JPS5838158B2 - 新抗生物質コンプレツクス - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｂｕ−２１８３と命名される新アミノグリコ
シド抗性物質コンプレックスに関するものであり、この
ものは、シュードモナス （ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）種Ｄ９４６−Ｂ８３株
と命名されるシュードモナスの新株（ＡＴＣＣ３１０８
６号）を同化可能な窒素および炭素源を含有する栄養培
地中深部好気性条件下に該培地中該微生物によって実質
的な量のＢｕ−２１８３コンプレックスが生じるまで培
養し、培地からＢｕ−２１８３コンプレックスを任意に
回収することによって製造される。

本発明はまた、本質的にＢｕ −２ １ ８ ３Ａ，Ａ
２およびＢと命名される抗性物質成分ならびにＢｕ−２
１８３Ｄと命名される有用な中間体よりなるＢｕ−２１
８３コンプレックスの個々の成分を別別の物質として製
造する方法を提供し、この方法は、上述した方法によっ
てＢｕ−２１８３コンプレックスを製造し、この抗生物
質コンプレックスを培地の菌体から分離し、カチオン系
イオン交換樹脂にＢｕ−２１８３コンプレックスを吸着
させ、吸着剤からＢｕ−２１８３コンプレックスを分別
溶離し、そして所望の成分のフラクションを回収するこ
とよりなる。

第１図は、臭化カリウム中ペレット状にした時のＢｕ−
２１８３Ａ遊離塩基の赤外吸収スペクトルを示す。

第２図は、２，２−ジメチル−２−シラペンタン−５−
スルホン酸を内部標準として使用しＪＥＯＬ６０メガヘ
ルツＮＭＲスペクトロメーター（ ＴＮＭ−Ｃ−６０Ｈ
Ｌ型）で測定した時のＤ２０に溶解した塩酸塩としての
Ｂｕ−２１８３Ａのプロトン磁気共鳴スペクトルを示す
。

第３図は、臭化カリウム中ペレット状にした時のＢｕ−
２ １ ８ ３Ａ２遊離塩基の赤外吸収スペクトルを示
す。

第４図は、２，２−ジメチル−２−シラペンクン−５−
スルホン酸を内部標準として使用しＪＥＯＬ６ｏメガヘ
ルツＮＭＲスペクトロメーター（ ＴＮＭ−Ｃ−６０Ｈ
Ｌ型）で測定した時のＤ２０に溶解した塩酸塩としての
Ｂｕ ２ １ ８ ３Ａ２のプロトン磁気共鳴スペク
トルを示す。

第５図は、臭化カリウム中ペレット状にした時のＢｕ−
２１８３Ｂ遊離塩基の赤外吸収スペクトルを示す。

第６図は、内部標準として２，２−ジメチル２−シラペ
ンクン−５−スルホン酸を使用しＪＥＯＬ６０メガヘル
ツＮＭＲスペクトロメーター（ ＴＮＭ−Ｃ−６０ＨＬ
型）で測定した時のＤ２０に溶解した塩酸塩としてのＢ
ｕ − ２ １ ８ ３Ｂのプロトン磁気共鳴スペクト
ルを示す。

第７図は、臭化カリウム中ペレット状にした時のＢｕ−
２１８３Ｄ遊離塩基の赤外吸収スペクトルを示す。

第８図は、内部標準として２，２−ジメチル２−シラノ
ペンクン−５−スルホン酸を使用しＪＥＯＬ６０メガヘ
ルツＮＭＲスペクトロメーター（ ＴＮＭ−Ｃ−６０Ｈ
Ｌ型）で測定した時のＤ２０に溶解した塩酸塩としての
Ｂｕ−２１８３Ｄのプロトン磁気共鳴スペクトルを示す
。

−ｆａナマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシ
ン、ネオマイシン、トブラマイシンおよびパロモマイシ
ンのような数種のアミノグリコシド抗生物質が当該技術
において知られている。

しかし、更に新広範囲抗生物質、特にシュードモナスの
ようなアミノグリコシド耐性菌に対して活性を有するも
のに対する必要性がある。

ブリストル万有培養菌コレクション中シュードモナス種
Ｄ９４６−Ｂ８３株と命名されるシュードモナスの新菌
株は、インドの土壌試料から単離された好冷土壌細菌で
ある。

この微生物の培養菌は、ワシントンＤＣのジ・アメリカ
ンタイプ・カルチャー・コレクションに委託され、ＡＴ
ＣＣ３１０８６としてその微生物永久コレクションに加
えられている。

また該微生物は、昭和５０年１２月８田こ工業技術院微
生物工業技術研究所に委託された（微生物受託番号微工
研菌寄第３３２８号）。

本発明の新規なアミノグリコシドコンプレックスは、少
なくとも５種のアミノグリコシド成分よりなり、Ｂｕ
２ １ ８ ３ Ａ， Ａ２およびＢと命名されたそ
のうちの３種は生物活性があることが見出され、Ｂｕ−
２１８３ＣおよびＤと命名された２種は生物活性がない
。

抗生物質コンプレックスＢｕ−２１８３および３種の上
記生物活性抗生物質成分の各々は、広範囲の抗菌活性を
有し、シュードモナス種を含むアミノグリコシド耐性菌
の大部分を阻止する。

抗生物質Ｂｕ−２１８３、Ｂｕ−２ １ ８ ３Ａ ，
Ｂｕ２１８３Ａ２およびＢｕ−２１８３Ｂは、抗菌剤
として、動物飼料中栄養補給剤としてまた家禽および動
物（ヒトを含む）の治療剤として価値がある。

それらは、ダラム陽性およびダラム陰性菌起因感染症、
特にアミノグリコシド耐性菌起因疾患の処置の際価値が
ある。

発酵生産コンプレックスの新規な生物不活性成分の一つ
、即ちＢｕ−２１８３Ｄは、生物活性成分Ｂｕ ２
１ ８ ３ Ａ ， Ａ２およびＢの半合成製造（Ｎ−
アシル化による等）の際中間体として有用である。

