SU1747486A1

SU1747486A1 - Method of viral suspension marburg concentration

Info

Publication number: SU1747486A1
Application number: SU904832840A
Authority: SU
Inventors: Валерий Николаевич Зеленков; Владислав Валерьевич Солодкий
Priority date: 1990-05-29
Filing date: 1990-05-29
Publication date: 1992-07-15

Abstract

Изобретение относитс к медицинской промышленности и касаетс концентрировани вируссодержащих суспензий в вирусологической практике. Цель изобретени - повышение степени концентрировани вируса Марбург из суспензии с сохранением его биологической активности. Способ включает обработку суспензии химическим реагентом с последующим отделением осадка, содержащего концентрат вируса. В качестве химического реагента используют водный раствор полиэтиленимина, который добавл ют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 1-10 - 2,0-КГ %.3табл.The invention relates to the medical industry and relates to the concentration of virus-containing suspensions in virological practice. The purpose of the invention is to increase the degree of concentration of the Marburg virus from the suspension while maintaining its biological activity. The method involves treating the suspension with a chemical reagent followed by separation of the precipitate containing the virus concentrate. An aqueous solution of polyethylenimine is used as a chemical reagent, which is added to the vaccinated suspension to a final concentration of 1-10 - 2.0-KG% .3 table.

Description

Изобретение относитс к медицинской промышленнбсти и касаетс концентрировани вируссодержащих суспензий в вирусологической практике.This invention relates to the medical industry and relates to the concentration of virus-containing suspensions in virological practice.

Дл концентрировани различных вируссодержащих суспензий широко используютс химические и физико-химические методы. К таким методам относ тс методы осаждени вирусов из суспензий сол ми, водорастворимыми полимерами (полиэтиленгликолем ), а также бифазными полимер- содержащими системами.Chemical and physico-chemical methods are widely used to concentrate various virus-containing suspensions. Such methods include methods of precipitating viruses from suspensions with salts, water-soluble polymers (polyethylene glycol), and also bi-phase polymer-containing systems.

Известен способ концентрировани вируса понского энцефалита путем обработки суспензии вируса сульфатом аммони . Осаждение вируса производитс за счет его высаливани солью. Концентраци сульфата аммони в суспензии вируса составл ет 20-40%. Эксперименты показывают, что использование вышеуказанных концентраций сульфата аммони дл осаждени вируса Марбург приводит к концентрированию суспензии по объему от 10 до 40 раз при отсутствии эффекта концентрировани по биоактивности (биотитру) вследствие высокой инактивации вируса Марбург.There is a known method of concentrating a Japanese encephalitis virus by treating a suspension of the virus with ammonium sulfate. The virus is deposited by salting it out. The concentration of ammonium sulfate in the virus suspension is 20-40%. Experiments show that using the above concentrations of ammonium sulfate to precipitate Marburg virus leads to a concentration of suspension by volume from 10 to 40 times in the absence of a concentration effect on bioactivity (biotitra) due to high inactivation of Marburg virus.

Недостатком этого способа вл етс высока инактиваци вируса Марбург, понского энцефалита и других вирусов в процессе концентрировани сульфатом аммони , а также высокое содержание оса- дител (соли) в растворе, что требует последующего удалени соли из суспензии.The disadvantage of this method is the high inactivation of Marburg virus, Japanese encephalitis and other viruses in the process of concentration with ammonium sulfate, as well as a high content of precipitator (salt) in solution, which requires the subsequent removal of salt from the suspension.

