит В-1О06 получен из штамма такого типа B -feqvun)ATCC 14О67 в результате комбинированного ES03действи двух мутагенов - Уф лучей и этиленимина (ЭЙ), мутант CongCutamicuvM ВНИИгенетик-а 49-7 - из штамма дикого типа Сог. g ButaMiicuniATCC 13032 в результате воздействи химического мутагена - нитрозогуанидина. Культурально-морфологическа харак еристика штаммов-продуцентов Ь -гомосерина приведена, в таблице.

Штамм

BrevitecteHuvYi 8avuwi

Характеристика В-1О06

Клетки овальные, длиной 1,52 ,5 мк, бесспоровые, неподвижные , грамположительные,

А ) На п тые сутки роста при колонии диаметром 4 - 5 мм, круглые с гладким краем, центр приподн т в виде корпуса, поверхность гладка , блест ща , цвет Желтовато-кремовый, На вторые сутки рост штриха умеренный, край гладкий, поверхность блест ща , плотна .

Рост по уколу умеренный, в основном на поверхности ере ды.

CxsrvnebacteHuvM g Buiurnicuwt

ВНИИгенетика 49-7

Клетки овальные, длиной 1,0-2,0 мк, бесспоровые, грамположительные, неподвижные. .

На п тые сутки роста при 28 С

колонии диаметром 3-4 см, К|эуглыё с гладкими краем, центр приподн т , по «раю концентрическа складка, поверхность гладка , блест ща , цвет кремовый.

На вторые сутки рост штриха yMepeitный , поверхность блест ща , плотна .

Рост по укочу умеренный, в основном на поверхности среды.

Штамм

BrevibacteriuYM itavum

Характе ристика

V

инеральна

Дл роста необходим биотин, реда Гловера тиамин, и треонин. На п тые с глюкозой сутки роста колонии диамет- ром 2,0-2,5 мм светлокремового цвета. Рост штриха на 3-е сутвд умеренный, плотный.

изиол огичесТемпература: растут при 2О37 с , оптимум 28-ЗОс, ие свойства рН: растет при 6 - 9, оптимум 7,0-8,0. Углеводы: хорошо утилизируют Глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, хуже галактозу, не используют лактозу, не гипролизуют крахмал. Спирты: использ)тот этанол, инозит, используют, но не утилизируют сорбит, маннит, оульцит, глицерин.

С ганические кислоты: хорошо используют уксусную кислоту, хуже молочную.

Источники азота: хорошо усваивают аммонийный азот (МНДСе (N«4 )2504 мочевину, и т.о.) не усваивают нитратный азот. Обладают уреазной активностью. Жела-тину не разжижают. Дл осуществлени процесса биосинтеза гомосерина культуру микроорганизма выращивают на агариз1жашсой питательной среде Хоттингера в течение ОЕЩОЙ сутки при 28-30 С. Затем суспензию клеток передают в колбы с посевной средой, сооержащей мелассу 4%, кукурузный экстрак 3% и NoiCC 0,4%, и провод т вырашивание на качалках (22О об/мин) в течение су ток. Выросший посевной материал передают в количестве 3-10% в основную ферментационную срецу. Процесс ферментации осу1дествл ют либо в колбах на качалке , либо в ферментере, объемом О,5- ЮО.ОО тыс.л. при интенсивном перемешиПродолжение таблицы

, Oor helDcic teHum QfCutawicum ВНИИгенетика 49-7

Дл роста необхопим биотин и треонин . На п тые сутки колонии диаметром 1,О-2,О мм светло-кремового цвета. Рост штриха на вторые сутки умеренный, плотный.

Температура: растут при 2О-37 С, оптимум 28-30 С, рН: растет при б - О, оптимум 7,О-8,О. Углеводы: хорошо утилизируют глюкозу, фруктозу , сахарозу, мальтозу, хуже галактозу . Ксилозу, мэннозу, не используют лактозу, не гиоролнзуют крахмал .

