SU1747456A1 - Способ очистки синтетических [8-аргинин]вазопрессина или окситоцина - Google Patents
Способ очистки синтетических [8-аргинин]вазопрессина или окситоцина Download PDFInfo
- Publication number
- SU1747456A1 SU1747456A1 SU904844581A SU4844581A SU1747456A1 SU 1747456 A1 SU1747456 A1 SU 1747456A1 SU 904844581 A SU904844581 A SU 904844581A SU 4844581 A SU4844581 A SU 4844581A SU 1747456 A1 SU1747456 A1 SU 1747456A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- oxytocin
- arginine
- purification
- acetic acid
- water
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к медицине и ветеринарии. Сущность изобретени состоит в очистке на колонке при использовании в качестве носител сополимера 1-винил-2- пирролидона с N.N-диметакроилгексамети- лендиамином {Шг-сн сн с Нз)--N4 с оснъ ° NH(cH2)6NHCo-c-- сн2-сн2Јн сн I 2 где I 0.92-0,94; k 0,06-0,08, диаметр набухших гранул 50-125 мк. Цель - упрощение процесса очистки, увеличение срока службы носител . Рабоча колонна находилась в 0,2 н. СНзСООИ 2 года, проведено 12 очисток без изменени структуры носител . 2 табл. %1 VJ СЛ
Description
Изобретение относитс к химии природных соединений, а именно способам очистки синтетических коротких пептидных гормонов-нонапептидов 8-аргинин вазоп- рессина или окситоцина, используемых в медицине и ветеринарии.
Основными фармакологическими свойствами 8-аргинин вазопрессина вл ютс регул ци водно-солевого обмена и антидиуретическа активность у позвоночных, повышение кров ного давлени у млекопитающих. Окситоцин обладает способностью к сокращению гладкой мускулатуры матки у млекопитающих и усилению лактации.
Синтетические 8-аргинин вазопрессин или окситоцин, полученные как твердофазным , так и классическим методом в растворе обычно содержат балластные вещества в виде солей, а также примеси пептидов, образуемые как побочные продукты синтеза. Однако дл применени в медицине и дл медико-биологических исследований необходимы гомогенные высокоочищенные препараты 8-аргинин вазопрессина и оксито- цина. Обычно очистка 8-аргинин вазопрес- сина или окситоцина осуществл етс в несколько стадий. На первой стадии - обес- соливани - происходит отделение от солей и лишь в небольшой степени от примесей пептидной природы, на второй и последующих стади х - от пептидов, загр зн ющих целевой продукт и значительно снижающих биологическую активность пептидного гор- мона.
Дл очистки синтетических 8-арги- нин вазопрессина или окситоцина от примесей пептидной природы известно использование противоточного распреде- лени , заключающегос в многократном распределении вещества между двум жидкими фазами.
Недостатком данного метода вл етс необходимость использовани дорогосто - щего оборудовани и сложность технологического процесса. Достичь существенной очистки и высокого уровн биологической активности можно только при значительном количестве переносов, а именно, дл 8-ар- гинин вазопрессина - 198, (а дл окситоцина - 300. При этом используютс значительные объемы органических растворителей .
Известен также способ очистки синте- тического окситоцина путем распределительной хроматографии на сефадексе G-25, который осуществл етс при элюировании веществ на хроматографической колонке смесью растворителей
Недостатком данного способа вл етс то, что воспроизводимые и удовлетворительные результаты очистки получены лишь при использовании многокомпонентной смеси бензола, бутанола, пиридина, уксус- ной кислоты и воды. Кроме того, четырехста- дийна подготовка носител к работе приводит к длительному (5-6 дней) циклу о°истки и требует значительных объемов растворителей. Вследствие образовани двухфазной системы на хроматографической колонке необходимо использовать избыточное давление, а колонку периодически перебивать дл предотвращени высокого сопротивлени носител .
Наиболее близким к предлагаемому вл етс способ очистки синтетических 8- аргинин вазопрессина или окситоцина от примесей пептидной природы гель-фильт- рацией на колонке с сефадексом G-15 при элюировании 0,2 н.уксусной кислотой. Подготовка к работе и регенерирование сефа- декса осуществл етс длительное врем 50%-ной уксусной кислотой
Однако така обработка декстрановых носителей, в частности сефадексов, нежелательна из-за их ограниченной устойчивости в сильнокислой среде. В этих услови х происходит химическа деструкци сефадекса, его частичное растворение и загр знение продукта. Кроме того, хранение сефадекса в рабочем состо нии в водном растворе невозможно вследствие легкости разложени его микроорганизмами, а использование антисептика или хранение при пониженной температуре требует дополнительных материальных и энергетических затрат. Сефа- дексы обладают ограниченной механической прочностью, что ограничивает применение избыточного давлени . Этот фактор, а также значительна длина колонки, например, дл очистки окситоцина длина колонки составл ет 110см, «нественно снижают технологичность процесса.
