SU655326A3

SU655326A3 - Способ получени антибиотика

Info

Publication number: SU655326A3
Application number: SU762319154A
Authority: SU
Inventors: Кавагучи Хироси; Томита Кодзи; Фудзисава Кей-Ичи; Цукиура Хироси
Original assignee: Бристоль-Мейерз Компани (Фирма)
Priority date: 1975-10-30
Filing date: 1976-02-02
Publication date: 1979-03-30
Also published as: JPS5838158B2; JPS5257112A; US4108725A

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

;з

зрачный, беловатый, виоследсттзии цвет его переходит в темно-желтый. Слегка в зкий. Диффундирующий пигмент не образуетс .

Питательный бульон и бульон на дрожжевом экстракте. Обильный рост. Мутный. С течением времени может происходить образование осадка и иногда образование иленки.

с дрожжевым экстрактом. Рост только на поверхности. В анаэробных услови х роста нет.

Ограниченно растет при 4°С, умеренный до обильного наблюдаетс рост при температуре от 10 до 32С, плохо растет при 37°С и совсем не растет при 41°С. рН среды от 4,5 до 11,00, нрсдпочтительным вл етс рН 5,5-9,5.

Добавление NaCl вли ет на рост; при добавлении 12% NaCl нет роста, умеренный рост наблюдаетс при добавлении 5% NaCl или менее.

Штамм Pseudomonas sp. D 946-В 83 производит диффундируюгций флуоресцентный пигмент в некоторых средах.

Антибиотик получают выращиванием щтамма Pseudomonas sp. D 946-В 83 АТСС 31086 в аэробных услови х на питательной среде, содержащей: источники углерода , например, глюкозу, фруктозу, маннозу , глицерин; способный к ассимил ции источник азота, например, рыбную муку, соевую муку, пентоны; неорганические соли , например, соли натри , кали , аммони , кальци , фосфата, сульфата, хлорида, бромида, нитрата, карбоната.

Температура выращивани 28-30°С. рН среды 5,5-9,5, предпочтительно 7,0. Выращивание осуществл ют в течение 3-5 дней.

Если ферментацию провод т в чане, то получают вегетативный прививочный материал в питательпом бульоне инокулировани бульонной культуры косой или почвенной культурой или лиофилизированной культурой организма. После получени активного прививочного материала его асептически перенос т в среду чана дл ферментации.

Хорощо развивщийс на косом агаре щтамм Pseudomonas sp. D 946-В 83 используют дл инокулировапи затравочной среды, содержащей, %: глюкозы 3,0; рыбной муки 2,0; соевой муки 0,5; пептона 0,2; СаСОз 0,6. Перед стерилизацией устанавливают рН 7,0. Затравочную культуру инкубируют при 28°С в течение 48 ч на ротационной качалке и 22 мл культуры перенос т в 100 мл ферментационной среды, наход щейс в 500 мл колбе Эрленмейра, в которой находитс , %: глицерина 2,0; льн ной муки 2,0; арахисовой муки 1,0; рыбной муки 2,0; (НП4)25О4 0,3; СаСОз 0,5. Количество антибиотика достигает максимального значени через 3-5 дней при 28°С. Антибиотическую активность в фер4

ментационном бульоне определ ют методом определени диффузии в системе «бумажный диек-агар с использаванием Bacillus subtilis PCI 219. Получают антибиотика 1500-2000 мкг/мл.

После получени бульона оптимальной активности устанавливают рН 2, основной водорастворимый антибиотический комплекс отдел ют от мицели и раствор ют в

водной ферментационной ереде. Бульон фильтруют и фильтрат, содержащий антибиотик , нейтрализуют до рП 7 и пропускают через катионообменную смолу (амберлит в аммониевой форме). Затем смолу

промывают водой и -разбавл ют NH40n, а антибиотик элюируют со смолы подход nuiM элюентом. Активные порции элюента объеди}1 ют, копцептрируют и выпаривают или лиофилизируют с получением антибиотика . При ПОМОН1И тонкослойной хроматографии получают сырое твердое вещество, которое еодержит три активных компонента А, А2 и В, а также два неактивных компонента С и D.

Антибиотик раздел ют на компоненты А, Ад, В, С и D при помощи катионообменной смолы типа Амберлит G-50 в аммониевой форме. После растворени антибиотика в воде его обрабатывают смолой, промывают

водой, разбавл ют гидроокисью аммони и элюируют подход щим элементом. 20 и. гидроокись аммони позвол ет получить компоненты А и В, дальнейшее элюировани-е колонны более концентрированным раствором гидроокиси аммони нозвол ет получить компоненты С и D. Чтобы получить очищенный компонент А2, необходимо осуществить дополнительное хроматографирование па колонке фракции А е целью разделени компонентов А2 и А.