微生物 シュードモナス種Ｄ９４６−Ｂ８３株（ＡＴＣＣ３１０
８６）と命名されるＢｕ−２１８３抗生物質産生菌は、
厳密に好気性、非胞子産生、ダラム陰性菌である。

細胞は杆状で、単極多鞭毛を生じる。

Ｄ９４６−Ｂ８３株は、４Ｃにおいて生育するが４１°
Ｃにおいて生育せず好冷菌である。

グルタミン酸培地および脱脂乳溶液中螢光色素を生じる
が、キングのＢ培地中生じない（Ｈ．イイヅカおよびＫ
．コマガタ：シュードモナス属分類の試みＪ．Ｇｅｎ．
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．９：７３〜８２、１９
６３）。

チトクロームオキシダーゼを生じない。

］）９４６−Ｂ８３株の形態学、培養および生理学上の
特性を以下記載する： 形態学 Ｄ９４６−Ｂ８３株は、運動性、非胞子産生かつダラム
陰性杆を特徴とする。

細胞は直線状、時に長軸に沿って曲っており、単極房状
鞭毛を生じる。

細胞貯蔵としてポリーβ−ヒドロキシ酪酸が含マれない
（Ｒ．Ｙ．スタニア、Ｎ．Ｊ．パレロニおよびＭ．ドウ
トロフ：好気性シュードモナス科菌：分類学的研究Ｊ
． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ． ４ ３ ：１
５９〜２７１、１９６６）。

被包、柄または粘液を生じない。

生育特性 普通寒天およびイーストエキス上の集落：多量生育。

１日後直径０．５〜１．５７１！７Ｌ，拡散、円形かつ
若干隆起。

平滑かつ軟質。不透明、乳白色、後バフーオレンジ色。

わずかに粘稠。拡散性色素はない。

普通ブロスおよびイーストエキスプロス：多量生育。

濁り、後沈渣ありまた時に薄膜。イーストエキス寒天穿
刺：表面のみ生育。

嫌気性条件下生育しない。

化学的限定（ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆ ｉｎｅ
ｄ）無機塩培地：全炭素源としてグルコースまたは乳酸
を添加する時中程度の生育。

生育因子要求：なし。

生育温度：４℃において限定された生育。

１０〜３２℃において中程度ないし多量生育。

３７℃においてわずかな生育。

４１℃において生育しない。

培地ｐＨの効果： ｐＨ ４． ０において生育しない
。

ｐＨ４．５およびｐＨ１０．５〜１ｌ．０において限定
された生育。

ｐＨ５。５〜９．５において中程度ないし良好な生育。

ＮａＣｌ効果：１２％のＮａＣｌにおいて生育しない。

６〜９％において限定された生育。５％またはそれより
少量において中程度の生育。

上述した形態学および培養上の特性は、シュードモナス
科（ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ
ａｃｅａｅ）の特性に似ている。

生理学的特性 Ｄ９４６−Ｂ８３株は、ある種の培地上拡散性螢光色素
を生じるが他のものでは生せず、一方既知の種のシュー
ドモナス、即ちシュードモナス・フルオレセンス（ Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）は多
量の螢光産生を示す（第１表）。

Ｄ９４６−Ｂ８３株の生理学および生化学上の特性を第
２表に示す。

この微生物による炭水化物および他の炭素源の利用を、
２種の既知のシュードモナス種（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ）、即ちＰｓ．フルオレセンスお
よびＰｓ．エルギノサ（ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ）と
比較して第３表に示す。

分類学 Ｄ９４６−Ｂ８３株は、上述した形態学、培養および生
理学上の特性からシュードモナド群（ Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｄｓ群）に属するように思われる。

スタニア等により提案された好気性シュ・−ドモナドに
対する分類系（Ｒ．Ｙ．スタニア、Ｎ．Ｊ ．パレロニ
およびＭ．ドウドロフ：好気性シュードモナス科菌：分
類学的研究Ｊ ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４
３ ：１５９〜２７１、１９６６）によれば、Ｄ９４６
一Ｂ８３株は、その陰性卵黄反応、陰性イノシトール利
用および陰性オキシダーゼ産生を除いてシュードモナス
・フルオレセンスにかなり密に関係している。

スタニアにより検討された１３の型の種の好気性シュー
ドモナドのうち、シュードモナス・マルトフイリア（
ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）のみが陰性オキシクーゼ反応
を示すことが報告されている。

しかし、この微生物は、螢光色素の欠如、陰性のメチオ
ニン要求、４゜Ｃにおいて生育がないこと、陰性のアリ
ギニンデヒドロラーゼおよび異なった基質の利用の点で
Ｄ９４６−Ｂ８３株と全く異なっている。

その故に、Ｄ９４６−Ｂ８３株は、シュードモナス属の
新種に属すると考えられる。

抗生物質の製造 抗生物質コンプレックスＢｕ−２１８３は、シュードモ
ナス種Ｄ９ ４ ６−Ｂ８ ３ （ＡＴＣＣ３１０８６
）と命名される新規なシュードモナス種を、水性栄養培
地中深部好気性条件下に培養することによって製造され
る。

この微生物は、同化可能な炭素源、例えば同化可能な炭
水化物を含有する栄養培地中で生育する。

好適な炭素源の例は、グルコース、フラクトース、マン
ノース、グリセロール等を包含する。

栄養培地はまた、例えば、魚粉、大豆ミール、ペプトン
等のような同化可能な窒素源を含有しなければならない
。

栄養無機塩を培養基に配合してもよく、上記の塩は、ナ
トリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン
酸、硫酸、塩化物、臭化物、硝酸、炭酸等のイオンを生
じることができる通常の塩のいずれよりなっていてもよ
い。

Ｂｕ−２１８３コンプレツスの製造は、微生物の十分な
生育が行なわれる任意の温度、例えば１０〜３２°Ｃに
おいて実施することができ、最も好適には２８〜３０℃
付近の温度において実施される。

普通至適の生産は３〜５日で得られる。

培地の至適ｐＨ範囲は、約ｐＨ ５． ５〜９．５であ
ることが見出されており、最も有利には、培地を約７の
ｐＨに調節する。

タンク培養を実施する時には、プロス培養に微生物の斜
面または土壌培養物あるいは凍結乾燥培養物を接種する
ことによって普通ブロス中増殖性接種物を得ることが望
ましい。