Спирты: слабо утилизируют этанол, не используют глицерин, дульцит, маннит.

Органические кислоты: хорошо используют уксусную и молочную кислоты, хуже фумаровую, нтарную, пировиноградную.

Источники азота: хорошо усваивают аммонийный азот, мочевину, не усваивают нитратный азот. Обладает уреазной активностью. Желатину не разжижают. вашга и аэ{эации в течение 6О-72 ч, при 24-32 0, рН 6,5-7,7 на питательной среоЁ, сооержашей источники углерода, например сахарозу, глюкозу, мелассу и гидрол, источники минеральвого. азота, , например соли аммони , хлористого , сернокислого , азогйокислого и др., мочевину соли фосфора, например фосфаты кали , аммони , и пр., соли магни , например сульфаты, хлсфиды и пр., источники рос товых факторе, например гидролизаты, кислотные или ферментативные микробного (собственна биомасса) Или дрожжевого белка, пилучеиного на углеводородах нефти БВК или древесных гицролизатах.

гиоролизаты лакгоальбумина арахисового.) соевого, подсолнечного или соевого шротов

автолизаты дрожжей ( или кормовых ), кукурузный экстракт и т.д., а также чистые препараты L -треонина, . d -биогина (или оестиобиотина) и тиамин

Через 6О-72 ч ферментации культуральна жидкость содержит, г/л: L-гомосерин 6-20; L-лизин 5-11; аланин 1,5, L-глутаминова кислота 0,2-5,3, валив 0,9-1,2.

Гомосерин можно выоелить в виде кристаллов или получить в виде технического препарата, представл ющего собой концентрат (жидкий или сухой), получавмый упариванием культуральной жидкости совместно с биомассой. Технический П1эепарат L-roMocepHHi получают в виде порошка без напол11ител (гигроскопическа форма), либо с наполнителем, напри- мер пшеничными отруб ми или Са(ОН) (негигроскопична форма).

Дл стабилизации гомосерига в культур альную жиокость в конце процесса добавл ют нес или HjSCi до рН 1,52 ,0, или бисульфит натри 0,3%,. хлороформ 0,3-1,О% и другие антисептики.

П р и м ёр 1 ,Односуточную культуру BreV.itavuwi В-1006, выращенную на кос ках с агаром Хоттингера, пересеивают на жидкую питательную среду , имеющую состав,%:

Меласса4,0

Кукурузный

экстракт2,0

NaCt0,4

Выращиваш1е посевного материала провод т в колбах Эрленмейера объемом 250 мл (объем среды 30 мл) на качалке (200-220 об/мин) при 20±1°С и пепередают в количестве 5% в ферментационую среду Следующего состава,%:

Глюкоза15,О

(,5

.-7H200,О4

КИдРО 0.3

.Feso -TH o0,001

Ми 504-74,00,001

Треонин0,03

СаСОз5,0

БИОТИН1,2 .

Тиамин2О

Ферментацию осуществл5пот в колЬах Эрлейнмейергз объемом 750 мл (объем среды 25 мл) на качалке (220 об/мин) при в течение 66-72 ч. В конце ферментации культуральна жидкость содержит, гл: Ь-гомосерин 12,6 и L -лизин 5,2,

Из культуральной жидкости L- гомо ,серин можно выделить известным способом в виде кристаллов.