Антибиотическое вещество А представл ет собой белое аморфное основание, растворимое в воде, слегка растворимое в метаноле и этаноле и практически нерастворимое в н-бутаноле, ацетоне и других органических растворител х.

Антибиотик А способен образовывать соли при взаимодействии е кислотами. Фармацевтически применимыми вл ютс нетоксичные соли таких органических и неорганических кислот, как хлористоводородна , серна , фосфорна , уксзсна , стеаринова , пропионова , винна , малеинова ,

бензойна , нтарна и т. п.

Антибиотик А дает положительную реакцию с нингидривовым и антроповым реагентами , но отрицательные реакции с реагентами Tollens, Fehling и Sakaguehhi.

Удельное вращение (плоскости пол ризации ) компонента А в виде основани составл ет yj 78,5°.

Образец антибиотика А после осаждени из этанола был подвергнут элементному

5

анализу, согласно которому вещество имеет формулу C.oHaiNaOgXCsHsOHXHaO.

Вычислено, %: С 44,24; Ы 8,52; N 9,11; О 38.13.

Найдено, % :С 44,25; Н 8,08; N 9,11; О (по разнице) 38,56.

Ди-Ы-ацетат антибиотика А получают в виде бесцветных игл, т. пл. 149-150°С, мол. вес. 481 (осмометрическим методом).

Вычислено, %: С 45,68; Н 7,47, N 8,41; О 38,44.

С.эНзйМзОнНгО.

Найдено, %: С 45,673; Н 7,49; N 8,19; О (по разнице) 38,59.

Антибиотик А представл ет собой слабоосновное вещество и имеет способные к титпозаиию груплы, имеющие значени рКа 6,90 и 9,40 в воде. Нриблизительный молекул рный вес антибиотика, на основании вычислений по данным титровани , составл ет 398.

Антибиотический компонент А2, подобно компоненту А, описанному выше, представл ет собой белое аморфное основное вещество , которое растворимо в воде, слабо растворимо в метаноле и этаноле и практически не растворимо в н-бутаноле, ацетоне и других традиционных растворител х. Оно способно к образованию солей при взаимодействии с кислотами и фармацевтически применимых солей. Компонент АЗ дает положительную нингидриновую реакцию и положительную антроновую реакцию и отрицательные реакции при взаимодействии с реагентами Tollens, Fehling и Sakaguchi.

Дл основани АЗ 79.Г (с 0,43, Н.О).

Образец антибиотика А2, выделенный в виде карбоната, был идентифицирован как CieHasNsOgXVsHaCOs.

Вычислено, %: С 44,79; Н 7,75; N 9,50; О 37,96.

Найдено, %: С 44,35; Н 7,83; N 9,21; О (по разнице) 38,61.

Антибиотик В аналогичен по внещнему виду и растворимости антибиотикам А и АО и представл ет собой белое аморфное основное вещество, которое растворимо в воде, слегка растворимо в метаноле и этаноле и практически не растворимо в н-бутаноле , ацетоне и других традиционных органических растворител х.

Антибиотик В способен к образованию солей при взаимодействии с кислотами. Дает положительные реакции с нингидрином и антроном и отрицательные реакции с реагентами Tollens, Fehling и Salxaguchi.

Удельное вращение антибиотика В в виде основани составл ет a 85° (с, 1,0, вода).

Образец антибиотика В при осаждении из этанола был идентифицирован как CnHsaNsOoXCzHsOHyHaO,

G

Вычислено, %: С 42,95; Н 8,34; N 9,36; О 39,35.

Найдено, %: С 42,69; Н 7,78; N 8,86; О (по разнице) 40,67.

Ди-К-ацетат антибиотика В получают в виде бесцветных призм, т. нл. 159-162°С, мол. вее 484 (методами осмометрии).

Вычислено, %: С 44,53; Н 7,27; N 8,66; О 39,54. С,8Нзз зО„ХН,0.

Найдено, %: С 44,96; Н 7,44; N 8.52; О (по разнице) 39,08.

Антибиотик В представл ет собой слабое основание и имеет способные к титрованию группы со значени ми рК 7,15 и 9,35 в воде. Как было вычислено из данных титровани , приблизительный молекул рный вес антибиотика составл ет 409.