このようにして活性接種物を得て後、発酵タンク培地に
無菌的に移す。

Ｂｕ−２１８３抗生物質コンプレックスの好適な製造操
作は次のとおりである： シュードモナスＤ９４６−Ｂ８３株のよく生育した寒天
斜面を使用して３％グルコース、２％魚粉、０．５％大
豆ミール、０．２％ペプトンおよび０．６％ＣａＣＯ３
を含有する種培地に接種した。

ｐＨは滅菌前に７． ０に調節した。

この種培養物を回転式振盪機（ ２ ５ Ｏ ｒｐｍ）
上２８゜Ｃにおいて４８時間温置し、生育物２−を５０
０７ｒＬｌの三角フラスコ中の発酵培地（２％グリセロ
ール、２％アマ二油、１％落花生ミール、２％魚ミール
、０．３％（ ＮＨ４ ） ２ Ｓ ０４および０．５
％Ｃ ａ ＣＯ３含有）１００−に移した。

抗生物質の産生は、２８℃において振盪して３〜５日後
最犬に達した。

発酵ブロス中の抗生物質の活性を、試験菌としてバシル
ス・ズブチリス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ） ＰＣＩ ２ １ ９を使用するペーパーディスク
ー寒天拡散定量によって決定した。

Ｄ９４６−Ｂ８３株は、この振盪フラスコ発酵法によっ
て１５００〜２０００ｍｃｇ／ｙｒｔｌｌの抗生物質コ
ンプレックスを産出した。

至適のブロスカ価（例えば上述した定量操作により決定
して）が得られて後、ブロスを約２のｐＨに調節し、そ
れにより塩基性水溶性抗生物質コンプレックスが菌体か
ら分離し、水性発酵培地に溶解する。

次にブロスを、好適には炉過助剤を用いて枦過し、抗生
物質を含有する炉液を中和して約７のｐＨとする。

中和した炉液を、陰イオン交換樹脂、好適にはアンモニ
ウム形のＩＲＣ−５０アンバーライト型のものに通す。

次に樹脂を水および希（Ｎ／５０ ）ＮＨ４０Ｈで洗浄
し、適当な溶離剤、例えばＮ／２ＮＨ４０Ｈで抗生物質
コンプレックスを樹脂から溶離する。

活性溶離剤を合し、真空濃縮し、蒸発または凍結乾燥し
て粗Ｂｕ−２１８３抗生物質コンプレックスを得る。

このようにして得られた粗製固体は、ＴＬＣにより、明
細書中Ｂｕ ２ １ ８ ３ Ａ ，Ａ２およびＢと
命名されている少なくとも３種の活性成分ならびに明細
書中Ｂｕ ２１８３ＣおよびＤと命名されている少な
くとも２種の不活性成分を含有することが示された。

このＢｕ−２１８３コンプレックスは、陽イオン交換樹
脂、好適にはアンモニウム形のアンバーライトＣＧ−５
０型の樹脂を使用することによりその成分Ｂｕ−２ １
８ ３Ａ ， Ａ２ｔ Ｂ ｔＣおよびＤに分離する
ことができる。

このコンプレックスを、水に溶解して後樹脂に適用し、
水および希（Ｎ／４０）水酸化アンモニウムで洗浄し、
適当な溶離剤で溶離する。

水酸化アンモニウム（Ｎ／２０）は、成分Ｂｕ−２１８
３ＡおよびＢを分離させることが見出されている。

比較的高濃度の水酸化アンモニウム、例えば（Ｎ／１０
）でカラムを更に溶離するとＢｕ−２１８３ＣおよびＤ
を得、これらはニンヒドリン陽性であるが生物不活性で
ある。

精製した成分Ｂｕ ２１８３Ａ２を得るためには、Ｂ
ｕ−２１８３Ａフラクションについて更にカラムクロマ
トグラフイーを行なって成分Ｂｕ−２１８３Ａ２および
Ｂｕ−２１８３Ａを分離することが通常必要である。

完全な分離および各成分の精製は、上述したクロマトグ
ラフ分離をくり返すことによって達成される。

第４表中下に示すように、明細書中Ｓ−１１７およびＳ
−１２２と命名された２種のＴＬＣ系が４種の成分Ｂ
ｕ−２１８３Ａ，Ｂ，ＣおよびＤを分別するのに適当で
あることが見出された。

後の実施例中詳述するような成分Ｂｕ−２１８３Ａのク
ロマトグラフ精製の間に、更に生物活性のアミノグリコ
シド成分が見出され、明細書中Ｂｕ − ２ １ ８
３ Ａ２と命名されている。

成分Ｂｕ − ２ １ ８ ３ Ａ２は、第５表中下に
示されるようにＴＬＣ系Ｓ−１１７およびＳ−１２２に
より戒分Ｂｕ−２１８３Ａから分別することができる。

Ｂｕ−２１８３抗生物質成分の特性データＢｕ−２１８
３Ａ 抗生物質Ｂｕ−２１８３Ａは白色無定形塩基であり、水
に可溶、メタノールおよびエタノールにわずかに溶け、
ブタノール、アセトンおよび他の普通の有機溶媒に実際
上不溶である。

抗生物質Ｂｕ−２１８３Ａは酸と塩を形成することがで
き、この抗生物質の医薬として使用可能な酸付加塩は本
発明の中に包含される。

適当な医薬として使用可能な酸付加塩の例は、例えば塩
酸、硫酸、リン酸、酢酸、ステアリン酸、プロピオン酸
、酒石酸、マレイン酸、安息香酸、コハク酸等のような
有機および無機酸との毒性のない塩を包含する。

成分Ｂｕ−２１８３Ａは、ニンヒドリンおよびアンスロ
ン試薬と陽性反応を示すが、トレンス、フエーリングお
よびサカグチ試薬と陰性反応を示す。

Ｂｕ−２１８３Ａ塩基の比旋光は〔α〕２１Ｄ ＋７８．５°（ ｃ ， １．０、水）である。

成分Ｂｕ−２１８３Ａの試料を、エタノールから沈殿さ
せた時Ｃ１５Ｈ３１Ｎ３０，・Ｃ２Ｈ５０Ｈ．Ｈ２０と
して分析した： 計算値：Ｃ，４４．２４ ；Ｈ，８．５２ ；Ｎ，９．
１１ ；０，３８．１３ｏ 実験値：Ｃ，４４．２５ ；Ｈ，８．０８ ；Ｎ，９．
１１；０（差より），３８．５６。

