RU2736224C2

RU2736224C2 - Method for rapid release of genomic dna for clinical studies

Info

Publication number: RU2736224C2
Application number: RU2018147571A
Authority: RU
Inventors: Татьяна Эдуардовна Иващенко; Юлия Алмазовна Насыхова; Ольга Александровна Тарасенко
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2020-11-12
Also published as: RU2018147571A; RU2018147571A3

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention is a method applicable for a different type of biological material, including whole blood and capillary blood samples, a leukocyte film, amniotic fluid, placenta villi, hair bulbs, dry whole blood spots, involving treatment of biological samples with a lysing buffer, wherein incubation is carried out at temperature 98 °C for 15 min, centrifugation—at 13.4 thousand rpm for 75 s, and lysing buffer include 0.75 mM EDTA (pH=8), 35 mcM SDS.EFFECT: method enables to extract DNA from biological samples with high concentration and high degree of purity of the recovered DNA in a method for rapid isolation of genomic DNA for clinical studies.1 cl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области биологии и медицины и связано с разработкой способа выделения геномной ДНК из образцов биологического материала. Способ может быть использован при выполнении молекулярно-генетических исследований наследственных и мультифакторных заболеваний, в том числе при пренатальных исследованиях, генной дактилоскопии, исследованиях акушерских и гинекологических патологий и др. Способ применим для различного типа биологического материала, в том числе образцов цельной венозной и капиллярной крови, лейкоцитарной пленки, амниотической жидкости, ворсин плаценты, луковиц волос, сухих пятен цельной крови. Способ позволяет выделять ДНК из биологических образцов с высокой концентрацией и высокой степенью чистоты выделяемой ДНК.The invention relates to the field of biology and medicine and is associated with the development of a method for isolating genomic DNA from samples of biological material. The method can be used when performing molecular genetic studies of hereditary and multifactorial diseases, including prenatal studies, gene fingerprinting, studies of obstetric and gynecological pathologies, etc. The method is applicable for various types of biological material, including samples of whole venous and capillary blood , buffy coat, amniotic fluid, placental villi, hair follicles, dry whole blood spots. The method makes it possible to isolate DNA from biological samples with a high concentration and high purity of the extracted DNA.

Анализ патентной и специальной литературы показал, что в настоящее время стандартными способами выделения ДНК является методы, основанные на использовании лизоцима, додецилсульфата натрия, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в качестве индукторов лизиса клеточной стенки, с последующей депротеинизацией лизата хлороформом или фенолом и осаждением ДНК этанолом или изопропанолом [Marmur. J.A. J. Mol. Biol. 1961. 3: 208-218, Sambrook J., Fritsch E.P., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. - NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 1885 p]. Основными недостатками указанных методов являются количество времени, затрачиваемое на проведение экстракции ДНК (2 дня), и многостадийность. Учитывая то, что многие клинические исследования, в частности пренатальные исследования, должны выполняться в кратчайшие сроки, сокращение длительности процесса является лимитирующим условием их использования. Другим недостатком указанных методов является невозможность или сложность стандартизации процесса для использования различных по качеству и количеству образцов, поступающих на исследования. Кроме того, недостатком данных методов является токсичность и дороговизна используемых реактивов.Analysis of patent and special literature showed that currently the standard methods for DNA isolation are methods based on the use of lysozyme, sodium dodecyl sulfate, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) as inducers of cell wall lysis, followed by deproteinization of the lysate with chloroform or phenol and DNA precipitation with ethanol or isopropanol [Marmur. J.A. J. Mol. Biol. 1961.3: 208-218, Sambrook J., Fritsch E.P., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. - NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 1885 p]. The main disadvantages of these methods are the amount of time spent on DNA extraction (2 days), and the multistage nature. Considering the fact that many clinical studies, in particular prenatal studies, must be carried out as soon as possible, reducing the duration of the process is a limiting condition for their use. Another disadvantage of these methods is the impossibility or difficulty of standardizing the process for the use of samples of different quality and quantity submitted for research. In addition, the disadvantage of these methods is the toxicity and high cost of the reagents used.

