SU737359A1

SU737359A1 - Method of determining cholesterol total content in biological material

Info

Publication number: SU737359A1
Application number: SU782617133A
Authority: SU
Inventors: Леонид Васильевич Орлов
Priority date: 1978-05-16
Filing date: 1978-05-16
Publication date: 1980-05-30

Description

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ(54) METHOD FOR DETERMINING THE GENERAL CONTENT OF CHOLESTEROL IN THE BIOLOGICAL MATERIAL

Изобретение относитс к биологической химии, в частности к $изико-химиче КИМ способам определени общего содер жани холестерина, примен емым в научно-исследовательских и зооветеринарных лаборатори х. Известен способ определени общего содержани холестерина в биолот-ическом материале, в котором дл предотвращени вли ни липидны.х компонентов на инте1 сивность окрашивани и точность анализов общие липиды, предварительно выделенные с помощью органических растворителей, омыл ют, и цветную реакцию провод т с неомыл емой фракцией 0, раствором хлорного желе за в уксусной кислоте. Недостатком указанного способа вл етс его трудоемкость, так как он включает предварительную экстракцию общих липидов органическими растворител ми . Наиболее йшзким к предлагаемому способу вл етс способ, при кот о рбм провод т омылёние липидов в биологическом материале с помощью спиртового раствора щелочи, экстрагирование холестерина петролейньш эфиром, промыва,ние экстракта дистиллированной водой, упари ван:ие растворйтел и цветную реакцию с хлорным железом и уксусной кислотой . ГЖ1естаыГс оГоёеспечива6т бпрёделение оёщего содержани холестерина в таком биоло: йческом материале, как сйЫрШГа йрТЗЁИ, плазма, но он не применим1гл тканей животных. Недсктатком его вл етс такжэ сравнительно низка ч твствител ьность цветной реакции хопестеринй с хлор1ным же лезом. Цель изобрет-эни - повышение чувствительности способа при определении холестерина в ткан х животных. Цель достигаетс том, что омыление ли11идов провой т 25-.30%-ным спиртовым р&створом КОП в гечоиио 12-15 ч aria осуществлени одновременно и гид ролиза биологического материала, экстр гируют неомьш емую фракцию линидов петролейным эфиром, промывают экстрак дистиллированной водой, упаривают раст веритель и добавл ют сульфофосфованили новый реагент дл осуществлени цвет ной реакции. Пример. Среднюю пробу и тканей животных в количестве 0,2,- 0,3 г помещают в пробирку с 2 мл 25«-30%.-ного раствора КОН в воде с метанолом (1:1) и провод т одно- временный гидролиз биологического ма териала в течение ч при в термостате. Объем содержимого пробир ки довод т дистиллированной водой до 5 мл, прибавл ют 4 мл петролейного эфира, энергично встр хивают и после разделени фаз верхний слой отсасывают в другую пробирку. Затем дважды провод т экстрагирование 3 мл петролейного эфира. Объединенные экстракты сначала промь{6ают 6 мл 1н раствора КОН, а потом 2 раза 6 мл дистиллированной во ды и 0,1 объема экстракта упаривают в вакуумном шкафу при 40 Б-С или на вод ной бане при температуре С. К сухому остатку добавл ют 1 м ккмкчески чистой концентрированной серной кислоты, выдерживают 1О мин в кип щей вод ной бане или 20 мин при 105 С в термостате. В охлажденThis invention relates to biological chemistry, in particular to chemical and chemical IMC, methods for determining total cholesterol used in research and veterinary laboratories x. A known method for determining total cholesterol content in a biolabel material, in which, to prevent the influence of lipid components on the staining intensity and the accuracy of analyzes, total lipids, previously separated with organic solvents, are sieved, and the color reaction is carried out with uncleaned fraction 0, chlorine jelly solution in acetic acid. The disadvantage of this method is its laboriousness, since it involves the preliminary extraction of total lipids with organic solvents. The method most suitable for the proposed method is that the rbm is used to saponify lipids in biological material with an alcoholic alkali solution, extract petroleum ether cholesterol, wash the extract with distilled water, evaporate it: dissolve and color the reaction with ferric chloride and acetic acid. GZH-testayGS is designed to ensure that cholesterol is present in such a bio-logical material as syrinae, plasma, but it does not apply to animal tissues. It is also a relatively low frequency of the color reaction of chopesterol with chlorine iron. The goal of the invention is to increase the sensitivity of the method in determining cholesterol in animal tissues. The goal is that the hydrolysis of liquefied liquids with a 25–30% alcohol P & T range of the CPC in 12-15 hours aria geo-tion and simultaneous hydrolysis of the biological material, extracts the remaining fraction of the lines with petroleum ether, washed with distilled water, evaporate the solvent and add sulfophosphate a new reagent to effect a color reaction. Example. An average sample and animal tissues in the amount of 0.2, -0.3 g are placed in a test tube with 2 ml of a 25 "-30% solution of KOH in water with methanol (1: 1) and simultaneous hydrolysis of the biological substance is carried out. material for hours when in the thermostat. The volume of the contents of the tube is brought to 5 ml with distilled water, 4 ml of petroleum ether are added, shaken vigorously, and after separation of the phases, the upper layer is sucked off into another tube. Extraction is then carried out twice with 3 ml of petroleum ether. The combined extracts are first washed with 6 ml of 1N KOH solution, and then 2 times with 6 ml of distilled water and 0.1 volume of the extract evaporated in a vacuum oven at 40 ° C or in a water bath at temperature C. To the dry residue is added 1 m of a clear pure sulfuric acid, incubated for 10 min in a boiling water bath or for 20 min at 105 ° C in a thermostat. In cooled