Ｂｕ−２１８３ＡのジーＮ−アセテートは、無色の針状
晶、ｍｐ１４９〜１５０℃として得られた。

浸透圧法により測定して分子量４８１を有し、Ｃ１，Ｈ
３，Ｎ３０１、・Ｈ２０として分析した。

計算値：Ｃ，４５．６８ ；Ｈ，７．４７ ；Ｎ，８．
４１ ；０，３８．４４。

実験値：Ｃ，４５．７３ ；Ｈ，７．４９ ；Ｎ，８．
１９；０（差より）３８．５９ｏ Ｂｑ ２１８３Ａは弱塩基性であり、水中６．９０お
よび６．４０のｐＫａ’値をもつ滴定可能な基を有して
いる。

滴定データから計算した場合この抗生物質のおよその分
子量は３９８である。

成分Ｂｕ ２１８３Ａは唯一の末端紫外線吸収を示す
。

臭化カリウム中ペレット状にした時実質的に第１図に示
される赤外スペクトルを有し、次の波数（ｃｒＩＬ−’
単位）において特性バンドをもつ＝１６３５および１５
７０（アミド）ならびに１０８０および１０２０（ヒド
ロキシル基）。

酸化デューテリウム中約８％の濃度に溶解した時、Ｂｕ
−２１８３Ａ塩酸塩のＮＭ財ベクトルは実質的に第２図
に示すとおりである．このスペクトルは、δ５．１ ７
ｐｐｍにおいてアノマーのプロトン（ＩＨ，ｄ，Ｊ＝
３ヘルツ）そしてδ１．１２（ ３Ｈ，ｔ ，Ｊ＝７．
５ヘルツ）および２．２９（ ２Ｈ，ｑ ，Ｊ＝７．５
ヘルツ）ｐｐｍにおいてプロピオニル基を示す。

’Ｂｕ−２１８３Ａの構造は次のように決定された： Ｂｕ − ２ １ ８ ３ Ａ２ 抗生物質成分Ｂｕ ２ １ ８ ３Ａ２は、上のＢｕ
−２ １ ８ ３Ａと同様白色無定形塩基であり、水
に可溶、メタノールおよびエタノールにわずかに溶け、
ｎ−ブタノール、アセトンおよび他の普通の有機溶媒に
実際上不溶である。

酸と塩を形成することができ、Ｂｕ−２１８３塩基の医
薬として使用可能な酸付加塩は本発明の中に包含される
。

成分Ｂｕ − ２ １ ８ ３Ａ２は、陽性のニンヒド
リンおよびアンスロン反応そして陰性のトレンス、フエ
ーリングおよびサカグチ反応を示す。

２５一 Ｂｕ ２ １ ８ ３Ａ２塩基の比旋光は［α）ｎ一
＋７９．１°（ ｃ ， ０．４３ ，Ｈ２０）である
。

炭酸塩として単離したＢｕ − ２ １ ８ ３Ａ２の
試料をＣ１６Ｈ３３Ｎ３０９・’／２ Ｈ２ ＣＯ３と
して分析した。

計算値：Ｃ，４４．７９ ；Ｈ，７．７５ ；Ｎ，９．
５０；０，３７．９６。

実験値：Ｃ，４４．３５；Ｈ，７．８３；Ｎ，９．２１
；０（差より）３８．６１。

成分Ｂｕ−２ １ ８ ３Ａ２は唯一の末端紫外線吸収
を示す。

ＫＢｒ中ペレット状にした時、実質的に第３図に示すよ
うな赤外スペクトルを有する。

約６％の濃度でＤ，０に溶解した時、Ｂｕ − ２ １
８ ３Ａ２塩酸塩のＮＭＲスペクトルは実質的に第４
図に示すとおりである。

成分Ｂｕ−２１８３Ａ２は、ＮＭＲスペクトル中成分Ａ
およびＢにおけるプロピオニルまたはアセチル基の代リ
にδ０．９２（３Ｈ，ｔ）、１．６３（２Ｈ，六重項）
および２．３０（２Ｈ，ｔ）におけるｎ−ブチリル基の
存在によってＢｕ−２１８３ＡおよびＢｕ−２１８３Ｂ
から区別することができる。

成分Ｂｕ − ２ １ ８ ３Ａ２の構造は次のように
決定された： Ｂｕ−２１８３Ｂ 抗生物質Ｂｕ ２１８３Ｂは外観および溶解性が成分
Ｂｕ−２１８３ＡおよびＡ２と非常に似ており、白色無
定形の塩基であり、水に可溶、メタノールおよびエタノ
ールにわずかに溶け、ｎ−ブタノール、アセトンおよび
他の普通の有機溶媒に実際上不溶である。

抗生物質Ｂｕ ２ １ ８ ３ Ｂは、酸と塩を形成
することができ、この抗生物質の医薬として使用可能な
酸付加塩は本発明の中に包含される。

成分Ｂｕ−２１８３Ｂは、ニンヒドリンおよびアンスロ
ンと陽性反応を示すが、トレンス、フエーリングおよび
サカグチ試薬と陰性反応を示す。

Ｂｕ−２１８３Ｂ塩基の比旋光ハ〔α〕２１Ｄ ＋８５°（ｃ，１．０，水）である。

成分Ｂｕ−２１８３Ｂの試料をエタノールから沈殿させ
た時Ｃ１４Ｈ２，Ｎ３０，・Ｃ２Ｈ５０Ｈ−Ｒ２０とし
て分析した。

計算値：Ｃ ，４２．９５ ；Ｈ８．３４ ；Ｎ，９．
３６；０，３９．３５。

実験値：Ｃ，４２．６９；Ｈ，７．７８；Ｎ，８．８６
；０（差より）４０．６７。

Ｂｕ−２１８３ＢのジーＮ−アセテートは無色柱状晶、
ｍｐ １ ５ ９〜１６２℃として得られた。

浸透圧計により決定した際分子量４８４を有し、Ｃ１３
Ｈ３３Ｎ３０１、・Ｈ２０として分析した。

計算値：Ｃ，４４．５３ ；Ｈ，７．２７ ；Ｎ，８．
６６ ；０，３９．５４。

実験値：Ｃ，４４．９６ ；Ｈ，７．４４ ；Ｎ，８．
５２；０（差より）３９．０８ｏ Ｂｕ−２１８３Ｂは弱塩基性であり、水中７．１５およ
び９．３５のｐＫａ’値をもつ滴定可能な基を有する。

