(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕ Т/, ФИКСИРОВАННОГО НА ТВЕРДОМ 1- ОСИТЕЛЕ Целлюлозу 1редБарптельно обра6ать вают щелочным pacтБOpo y; затем промьюануг- и диспергируют в органической жидкости (кейтралЬ )НОЙ или слабоосновной). После введе ки агента хлорировани в дисперсию целлютечение нескольких часов при темпелоз fji в предпочтителько С осушестратуре в)ь1ют выдержку реаг фующих cHCTevr, а затем целлюпооу выдел ют, промьюают и при необходимости сушат. Целесообразнее цобавл гь горируюишй агент к дисперсии целлю-лозЕ-л гюстененно. Затем осуществл ют контакт обработанной целлюлозы с буферным раствором фер мента при рН последнего 5,,0-10,0 и температуре ниже 45 С, Длительность контак ,та дл фиксации фер тента на целлюлозе 2448 час. Количество расходуемого к весу активированной аеллюлоз,: составл ет 1-60 асс.%. К группе фер -1е ;тоВ5 способных завать комплексные соедир.они с активированной целлюлозой, ОТ1ЮСЯТС.П инвертаз/л, лмилаза, мальтас5а, пектииаза, ;:1отеазь,. пептидазы, трипсин, химотрипсрпц лизоцим , фосфотазь, рибонуклеазы. Особое место а. нимают сычуукньй фермент, бета-г;;лакт -гдаза и химо трипсин. Желательно, чтобы Ци/(Л.юлозньш но ситель содержал около 5-25% лигнина по гзесу сухого вещества. Дл получени такой целлюлозы можно использовать щепу, опилки , солому, а также бумажную массу при условии содержани лигнина в указ знных пределах. /Можно примен ть также стержни ночатка к тсурузы. Размер частиц целлюло зы от 0,2 мм до нескольких сантиметров {предпочтительно О,5-5 мм). Наиболее хорошие резу.льтаты получают при использовании стержней початка кукуру зы в кусках О,5-1О Mtyt, обработанных хлоРИДОМ т онила в гфисутствии избытка пиридина и содержащих в х-отовом виде 2-6 % серы и хлора менее 1 %. Чтобы получить фермент, фиксировапньш на лигч;ифн1шрованной целлюлозе, последнюю {соцержащую лигнин) измельчают, полученные куски обрабатьюают вначале щелочи ьгк раствором, раствор наход щийс на их по верхности лигнин, затем куски (зерна) целлюлозы промывают хо.лодпой водой, обезвоживают спиртом и промывают пиридином, ввод в суспензию хлорид тионила и поддержива темиературу на уровне 55-60 С, чСпу т час суспензию охлаждают, выдел ют зерна , промывают водой, затем раствором кислоты с рН близким к 2,0, спиртом и супзт при температуре ниже 50 С. Нанесение фермента на полученный нс/с тель осуществл ют в среде буферного водно го раствора при рН 5,9-6,4 и температуре vO-.tf С в течение 24 час. Затем зерна с г Aije.;e.. ферментом вьщел ют, цромьтают бзферным раствором с соответствующим рН п -ВОДОЙ. Хранить полученные зерна рекомендуетс при относитепьно низкой температуре в буферном растворе при рН, обеспечиваюгаем устойчивс(зть фермента. Пример 1. Хпорирование цаплю - лозы 3 присутствии пиридина. Цегшюлоау в количестве 32,4 г обра- б.:ггьша.чи IS/o-KbiM водным раствором гидроокиси атрик s течение 2 час. Затем ее проь..5ьюапи мета1: олом до тех пор, пока фильтраты перестанут быть основными, и гафидином. После этого ее суспендируют в 800 мл Г1ирид(;нг:, К суспензии добавл ют 146 мл хлорида ткони а с чистотой 99 % м ост авл ют в покое 4 час, поддержива 28 С. Сщст это врем получен - ную смесь внос т в ванну лед ной воды и перемэш1-тают 1 час. Затем целлюлозу отфилгьфовыэийУг и готов т из нее и из рас-твора сьл: 1.енного двууглекислого натри суспе«-31-,ю. которую через сутки промывают водой. Полученную целлюлозу сушат 24 чгс при 50 С, В ней содержитс 3,57% хлора и 4j4% серы. Опытами у-,:7а-ьювлено5 что в среде пиридина сера фиксируетс на целлюлозе Б течение первого часа реакции и,если one- рахшю продолжать :ас.