SU539507A3

SU539507A3 - Способ получени гликопептида

Info

Publication number: SU539507A3
Application number: SU1186409A
Authority: SU
Inventors: Бертеллини Джиэнфранк; Бутти Андриэно; Прино Джузеппе
Original assignee: Префар Проспекшн Дэ Реверч Фармацеутикес (Фирма)
Priority date: 1966-09-29
Filing date: 1967-09-28
Publication date: 1976-12-15
Also published as: MY7100041A; YU31438B; ES345550A1; CH494739A; GB1166939A; AT275029B; BE704537A; DE1617741B1; IL28649A; NO123051B; NL6713286A; GR34664B; DK116308B

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОПЕПТИДА

Изобретение относитс к фармацевтической промышленности и может найти применение в медициие дл лечени воспалительных заболеваний .

Способа получени гликопептида в патентной и доступной литературе не описано.

С целью получени гликопептида слизистую оболочку желудка или двенадцатиперстной кишки свиньи и растирают в порошок, экстрагируют водой при 50-100°С в течение 10-45 мин при рН 1 -10, подкисл ют уксусной кислотой, фильтруют, гидрализат обрабатывают ацетоном, разбавл ют водой, высушенный и измельченный осадок подвергают энзнматическому протеолизу папаином или трипсином с последующей фильтрацией смеси и высушиванием.

Способ осуществл ют следующим образом.

Слизистую оболочку желудка или двенадцатиперстной кишки свиньи растирают в порошок , экстрагируют водой и нагревают при 50-100°С в течение 10-45 мин. Предпочитают проводить обработку при нагревании до температуры кипени , приближающейс к 100°С. Значение рН довод т до значений, которые могут находитьс в пределах от 1 до 10 путем добавлени кислот или щелочей. При рН выше 10 материал быстро разрушаетс . При значени х рН выше 9 ведут строгий контроль за температурой и временем нагревани . По окончании гидролиза осаждают все органические вещества, обладающие кислым характером, например серусодержащие мукополисахариды. Если гидролиз провод т при щелочной рН, смесь снова довод т до кислой рН путем добавлени слабой кислоты, например уксусной, вызыва тем самым осаждение этих веществ. Фильтрат затем освобождают от протеиновых отбросов путем обработки энзимами, например параином, в услови х с подход щим рН. Перед энзиматической обработкой провод т предварительное

5 осаждение большинства протеиновых отбросов путем добавлени подход щего реагента, например трихлоруксуспой кислоты. Разбавлением фильтратов органическими растворител ми (спиртом или ацетоном) получают сырой гликонептид в виде белого или светлокоричневого порошка. Затем от сырого продукта удал ют примеси сол ного характера. Очистку осуществл ют при помощи диализа, либо пропусканием через ионообменные смолы кислотного или смешанного типа. Выход продукта после очистки достигает 65-75% по весу, а полученный продукт представл ет собой бесцветный без запаха аморфный порошок . Содержание фосфора и серы в очищенном продукте очень ничтожны. Отсутствуют также урановые кислоты, гликопептиды вл ютс одним из типов гликопротеинов, структура которых вл етс результатом сочетани полисахаридпых и протеиновых мо-. лекул с преобладанием полисахаридной части. Гексозамины содержатс в количестве 40- 50%, аминокислоты 13-18%, гексозы 27- 317о и производные нейраминовых кислот 4-6%.

Фармакологические тесты на лабораторных животных показывают, что гликопентиды в дозах от 12,5, 25 или 50 мг/кг вызывают локальную здему карагенипом и серотонином, диффузию Blue Evansa во внутрикожную иолость серетопином, декстраном и брадихинином , а рост гранулемы, вызванной ватным шариком у крыс. При дозах 100 мг/кг гликопеитид уменьшает т жесть звенной болезни привратниковой части желудка и быстропротекаюш ,их зв.

