слcl
0505
Э Изобретение относитс к области биохимии, а именно к способам полу чени препарата фермента терминаль ной дезоксинуклеотидилтрансферазы (дНТФазы)из тимуса теленка и може быть использовано дл анализа на содержание фермента ДНТФазы в клеточных экстрактах животных тканей. Получаемый препарат после его иммо билизации может быть использован в процессах получени олиго- и по лидёзоксинуклеотидов. Известен спбсоб получени препарата терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы из тимуса теленка состо щий из следующих стадий: 1,Экстракци фермента из предва рительно измельченного сырь К-фос фатным буфером, рН которого обычно 7,4+0-,05, отделение экстракта от остатков сырь , 2.Хроматографирование экстракт на фосфоцеллюлозе р-11 с десорбцие фермента К-фосфатным буфером рН 7,2+0,05; 3.Пропускание десорбируемого раствора, содержащего фермент, через диэтиламиноэтилцеллюлозу дл удалени нуклеиновых кислот; 4.Рёхроматографи раствора, по лученного на предыдущей стадии, на фосфоцеллюлозе Р-11 (длительность 20-40 ч); 5.Концентрирование, дезоксинуклеотидилтрансферазы обработкой раствора (НН4)2ВО В количестве 55% рт степени насыщени , перерастворе ние полученного осадка в КгфосфатЬом буфере рН 7,2. Расход фосфоцеллюлозы на проведение i цикла выделени 6-8 г, смола используетс в 3-4 циклах. Недостатками способа вл ютс использование фосфоцеллюлозы Р-11 дл сорбции ДНТФазы из гомогената тимуса. После 3-4 регенераций емкость фосфоцеллюлозы Р-11 падает 2 раза, что делает ее непригодной дл дальнейшего использовани в процессе выделени ДНТФазы. Процес регенерации фосфоцеллюлозы длителе он включает промывки фосфоцеллюлоэыО ,15н.НС1 в 50%-ном этаноле, во дой, 0,15 н. NaOH с 0,005 М ЭДТА и вновь водой. Регенерацию ведут в течение 2-5 сут в зависимости от количества фосфоцеллюлозы. Проведение рехроматографии ДНТФазы на фосфоцеллюлозе Р-11 вл етс длительным процессом - нане сение раствора ДНТФазы на колонку с Р-11 ведут в течение 20-40 ч. Препарат, полученный дантзм сп собом, содержит помимо целевого фермента примесь фосфодиэстеразы ( т а, разрушающего олиго- и полинуклертиды) .1 После икмобилиза препарата, полученного на стадии 5, получают препараты иммобилизованной ДНТФазы, содержащие до 0,5 ед,акт/мг ФДЭ. Использование таких препаратов иммобилизованной ДНТФазы в синтезе дезоксиполимеров затруднено ввиду высокого содержани фосфодиэстеразы. Цель изобретени - упрощение процесса получени препарата ДНТФ- азы,пригодного дл использовани в синтезе полидезоксинуклеотидов и улучшение качества препарата за счет снижени содержани фосфодиэстеразы в препарате. Это достигаетс описываемым способом получени препарата ДНТФазы из тимуса теленка, который заключаемс в экстракции фермента из измельченного сырь К-фосфатным буфером (обычно имеющим рН 7,4+0,05), отделении экстракта, хроматографировании его на целлюлозном .сорбенте аминоэтилцеллюлозе с иммобилизованной на ней дезЪксирибонуклеиновой кислотой в количестве 45-70 t-tr/r сорбента с десорбцией фермента К-фосфатным буфером рН 7,2±0,05 с последующим пропусканием получаемого десорбируемого раствора через диэтиламиноэтилцеллюлозу . Отличительным признаком данного изобретени вл етс использование в качестве целлюлозного сорбента при хроматографии экстракта аминоэтилцеллюлозы с иммобилизованной на ней дезоксирибонуклеиновой кислотой в количестве 45-70 мг/г сорбента (ДНК-АЭ-целлюлозы), способ получени которой описан. Таким образом, описываемый способ позвол ет сократить длительность процесса за счет сокращени числа стадий до трех. В результате проведени этих трех стадий выделени ДНТФазы получают препарат фермента с удельной активностью по включению дезоксидейозиинтрифосфата 1000-1500 ед/мг, т.е, такой же, как после 5 стадий способа, - прототипа. Кроме того, этот препарат не содержит даже следов .фосфодиэстеразы - фермента , разрушающего полинуклеотиды. Выход ДНТФазы составл ет 14000 18000 ед.