и 28 С, то содержание ее понижаетс . Количество фиксиро - вайного хпора наоборот повыашетс спуст незрвьш iJi.: рвакШ1И. Пример 2. Хлорирование целлюлозы в присутствии дичжсг.ка. Готов т суспензию из СО г целлюлозы и 450 M.TI диоксана. Добаь. ют 30 мл хлор да тиснила. После 1 -sacu реакции смесь фильтруют, щ;о:льжают вг:;:;.: и сушат. Содержание хлора в целлюлозе 1,51%. Если повысить количество хлорида тиопила при получении реакционной смеси (или врем реакпли), то содержание .хлора в целлюлозе не увеличиваетс . Пример 3. Обработка целлюлозы хлористым сульфирилом. Обработку целлюлозы ведут аналогично гфимеру 1, но вместго гооридина используют 44 мл хлористого сульфурила, т. е. 0,50 мол . П р и м е р 4. Обработка целлюлозы в присутствии трихлорида фосфора. Обработку целлюлозы ведут аналогично примеру 3, но используют 50 мл трихлорида фосфора, т. е. 0,6 мол . П р и м е р 5. Обработка целлюлозы пентахлоридом фосфора. Процесс осуществл ют аналогично примеру 4, но используют 62,5 г пентахлорида фосфора или 0,3 мол , предварительно растворенного в диоксане. Таким образом , используют одновременно гафид1гн и диоксан. Пример 6. Приготовление комплек сного соединени целлюлоза-сыч жный фермент . Сульфо-хлорированную иеллюпозу в количестве 16 г, согласно примеру I, ввод т в контакт с 4О мл раствс эа промьглленного сычужного фермента, разбавленного п тикратным количеством буферного раствора фосфата 1ФИ рН 6,2. Поддерживают температуру между 4 и 6 С при перемеатвании. Спуот 48 час целлюлозу промьшают в 250 мл буферного раствора фосфата при рН 6,2 25О мл водного раствора хлористо го натри (5 молей/литр) и 250 мл воды. Затьм комплексное соединение снова суспендируют в 250 мл буферного раствора апетата при рН 454-5 температуре 4-6 С и перемешивании в течение 1 час. Эту обработку провод т дл десорбции ковалентной св зью не фиксированной фракции фермента. После новой фильтрации не растворенный фермент возвращают и суспендируют с 250 мл буферного раствора ацетата в течение 20 час. После послед ней фильтрации полученное комплексное сое динение целлюлоза-сычужньш фермент диспергируют в 100 мл этого буферного раствора ацетата ггри рН 4,4 и оно со фан ет- с в холодильнике при 4-6 С. Активность 16 г этого комплексного соединени эквивалентна 0,12 мл промы Ш1енкого сычужного фермента. Пример 7. Комплексное соединени целлюлоза-х м отрипсии, Ввод т в трубки из пластмассы дл цен трифуги 5ОО мг целлюлозы, обработаннсй согласно примеру 2, добавл ют 1О мл буферного ферментативного раствора при рН 9 (борна кислота, /хлористый калий/ хлорис тый натрий), обозначенного маркой титри- зол. Трубки помешают на виброшнт на 1О мин при комнатной температуре. Затем про извод т их центрифугирование в течение 20 мин со скорос гью 25ОО об/мин. Уда л ют всплывшую часть, осадок промывают дл десорбции части фермента, котора не фиксировалась, 10 мл раствора хлористого натри , содержащего 5 молей хлористого натри на 1 л. После перемешивани снова производ т центрифугирование в течение 20 мин. Остаток обрабатывают буферным раствором при рН 8,5, известны { под назBaiffleM трис, состо щим из амино-2 гидроксиметил-2 пропандиол-1,3, и 10 мл ти ризола при рН 9. Провод т еще две промьеки, после чего обработанную целлюлозу сушат. Протеолитическа активность полученно го сухого ломплеконого соедЕнеки опре- дел етсй на казешге гсри рН 8,5 и температуре 37 С. Дл ЭТО1Х1 в когшческую колбу внос т 800 мг комплексного соедине - ни и 2О мл раствора казенна (или сн того молока), спуст Ю мин отбирают Юмл раствора, который выгажают в пробгфку, содер чащую 10 мл трих оруксусной кислоты дл остановки реакции. Затем пробир - ку помешают на 1/2 час в вашту. где под- отО/-держивают 37 С, дл осаждени всего казеина , который не был гидролизован. Фильтруют и определ ют количество вьщелен - кого тирозина измерением оптической плот кости фильтрата при длине волны 275ОА. Taicif образомJ наход т, что активность 50О Ml- комплексного соединени пеллюлозахимотрипсика сравнима с активностью 0,8 мг свободного трипсина по отношению к 1О М.1 сн того молока в тех же уело - Пример 8. Комплексное соедине- пне трипснн-целлюлоза. 