Пример 1. 10,2 кг глубоко замороженной свободной от жира двенадцатиперстной кишки свиньи размалывают в м сорубке. Материал суспендируют в 10 л воды и кип т т при перемешивании в течение 15 мин. В процессе этой обработки рП раствора поддерживают равным 9,2 путем повторных добавлений Зн. гидроокиси натри . К концу этого нериода рН довод т до 4,7 добавлением 80%-ной уксусной кислоты (около 500 мл); смеси дают охладитьс до 30°С, и после прибавлени 10 л ацетона и 1 кг фильтруюшего веш,ества (целит, целатум и т. д.) фильтруют через ткань под действием силы т жести. Таким путем получают 22 л фильтрата, которые зате.м разбавл ют 55 л ацетона. Таким путем продукт осаждают, собирают декантацией, промывают ацетоном, сушат нод вакуумом н измельчают . Вес полученного таким путем сухого порошка приблизительно равн етс 3 кг.

Этот порошок диспергируют в 9 л воды,,.рП раствора довод т до 5,7 с помощью 2н. сол ной кислоты, затем добавл ют 20 г хлористого натри и 20 г папаина, и после этого смесь нагревают при перемешивании до в течение 24 ч. Затем добавл ют 50 г фильтрующего вещества и смесь профильтровывают через ткань под действием силы т жести. Фильтрат концентрируют под уменьшенным давлением (50 мм рт. ст.) до объема 3 л и после этого обрабатывают 2,7 л ацетона. Полученный таким образом осадок, который собиралс декантацией, промывают ацетоном и сушат под вакуумом.

Выход сырого гликопротеина приблизительно составл ет 66 г.

Найдено, %: Р 3,63; S 0,21; N 5,91; ацетильные группы 7,21. В зкость 1%-ного раствора при 20°С 1,2699 ср; рН 1%-ного раствора 6,9.

Пример 2. 3,8 кг глубокозамороженной желудочной слизистой оболочки свиньи размалывают в м сорубке. Материал суспендируют в 7,5 л воды и кип т т при перемешивании в течение 15 мин. В процессе этой обработки рН раствора поддерживают при значении 8,6 путем повторных добавлений 2 н. гидроокиси натри . В конце этого периода сначала прибавл ют 250 мл 80%-ной уксусной :ислоты, а затем некоторое количество трихлорацетоуксуспой кислоты (около 160 г), достаточное дл доведени рН раствора до 1,8. Образовавшийс осадок удал ют центрифугированием и прозрачный фильтрат разбавл ют ацетоном в количестве четырех объемов фильтрата. Осадок собирают фильтрованием , промывают ацетоном, сушат нод вакуумом и измельчают. Получают 47 г порошка,

который подвергают панаиновому протеолизу после доведени рН до 5,7 по методу, описанному в предыдущем примере. Получают сырой продукт, который весит 20 г. Найдено, %: Р 4; N 6,2.

Пример 3. 1 кг глубокозамороженной свободной от жира двенадцатиперстной кишки свиньи перемалывают на м сорубке. Материал суспендируют в 1 л воды, и после доведени рП до 4 прибавлением 80 %-ной уксусной

кислоты кип т т при перемешивании.

Смесь поддерживают при кип чении в течение 15 мин, затем ей дают охладитьс и центрифугируют . Фильтрат обрабатывают 10 г ацетата натри и затем разбавл ют четырьм

объемами ацетона. Осадок отдел ют декантацией , промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают. 1аким путем получают 11 г порошка, которые подвергают папаиновой протеолитической обработке после доведени рП до 5,7, как описано в примере 1.

Сырой продукт, полученный по этой методике , весит 5,2 г. Найдено, %: Р 2,5; N 6,03. П Р и м е Р 4. 1 кг глубокозамороженной свободной от жира двенадцатиперстной кишки

свиньи размалывают на м сорубке. Материал суспендируют в 1 л воды, и после доведени рН до значени 1,7 добавлением трихлоруксусной кислоты нагревают до 50°С. Смесь поддерживают при этой температуре в течение

30 мин при перемешивании, и затем охлаждают и центрифугируют. Фильтрат обрабатывают 15 г ацетата натри и затем разбавл ют четырехкратным объемом ацетона. Осадок отдел ют декантацией, промывают ацетоном,

сушат под вакуумом и измельчают. Таким путем получают 9 г порошка-, который подвергают нротеолитической обработке панаином после доведени рН до 5,7, как описано в примере 1.

Сырой нродукт, нолученный по этой методике , весит 4,8 г.

