SU1761800A1 - Стабилизирующий состав дл получени лиофилизированных препаратов на основе культурального вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей - Google Patents

Abstract

Использование: вирусологи . Сущность изобретени : дл  получени  сухих вирусных препаратов используют стабилизирующий состав, который содержит, (г/л культураль- ной вирусной суспензии): мальтоза 28-60; пептон 44-100; желатин 10-20; бычий сывороточный альбумин 11-25, тиосульфат натри  1,25-3,0.

Description

Изобретение относитс  к вирусологии и биотехнологии и может быть использовано дл  получени  сухих вирусных препаратов методом лиофилизации.

Известны стабилизирующие добавки, используемые дл  лиофилизации культу- ральных суспензий вирусов и живых культу- ральных вакцин в виде композиций, состо щих из пептона, белков и углеводов. Например, дл  стабилизации вирусной вакцины против чумы плото дных использовали пептон и лактозу, в качестве наполнител  при высушивании вакцины против болезни Тешена свиней использовали пептон, сахарозу и желатозу, дл  стабилизации живой коревой вакцины - сорбит и желатозу.

Недостатком вышеперечисленных составов  вл етс  то, что они обеспечивают сохранение биологической активности препаратов в течение 1 года при температуре хранени , не превышающей +4°.

Наиболее близким техническим решением по стабилизации культуральных суспензий тогавирусов, выбранным в качестве прототипа,  вл етс  состав, включающий в себ  пептон, или бычий альбумин, или сахарозу с желатином. Недостатком предложенного состава  вл етс  то, что он рекомендован дл  получени  препаратов, хранение которых осуществл етс  при температуре не более +4° С и при этом на стадии высушивани  наблюдаетс  значительное снижение инфекционной активности пор дка 0,8-1,3lg LDso.

Целью предлагаемого технического решени   вл етс  снижение потерь инфекционной активности вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ), наработанного на культуре клеток, на стадии лио- фильного обезвоживани  и последующего длительного хранени  при положительных температурах. Поставленна  цель достигаетс  тем, что в качестве стабилизатора используетс  состав, состо щий из пептона желатина и углевода, дополнительно содержащий бычий сывороточный альбумин (БСА) и тиосульфат натри . В качестве углевода используетс  мальтоза при следующих соотношени х компонентов (г/л культураль- ной вирусной суспензии):

Мальтоза28-60

Пептон44-100

сл

С

о

ЮЯ&

со

о

,

Желатин10-20

БСА11-25

Тиосульфат натри 1,25-3,0

На фиг. 1 и 2 приведены динамики инактивации вируса ВЭЛ в составе препаратов с различными стабилизирующими составами дл  температур хранени  37 и 20°С, соответственно .

Подготовка вирусного материала к высушиванию проводилась следующим образом , Выращивание вируса (штаммы ТС-83 и № 230) на культуре клеток проводилось в соответствии с известной методикой. Полученный материал представл л собой поддерживающую питательную среду (на основе среды Игла MEM с добавлением 1- 2% сыворотки КРС), содержащую вирус. Компоненты стабилизирующего состава: пептон, БСА, мальтоза и тиосульфат натри  добавл лись в сухом виде к соответствующему количеству культуральной вирусной суспензии и раствор лись в ней при комнатной температуре, после чего к полученной смеси добавл лс  желатин в виде 10%-ного водного раствора, подогретого до 30-35° С. Замораживание материала осуществл лось при (-30)-(-40)° С, после чего он выдерживалс  при этой температуре не менее 2 часов. Высушивание проводилось в течение 18-24 часов в вакууме (,1 мм рт.ст.) при температуре подогрева полок лиофилизатора 40° С. Остаточна  влажность полученного препарата при этом не должна превышать 3%. Хранение высушенного материала осуществл етс  в течение 14 дней при 37° С либо не менее 6 мес при 20° С.

Тестирование инфекционной активности исходного и лиофилизованного вирусного материала, а также его инфекционной активности во врем  хранени  при положительных температурах, проводилось путем титровани  на первичной культуре фиброб- ластовэмбриона курицы (ФЭК) под твердым агаровым покрытием.