Известны способы, в том числе и коммерческие наборы (DIAtom™ DNA Prep100) для выделения ДНК, на основе обратимой сорбции молекул ДНК на поверхности сорбента в присутствие хаотропной соли [Vogelstein В, Gillespie D. 1979. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 76, 615-619; Thompson J.D, Cuddy K.K., Hainess D.S., Gillespie D. 1990. Nucl. Acids Res., v. 18,1074]. Однако, в состав данных наборов входят йодистый натрий, перхлорат натрия и соли гуанидина, которые могут содержаться в остаточных концентрациях в конечном продукте выделения и могут снижать выход ДНК, а также ингибировать активность ряда ферментов, что ограничивает сферу их практического применения.Known methods, including commercial kits (DIAtom ™ DNA Prep100) for DNA isolation, based on reversible sorption of DNA molecules on the surface of the sorbent in the presence of a chaotropic salt [Vogelstein B, Gillespie D. 1979. Proc. Natl. Acad. Sci., V. 76,615-619; Thompson J. D, Cuddy K. K., Hainess D. S., Gillespie D. 1990. Nucl. Acids Res., V. 18.1074]. However, these kits contain sodium iodide, sodium perchlorate and guanidine salts, which can be contained in residual concentrations in the final product of isolation and can reduce the DNA yield, as well as inhibit the activity of a number of enzymes, which limits the scope of their practical application.

Известны способы выделения ДНК и коммерческие наборы (Dynabeads® DNA, Dynal; MagneSil, Promega; GenoPrep™ NA magnetic beads, Qiagen), основанные на использовании магнитной сепарации. Для процесса выделения используются магнитные носители с иммобилизированными аффинными лигандами или изготовленные из биополимера, увеличивающего аффинность к нужной нуклеиновой кислоте. Основным недостатками данных методом является высокая стоимость реактивов и многостадийность.Known methods of DNA extraction and commercial kits (Dynabeads® DNA, Dynal; MagneSil, Promega; GenoPrep ™ NA magnetic beads, Qiagen), based on the use of magnetic separation. For the isolation process, magnetic carriers with immobilized affinity ligands or made from a biopolymer that increases the affinity for the desired nucleic acid are used. The main disadvantages of this method are the high cost of reagents and the multistage nature.

Наиболее близким техническим решением является коммерческий набор «Экспресс-ДНК-Био» (Группа компаний «Алкор-био»), который так же, как и предлагаемый способ выделения, основан на термальном лизисе и последующем осаждении нерастворимых компонентов. Набор позволяет экспресс выделение ДНК из цельной крови и биоптатов. Однако, данный набор имеет ограниченную область применения и заявлено его применение для выделения ДНК, которая может быть использована только при постановке ПЦР в реальном времени. Кроме того, недостатком является стоимость набора и низкий выход ДНК.The closest technical solution is the commercial set "Express-DNA-Bio" (Group of companies "Alkor-bio"), which, like the proposed method of isolation, is based on thermal lysis and subsequent precipitation of insoluble components. The kit allows for the express isolation of DNA from whole blood and biopsies. However, this kit has a limited field of application and its use is claimed for DNA isolation, which can only be used for real-time PCR. Besides, the disadvantages are the cost of the kit and the low DNA yield.

Целью изобретения является повышение эффективности, снижение трудоемкости и длительности процесса выделения геномной ДНК для клинических исследований, а также удешевление способа.The aim of the invention is to increase the efficiency, reduce the complexity and duration of the process of isolating genomic DNA for clinical research, as well as reduce the cost of the method.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе экспресс-выделения геномной ДНК для клинических исследований, включающем обработку биологических образцов лизирующим буфером, инкубирование, центрифугирование, инкубирование производят при температуре 98°С в течение 15 мин, центрифугирование при 13,4 тыс об/мин в течение 75 сек, а в лизирующий буфер включают 0.75 мМ ЭДТА (рН=8), 35 мкМ SDS.The solution to this problem is ensured by the fact that in the method of express-isolation of genomic DNA for clinical research, including the processing of biological samples with a lysis buffer, incubation, centrifugation, incubation is performed at a temperature of 98 ° C for 15 min, centrifugation at 13.4 thousand rpm for 75 sec, and 0.75 mM EDTA (pH = 8), 35 μM SDS are included in the lysis buffer.