Биологически неактивный пптибиотп ский компонент D представл ет собой белое аморфное основное вещество, которое растворимо в воде, слабо растворимо в метаноле и этаноле и практическ нерастворимо в н-бутано.тс, ацетоне п других традиционных органических растворител х. Вещество D способно образовывать соли при взаимодействии с кислотами.

Компонент D дает положительные реакции с нингидрином и антроном, но отрицатель5 ые реакции с реагентами Tollens, Fehlinfj и Sakaguchi.

Удельное вращение компонента D в виде осиовани составл ет 72,5° (с 1,0, вода).

Образец компонента D, выделенный в виде карбоната, был идентифицирован как С.аНотЫзОзУНзСОз.

Вычислено, %: С 38,70; Н 7,25; N 10,42; О 43,63.

Найдено, %: С 38,86; Н 6,93; N 10,14; О (по разнице) 44,07.

Компонент D представл ет собой слабое основание и пмеет три способные к титрованию группы с величинами рК 6,95 (2 эквивалента) и 9,68 в воде.

Три-Ы-ацетат компонента D получают в виде бесцветных призм, т, пл. 159-162°С. Эта соль оказалась идентичной ди- -ацетату компонента В.

Определение структуры компонентов А и В.

.М гкий кислотный гидролиз компонентов А и В дает такое же дезацпльное соединенпе С 2Н97Хз08, которое идентично компоненту D, полученному хроматографнческим разделением сырого комплекса антибпотнка . Общее N-ацетилирование антибиотика дало три-Н-ацетат (С18НззКзОп), который был идентифицирован как ди-М-ацетат компонента В.

Кислый гидролиз компонента В в метанольном растворе хлористоводородной

кислоты (насыщенный раствор, температура начала отекани флегмы, 24 ч) прпводит к получению агликона н аминосахара совместно с компонентом D. Агликон выдел ют в виде крнеталличсского сульфата, т. пл. 263-264°С, который был кдентифицировап как CsHi6No04H2SO4.

Вычислено, %: С 25,90; Н 6,52; N 10,07; S 11,52.

Найдено, %: С 26,10; Н 6,47; N 9,93; S 11,29.

ЯМР-спектр, сн тый при 220 MHrN, о-гексаацетата этого вещества совместно с даннымн масс-спсктрального анализа, полученными при использовании N-ацетил-оTMS N-ацетил-диизопронилидена и гексаN-0 , N-ацетнл производных агликона, позвол ет предположить 1,4-диамино-2,3,5,6тетра-ольную структуру дл агликоновой части.

Ди-К-ацетат агликона получают в виде бесцветных игл, т. пл. 114-115°С.

Вычислено, %: С 45,45; Н 7,63; N 10,60.

C.oHzoNaOs.

Найдено, %: С 45,37; Н 7,97; N 10,57.

Аминосахарный фрагмент, полученный после описанного кис;1ого метанолиза компонента В, очнщают хроматографировапием на Амберлите G-50 и раздел ют на схи (3-формы метилгликозида, причем а-форма - основной продукт. N-ацетилированием а-метилгликозида получают вещество в виде бесцветных призм, т. пл. 185-186°С.

Вычислено, %: С 45,95; Н 7,28; N 5,95.

CgHirNOe.

Найдено, %: С 45,93; Н 7,43; N 5,88.

Масс-спектр этого N-ацетильного производного дает пик при т/е 204 (М-31), соответствующий потери молекулой гликозидной метоксильной группы. Таким образом , свободный аминосахар должен иметь формулу CcHisNOsа- и р-формы метилгликозида идентифицированы как метил-4-амино-4-диокси-а- и p-D-глюкопиранозид соответственно в результате сн ти ИК- и ЯМР-спектров их тетра-N, о-ацетилпроизводных. ИК-спектры искусственных образцов этих Сахаров, выделенных из 4-трехалосамина, соответствуют ИК-спектрам экеисрименталькых образцов .

Кислый гидролиз компонента D дает те же самые агликон и амикоеахар, что были выделены из гидролизата компонента В.

Компонент С, полученный хроматографическим разделением сырого комплекса антибиотика , подвергают гидролизу в среде метанола, содержащего 1 н. НС1, при температуре стекани флегмы в течение 3 ч. Агликоновый фрагмент идентичен этой части в других компонентах антибиотика, и фрагмент сахара идентифицирован как метил D-глюкозид с иомощью тонкослойной хроматографии, ЯМР- и хроматографии.