П р и м е р 2 . Культура, способ приготовлени посевного материала и услови основной ферментации, как в примере 1. Отличием вл етс состав ферментационной среды, содержащей следующие компоненты,%:

Сахар технический. 15,0

Автолизат ВВК (аминный азот

О,В%)1,5

(NH4)i5043,0

К2.ЦРР41,15

/WgrBO -THjO0,06

,0

Через 72 ч выращивани в культураль ной жидкости накапливаетс г/щ: L-гомсерин 13,3, L-лизкН 6,3 и аланин 1,3

П р и м е р 3 . Культуру . ЕаVUVW В-1ОО6 выращивают на посевной среде согласно примеру 1. Биосинтез гомосерина осуществл ют в колбах Эр- лейнмейера объемом 25О мл (объем среды - 12 мл) на качалке (220 об/мин при 29:+1с в течение Зсут. на питательной среде следующего состава,%:

Меласса

20

Нд)2504

2,6

КзНРО

0,2

0,05

СаСО,,

ЗО

Гидролизат

БВК(сернокислый )

0,75(на технически вес БВК).

Через 72 ч выращивани в культуралной жидкости накапливаетс г/л,: U -гомосерин 12,5 L-лизин 8,2 и аланин 0,8

П р и м е р 4 . Ферментацию провод т по примеру 3. Отличием вл етс состав ферментационной среды. В качестве источника ростовых факторов испильзу ют кислотный Гидролизат хлопкового шрота в количестве .

Через 70 ч вьфащивани продуцента в культуральной жидкости накапливаетс г/л,: L-гомосерин 9,8 и I,-лизин 8,5.