акт, из 100 г тимуса. Расход ДНК-АЭ-целлюлозы на проведение 1 цикла выделени ДНТФазы из 100 г тимуса составл ет 12-20 г, сорбент может быть использован как минимум в 9 циклах. Как показали опыты по. многократному использованию ДНК-АЭ-целлюлозы дл выделени ДНТФазы из гомогената тимуса, хроматографические свойства ДНК-АЭ-целлюлозы не ухудшились в результате проведени 9 циклов выделени : выход и удельна активность препараThe invention relates to the field of biochemistry, namely to methods for preparing the terminal deoxynucleotidyl transferase (dNTPase) enzyme preparation from calf thymus and can be used to analyze the content of the DNTPase enzyme in cellular extracts of animal tissues. The resulting preparation, after its immobilization, can be used in the processes of obtaining oligo- and lidoxox nucleotides. The preparation of the preparation of terminal deoxynucleotide transferase from calf thymus is known, consisting of the following stages: 1, Extraction of the enzyme from the pre-crushed raw material K-phosphate buffer, pH of which is usually 7.4 + 0-, 05, separating the extract from the raw material residues, 2. Chromatography of p-11 phosphocellulose extract with desorption of the enzyme K-phosphate buffer pH 7.2 + 0.05; 3. Passing the desorbable solution containing the enzyme through diethylaminoethyl cellulose to remove nucleic acids; 4. Re-chromatography of the solution obtained at the previous stage on phosphocellulose P-11 (duration 20–40 h); 5. Concentration, deoxynucleotidyl transferase by treating the solution (HH4) 2BO In an amount of 55% of mercury saturation degree, re-dissolve the resulting precipitate in Kg phosphate buffer pH 7.2. The consumption of phosphocellulose for carrying out the i-cycle of release of 6-8 g, the resin is used in 3-4 cycles. The disadvantages of the method are the use of phosphocellulose P-11 for sorption of DNTPase from thymus homogenate. After 3-4 regenerations, the capacity of phosphocellulose P-11 drops 2 times, which makes it unsuitable for further use in the process of isolating DNTPases. The process of regeneration of phosphocellulose for a long time, it includes the washing of phosphocellulose, 15N.С1 in 50% ethanol, water, 0.15 n. NaOH with 0.005 M EDTA and again with water. Regeneration is carried out within 2-5 days, depending on the amount of phosphocellulose. The re-chromatography of DNTPase on phosphocellulose P-11 is a long process — applying the DNTPase solution on a column of P-11 is carried out for 20-40 hours. The preparation, obtained by itself, contains in addition to the target enzyme an admixture of phosphodiesterase (t a, which breaks oligo - and polynucletides) .1 After immobilization of the preparation obtained in stage 5, preparations of immobilized DNTFase containing up to 0.5 units, act / mg PDE are obtained. The use of such preparations of immobilized DNTPase in the synthesis of deoxy polymers is difficult due to the high phosphodiesterase content. The purpose of the invention is to simplify the process of obtaining a DNTPase preparation suitable for use in the synthesis of polydeoxynucleotides and to improve the quality of the preparation by reducing the content of phosphodiesterase in the preparation. This is achieved by the described method of preparing a DNTPase preparation from calf thymus, which consists in extracting the enzyme from the crushed raw material with K-phosphate buffer (usually having a pH of 7.4 + 0.05), separating the extract, chromatographing it on the aminoethylcellulose cellulose absorbent immobilized on it 45-70 t-tr / r desoxyribonucleic acid in sorbent with desorption of enzyme K-phosphate buffer, pH 7.2 ± 0.05, followed by passing the resulting desorbing solution through diethylaminoethylcellulose. A distinctive feature of the present invention is the use of 45-70 mg / g of sorbent (DNA-AE-cellulose), the production method of which is described, as a cellulose sorbent for chromatography of an extract of aminoethylcellulose with deoxyribonucleic acid immobilized on it. Thus, the described method makes it possible to shorten the process time by reducing the number of stages to three. As a result of carrying out these three stages of the isolation of DNTPases, an enzyme preparation with a specific activity on the inclusion of deoxydeiosyosine triphosphate of 1000-1500 units / mg, i.e., the same as after the 5 stages of the method, of the prototype, is obtained. In addition, this drug does not even contain traces of phosphodiesterase, an enzyme that destroys polynucleotides. The yield of DNTPase is 14,000 18,000 units of act, out of 100 g of thymus. The consumption of DNA-AE-cellulose for conducting 1 cycle of DNTPase isolation from 100 g of thymus is 12-20 g, the sorbent can be used for at least 9 cycles. As shown by experiments on. repeated use of DNA-AE-cellulose to isolate DNTPases from thymus homogenate, the chromatographic properties of DNA-AE-cellulose did not deteriorate as a result of 9 cycles of isolation: the yield and specific activity of the preparation