RU2664729C1

RU2664729C1 - Method for blood serum purification of large cattle from contaminating agents

Info

Publication number: RU2664729C1
Application number: RU2017117994A
Authority: RU
Inventors: Алексей Петрович Пономарев; Евгений Васильевич Белик; Борис Леонидович Манин; Марина Михайловна Коган
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ "БИОХИМСЕРВИС"
Priority date: 2017-05-23
Filing date: 2017-05-23
Publication date: 2018-08-22

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology and is intended for the purification of blood serum of cattle from contaminants. Method includes the use of frozen blood supplied from the meat producing plants. To the serum, after thawing and clarification by microfiltration through a filter with pores of 450 nm, 1 % of the purified aqueous extract of the shungite mineral is added with stirring. Mixture is left to stand for 18–20 hours at room temperature and clarified by separation on a flow centrifugal separator. Process is completed by filtration through a sterilizing microfilter with a pore diameter of 220 nm.EFFECT: use of the invention provides highly effective removal from the serum of contaminant agents of viral, bacterial and other etiology containing a nucleic component in the form of DNA or RNA.1 cl, 6 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, связанной с очисткой сыворотки крови крупного рогатого скота, используемой для культивирования первично трипсинизированных и перевиваемых культур клеток, являющихся исходным биоматериалом для репродукции различных вирусов животных и человека, используемых при получении противовирусных препаратов.The invention relates to the field of biotechnology associated with the purification of blood serum of cattle used for the cultivation of primary trypsinized and transplanted cell cultures, which are the starting biomaterial for the reproduction of various animal and human viruses used in the preparation of antiviral drugs.

Предложенный способ включает удаление контаминирующих агентов из сыворотки крови крупного рогатого скота путем предварительной микрофильтрации, добавления при перемешивании водного экстракта минерала шунгита, процесса отстаивания, последовательного осветления сепарированием и фильтрацией через стерилизующий микрофильтр.The proposed method involves the removal of contaminating agents from the blood serum of cattle by preliminary microfiltration, adding with stirring an aqueous extract of shungite mineral, the settling process, sequential clarification by separation and filtration through a sterilizing microfilter.

Технический результат изобретения - высокоэффективное удаление из состава сыворотки контаминирующих агентов вирусной и бактериальной этиологии, содержащих в своем составе нуклеиновый компонент в форме ДНК или РНК.The technical result of the invention is a highly effective removal of the viral and bacterial etiology contaminating agents from the composition of the serum containing a nucleic component in the form of DNA or RNA.

Общеизвестно, что сыворотка крови, входящая в состав питательных сред, является не только одним из наиболее важных ее ингредиентов, но и одним из наиболее вероятных источников контаминации клеточных культур вирусами, бактериями, микоплазмами, нанобактериями и другими видами контаминант. Эффективность культивирования клеток, как в суспензии, так и в монослое связана с качеством питательной среды, ростовые свойства которой в значительной степени зависят от качества сыворотки крови животных в составе питательной среды. В практической работе чаще всего сыворотку получают из крови убойного скота различного вида и возраста. Такие сыворотки, как правило, содержат контаминанты в виде различных вирусов, дрожжей, грибов, L-форм бактерий, микоплазм, нанобактерий, тяжелых белков, ингибиторов, липидсодержащих компонентов, что отрицательно сказывается на росте и размножении клеток и вирусов в клеточных культурах.It is well known that blood serum, which is part of nutrient media, is not only one of its most important ingredients, but also one of the most likely sources of cell culture contamination with viruses, bacteria, mycoplasmas, nanobacteria and other types of contaminants. The efficiency of cell cultivation, both in suspension and in a monolayer, is associated with the quality of the nutrient medium, the growth properties of which largely depend on the quality of animal blood serum in the nutrient medium. In practical work, most often serum is obtained from the blood of slaughter cattle of various types and ages. Such sera, as a rule, contain contaminants in the form of various viruses, yeasts, fungi, L-forms of bacteria, mycoplasmas, nanobacteria, heavy proteins, inhibitors, lipid-containing components, which adversely affects the growth and reproduction of cells and viruses in cell cultures.

Известен способ очистки сыворотки крови на фильтрах EKS с последующим замораживанием в полиэтиленовых канистрах при -15 -20°C не менее 7 суток, дальнейшим размораживанием и удалением 5% нижних гемолизированных слоев, при этом светлую сыворотку подвергают однократной стерилизующей фильтрации при +2 +6°C. Таким образом, методом замораживания-оттаивания достигается удаление из нативной сыворотки крови бычков веществ, ингибирующих рост клеток. Недостатком данного способа очистки сыворотки крови является непрогнозируемость биохимического состава очищенной сыворотки.A known method of purification of blood serum on EKS filters, followed by freezing in polyethylene canisters at -15 -20 ° C for at least 7 days, further thawing and removing 5% of the lower hemolyzed layers, while the light serum is subjected to a single sterilization filtering at +2 + 6 ° C. Thus, by freezing-thawing, removal of gobies from cells that inhibit cell growth from native blood serum is achieved. The disadvantage of this method of purification of blood serum is the unpredictability of the biochemical composition of purified serum.