В опытах in vitro показано, что антибиотик и и 1дивидуальныо аитибиотические компоненты А, Д; и в обладают щироким

спектром антибактериальной активности. Антибиотик и активные компоненты ингибируют больи1инство аминогликозидустойчивых организмов. Обнаружено, что комповент А2 вл етс более активным по срав 1ению с компонентом В, но менее активен чем А.

Минимальную ингибирующую концентрацию А и В определ ют по отношению к

больщому количеству бактерий способом двукратиого разбавлени агара в чащкахс питательным агаром. Дл этой цели использ аот иноколумрепродуцирующее устройство . Количество прививочного материала поддерживают таким, чтобы оно составл ло разбавление в 10 раз оставленной на ночь культуры испытуемых организмов в сердце-пептонном бульоне (Direc). Удельные активности компонентов А и В

умеренные или достаточно слабые в отноп:енпи значений минимальной ингибиторной концентрации (МИК), причем комиоиен А в 2-4 раза более акт1:пеи, чем В. Однако они имеют широкий спектр антибактериальной активности против грамположительных и грамотрицательных бактерий , включающих многие аминогликозидустойчивые организмы и штаммы.

Установлено, что антибиотик с чистотой

30-40% ингибирует Е. соИ А 20365 при концентрации 12,5 мкг/мл, К. pneumoniae D-11 при концентрации 1,5 мкг/мл, и Ps. aeroginosa А 9930 при концентрации 25 мкг/мл.

Вли ние рН на МИК.

Вли ние рН среды на МИК комионента А изучают методом двойного разбавлени агара с иснользованием среды иитательного агара при рН 6,0, 7,0, 8,0 и 9,0. Результаты показывают, что активность компонента А увеличиваетс в среде с . щелочным рН и уменьшаетс в среде с кислым рН.

Вли ние среды на активность компонентов А и В изучают по отношению к 8-ми испытуемым организмам. В качестве испытуемых сред используют питательный агар, сердце-пеитонный агар и Mueller-Hintoorap. рН среды устанавливают 8,0. Наибольша

активность in vitro про вл етс при использовании в качестве испытуемой среды питательного агара.

Активность и токсичность компонентов А и В оценивают in vivo при экспериментальном заражении мышей. В качестве патогенных бактерий используют S. aureus snith, Е. coli № 1 HJ и Ps. aeroginosa A 9930. Мышей заражают 100X4050 дозой патогенов в 5%-ной сусиензии желудочного

муцина свиией, единичное иодкожное введение антибиотика осуществл ют немедленно после бактериального заражени (О ч) и двойную дозировку антибиотика ввод т через О или 3 ч после заражени .

Дл каждого дозировочного уровн исполь9

зуют группы в 5 мышей, н животных наблюдают в течение 5-ти дней дл определени средней защитной дозы LDooКомпоненты А и В про вл ют активность in vivo против всех трех испытуемых бактерий.

Острую токсичность компонентов А и В определ ют на мышах при подкожном и внутривенном применении. Мышей наблюдают в течение 15-ти дней. Внутривенна (i. V.) и подкожна (s.e.) LDso компонента А составл ет 2500 мг/кг и 1000 мг/кг соответственно . Компонент В значительно менее токсичен, чем А, и не вызывает смертельного исхода при дозировках вплоть до 2000 мг/кг как при внутривенном, так и при подкожном применении в течение 15дневного периода наблюдени .

Компонент D, хот он и вл етс биологически неактивным, представл ет собой ценное промежуточное вещество в полусинтстическом получении биологически активных KOjMnoH€HTOB А, А2, В. Так, например, свободна аминогруппа промежуточного вещества D (после соответствующей защиты других реакционноспособных функциональных групп) может быть подвергнута N-ацилированию в соответствии со способами , известными per se, с образованием (после удалени любых защитных групп) N-бутирильного производного А, N-ацетильного производного В и N-пропионильного производного А2.

Пример 1. Ферментаци в чане.

Штамм D 946-В 83 культуры Pseudomonas на косом агаре используют дл инокулировани 100 мл затравочной среды №83В (3% глюкозы, 2% рыбной муки, 0,5% соевой муки, 0,2% пептона и 0,6% СаСОз) в 500 мл колбах Эрленмейра. Колбы инкубируют при 28°С в течение Здней на ротационной мешалке (250 об/мин), и используют 1 л затравочной культуры дл инокулировани 300 л ферментационной среды № 100 (2% глицерина, 1% Pharmainedia , 2% рыбной муки, 2% муки льн ного семени, 0,3% (NH4)2S04, 0,6% СаСОз). Ферментацию в чане провод т при 30°С, перемешивании со скоростью 140 об/мин, при скорости аэрации 200 л/мин. Активность бульона определ ют методом «бумажный диск-пластина агара с использованием В. subtilis PCI 219 в качестве образца дл анализа и ВИ 2183 А - в качестве стандарта дл анализа. Полученные результаты представлены в табл. 1.