Claims

П р и м е р 5 . Односуточную культуру Cor.grEutamiCum ВНИИгенетика 49-7 выращивают на посевной среде по примеру 1. Основную ферментацию осуществл ют на питательной среде слеаун щего состава, %: Меласса Кукурузный 2,0 (по экстракт техническо му весу) ( N«4)2604 2,5 СаСО 2,0 Режим культивировани по примеру Через 72 ч выращивани продуцента в культуральной жиокости содержитс , г/л L - гомосерин 9,4/ L -лизин 6,2; L -глут минова кислота 2,3 и1;аланин 3,0. П р и м е р 6 . Культура и способ приготовлени посевного материала как § примере 1. Основную ферментацию провод т в ферментаторах (емкость 0,5 л) при интенсивном перемешивании (мешалка 60О-800 об/мин) и аэрировании (GJ 1: об/мин) при 29tl,cf С в течение 72 ч на питательной среае,%: Меласса17,О CNH4)2S042,5 КпНРО.0,15 Mg-504-7H2O0,05 Ферментолизат БВК ( аминный азот1,8%)2,2 CaCOj3,0 В конце ферментации через 96 ч культуральна жидкость содержит, г/п: U- гомосерин 8,3 и Ь-лизин 9,3, Полученную культуральную жидкость пос ле добавлени 0,3% бисульфита натри (по массе) в виде кристаллов или водно го раствора упаривают под вакуумом (о таточное давление О,07-О,2 ат) до 25-55%-ного содержани (по массе) сухих веществ при минимат.но-возможн тепловом возсействии (до 15 мин), например в проточно-пленочном испарител или в аппарате с падающей пленкой жид кости. В готовом продукте содержитс Ь -гомосерина - 15-25 г/л. П р и м е р 7 . Культура Вг- f ta В-1006. Выращивание посевног материала осуществл5п6т в две ступени. На первой ступени пи примеру 1, На второй ступени - посевной материал выращивают в ферментах емкостью Ю в течение 16-22 ч на питательной сре с мелассой (4%), кукурузным экстракто ( 3%) и (0,4%), использу дл засева посевной материал из маточных колб в количестве 0,01-0,001% (по объему). Дл засева ферментационной среды используют посевной материал пто рой ступени, передава его в количестве 2-1О% (по объему). Основную ферментацию гомосерина осуществл ют в рабочих ферментах емкостью 10О м на ферментационной среде следующего состава, %: Меласса17,О Кукурузный экстракт3,0 ( МНд)2 Р04О Mg-S04-7H{tO0,05 Ферментацию провод т при при аэрации 0,5-1,0 объем возЦуха на I объем среды в 1 мин при посто нно работающей мещалке, имеющей 180об/ми1Г. рН в ходе процесса подиерживают на уровне 6,8-7,7 добавлением соответствующего реагента ( или НС1). Через 68 ч культивировани в культуральной жидкости накапливаетс , г/л: L-Гомосерин 10,3 и Ь -лизин 8,3. Полученную культуральную жидкость упаривают по примеру 5 и высушивают на распылительной сушилке, преиварител -. но довед .рН концентрата до 11,5-12,0, например добавлением измельченной Са(ОН)2 (10-30% извести от массы веществ ксшцентрата) при температуре теплоносител на вхосе 170-35О С и на выходе 8О-120 С, Полученный концентрат представл ет собой воздушносухой псрошок, содержащий 4% гомосерина , 3% лизина, О,05-О,8% валина и 0,5-1,5% аланина. П р и м е р 8 . Культуру Bt-f aVUW В-1ОО6 вьфшцивают на посевной среде по примеру I и передают в количестве 5% (по объему) в ферментационную среду следующего состава,%: Ацетат N«4Pt8 Глюкоза2,0 К2 ЦР040,2 THsfO0,5 Автолизат БВК (аминный азот 1,О%)2,5 Ферментацию провод т в ферментерах емкостью 0,5 л, оборудованных системой терморегул ции, датчиками измерени рО и рН , а также устройством, обес .печивающим автоматическое подоержание рМ на заданном урсдане. Ферментацию провод т щ)и посто нно работающей мещалко (80О об/мин) в посто нно подаваемом через барбатер ,-воздуха (1;1 об/мин). рН среды перед началом процесса 6,56 ,8, Через 6-8 ч ферментации после достижени уровн рН 7,4-7,6 включает;СЯ подача подпитки, осуществл ема автоматически по сигналу рН-цатчика. Состав используемой подпиткиД: Ацетат13,5 Ацетат46,5 Через 72 ч ферментации расходуетс 118 мл подпитки. В культуральчой жис кости накапливаетс 12,6 г/л Ь -гомойерииа и 11,5 г/л Ь-лизина. Таким образом, как показано в примеpax , предлагаемый способ позвол ет получить Ь -гомосерин как на синтетических , так и на комплексных питательных средах, т.е. на средах, содержащих раз личные щеточники углерода и доступное и дешевое техническое сырье. Предлагаемые новые штaммь -пpoдyцeнты гомосерина синтезировать до 20 г/л продукта. Способ рекомеидован к внедрению на предпри ти х микробиологической промыш лвнности дл производства Ь-гомосерина в кристаллической форме или в форме технического препара:та (концентрата). Формула изобретени 1. Способ получени Ь -гомосерина путем глубинного культивировани проду цирующих его треонинзависимых микро- . организмов видaБi viЪacte iuщ iEovum или CorvnebacteHum g tutamicum 64 7.12 в услови$1х: аэрации на питательной среце, содержащей ассимилируемые источники углерода, минеральный азот и другие необходимые соли в присутствии источНИКОВ ростовых веществ., отличающийс тем, что, с целью повышени выхода U-гомосерина, в качестве треонин зависимых микроорганизмов- продуцентов из видaS 6viЪacteHulт ftovum используют штамм B evilaac-teHuw fbdvuni В-1006, или из видаCoi webacteHuVn gtutct л-icum штаимл CorvnebactftHum gtotxjmicum ВНИИгенетика 49-7. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с тем, что культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве ассимилируемых источников углерода мелассу, ги1фол, сахар, ацетат или уксусную KiicnoTy, а г качестве источника ростовых веществ используют куку рузныйэкстракт или гидролизаты растительного , животного или микробного белка , или автолизаты ил1 гидролизаты дрожжей. Источники инфо,эмации, прин тые во внимание при экспертизе 1.Патент Франции № 1581254, кл. С 12 D , опублик. 1965.
2.Патент Франции № 13О6О15 кл. С 12 ТЭ , опублик. 1965.