Известен способ деконтаминации сыворотки за счет обработки ее полиэтиленгликолем (ПЭГ). Водорастворимый полимер ПЭГ используют для очистки сывороток от специфических протеинов, микоплазм, вирусов и других контаминантов. Недостатком данного метода является то, что изменяется биохимический состав сыворотки в сторону уменьшения содержания ряда компонентов, например общего белка, до 30% от исходного, при этом растворенный ПЭГ остается в составе сыворотки.A known method of decontamination of serum by treating it with polyethylene glycol (PEG). The water-soluble PEG polymer is used to purify serums from specific proteins, mycoplasmas, viruses and other contaminants. The disadvantage of this method is that the biochemical composition of the serum changes in the direction of decreasing the content of a number of components, for example, total protein, to 30% of the original, while the dissolved PEG remains in the serum.

Наиболее близким является способ очистки сыворотки крови от контаминантов с помощью фильтрации через фильтры с диаметром пор 100 нм, что позволяет полностью освободиться от микоплазм, и дальнейшей фильтрацией через фильтры с диаметром пор 40 нм, способных удерживать вирусные частицы размером 60 нм. Недостатком данного способа является то, что при микрофильтрации через фильтры с диаметром пор не более 100 нм задерживаются белки, ферменты, иммуноглобулины, гормоны, белки-ингибиторы и многие другие полезные компоненты, что значительно снижает качество сыворотки. Кроме того, процесс микро- и ультрафильтрации сопровождается неизбежной закупоркой пор фильтра, что также влияет на качественный состав сыворотки в динамике фильтрования.The closest is a method for purifying blood serum from contaminants by filtering through filters with a pore diameter of 100 nm, which allows you to completely free from mycoplasmas, and then filtering through filters with a pore diameter of 40 nm, which can hold viral particles of 60 nm in size. The disadvantage of this method is that during microfiltration through filters with pore diameters of not more than 100 nm, proteins, enzymes, immunoglobulins, hormones, protein inhibitors and many other useful components are retained, which significantly reduces the quality of serum. In addition, the process of micro- and ultrafiltration is accompanied by the inevitable blockage of the pores of the filter, which also affects the qualitative composition of the serum in the dynamics of filtration.

Задачей предлагаемого изобретения является существенное улучшение качества сыворотки за счет освобождения ее от возможных контаминирующих агентов вирусной и бактериальной этиологии, содержащих в своем составе нуклеиновый компонент в форме ДНК или РНК, с целью предотвращения их попадания в состав питательной среды.The objective of the invention is to significantly improve the quality of serum by freeing it from possible contaminating agents of viral and bacterial etiology containing a nucleic component in the form of DNA or RNA, in order to prevent their entry into the nutrient medium.

Для решения поставленной задачи в биоматериал в форме сыворотки крови крупного рогатого скота, поставляемый в замороженном виде с боенских предприятий, после оттаивания и прохождения этапа предварительной микрофильтрации добавляют при перемешивании 1% очищенного водного экстракта минерала шунгита, проводят процесс отстаивания, затем последовательно осветляют сепарированием и проводят фильтрование через стерилизующий микрофильтр.To solve this problem, in the biomaterial in the form of blood serum of cattle, delivered frozen from slaughterhouses, after thawing and passing through the preliminary microfiltration stage, 1% of the purified aqueous extract of schungite mineral is added with stirring, the settling process is carried out, then it is clarified sequentially by separation and carried out filtering through a sterilizing microfilter.

Для приготовления очищенного водного экстракта минерала шунгита используют природный шунгит в виде щебня, изготовленный в соответствии с ТУ 5714-007-12862296-01. В качестве экстрагента при получении экстракта шунгита используют дистиллированную воду. Экстракт шунгита предварительно подвергали очистке от содержащихся в нем микро- и макроэлементов, при этом в экстракте оставались преимущественно редкоземельные ультрамикроэлементы - лантаноиды.To prepare a purified aqueous extract of shungite mineral, natural shungite in the form of crushed stone is used, made in accordance with TU 5714-007-12862296-01. As an extractant, distilled water is used to produce shungite extract. Shungite extract was preliminarily purified from the micro and macro elements contained in it, while the extract remained predominantly rare earth ult micro micro elements - lanthanides.