Цель изобретени - упрощение процесса очистки синтетических пептидных гормонов 8-аргинин вазопрессина или окситоцина от примесей пептидной природы .
Поставленна цель достигаетс тем, что в качестве носител предлагаетс использовать гидрофильный полимер на основе 1- винил-2-пирролидона со свойствами, позвол ющими преодолеть недостатки сефадекса , т е. повысить устойчивость к кислым средам
Сополимеры 1-винил-2-пирролидона с N,N -метиленбисакриламидом, а также модификации этого полимера различными N- замещенными низшими алкилами метакриламидами используют дл гель- фильтрации белков. Однако они не примен ютс дл очистки олигопептидов.
Согласно предлагаемому способу дл очистки нонапептидных гормонов 8-арги- нин аазопрессина или окситоцина гель- фильтрацией используетс в качестве носител сополимер 1-винил-2-пирролидо- на с N.N -диметакроилгексаметилендиами- иом формулы
сн,
пз
{снгсн снгс- -к
,Мч .
КН2)6 NH
9
СН:
где I 0,92-0,94 k 0,06-0.08, диаметр набухших гранул полимера 0,05- 0,125 мм. Элюирование провод т 0,2 н.уксусной кислотой, регенерирование носител - 50%-ной уксусной кислотой. Данный способ позвол ет осуществить очистку 8-аргинин вазопрессина или оксито- цина от примесей пептидной природы по стандартному циклу, приведенному в табл. 1.
Рабоча хроматографическа колонка находилась в 0,2 н.уксусной кислоте в течение двух лет. За это врем на ней успешно проведено 12 делений 8-аргинин вазопрес- сина и окситоцинэ практически без измене- ний структуры носител , условий и результатов очистки, с хорошей воспроизводимостью результатов.
Предлагаемый полимер не подвергаетс разрушению микроорганизмами в вод- ной среде при комнатной температуре, не требу дополнительных материальных и энергетических затрат, св занных с использованием антисептика или хранением при пониженной температуре. Не наблюдаетс его химическа деструкци в сильнокислой среде и св занное с этим загр знение продукта , что позвол ет примен ть многократно регенерацию 50%-ной уксусной кислотой. Полимеры на основе 1-винил-2- пирролидона обладают более высокой механической прочностью по сравнению с сефадексами, при использовании избыточного давлени не происходит механической деструкции полимера. Согласно предлагав- мому способу примен етс колонка длиной в 28,5-47,5 см, что повышает технологичность метода.
Исходные вещества 8-аргинин вазоп- рессин и окситоцин синтезировали класси- ческим методом в растворе. Отщепление бензильной защиты сульфгидрильной группы цистеина в обоих случа х осуществл ли натрием в жидком аммиаке. На этой стадии из-за жесткого воздействи образуетс зна- читальное количество примесей в результате разрушени пептидных гормонов. Дл образовани дисульфидной св зи 8-арг и- нин вазопрёсдина использовали феррициа- нид кали , циклизацию окситоцина осуществл ли Й202. Большую часть примесей , образующихс на этой стадии в результате межмолекул рного окислени составл ют изомерные димеры. Полученные 8-аргинин вазопресссин или оксито- цин обессоливали на амберлите IRC-50 (Н4) лиофилизовали и использовали дл очистки по предлагаемому способу. В качестве исходного использовали также загр зненный окситоцин, представл ющий собой узкую
фракцию с пониженным содержанием целевого гормона после очистки окситоцина дл ветеринарии препаративной 8ЭЖХ на но- ситиге Силасорб Cie. Характеристики исходных и очищенных по предлагаемому способу продуктов приведеныв табл. 2.
Известно, что вазопрессорна активность очищенного 8-аргинин вазопрессина составл ет470+20 МЕ/мг, очищенный окситоцин обладает биологической активностью 480 МЕ/мг. В соответствии с табл.2 пониженна биологическа активность дл 8-ар- гинин вазопрессина составл ет -22°,дл окситоцина-25,5°-значениеугла удельного вращени св зано с невысоким содержанием целевого пептида в исходных образцах. В результате очистки по предлагаемому способу наблюдаетс улучшение физико-химических характеристик продуктов и получают практически индивидуальные по ВЭЖХ продукты с биологической активностью , аналогичной прототипу.