Примеры стабилизирующих составов, использованных дл  лиофилизации вируса ВЭЛ, наработанного на культуре клеток.

П р и м е р 1. Компоненты защитной среды, г/л культуральной вирусной суспензии:

Мальтоза60

Пептон100

БСА25

Тиосульфат натри 3,0

Желатин20

П р и м е р 2. Компоненты защитной среды, г/л культуральной вирусной суспензии:

Мальтоза44

Пептон72

БСА18

Тиосульфат натри 2,12

Желатин15

П р и м е р 3. Компоненты защитной среды, г/л культуральной вирусной суспензии:

Мальтоза28

Пептон44

БСА11

Тиосульфат натри 1,25

Желатин10

Дл  указанных примеров инактиваци  вирусного материала на стадии лиофильно- го обезвоживани  оценивалась путем опре- делени  инфекционной активности материала до и после высушивани . Дл  за вл емого стабилизирующего состава (примеры 1-3) и дл  приведенных выше условий лиофилизации разница между титрами ис- ходной суспензии и высушенного материала составл ла 0,1+ 0,2 Ig БОЕ.

В т;абл. 1 приведены средние значени  констант скоростей инактивации вируса ВЭЛ в составе полученного препарата дл  температур хранени  -12, 20 и 37°С.

Дл  расчета констант скоростей инактивации использовалась модель вида ехр(-КИн Г)(1)

где Кин - константа скорости гибели вируса; Со и С - исходна  и текуща  концентраци  вируса, соответственно: т- врем  экспозиции. В соответствии с (1) строились линейные регрессии дл  функции

Т а+Ьт(2)

Тогда коэффициент инактивации: ,303 b(3)

Дл  определени  коэффициентов модели (2) был использован взвешенный метод наименьших квадратов. Модель считалась адекватной , если пр ма  регрессии проходила через доверительные интервалы используемого набора экспериментальных точек. Рас- чет концентраций вирусов проводилс  в соответствии с известной методикой, доверительные интервалы определ лись дл  5%-но- го уровн  значимости.

В ходе экспериментальных исследова- ний проводилось сравнение эффективности предлагаемого стабилизирующего состава с известными аналогами и прототипом. Данные приведены в табл.2.

В табл. 3 приведены данные, позвол ю- щие сопоставить стабилизирующие свойства защитных сред, приведенных в табл. 2, на стади х лиофильного обезвоживани  и последующего хранени  при температуре 20 и 37°С.

Изданных, приведенных в табл. 2, видно, что предлагаемое техническое решение обеспечивает существенное повышение устойчивости вируса ВЭЛ на стадии лиофильного обезвоживани . Предлагаемый стабилизирующий состав позвол ет в несколько раз снизить потери биологической активности препаратов при хранении их в диапазоне положительных температур до 37° С.

Наиболее рационально применение данного стабилизатора при производстве живых вирусных вакцин, т.к. его использование обеспечивает выживаемость вирусов на этапе приготовлени  вакцины и позвол ет производить хранение и доставку данной вакцины без применени  специальной холодильной техники.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Стабилизирующий состав дл  получени  лиофилизированных препаратов на

   основе культурального вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, содержащий пептон, желатин и углевод, отличающийс  тем, что, с целью снижени 

   потерь инфекционной активности в процессе лиофильного высушивани  и последующего хранени  при положительных температурах, состав дополнительно содержит бычий сывороточный альбумин и тиосульфат натри , а в качестве углевода в нем используют мальтозу при следующих соотношени х компонентов, г/л культу- ральной вирусной суспензии:

   Пептон44-100

   Желатин10-20

   Мальтоза .28-60

   Бычий сывороточный альбумин 11-25 Тиосульфат натри 1,25-3,0

   Т а б л и ц а 1

   25

   Таблица2

   ТаблицаЗ

   t/H0e#i( 0#л7(/6ностй fffffff/

   ,0

   Фиг. 1

   t/#pe#qt/ff#/fffs af/nt/faoc/лй, fff Ј0Ј//4/t

   8.0 60SOПО150

   фиг. 2

   в

   to

   12 ft Т,сут#и

   т1r180

   су/пни