В таблице 1 приведено содержание лантаноидов в очищенном водном экстракте шунгита. Содержание лантаноидов в экстракте шунгита определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией в индуктивно связанной плазме (ELAN DRC II, «Perkin Elmer», США).Table 1 shows the lanthanide content in the purified aqueous schungite extract. The lanthanide content in the schungite extract was determined by inductively coupled plasma ion spectrometry mass spectrometry (ELAN DRC II, Perkin Elmer, USA).

Сущность предлагаемого способа очистки сыворотки крови крупного рогатого скота заключается в том, что замороженный исходный материал после оттаивания осветляют микрофильтрацией пропуском через микрофильтр с диаметром пор 450 нм. Затем к осветленной сыворотке добавляют при перемешивании 1% очищенного и концентрированного водного экстракта шунгита, после чего сыворотку оставляют отстаиваться на 18-20 часов при комнатной температуре. Образовавшуюся в сыворотке взвесь из хлопьев и представляющую собой коагулированные частицы отделяют с использованием центробежного проточного сепаратора. Осветленная сыворотка выходит через нижний лоток сепаратора в приемную емкость. Из шламового пространства сепаратора извлекают биосубстрат для контроля, который помещают в стерильный бюкс. По завершении процесса сепарирования осветленную сыворотку фильтруют в условиях ламинарного бокса через стерилизующий микрофильтр с диаметром пор 220 нм.The essence of the proposed method for the purification of blood serum of cattle is that the frozen starting material after thawing is clarified by microfiltration by passage through a microfilter with a pore diameter of 450 nm. Then, 1% purified and concentrated aqueous schungite extract is added to the clarified serum with stirring, after which the serum is left to stand for 18-20 hours at room temperature. The cereal suspension formed in the serum and consisting of coagulated particles is separated using a centrifugal flow separator. The clarified serum leaves through the lower tray of the separator in a receiving tank. Biosubstrate is removed from the slurry space of the separator for control, which is placed in a sterile box. Upon completion of the separation process, the clarified serum is filtered under conditions of a laminar box through a sterilizing microfilter with a pore diameter of 220 nm.

Определение биохимического состава, pH, контроль на стерильность, а также оценку ростостимулирующих свойств сыворотки крови осуществляют общепринятыми стандартными методами. Биохимический анализ образцов сыворотки на отдельных этапах очистки проводят с помощью автоматического биохимического анализатора «BioChemFC-360» («HTI», США).Determination of biochemical composition, pH, sterility control, as well as assessment of the growth-promoting properties of blood serum is carried out by generally accepted standard methods. Biochemical analysis of serum samples at individual stages of purification is carried out using a BioChemFC-360 automatic biochemical analyzer (HTI, USA).

При разработке данного способа очистки сыворотки крови крупного рогатого скота от контаминантов учитывалось, что в процессе микрофильтрации использование фильтра с диаметром пор 450 нм является предварительным этапом осветления, при котором бактериальные клетки полностью не задерживаются. Добавление к осветленной сыворотке очищенного и концентрированного экстракта шунгита будет способствовать коагуляции ее компонентов, в состав которых входят и клетки микроорганизмов, с образованием взвеси хлопьев. Предполагается сохранение биохимического и минерального состава компонентов сыворотки на этапах очистки за счет избирательного коагулирования преимущественно бактериальных клеток. Проведение процесса сепарирования с отделением образовавшейся взвеси позволит увеличить прозрачность сыворотки и провести ее деконтаминацию.When developing this method for purifying cattle blood serum from contaminants, it was taken into account that in the process of microfiltration, the use of a filter with a pore diameter of 450 nm is a preliminary clarification step in which the bacterial cells do not completely retain. Adding purified and concentrated shungite extract to the clarified serum will contribute to the coagulation of its components, which include microorganism cells, with the formation of a suspension of flakes. Preservation of the biochemical and mineral composition of serum components at the stages of purification due to the selective coagulation of mainly bacterial cells is supposed. Carrying out the separation process with the separation of the resulting suspension will increase the transparency of the serum and carry out its decontamination.

Введение в предварительно очищенную сыворотку лантаноидов будет способствовать избирательной коагуляции бактериальных клеток, что обусловлено реакцией комплексообразования трехвалентных катионов лантаноидов с нуклеиновыми кислотами микроорганизмов. Предполагается, что реакция нуклеиновой кислоты с металлом осуществляется посредством фосфатных групп, при этом компоненты сыворотки, не содержащие ДНК или РНК, не принимают участия в реакции комплексообразования.The introduction of lanthanides into pre-purified serum will facilitate the selective coagulation of bacterial cells, which is due to the complexation reaction of the trivalent cations of lanthanides with the nucleic acids of microorganisms. It is assumed that the reaction of a nucleic acid with a metal is carried out by means of phosphate groups, while serum components that do not contain DNA or RNA do not participate in the complexation reaction.

Очистка сыворотки крови крупного рогатого скота предлагаемым способом иллюстрируется следующими примерами.The purification of blood serum of cattle by the proposed method is illustrated by the following examples.