滴定データから計算した際この抗生物質のおよその分子
量は４０９である。

成分Ｂｕ−２１８３Ｂは唯一の末端紫外線吸収を示す。

臭化カリウム中ペレット状にした時、実質的に第５図に
示される赤外スペクトルを有し、次の波数（ Ｃｒｒｔ
−”単位）において特性吸収バンドをもつ：１６３５お
よび１５７０（アミド）ならびに１０８０および１０２
０（ヒドロキシル基）。

１０％の濃度で酸化デューテリウムに溶解した時、Ｂｕ
−２１８３Ｂ塩酸塩ＮＭＲスペクトルは、夫々Ａおよび
Ａ２におけるプロピオニルまたはブチリル基の代りにδ
２．０ ２ ｐｐｍ（ ３Ｈ ， ｓ ）におけるアセ
チル基の存在によってＢｕ−２１８３ＡおよびＡ２から
区別することができる。

成分Ｂｕ−２１８３Ｂは次の構造を有する：中間体Ｂｕ
−２１８３Ｄの特性データ 生物不活性成分Ｂｕ−２１８３Ｄは白色無定形塩基であ
り、水に可溶、メタノールおよびエタノールにわづかに
溶け、ｎ−ブタノール、アセトンおよび他の普通の有機
溶媒に実際上不溶である。

化合物Ｂｕ−２１８３Ｄは酸と塩を形成することができ
、塩基の酸付加塩は本発明の中に包含される。

成分Ｂｕ−２１８３Ｄはニンヒドリンおよびアンスロン
試薬と陽性反応を示し、トレンス、フ工−リングおよび
サカグチ試薬と陰性反応を示す。

２１ Ｂｕ−２１８３Ｄ塩基の比旋光は〔α〕Ｄ−＋７２．５
°（ Ｃ ， ｉ．ｏ、水）である。

炭酸塩として単離した成分Ｂυ−２１８３Ｄの試料をＣ
Ｉ２ Ｈ２７ Ｎ３ ｏ８・Ｈ２ＣＯ３として分析した
。

計算値：Ｃ，３８．７０ ；Ｈ，７．２５ ；Ｎ，１０
．４２ ；０，４３．６３。

実験値： Ｃ，３８．８６ ；Ｈ，６．９３ ；Ｎ，１
０．１４；０（差より）４４．０７ｏ Ｂｕ−２１８３Ｄは弱塩基性であり、水中６．９５（２
当量）および９．６８のｐＫ ａ’値をもつ３個の滴定
可能な基を有する。

Ｂｕ−２１８３ＤのトリーＮ−アセテートは無色柱状晶
、ｍｐ １ ５ ９〜１６２゜Ｃとして得られた。

この塩は、Ｂｕ−２１８３ＢのジーＮ−アセテートと同
一であることが決定された。

成分Ｂｕ−２１８３Ｄは唯一の末端紫外線吸収を示す。

臭化カリウム中ペレット状にした時、実質的に第７図に
示されるような赤外スペクトルを有する。

このスペクトルは、生物活性或分Ａ，Ａ２およびＢ中に
存在するアミドカルボニルバンドが欠けていることを示
す。

１０％の濃度で酸化デューテリウムに溶解した時、Ｂｕ
−２１８３Ｄ塩酸塩のＮＭＲスペクトルは実質的に第８
図に示されるとおりである。

Ｂｕ ２ １ ８ ３ Ｄの構造は次のように決定さ
れた： Ｂｕ−２１８３成分の構造決定 Ｂｕ−２１８３ＡおよびＢの緩和な酸性加水分解（ Ｉ
Ｎ−ＨＣｌ，／ＭｅＯＨ，８０℃、３時間）によって同
じデスアシル化合物、Ｃ］２Ｈ２７Ｎ３０３が生じ、そ
れは粗Ｂｕ−２１８３コンプレックスのクロマトグラフ
分離により得られるＢｕ−２１８３Ｄ成分と同一であっ
た。

Ｂｕ−２１８３Ｄの全Ｎアセチル化によってトＩＪ−Ｎ
−アセテート、Ｃ，８Ｈ３３Ｎ３０１１が生じ、それは
成分Ｂｕ−２１８３ＢのジーＮ−アセテートと同定され
た。

メタノール性塩化水素中Ｂｕ−２１８３Ｂの酸加水分解
（飽和、還流温度、２４時間）は、成分Ｂｕ−２１８３
Ｄと共にアグリコンおよびアミノ糖を生じた。

アグリコンを結晶性硫酸塩として単離し、ｍｐ ２ ６
３〜２ ６ ４℃、 Ｃ６Ｈ１６Ｎ２０４・Ｈ２ＳＯ
４として分析した。

計算値：Ｃ，２５．９０；Ｈ，６．５２；Ｎ，１ ０．
０７ ； Ｓ ， １ １．５２ｏ実験値：Ｃ，２６．
１０ ；Ｈ，６．４７ ；Ｎ，９．９３；Ｓ，１１．２
９ｏ そのＮ，０−へキサアセテートの２２０メガヘルツＮＭ
ＲスペクトルならびにアグリコンのＮアセチルー０−Ｔ
ＭＳ，Ｎ−アセチルージイソプロピリデンおよびヘキサ
ーＮ，０−アセチル誘導体について得られたマススペク
トルのデータは、アグリコン部分に対して１，４−ジア
ミノー２，３，５．６−テトラーオール構造を示唆した
。