25 50 100 15О 200 25О 40025 50 100 15О 200 25О 400

- 1- one

ОABOUT

. 1 + 5 . 94 ную пробирку приливают 2 мл фосфованил шсвого р.еактива, состо щего иа 1 части 0,й%«-ного водного раствора ванилина и 4 частей ортофосфорной кислоты, энер. гично встр хивают, выдерживают в течение 45 мин при комнатной температуре дл развити стабильного малинового окрашивани в течение 24 ч и колориметрируют при длине волны 56О мм в кю«вете с толщиной сло 5 мм против сле пой пробы с 1 мл концентрированной серной кислоты и 2 мл фосфованилиново- го реактива. Положительный эффект предлагаемого способа по сравнению с известными сос тоит в том, что достигаетс стабильное цветное окрашивание в течение 24 ч, высока чувствительность и, кроме Toino, повышаетс производительность на 10- 20%, .Нар ду с этим, исключив предварительное экстрагирование общих липидов, на 1 анализ экономитс 25 мл смеси диэтилового эфира и этанола в объемном соотношении 3:1 или 50 мл смеси хло реформа и метанола в объемном соотношении 2:1, Кроме этого все анализы можно проводить в мерных пробирках без испсшьзовани мерных колб и делительных воронок, Сравнение предлагаемого способа с известным способом определени общего содержани холестерина приведено в таблице .,. 1 + 5. 94 ml of a test tube is poured with 2 ml of phosphonate of a long-acting reagent, consisting of 1 part 0, a% aqueous vanillin solution and 4 parts of orthophosphoric acid, ener. Shake gently, incubate for 45 minutes at room temperature to develop a stable crimson dye for 24 hours and colorimetrate at a wavelength of 56O mm in a 5 mm thick clump against a sample from 1 ml of concentrated sulfuric acid and 2 ml phosphaniline reagent. The positive effect of the proposed method as compared with the known cases is that a stable color staining is achieved for 24 hours, high sensitivity and, besides Toino, productivity increases by 10-20%. In addition, eliminating the preliminary extraction of total lipids, per 1 analysis saves 25 ml of a mixture of diethyl ether and ethanol in a volume ratio of 3: 1 or 50 ml of a mixture of chloroform and methanol in a volume ratio of 2: 1. In addition, all analyzes can be carried out in measuring tubes without measuring flasks and Yelnia funnels, comparing the present method with the known method of determining total cholesterol is shown in Table.,

Claims

Claims A method for determining total cholesterol content in a biological material, including lipid saponification with an alcoholic alkali solution, extracting the unwashed lipid fraction with petroleum ether, washing the extract with distilled water, evaporating the solvent, and adding a reagent to perform a color reaction.

7373SS

About the fact that, in order to increase the sensitivity of the method in determining cholesterol in animal tissues, saponification of lipids is carried out

25-30% -. Nom alcoholic solution of KOH for 12-15 h for the implementation of simultaneous and hydrolysis of bi (Biopsy material and, as a matter of fact, for the color reaction use sulfophosphate reagent.

Hs -4hj - / - i.bi ,,.