Пример 1. Биохимические показатели образцов одной из типовых серий сыворотки крови сгруппированы в следующем порядке:Example 1. Biochemical parameters of samples of one of the typical series of blood serum are grouped in the following order:

- оценка состояния белкового обмена (табл. 2);- assessment of the state of protein metabolism (table. 2);

- оценка состояния водно-электролитного и минерального обменов (табл. 3);- assessment of the state of water-electrolyte and mineral exchanges (table. 3);

- оценка состояния липидного обмена (табл. 4);- assessment of lipid metabolism (table. 4);

- оценка активности ферментов (табл. 5);- assessment of enzyme activity (table. 5);

Из результатов биохимического контроля следует, что содержание компонентов белкового обмена: общий белок, альбумин, мочевина, мочевая кислота, креатинин, билирубин, в образцах сохраняются на уровне исходной сыворотки. Некоторое увеличение содержания компонентов после фильтра 220 нм обусловлено тем, что образцы сыворотки отбирают на конечном этапе фильтрации. Содержание глюкозы как компонента углеводного обмена также остается без изменений.From the results of biochemical control it follows that the content of the components of protein metabolism: total protein, albumin, urea, uric acid, creatinine, bilirubin, in the samples remains at the level of the initial serum. A slight increase in the content of components after the 220 nm filter is due to the fact that serum samples are taken at the final stage of filtration. The glucose content as a component of carbohydrate metabolism also remains unchanged.

В таблице 3 представлены результаты определения компонентов водно-электролитного и минерального обмена сыворотки крови.Table 3 presents the results of determining the components of water-electrolyte and mineral metabolism of blood serum.

Из данных таблицы 3 следует, что по содержанию кальция, магния, фосфора, калия, натрия, меди, алюминия, никеля и стронция различия отсутствуют на всех этапах очистки сыворотки.From the data of table 3 it follows that according to the content of calcium, magnesium, phosphorus, potassium, sodium, copper, aluminum, nickel and strontium, there are no differences at all stages of serum purification.

Главными липидными компонентами сыворотки крови являются свободный холестерин и триглицериды (таблица 4).The main lipid components of blood serum are free cholesterol and triglycerides (table 4).

Содержание ферментов в сыворотке крови на этапах очистки представлено в таблице 5.The content of enzymes in serum at the stages of purification are presented in table 5.

Из таблицы 5 следует, что ферменты сыворотки аланинаминотрансфераза, альфа-амилаза, креатинкиназа, щелочная фосфатаза и другие в исходном образце и в образцах после сепаратора и микрофильтрации остаются на одном уровне.From table 5 it follows that the serum enzymes alanine aminotransferase, alpha-amylase, creatine kinase, alkaline phosphatase and others in the original sample and in the samples after the separator and microfiltration remain at the same level.

Пример 2. В таблице 6 представлены данные биохимического контроля следующих образцов: нативная сыворотка, прошедшая этап микрофильтрации через фильтр 450 нм; сыворотка после внесения лантаноидов и экспозиции в течение 20 часов; после последовательных этапов сепарирования и стерилизующей микрофильтрации. Сыворотка крови, осветленная сепарированием с отделением биосубстрата, в процессе стерилизующей микрофильтрации не вызывает интенсивной закупорки пор фильтра, что значительно упрощает технологию микрофильтрации.Example 2. Table 6 presents the data of biochemical control of the following samples: native serum, which passed the stage of microfiltration through a 450 nm filter; serum after application of lanthanides and exposure for 20 hours; after successive stages of separation and sterilizing microfiltration. Blood serum clarified by separation with the separation of the biosubstrate during the sterilizing microfiltration does not cause intense blockage of the pores of the filter, which greatly simplifies the microfiltration technology.

Как следует из данных таблиц 1-5, компоненты сыворотки крови, не содержащие ДНК или РНК, не принимают участия в реакции комплексообразования, так как их содержание в исходной нативной сыворотке не изменяется по сравнению с конечным продуктом. Сыворотка, обработанная лантаноидами, обладает стабильными ростовыми свойствами, обеспечивает стабильное пассирование и криоконсервирование клеток.As follows from the data of tables 1-5, the components of the blood serum that do not contain DNA or RNA do not participate in the complexation reaction, since their content in the original native serum does not change compared to the final product. Serum treated with lanthanides has stable growth properties, provides stable passaging and cryopreservation of cells.

Claims

A method of purifying cattle blood serum from contaminating agents, including the use of frozen blood supplied from slaughterhouses, characterized in that after thawing and clarification by microfiltration through the filter with pores of 450 nm, serum is added to the serum with stirring 1% purified schungite mineral water extract, defended 18-20 hours at room temperature, clarified by separation on a flow centrifugal separator and the process is completed by filtration through a sterilizing microfilter with a diameter of then 220 nm.