アグリコンのジーＮ−アセテートは無色の針状晶、ｍｐ
１ １ ４〜ｌ １ ５゜Ｃとして得られ、Ｃ１ｏＨ
２ｏＮ２０６として分析した。

計算値：Ｃ，４５．４５ ；Ｈ，７．６３ ；Ｎ，１０
．６００ 実験値：Ｃ，４５．３７；Ｈ，７、９７；Ｎ，１０．５
７ｏ アグリコンに対してグリコース型配置が最もありそうに
考えられたので、４−アミノー４−デオキシーＤ−グル
コースから１，４−ジアミノ−４，４−ジデオキシーＤ
−ソルビトールの製造を実施し、生成物はＴＬＣおよび
ＮＭＲ分析によってこのアグリコンであることが示され
た。

上の成分Ｂの酸性加メタノール分解の後得られたアミノ
糖部分は、アンバーライトＣＧ−５０クロマトグラフイ
ーによって精製し、メチルグリコシドのαおよびβ形に
分離し、α形が主生成物であった。

α−メチルグリコシドのＮ−アセチル体は無色の柱状晶
、ｍ ｐ １ ８ ５〜１８６℃を生じ、それをＣ，Ｈ
１７ＮＯ６として分析した。

計算値：Ｃ，４５．９５ ；Ｈ，７．２８ ；Ｎ，５．
９５。

実験値：Ｃ，４５．９３ ；Ｈ，７．４３ ；Ｎ，５．
８８。

このＮ−アセチル誘導体のマススペクトルは、分子から
のグリコシドのメチル基の損失に帰せられるｍ／ ｅ
２ ０ ４ （ Ｍ−３ １ ）においてピークを示し
た。

その故に、遊離アミン糖は式Ｃ６Ｈ１３ＮＯ５を有する
べきである。

このメチルグリコシドのαおよびβ形は、それらのテト
ラーＮ，０−アセチル誘導体のＩＲおよびＮＭＲスペク
トルによって、メチル４−アミノー４−デオキシーα一
およびβ一Ｄ−グルコピラノシドと同定された。

４−トレハロスアミンから単離されたこれらの糖の標準
試料（Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ２７，１４５．１９７４）
のＩＲスペクトルは、実験試料のＩＲスペクトルと一致
していた。

ＧＮＨＣｌ中Ｂｕ−２１８３Ｄの酸加水分解は、Ｂｕ−
２１８３Ｂの加水分解物から単離されたのと同じアグリ
コンおよびアミノ糖を生じた。

粗Ｂｕ − ２ １ ８ ３コンプレックスのクロマト
グラフ分離によって得られたＢｕ−２１８３Ｃを、ＩＮ
Ｈ（ｊを含有するメタノール中還流温度において３時間
加水分解した。

アグリコン部分は、Ｂｕ−２１８３の他の部分のものと
同一であり、ＴＬＣ，ＮＭＲおよびクロマトグラフイー
により糖部分はメチルＤ−グルコシドと同定された。

従って、Ｂｕ−２１８３Ｃの分子式は Ｃ１２Ｈ２６Ｎ２０８である。

上のデータを基にしてＢｕ−２１８３の各成分の構造を
次のように決定した： 抗菌活性 試験管内試験は、コンプレックスＢｕ−２１８３ならび
に個々の抗生物質戒分Ｂｕ−２１８３Ａ，Ａ２およびＢ
が広範囲の抗菌活性を有していることを示す。

この抗生物質コンプレックスおよび活性戒分は、大部分
のアミノグリコシド耐性菌を明止する際特に有用である
。

成分Ｂｕ−２１８３Ａ２は、Ｂｕ−２１８３Ｂより活性
が高いが、Ｂｕ−２１８３Ａより活性が低いことが見出
されている。

Ｂｕ−２１８３ＡおよびＢの最小阻止濃度（ＭＩＣ）を
、普通寒天板上２倍寒天希釈法により種々の細菌に対し
て測定した。

ステイーアス等の接種物複製器を使用した。

接種量は、ノ＼一ト・インフユージョン・ブロス（デイ
フコ）中の試験菌の一夜培養物の１０４希釈であるよう
に調節した。

結果は、参照用抗生物質と比較試験したカナマイシンの
結果と共に第６表に示す。

Ｂｕ−２１８３ＡおよびＢの固有の活性は、ＭＩＣ値で
中程度またはむしろ弱く、成分ＡはＢの約２〜４倍の活
性である。

しかし、それらはアミノグリコシド耐性菌およびシュー
ドモナス株の多くを含むダラム陽性およびダラム陰性菌
に対して広範囲の抗菌活性を示す。

下の第７表は、数種の病原菌に対する戒分Ｂｕ−２１８
３ＡおよびＡ２の最小阻止濃度を示す。

約３０〜４０％の純度のＢｕ−２１８３コンプレックス
の試料は、１ ２． ５ ｍｃｇ／ｍｌ．の濃度でＥ．
コーリ（ｃｏｌｉ）Ａ２ ０ ３ ６ ５を、１ ２．
５ ｍｃｇ／ｒｕｌ３の濃度でＫ．ニューモニエ（ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ） Ｄ −１１を、また２５ｍｃ
ｇ／ｍｌの濃度でＰｓ． エルギノサ（ ａｅ ｒｕ
ｇ ｉｎｏｓａ ）を阻止することが見出された。

ＭＩＣに対する培地ｐＨの効果 Ｂロー２ １ ８ ３ＡのＭＩＣに対する培地ｐＨの効
果を、ｐＨ６．７ ， ７．０ ， ８．０および９．
０の普通寒天培地を使用する２倍寒天希釈法によって研
究した。

第８表に示す結果は、Ｂｕ−２０８３Ａの活性がアルカ
リ性ｐＨにおいて増太し、酸性ｐＨにおいて低下するこ
とを示した。

培地の効果 Ｂｕ−２１８３ＡおよびＢの活性に対する培地の効果を
８種の試験菌に対して測定した。

試験した培地は、普通寒天、ハート・インフユージョン
・アガーおよびミュラー・ヒントンア力一であった。

培地ｐＨをｐＨ８に調節した。

第９表に示すように、試験培地として普通寒天を使用し
た時最犬の試験管内活性が示された。

生体内活性および毒性 Ｂｕ−−２１８３ＡおよびＢをマウスの実験感染におい
て生体内評価した。

用いた病原菌は、Ｓ．オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）スミ
ス、Ｅ．コーリＮＩＨＪおよびＰｓ ．エルギノサＡ９
９ ３ ０であった。