Наиболее близким к предлагаемому вл етс способ концентрировани вируса 6eL шенства методом флокул ции. В качестве флокул нта используют водорастворимый неионогенный полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ с мол.массой 60000) в концентрации 1-9%. Экспериментальные исследовани полиэтиленгликол , используемого в качестве реагента дл осаждени вируса Марбург , показали, что применение вышеуказанных концентраций ПЭГ дл осаждени вируса Марбург позвол ет увеличить концентрацию вируса не более чем вClosest to the present invention is a method of concentrating the 6eL virus by flocculation. Water-soluble non-ionic polymer polyethylene glycol (PEG with a mol. Mass of 60,000) is used as a flocculant in a concentration of 1–9%. Experimental studies of polyethylene glycol used as a reagent for the deposition of the Marburg virus have shown that using the above concentrations of PEG to precipitate the Marburg virus allows an increase in the concentration of the virus to no more than

22

х| ооx | oo

OsOs

13 раз по биотитру по сравнению с исходной концентрацией вируса.13 times biotitre compared with the initial concentration of the virus.

Недостатком прототипа вл етс инактиваци вирусов (Марбург, бешенства) в процессе их осаждени полиэтиленглико- лем, а также довольно высокое содержание ПЭГ в растворе (до 9%, что требует последующего его удалени из суспензии.The disadvantage of the prototype is inactivation of viruses (Marburg, rabies) during their precipitation with polyethylene glycol, as well as a rather high content of PEG in solution (up to 9%, which requires its subsequent removal from the suspension.

Целью изобретени вл етс повышение степени концентрировани вируса Марбург с сохранением его биологической активности.The aim of the invention is to increase the degree of concentration of the Marburg virus while maintaining its biological activity.

Цель достигаетс тем, что согласно способу провод т обработку суспензии вируса водорастворимым полимером с последующим отделением осадка, содержащего концентрат вируса. В качестве водорастворимого полимера используют раствор полиэтилен имина, который добавл ют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 1-10 -2,СМСГ2%.The goal is achieved in that according to the method, the virus suspension is treated with a water-soluble polymer, followed by separation of the precipitate containing the virus concentrate. As a water-soluble polymer, a solution of polyethylene imine is used, which is added to the vaccinated suspension to a final concentration of 1-10 -2, CMSH2%.

Способ реализуют следующим образом .The method is implemented as follows.

Суспензию вируса Марбург, полученную стандартным способом культивировани на клетках ЛЭЧ (легкие эмбрионы человека), разливают по 40 мл в б центрифужных пробирок. Водный раствор поли- этиленимина с мол.массой 60000 и концентрацией 10-20% добавл ют в вируссодержащую суспензию до получени конечной его концентрации ,. Операцию введени аликвот полиэтилени- мина провод т при комнатной температуре и перемешивании. Суспензию отстаивают не менее 24 ч при 4°С (температура бытового холодильника). После отстаивани над- осадочную жидкость сливают, к осадку добавл ют 1,2 мл раствора Хенкса или другую стандартную среду и ресуспендируют. В зависимости от соотношени объемов исходной вирусной суспензии и среды дл ре- суспендировани получают продукт нужной кратности концентрировани . Определение биоактивности ресуспендированного осадка провод т стандартным методом титрова- ни на монослое клеток vero. Биоактивность выражают в бл шкообразу- ющих единицах (БОЕ) на 1 мл суспензии. Способ может быть использован в лабораторных услови х дл повышени концентрации по биотитру вируса Марбург, а также в вирусологической практике дл получени антигена указанного вируса из его культу- ральных суспензий низких концентраций.The Marburg virus suspension, obtained by the standard culture method on LEC cells (human light embryos), is poured into 40 ml b-centrifuge tubes. An aqueous solution of polyethylenimine with a molar mass of 60,000 and a concentration of 10–20% is added to the virus-containing suspension to obtain its final concentration,. The operation of introducing aliquots of polyethylene imine is carried out at room temperature and stirring. The suspension is defended for at least 24 hours at 4 ° C (temperature of a domestic refrigerator). After settling, the supernatant is drained, 1.2 ml of Hanks solution or another standard medium is added to the precipitate and resuspended. Depending on the ratio of the volumes of the initial viral suspension and the medium for the resuspension, a product of the desired concentration ratio is obtained. Determination of the bioactivity of the resuspended pellet was carried out using the standard monolayer method for vero cells. Bioactivity is expressed in plaque forming units (PFU) per 1 ml of suspension. The method can be used in laboratory conditions to increase the biotitre concentration of the Marburg virus, as well as in virological practice to obtain the antigen of this virus from its cultured suspensions of low concentrations.