Найдено, %: Р 2,6; N 6,1. Пример 5. 100 г сырого гликопротеина, полученного по методике примера 1, суспендируют в 1 л воды. Суспензию с помощью центрифугировани освобождают от нерастворимой части и фильтрат обрабатывают 2н. гидроокисью натри до значени рН 7,8. Полученный таким образом раствор подвергают

диализу с деионизированной водой при 20°С

через целлюлозную мембрану толщиной 0,03 мм в течение 48 ч. В конце этой обработки раствор достигает объема 2 л. Раствор концентрируют до первоначального объема 1000 мл под уменьшенным давлением 50 мм рт. ст., обрабатывают 5 г хлористого натри и разбавл ют 1200 мл ацетона или 2500 мл метанола. Образовавшийс осадок собирают декантацией, промывают растворителем , примен вшимс дл осаждени , сушат под вакуумом и измельчают. Выход 69 г.

Продукт имеет следующие аналитические характеристики:

Найдено, %: S 0,25; N 5,81; Na 0,71; гексозамины 39,2; СНзСО 9,75.

В зкость 1%-ного раствора при 20°С 1,6409 спуаз; рН 1%-ного раствора 6,3; урановых кислот нет; протеины содержатс в количестве 16,3% (фолин); гексозы 29,5%, производные нейраминовой кислоты 4,55%.

Пример 6. 100 г сырого гликонротеина, полученного по методике примера 1, суспендируют в 1 л воды. Суспензию освобождают от нерастворимой части путем центрифугировани и фильтрат обрабатывают 150 мл смолы «Амберлит JR 120 при комнатной температуре в течение получаса. Смолу затем промывают 100 мл дистиллированной воды и промывные воды объедин ют с основным раствором . 5 г хлористого натри добавл ют и провод т осаждение из раствора путем разбавлени 1320 мл ацетона. Образовавшийс осадок собирают декантацией и промывают 3 раза ацетоном, осадок затем вновь раствор ют в 750 мл воды и рН раствора довод т до 6,2 с помощью обработки 2 н. NaOH. 3 г ацетата натри добавл ют в водный раствор, разбавл ют 2,5 об. его раствора ацетоном, посредством чего получают осадок, который собирают декантацией, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают. Выход 67 г.

Найдено, %: Р 0,08; S 0,2; N 6,03; СНзСО 9,34; Na 0,43; гексозамины 39,5; урановых кислот нет; гексозы - 29,5; протеины (фолин ) 14,0; производные нейраминовой кислоты 5,33.

рН 1%-ного раствора 6,2. В зкость 1%-ного раствора при 20°С 1,9189 снуаз.

Пример 7. 100 г сырого гликопротеина, полученного но методике примера 1, суспендируют в 1 л воды. Суспензию освобождают от нерастворимой части с номощью центрифугировани и фильтрат обрабатывают 100 мл смолы «Амберлит JR 120. Через 30 мин после этой обработки смолу отдел ют

фильтрованием и промывают 100 мл дистиллированной воды, промывные жидкости объедин ют с фильтратом. Этот раствор обрабатывают 100 мл «Амберлита JR А 410 дополнительно в течение 30 мин. Смолу отдел ют

фильтрованием и промывают 150 мл дистиллированной воды, промывные жидкости объедин ют с фильтратом и рН довод т до 6,2 с помощью добавлени 2н. NaOH. Добавл ют 5 г ацетата натри с последующим разбавлением равным объемом ацетона. Образовавщийс осадок собирают декантацией, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают . Выход 70 г. Найдено, %: Р 0,04; S 0,11; Na 0,27; ацетильные группы 0,93; N 5,74; гексозамины 40; урановых кислот нет; протеины (фолин) 14,5; гексозы 31; производные нейраминовой кислоты 5,20. рН 1%-ного раствора 6. В зкость 1%-ного

раствора при 20°С 1,9004.

Claims

Формула изобретени

35

Способ получени гликонептида, отличающийс тем, что, слизистую оболочку желудка или двенадцатиперстной кишки свиньи растирают в порошок, экстрагируют водой

при 50-100°С в течение 10-45 мин при рН 1 - 10, подкисл ют уксусной кислотой, фильтруют , гидролизат обрабатывают ацетоном, разбавл ют, водой, высушенный и измельченный осадок подвергают энзиматическому протеолпзу папаином или трипсином с последующей фильтрацией смеси и высущиванием.