ブタ胃粘素の５％懸濁液中病原菌のＬＤ５ｏ量×１００
でマウスを攻撃した。

細菌攻撃の直接（０時間）抗生物質で１回皮下処置し、
２回用量スケジュルにおいては攻撃後Ｏおよび３時間に
抗生物質を投与した。

各用量に対して１群５匹のマウスを使用し、動物を５日
間観察して中間保護量（ＰＤ５。

）を決定した。

結果を第１０表に示す。

Ｂｕ−２１８３ＡおよびＢは、試験した感染３種のすべ
てに対して生体内活性を生じた。

Ｂｕ−２１８３ＡおよびＢの急性毒性を、マウスにおい
て皮下および静脈内径路により測定した。

マウスを１５日間観察し、成分Ｂｕ−２１８３Ａの静脈
内（１ｕ）および皮下（ ｓｃ ） ＬＤ５０はＬＤ５
ｏは夫々２５００ｍ９／ｋｇおよび１ ０ ０ ０ ｍ
ｌ？／ｋｙであることが見出された。

或分Ｂｕ−２１８３ＢはＢ ｕ − ２ １ ８ ３
Ａよりはるかに毒性が低く、１５日の観察期間ｉｖによ
ってもｓｃによっても２０００■／ｋｇまでの用量は死
亡は起らなかった。

戊分Ｂｕ−２１８３Ｄの有用性 戒分Ｂ ｕ − ２ １ ８ ３ Ｄは生物不活性であ
るが、生物活性威分Ｂ ｕ ２ １ ８ ３ Ａ，Ａ
２およびＢの半合威製造の際価値ある中間体である。

その故に、中間体Ｂｕ−２１８３Ｄの遊離のアミノ基（
他の反応性官能基の適当な保護の後）をそれ自体既知の
方法によってＮ−アシル化して（保護基の除去の後）Ｎ
−ブチリル誘導体Ｂｕ−２１８３Ａ，Ｎアセチル誘導体
Ｂ 口ピオニル誘導体Ｂ ことができる。

Ｕ Ｕ ２ １ ８ ３ＢまたはＮ−プ ２１８３Ａ２を製造する １） Ｒ．Ｙ．スタニア、Ｎ．Ｊ ．パレロニおよびＭ
．ドウドロフ：好気性シュードモナフ科菌：分類学的研
究 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ． ４ ８ ：
１５９〜２７１ ．１９６６ ２） Ｍ．Ｅ．ローズ：シュードモナス・フルオレセン
スの特性 Ｊ ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ． ２
１ ：２２１〜２６３．１９５９ ３）Ｈ．イイズカおよびＫ．コマガタ：シュードモナス
属の分類の試み Ｊ ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｌ． ９ ： ７ ３−８ ２ ． １ ９
６ ８４）Ｈ．イイズカおよびＫ．コマガタ：シュード
モナス属分類学、特にその炭素化合物代謝機構について
Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９
：８３〜９５ ．１９６８ ５）Ｖ．Ｂ．Ｄ．スカーマン： Ａｂｓｔｒａｃｔｓ
ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ウイリー−インターサイエンス、ニューヨーク、
ロンドン、シドニーおよびトロント、３６４頁、１９６
９次の実施例は、本発明を例示する目的にのみ提供され
、いかなる意味でも本発明を限定するものではない。

上の開示および以下の実施例中挙げられるアンバーライ
トＪＲＣ−５０およびＣＧ−５０は、カルボン酸−ポリ
メタクリル酸型の弱酸性陽イオン交換樹脂の商品名であ
る。

例１． タンク発酵 シュードモナス種Ｄ９４６−Ｂ８３株の寒天斜面培養物
を使用して５００ｍｌの三角フラスコ中の種培地８３Ｂ
号（３％のグルコース、２％の魚粉、０．５％の大豆の
ミール、０．２％のペプトンおよび０．６％のＣａＣＯ
３）１００ＴｒＬｌに接種した。

このフラスコを回転式振とう機（２ｓｏｒｐり上２８゜
Ｃにおいて３時間温置し、この種培養物１リットルを使
用して発酵培地１００Ｆ号（２％のグリセリン、１％の
ファルマメディア、２％の魚粉、２％のアマ二油、０．
３％の（ ＮＨ４） ２ＳＯ４，０．６％ＣａＣＯ３）
３００リットルに接種した。

タンクを１４０ｒｌｌｍの攪拌および２ ０ ０ １Ｊ
ットル／分の通気速度下に３０°Ｃにおいて運転した。

ブロスカ価は、Ｂ％ズブチリスＰＣＩ２１９を定量菌と
してまたＢｕ２１８３Ａを定量標準として使用するペー
パーディスクー寒天プレート法によって検定した。

次の結果が得られた： 例２． 抽出 収獲したブロスをｐＨ２において済過助剤で炉過した。

Ｆ液（１９リットル）はＢｕ−２１８３Ａ約３０ｇの力
価を含有し、ｐＨを７に調節し、アンバーライトＩ Ｒ
Ｃ−５ ０ （ ＮＨ４ 形）３リットルと共に攪拌
した。

樹脂を分離し、水１ ０ １ＪットルおよびＮ／５ ０
ＮＨ４０Ｈ ５ ！Ｊットルで順次洗浄し、次にＮ／
２ ＮＨ４０Ｈ ４ １Ｊットルづつで２回攪拌して生
物活性体を溶離した。