4 г носител , приготовленного согласно примеру 2j ввод т в кош1ческую Лолбу с 8О мл ферментат1тного раствора, содержащего 2ОО мг трипсина и 1ОО мл буферного раствора титризола при рН 9. Пере- меш нвают в термостате и оставл ют на 10 мин ЩУК 37 С, Затем фильтруют на 4ритирован(юм CTeiciie ь промьюают ком плексное соедикенме 7О мл иодиог-о раствора с 5 мол ми хлористого катри.к .i 1 л. Вторую и промьшкн ;троБоа т соответственно с 50 к ЗО мл гот-о же раствора хлорнстого нптрм . Получеикое комплексное сое-цк;;ег&1е ссхра51 ют в бу ферном раегворе при рН 8.5. Лрг теол итическа активность 50О vir комплексного соединени , стфеделенна на каоеипе при рЬ; 8j5 к 37С, соответствует активности 0,4 мг СБободкого трипсина, Пример 9. Комплексное соединение бета-га ла ктозидава-целлюлоза. К 13 г модифкщфованной согласно примеру 1 целлюлозы добавл ют 4О мл ферментативного раствора, разбавленного в Ю мп буферного раствора при рН 7,2, состошле- го из 10 маль/л фосфата кали и 10 моль/л х ористого магни . Ферментптивньш раствор представл ет co6oi4 целлюларный экстракт Esclie г i-с hid Cofci, К 12, очнщенный путем осаждени сульфатом аммони , содержащий 18ОО ед. о-нитрофени.л-бета-ТЗ- галактопиранозида (О. П. П. Г.). Перемешивают смесь в течение 48 час при 40 С, После первой фильтрации комплекс- ное соединение промывают п суспенд1фуют(54) A METHOD FOR OBTAINING A T / FERMIN FIXED ON A SOLID 1-DEFINER Cellulose 1 is prepared by alkaline production y; then promuang - and dispersed in an organic liquid (keyral) NOY or weakly basic). After introducing the chlorinating agent into the cellulose dispersion for several hours at a temelose fji, preferably the extractor is exposed to cHCTevr reagents, and then the cellulose is isolated, washed and, if necessary, dried. It is more expedient to add an additional burning agent to the dispersion of cellulose-l gustenenno. Then, the treated cellulose is contacted with a buffer solution of the enzyme at a pH of 5, 0-10.0 and a temperature below 45 ° C. The contact time is fixed for fixing the enzyme on the pulp for 2448 hours. The amount of activated cellulose consumed by weight, is 1-60 ass.%. To the group fer-e; to V5 capable of scaling up complex compounds with activated cellulose, from 1Ts., Invertase / l, lmylase, maltasa, pectiase,;: 1tetaz ,. peptidases, trypsin, chymotrypsin lysozyme, phosphatase, ribonucleases. Special place a. sychuuk enzyme, beta-g; lacto-hdaz and chemo-trypsin. It is desirable that the Qi / (L. Julestock) medium contains about 5-25% lignin per dry matter. Chips, sawdust, straw, as well as paper pulp can be used to produce such cellulose under the condition that the lignin content is within the decree. also apply the rods of the bed to the tsuruz. The particle size of the cellulose is from 0.2 mm to several centimeters (preferably O, 5-5 mm). The best results are obtained by using corn cobs in pieces O, 5-1 O Mtyt, treated with chloride t itil in the presence of an excess of pyridine and containing 2-6% of sulfur and chlorine in the form of sulfur less than 1%. To obtain the enzyme on fiksirovapnsh ligch; ifn1shrovannoy cellulose, lignin last {sotserzhaschuyu) pulverized pieces obtained obrabatyuayut gk first alkali solution, the solution is schiys