Конкретные примеры выполнени способа при различных концентраци х поли- этиленимина приведены в табл.1.Specific examples of the process at various concentrations of polyethyleneimine are given in Table 1.

Анализ табл.1 показывает, что использование водного раствора полиэтиленимина в диапазоне конечных концентраций 1,0 - 2, позвол ет сконцентрировать вирус Марбург более чем в 10 раз по титру при сохранении его биоактивности иThe analysis of Table 1 shows that the use of an aqueous solution of polyethylenimine in the range of final concentrations of 1.0-2, makes it possible to concentrate the Marburg virus more than 10 times in its titer while maintaining its bioactivity and

полноте осаждени вируса 40-98%. Начальные концентрации раствора полиэтилени- мина существенного вли ни на процесс концентрировани не оказывают. Использование конечных концентраций полиэтиленимина менее 1, ведет к снижению полноты осаждени вируса и степени его концентрировани ,.Увеличение концентрации полиэтиленимина более 2,0 ведет к значительной инактивации вируса , снижению полноты осаждени и степени концентрировани по титру. Кроме того, экспериментальные данные по хранению концентрата вируса Марбург, полученного вышеописанным способом, при 4°Сcompleteness of virus deposition 40-98%. The initial concentrations of the polyethylene imine solution do not significantly affect the concentration process. The use of final concentrations of polyethylenimine less than 1 leads to a decrease in the completeness of virus deposition and the degree of its concentration. Increasing the concentration of polyethyleneimine more than 2.0 leads to a significant inactivation of the virus, reducing the completeness of precipitation and the degree of concentration in titer. In addition, the experimental data on the storage of the Marburg virus concentrate obtained by the method described above at 4 ° C

(температурь бытового холодильника) свидетельствует о сохранении его биологической активности в течение 1 мес.(temperature of the domestic refrigerator) indicates the preservation of its biological activity for 1 month.

Данные по хранению концентрата вируса Марбург, полученного с использованиемData storage of Marburg virus concentrate obtained using

полиэтиленимина приведены в табл.2.polyethylenimine are given in table 2.

Экспериментальные исследовани водного раствора полиэтиленгликол (прототип ) в конечной концентрации в суспензииExperimental studies of an aqueous solution of polyethylene glycol (prototype) at final concentration in suspension

1-9% дл осаждени вируса Марбург показали (табл.3), что концентрацию вируса можно увеличить не более чем в 13 раз по биотитру по сравнению с исходной его концентрацией .1–9% for virus deposition Marburg showed (Table 3) that the virus concentration can be increased no more than 13 times in biotitre compared to its initial concentration.

Данные по концентрированию суспензии вируса Марбург с использованием поли- этиленгликол приведены в табл.3.Data on the concentration of the Marburg virus suspension using polyethylene glycol is given in Table 3.

Преимуществом предлагаемого способа концентрировани вируса МарбургThe advantage of the proposed method of concentrating the Marburg virus

(табл.1) по сравнению со способом-прототипом (табл.2) вл етс повышение степени концентрировани вируса в три и более раз с сохранением его биологической активности . При этом концентраци осадител в(Table 1) compared with the prototype method (Table 2) is an increase in the degree of virus concentration three or more times while preserving its biological activity. The concentration of precipitator in

предлагаемом способе ниже, чем в прототипе на два пор дка, вследствие чего не требуетс дополнительна очистка от осадител .the proposed method is lower than in the prototype by two orders of magnitude, as a result of which additional purification from the precipitator is not required.

Claims

Invention Formula

A method for concentrating a suspension of Marburg virus, including its processing with a water-soluble polymer followed by separation of the virus sediment, characterized in that, in order to increase

the degree of concentration of the virus while preserving its biological activity; a 10-20% aqueous solution of polyethyleneimine is added to the virus-containing suspension to a final concentration -.

Table1

Table 2

Table 3