活性溶離液を合し、真空濃縮し、次に凍結乾燥して白色
固体１８．６ｇ（約７ ０ ０ ｍｃｇ／７７２？）を
得た。

この固体を水に溶解し、アンバーライトＣＧ＝５ ０
（ＮＨ４ 形、４００Ｉ７１ｌ）のカラムに施用した。

カラムを水２．２リットルおよびＮ／４０ＮＨ４０Ｈ
３リットルで順次洗浄し、次にＮ／２ ０ ＮＨ４０Ｈ
で展開した。

この溶離液を分別して集め、Ｂ．ズブリチス プレート
上の生物定量により、またＴＬＣ（系Ｓ１１７、ニンヒ
ドリン）により調べた。

適当なフラクションを合し、真空濃縮し、凍結乾燥して
次の固体を得た。

例３． Ｂｕ−２１８３Ａの製造 例２．中得られたＢｕ−２１８３Ａの粗試料（２．７ｇ
）を水に溶解し、アンバーライトＣＧ５ ０ （ ＮＨ
４、８ ０ｍＡ）のカラムに施用した。

カラムをＮ／２ ０ ＮＨ４０Ｈで溶離し、溶離液各１
５ｍｌｌづつをフラクション・コレクターによって集め
た。

フラクションをＴＬＣ−ニンヒドリンにより、また生物
定量により調べ、適当なフラクションを合し、真空濃縮
し、凍結乾燥して次の固体を得た。

Ｂｕ−２１８３Ａの純品をＣ１３Ｈ３１Ｎ３０，・１／
２Ｈ２ＣＯ３として分析した。

計算値：Ｃ，４３．４５ ；Ｈ，７．５３ ；Ｎ，９．
８１。

実験値：Ｃ，４３．２２ ；Ｈ，７．５２ ；Ｎ，９．
４９ｏそのＩＲおよびＮＭＲスペクトルを夫々第１およ
び２図に示す。

ＮＭＲデータの要約を下に示す：例４． Ｂｕ−２１８３Ｂの製造 例２．中得られたＢｕ−２１８３Ｂの粗試料（３．３ｇ
）を水に溶解し、アンバーライトＣＧ５０（ＮＨ４ 、
１３０−）のカラムに施用した。

カラムをＮ／２ ０ ＮＨ４０Ｈで溶離し、溶離液各１
５ＴＬｌづつをフラクション・コレクターによって集め
た。

フラクションをＴＬＣ−ニンヒドリンにより、また生物
定量により調べ、適当なフラクションを合し、真空濃縮
し、凍結乾燥して次の固体を得た。

Ｂｕ−２１８３Ｂの純品をＣ１４Ｈ２，Ｎ３０，’／２
Ｈ２ＣＯ３ として分析した。

計算値：Ｃ，４２．０２ ；Ｈ，７．３０ ；Ｎ，１０
．１４ｏ実験値：Ｃ，４１．９２；Ｈ，７．４３；Ｎ，
９．９３ｏそのＩＲおよびＮＭＲスペクトルを夫々
第５および６図に示す。

ＮＭＲデータの要約を下に示す：例５． Ｂｕ−２１８３ＣおよびＢｕ−２１８３Ｄの製造例２，
中使用したカラムを更にＮ／ ２ ０ ＮＨ４０Ｈ１．
４リットルで溶離し、それによって生物活性物質はそれ
以上溶離されなかった。

次にカラムをＮ／ １ ０ ＮＨ４０Ｈで溶離し、溶離
液をニンヒドリン試薬で噴霧したＴＬＣによって調べた
。

適当なフラクションを合し、真空濃縮し、凍結乾燥して
次の固体を得た。

例 ６． Ｂｕ ２１８３Ａ２の製造 例３．中記載した成分Ａの精製過程において、前流フラ
クションから新しい活性成分を単離し、戊分Ｂｕ−２
１ ８ ３ Ａ２と命名した。

それは下に示すようにＴＬＣ系Ｓ−１１７およびＳ−１
２２によって成分Ａと区別された：

【図面の簡単な説明】

第１図はＢｕ−２１８３Ａの赤外スペクトル（’ＫＢｒ
）である。 第２図はＤ２０中Ｂｕ−２１８３Ａ塩酸塩の核磁気共鳴
スペクトルである。 第３図はＢｕ ２ １ ８ ３ Ａ２の赤外スペクト
ル（ＫＢｒ）である。 第４図はＤ２０中Ｂｕ ２１８３Ａ２塩酸塩の核磁気
共鳴スペクトルである。 第５図はＢｕ２１８３Ｂの赤外スペクトル（ＫＢｒ）で
ある。 第６図はＤ２０中Ｂｕ−２１８３Ｂ塩酸塩の核磁気共鳴
スペクトルである。 第７図はＢｕ−２１８３Ｄの赤外スペクトル（ＫＢｒ）
である。 第８図はＤ２０中Ｂｕ−２１８３Ｄ塩酸塩の核磁気共鳴
スペクトルである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １式 の抗性物質Ｂｕ−２１８３Ａまたは医薬として使用可能
   なその酸付加塩。 ２ 塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、ステアリン酸、プロピ
   オン酸、酒石酸、マレイン酸、安息香酸およびコハク酸
   から選択される酸との特許請求の範囲第１項記載のＢｕ
   −２１８３Ａの酸付加塩。 ３式 の抗生物質Ｂｕ−２１８３Ｂまたは医薬として使用可能
   なその酸付加塩。 ４ 塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、ステアリン酸、プロピ
   オン酸、酒石酸、マレイン酸、安息香酸およびコハク酸
   から選択される酸との特許請求の範囲第３項記載のＢｕ
   −２１８３Ａの酸付加塩。 ５式 の抗性物質Ｂｕ−２ １ ８ ３Ａ２または医薬として
   使用可能なその酸付加塩。 ６ 塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、ステアリン酸、プロピ
   オン酸、酒石酸、マレイン酸、安息香酸およびコハク酸
   から選択される酸との特許請求の範囲第５項記載のＢｕ
   −２１８３Ａ２の酸付加塩。 ７式 のアミノグリコシド物質Ｂｕ−２ １ ８ ３ Ｄ マ
   タハその酸付加塩。 ８ 塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、ステアリン酸、プロピ
   オン酸、酒石酸、マレイン酸、安息香酸およびコハク酸
   から選択される酸との特許請求の範囲第７項記載のＢｕ
   −２１８３Ｄの酸付加塩。