on their surface lignin, then pieces (grain) cellulose ho.lodpoy washed with water, dehydrated with alcohol and washed with pyridine, introducing thionyl chloride into the suspension and maintaining the temperature at 55-60 ° C, for an hour, the suspension is cooled, the grains are separated, washed with water, then with an acid solution with a pH close to 2.0, with alcohol and supp 50 C. The application of the enzyme to the resulting ns / Tel carried out in a medium of aqueous buffer solution at pH 5,9-6,4 and vO-.tf temperature for 24 h. Then the grains with r Aije.; E .. enzyme are extracted, and they are washed with a bzefer solution with the corresponding pH n-WATER. It is recommended to store the obtained grains at a relatively low temperature in a buffer solution at pH, which is stable (enzyme. Example 1. Haponation of heron 3 in the presence of pyridine. Tsexulloau in the amount of 32.4 g. B. KbiM with an aqueous solution of hydroxide gas for 2 hours. Then pour it over. 5Japes meta1: ol until the filtrates are no longer basic, and hafidine. After that, they are suspended in 800 ml of Hydride (; ng :, 146 ml of tconi chloride with a purity of 99% m left at rest for 4 hours, maintaining 2 8 C. At this time, the resulting mixture is introduced into an ice-water bath and mixed for 1 hour. Then the cellulose is removed from the pulp and prepared from it and from the solution: 1. sodium bicarbonate, “-31-, washed every day with water. The obtained cellulose is dried 24 chgs at 50 ° C, It contains 3.57% chlorine and 4j4% sulfur. Experiments at -,: 7a-5, that is fixed on cellulose B in pyridine medium for the first hour reactions and, if one continues: ac. and 28 ° C, its content decreases. The amount of fixed hpor on the contrary increases with the help of iJi .: rvakSh1I. Example 2. Chlorination of cellulose in the presence of dichsg.ka. Prepare a suspension of CO g cellulose and 450 M.TI dioxane. Get it They are 30 ml of chlorine and tin. After 1 -sacu reaction, the mixture is filtered, u; o: l lg vg:;::.: And dried. The chlorine content in cellulose is 1.51%. If the amount of thiopyl chloride is increased during the preparation of the reaction mixture (or the time has passed), the chlorine content in the pulp does not increase. Example 3. Treatment of cellulose sulphuryl chloride. Cellulose treatment is carried out similarly to gfimer 1, but 44 ml of sulfuryl chloride are used along with gooridin, i.e., 0.50 mol. PRI me R 4. Treatment of cellulose in the presence of phosphorus trichloride. The treatment of cellulose is carried out analogously to example 3, but using 50 ml of phosphorus trichloride, i.e., 0.6 mol. PRI me R 5. Treatment of cellulose phosphorus pentachloride. The process is carried out analogously to example 4, but using 62.5 g of phosphorus pentachloride or 0.3 mol, previously dissolved in dioxane. Thus, gafid1H and dioxane are used simultaneously. Example 6. Preparation of the complex compound cellulose-chemic enzyme. An amount of 16 g of sulfo-chlorinated cellulose according to Example I was put in contact with 4 O ml of the solution of an enriched rennet enzyme diluted with 5 times the amount of the 1-phosphate phosphate buffer solution pH 6.2. Maintain the temperature between 4 and 6 ° C while stirring. After 48 h, the pulp is rinsed in 250 ml of phosphate buffer at pH 6.2-25 ml of an aqueous solution of sodium chloride (5 moles / liter) and 250 ml of water. Then, the complex compound is suspended again in 250 ml of an apatate buffer solution at pH 454-5, temperature 4-6 C and stirring for 1 hour. This treatment is carried out to desorb the covalent bond