Выделяемая предлагаемым способом ДНК может быть использована в клинических молекулярно-генетических исследованиях, выполняемых с использованием методов ПЦР-ПДРФ анализа, аллель-специфичной ПЦР, мультиплексной лигазной реакции (МЛПА), ПЦР в реальном времени, КФ-ПЦР, прямого секвенирования по Сэнгеру. Предлагаемый способ позволяет осуществлять эффективный лизис клеточных и ядерных мембран, экстракцию ДНК и одновременное ее осаждение. Данный способ не использует токсичные реагенты и абсолютно безопасен для оператора.The DNA isolated by the proposed method can be used in clinical molecular genetic studies performed using PCR-RFLP analysis methods, allele-specific PCR, multiplex ligase reaction (MLPA), real-time PCR, CF-PCR, direct Sanger sequencing. The proposed method allows for effective lysis of cell and nuclear membranes, DNA extraction and its simultaneous precipitation. This method does not use toxic reagents and is absolutely safe for the operator.

Способ выделения заключается в добавлении к предварительно подготовленному образцу биологического материала лизирующего буфера, последующей инкубации образца при температуре 98°С в течение 15 минут. По истечению времени образец центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Нерастворимые компоненты осаждаются на дно пробирки. Надоосадочную жидкость (супернатант) переносят в чистый эппендорф. Отобранный супернатант является конечным продуктом - раствором, содержащим выделенный образец ДНК, и далее его используют по назначению, в том числе для постановки реакции амплификации. Хранить образец выделенной ДНК данным методом следует при +4°С.The method of isolation consists in adding a lysis buffer to a previously prepared sample of biological material, followed by incubation of the sample at a temperature of 98 ° C for 15 minutes. After the expiration of time, the sample is centrifuged at 13.4 thousand rpm for 75 seconds. Insoluble components settle to the bottom of the tube. The supernatant fluid (supernatant) is transferred to pure Eppendorf. The selected supernatant is the final product - a solution containing the isolated DNA sample, and then it is used for its intended purpose, including for staging an amplification reaction. Store a sample of isolated DNA using this method at + 4 ° C.

Экспериментальным путем было подтверждено, что при условии использования рекомендуемых объемов биологического образца для выделения ДНК концентрация полученных растворов ДНК составляет 30-60 нг/мкл; коэффициент А260/А280 находится в пределах 1,7-1,9, что свидетельствует о высокой чистоте образцов. Измерение концентрации ДНК выполнялось при помощи флуориметра Qubit (Thermo Fischer Scientific, USA), степень ее чистоты определялись спектрофотометрическим методом с использованием NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA). Экспериментально было показано, что хранение образцов ДНК, выделенных данным способом, при температуре +4°С в течение 3 лет не влияет на качество ДНК.It was experimentally confirmed that, provided that the recommended volumes of a biological sample are used for DNA isolation, the concentration of the resulting DNA solutions is 30-60 ng / μl; the A260 / A280 coefficient is in the range 1.7-1.9, which indicates the high purity of the samples. The DNA concentration was measured using a Qubit fluorometer (Thermo Fischer Scientific, USA), the degree of its purity was determined spectrophotometrically using a NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA). It has been experimentally shown that storage of DNA samples isolated by this method at + 4 ° C for 3 years does not affect the quality of DNA.

Использование данного способа позволяет легко стандартизировать процесс без использования дополнительных исследований (спектрофотометрия, флуориметрия и т.д.), которые усложняют процесс и увеличивают время анализа, что часто является неприемлемым для клинических исследований.The use of this method makes it easy to standardize the process without using additional studies (spectrophotometry, fluorimetry, etc.), which complicate the process and increase the analysis time, which is often unacceptable for clinical studies.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образцом.The proposed method is carried out by the following sample.

Пример 1. Выделение ДНК из образца амниотической жидкости (при сроках беременности 16-25 недель).Example 1. Isolation of DNA from a sample of amniotic fluid (at 16-25 weeks of gestation).

Образец амниотической жидкости объемом 4 мл. центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость удаляют. К осадку добавляют 100 мкл лизирующего буфера. Осадок ресуспендируют. Суспензию инкубируют при температуре 98°С в течение 15 минут. По истечении времени суспензию центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость переносят в чистый эппендорф и далее используют при постановке ПЦР.4 ml amniotic fluid sample. centrifuged at 13.4 thousand rpm for 75 seconds. The supernatant is removed. 100 μl of lysis buffer is added to the pellet. The precipitate is resuspended. The suspension is incubated at 98 ° C for 15 minutes. After the time has elapsed, the suspension is centrifuged at 13.4 thousand rpm for 75 seconds. The supernatant liquid is transferred to a pure Eppendorf and then used for PCR.