Пример 2 (экстракци ). Созревший бульон фильтруют при рН 2. Фильтрат (19 л), который содержит около 30 г антибиотика А, довод т до рН 7 и перемешивают с 13 л Амберлита LRS-50 (ЫН4+-форма ). Смолу отдел ют, промывают 10 л воды и 5 л 15 н. NH40H, затем перемешивают с двум 4-литровыми порци ми 2н. NH4OH дл элюировани . Активные .элюа10

Т а б л 1 ц а 1

10

15

ты объедин ют, концентрируют в вакууме и затем лиофилизируют с получением 18,6 г белого твердого вещества (около 700 мкг/мг). Это твердое вещество раствор ют в воде и пропускают через колонку с Амберлитом G-50 (НН4+-форма, 400 мл). Колонку промывают 2,2 л воды и 3 л 4 н. NH40H и затем элюируют 20 н. NH4OH. Элюаты собирают по фракци м и исследу5 ют методом биологического анализа на пластине с В. subtilis, а также методом тонкослойной хроматографии (система S-117, нингидрин).

Соответствующие фракции объедин ют, концентрируют в вакууме и лиофилизируют с получением твердых веществ. Результаты представлены в табл. 2.

Таблиц а 2

35

40

45

Пример 3. Получение компонента А. Сырой образец компонента А (2,7 г), полученный в примере 2, раствор ют в воде и пропускают через колонку с Амберлитом G-50 (NH4+, 80 мл). Колонку элюируют 20 н. NH40H и каждые 15 мл элюата собирают при помощи фракционного сборника . Фракции исследуют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и реакцией на нингидрин, а также биологическим анализ (1м. Соответствующие фракции объедин ют , концентрируют в вакууме и лиофилизируют с получением твердых веществ. Результаты представлены в табл. 3. Чистый препарат компонента А идентифицирован как CisHaiNsOgXAnoCOa.

Вычислено, %: С 43,45; Н 7,53; N 9,81. Найдено, %; С 43,22; Н 7,52; N 9,49.

11

Таблица 3

12

объедин ют, концентрируют в вакууме н лиофилизируют с получением твердых веществ . Результаты представлены в табл. 5,

Таблица 5

Пример 4. Получение компонента В.

Сырой образец компонента В (3,3 г), полученный в примере 2, раствор ют в воде и пропускают через колонку с Амберлитом G-50 (NH4+, 130 мл). Колонку элюируют 20 н. NH4OH, и каждую порцию элюата---по 15 мл- собирают фракционным сборником. Фракции исследуют методом тонкослойной хроматографии и реакцией на нингидрин, а также биологическим анализом. Соответствующие фракции объедин ют , концентрируют в вакууме и лиофилизируют с получением твердых веществ . Результаты представлены в табл.4.

Таблица 4

Чистый препарат компонента В идентифицирован как С14Н29МзО9Х 2Н2СОз.

Вычислено, %: С 42,02; Н 7,30; N 10,14.

Найдено, %: С 41,92; Н 7,43; N 9,93.

Пример 5. Получение компонента С и компонента D.

Колонку, используемую в примере 2, далее про вл ют 1,4 л 20 н. NH4OH, в результате чего не происходит элюировани биологически активного вещества. Затем колонку цро вл ют 10 н. NH40H, и элюаты исследуют методом тонкослойной хроматографии с опрыскиванием нингидриновым реагентом. Соответствующие фракции

Пример 6. Получение компонента АЗ. В ходе процесса очистки компонента А, описанного в примере 3, выдел ют активный компонент из предыдущих фракций, который обозначен как компонент АЗ. Его отдел ют от компонента А системой дл тонкослойной хроматографии S-117 и8-122. Результаты представлены ниже:

ААЗ

S-1170,490,57

S-1220,390,48

Claims

Формула изобретени

Способ получени антибиотика общей формулы

снок

сн

он о

CrfflH

снон

где R - CHsCHsCONH, CHgCONH,

СНз(СН2)2СОЫН, NH2,

отличающийс тем, что штамм Pseudomonas sp. Д 946-В 83 АТСС 31086 выращивают в аэробных услови х на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при рН 5,5-9,5 и температуре 10-32°С с последующим выделением целевого продукта в свободном виде или в виде производных солей.