of a non-fixed fraction of the enzyme. After new filtration, the undissolved enzyme is returned and suspended with 250 ml of acetate buffer solution for 20 hours. After the last filtration, the resulting complex compound cellulose-rennet enzyme is dispersed in 100 ml of this buffer solution of acetate gryv pH 4,4 and it is fanned with a refrigerator at 4-6 C. The activity of 16 g of this complex compound is equivalent to 0.12 ml of Shyenko rennet enzyme. Example 7. Cellulose-x-o-ripsia complex compounds, Injected into tubes made of plastic for a trifuge price of 5OO mg of cellulose, treated as in Example 2, was added OO ml of enzyme buffer solution at pH 9 (boric acid, potassium chloride / sodium chloride). ), denoted by the brand titrizol. The tubes will interfere with vibrating for 1 O min. At room temperature. Then they are centrifuged for 20 minutes at a speed of 25OO rpm. The supernatant was removed, the precipitate was washed to desorb the portion of the enzyme that was not fixed, 10 ml of sodium chloride solution containing 5 moles of sodium chloride per liter. After stirring, centrifugation is performed again for 20 minutes. The residue is treated with a buffer solution at pH 8.5, known {under the name of BaiffleM Tris, consisting of amino-2 hydroxymethyl-2 propanediol-1,3, and 10 ml of trisol at pH 9. Two more sweeps are carried out, after which the treated pulp dried The proteolytic activity of the resulting dry compound is determined by a cashesg pH of 8.5 and a temperature of 37 C. For ETO1X1, 800 mg of the complex compound and 2 O ml of the solution of the treasury (or skim milk) are added to the coking flask min. A Yuml solution is taken, which is distilled into a sample containing 10 ml of trichloroacetic acid to stop the reaction. Then the test tube will be placed for 1/2 hour in the wash. where the sub-O / l is kept at 37 ° C to precipitate all casein that has not been hydrolyzed. The amount of tyrosine extracted is measured and measured by the optical density of the filtrate at a wavelength of 275 OA. Taicif methods find that the activity of the 50O Ml-complex compound pulp-glucose transcription is comparable to the activity of 0.8 mg of free trypsin relative to 1O M.1 skim milk in the same velo — Example 8. Complex compound trypsn-cellulose. 4 g of the carrier prepared according to Example 2j is introduced into a felted Lolba with 8O ml of fermentation solution containing 2OO mg of trypsin and 1OO ml of buffer solution of titrisol at pH 9. Mix in a thermostat and leave for 10 min. filter on 4 tured (yum CTeiciie) flush the complex compound 7O ml of iodine solution with 5 moles of cataric chloride to 1 liter. The second and industrial; troBot respectively from 50 to 30% ml of the same solution of chlorine solution. The resulting complex co-apex ;; er & 1xrx are placed in a buffer zone at pH 8.5. The etotic activity of the 50O vir complex compound, stemmed at ca. pb; 8j5 to 37 ° C, corresponds to an activity of 0.4 mg of Free-Tried Trypsin, Example 9. The complex compound of beta-ga la kezidava-cellulose. To 13 g of modified cellulose according to Example 1, add 4O ml of enzymatic solution, diluted in 10 ml of buffer solution at pH 7.2, consists of 10 milliliters per liter of potassium phosphate and 10 mol / liter of magnesium oxide. The enzyme solution is a co6oi4 Esclie g cell extract of i-c Cofci hid, K 12, precipitated by precipitation with ammonium sulfate, containing 18OO units. o-nitropheny. l-beta-TZ-galactopyranoside (O. P. P. P. G.). The mixture is stirred for 48 hours at 40 ° C. After the first filtration, the complex compound is washed and suspended.