Пример 2. Выделение ДНК из образца ворсины плаценты.Example 2. Isolation of DNA from a sample of placental villi.

Образец плаценты объемом до 2 мм² помещают в 100 мкл лизирующего буфера и инкубируют при температуре 98°С в течение 15 минут. При анализе образцов большего размера следует увеличить объем лизирующего буфера. По истечении времени образец центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость переносят в чистый эппендорф и далее используют при постановке ПЦР.A sample of the placenta with a volume of up to 2 mm ^{2 is} placed in 100 μl of lysis buffer and incubated at a temperature of 98 ° C for 15 minutes. For larger samples, increase the volume of lysis buffer. After the time has elapsed, the sample is centrifuged at 13.4 thousand rpm for 75 seconds. The supernatant liquid is transferred to a pure Eppendorf and then used for PCR.

Пример 3. Выделение ДНК из образца цельной венозной или капиллярной крови.Example 3. Isolation of DNA from a sample of whole venous or capillary blood.

Предварительно, образец цельной венозной крови следует центрифугировать в течение 5 минут при 1,5 тыс. об/мин для получения лейковзвеси. Затем 100 мкл надоосадочной жидкости переносят в чистый эппендорф и центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек с целью осаждения клеток крови. Надоосадочную жидкость удаляют. К осадку добавляют лизирующий буфер и осадок ресуспендируют. Суспензию инкубируют при температуре 98°С в течение 15 минут. По истечении времени суспензию центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость переносят в чистый эппендорф и далее используют при постановке ПЦР.Previously, a sample of whole venous blood should be centrifuged for 5 minutes at 1.5 thousand rpm to obtain a leukemia suspension. Then 100 μl of the supernatant is transferred into a clean Eppendorf and centrifuged at 13.4 thousand rpm for 75 seconds in order to precipitate blood cells. The supernatant is removed. Lysis buffer is added to the sediment and the sediment is resuspended. The suspension is incubated at 98 ° C for 15 minutes. After the time has elapsed, the suspension is centrifuged at 13.4 thousand rpm for 75 seconds. The supernatant liquid is transferred to a pure Eppendorf and then used for PCR.

Пример 4. Выделение ДНК из сухого пятна цельной крови.Example 4. Isolation of DNA from a dry spot of whole blood.

Предварительно, фильтровальную бумагу с сухим пятном цельной крови размером 0,2-0,5 см² мелко нарезают и помещают в пробирку. Для первичной отмывки образца к нему добавляют 1,5 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) и оставляют на 15-20 мин при комнатной температуре. Затем жидкость тщательно удаляют и добавляют 100 мкл лизирующего буфера. Образец инкубируют при температуре 98°С в течение 15 минут. По истечении времени образец центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость переносят в чистый эппендорф и далее используют при постановке ПЦР.Previously, filter paper with a dry spot of whole blood measuring 0.2-0.5 cm ^{2 is} finely cut and placed in a test tube. For the primary washing of the sample, 1.5 ml of saline (0.9% NaCl) is added to it and left for 15-20 minutes at room temperature. Then the liquid is carefully removed and 100 μl of lysis buffer is added. The sample is incubated at 98 ° C for 15 minutes. After the time has elapsed, the sample is centrifuged at 13.4 thousand rpm for 75 seconds. The supernatant liquid is transferred to a pure Eppendorf and then used for PCR.

Изобретение решает задачу упрощения, стандартизации и удешевления процесса, а также сокращения времени экстракции ДНК до 15 минут. Изобретение также позволяет значительно уменьшить количество образца, используемого для выделения ДНК.The invention solves the problem of simplifying, standardizing and reducing the cost of the process, as well as reducing the time for DNA extraction to 15 minutes. The invention also significantly reduces the amount of sample used for DNA extraction.

Claims

A method for the rapid isolation of genomic DNA for clinical research, including the processing of biological samples with a lysis buffer, incubation, centrifugation, characterized in that the incubation is performed at a temperature of 98 ° C for 15 minutes, centrifugation - at 13.4 thousand rpm for 75 sec, and 0.75 mM EDTA (pH = 8), 35 μM SDS are included in the lysis buffer.