Индивидуальность веществ контролировали тонкослойной хроматографией на пластинах Силуфол в системах (соотношени объемные):
1)н-пропанол - вода, 25%-ный аммиак 6:1:3:
2)н-бутанол - пиридин-уксусна кислота-вода 15:10:3:12;
3)н-бутанол - уксусна кислота-вода 3:1:1;
4)пиридин - уксусна кислота - вода 50:30:15;- -
5)н-бутанол - уксусна кислота - вода 4:1:5 (верхн фаза);
6)н-бутанол - уксусна кислота - вода 4:1:1,
ВЭЖХ на колонке Servachrorrt Si:100:Polyol:RP8 (250x4,6 мм), размер частиц 5 мкм, элюент 0,05%-на трифторуксус- на кислота, градиент ацетонитрила от 15 до 30% и на колонке Ultrasphere Octyl (250x4,6 мм) элюент 0,05 М КНзРОз, градиент ацетонитрила от 10 до 60%, детектирование проводили при длине волны 226 нм. Величины углов удельного вращени определ лись на пол риметре Perkln - Elmer 241 me.
Пример 1. Очистка 8-аргинин вазоп- рессина.
Раствор 90 г 8-аргинин вазопрессина с вазопрессорной биологической активностью 324 МЕ/мг, в 0,8 мл 0,2 н.уксусной кислоты нанос т на колонку 16x47CMC сопо-. лимером 1-винил-2-пирролидона с N.Nl -ди- метакроилгексаметилендиамином с I 0,94, k 0,06 и диаметром набухших гранул 0,05- 0,07 мм и элюируют со скоростью 9,5 мл/ч. Отбирают55 мл элюата и фракционируют по 1 мл. Фракции, содержащие целевое вещество , объедин ют и лиофилизуют. Получают 57,3 мг (91% по основному веществу) 8-аргинин вазопрессина, индивидуального по ТСХ в Системах 1-4.
Пример 2. Очистка окситоцина.
Раствор 109 мг окситоцина в 1 мл 0,2 н.уксусной кислоты нанос т на колонку 1,6x43.5 см с сополимером 1-винил-2-пир- ролидона с М,м -диметакроилгексаметилен- диамином с I 0,94, к 0,06 и диаметром набухших гранул 0,05-0,07 мм и элюируют со скоростью 6 мл/ч. Собирают 40 мл элюа- та, фракционируют по 1 мл. Фракции, содержащие целевое вещество, объедин ют и лиофилизуют, Получают 33,3 мг (64 %) по основному веществу) окситоцина, индивидуального по ТСХ в системах 5 и 6.
Пример 3. Очистка загр зненного окситоцина.
Желтоватый раствор 103 мг окситоцина с биологической активностью 99 МЕ/мг нанос т на колонку 1,6x28,5 см с сополимером 1-винил-2-пирролидона с N,N-диметакро- илгексаметилендиамином с I 0,92, k 0,08 и диаметром набухших гранул 0,1-0,125 мм и элюируют аналогично примеру 2. Получают 10,4 мг (51% по основному веществу) окситоцина.
Пример 4. Получение сополимера 1-винил-2-пирролидона с N ,N-диметакро- илгексаметилендиамином.
В 1,5 л деминерализованной воды раствор ют 115 г хлорида натри при 95°С и перемешивании, добавл ют суспензию 40 г крахмала в 100 мл деминерализованной воды , кип т т в течение 5-10 мин, охлаждают до 40°С и раствор ют в реакционной среде 180 г карбоната кали . При перемешивании в течение 3-5 мин добавл ют раствор моно- меров, состо щий из 150 мг 1- винил-2-пиррол и донаи
М,м -диметакроилгексаметилен- диамина (21,7 г дл k 0,06 и 29,6 г дл k 0,08) 150 мл циклогексанола и 1,5 г азоСтандартный вазопрессина
бис-шобу.иронитрила . Реакционную массу перемешивают при 55иС 20 мин и повышают температуру до 70°С в течение 2 ч. Сополи- меризацию продолжают 3 ч, заверша ее
при 80°С. Реакционную массу охлаждают и разбавл ют 5 л деминерализованной воды. Полученные гранулы несколько раз промывают этанолом или пропанолом и фракционируют на ситах с различными размерами
чеек. Получают фракции сополимера 1-ви-. нил-2-пирролидона с N.N -диметакроилгек- саметилендиамином с I- 0,94 и k 0,06 или I 0,92 и k - 0,08 и диаметром набухших гранул от 0,05 до 0,315 мм с общим выходом
Claims (1)
- 81 %. Удельный объем гранул в воде 5,8-6,2 мг/л. Фракции с диаметром набухших гранул 0,05-0,125 используют дл очистки. Формула изобретени Способ очистки синтетических 8-аргинин вазопрессина или окситоцина гель- фильтрацией на колонке при элюировании раствором уксусной кислоты,отл ичающ- и и с тем, что с целью упрощени процесса , в качестве носител используют сополимер 1-винил-2-пирролидона с N.N-диметакроилгексаметилендиамином формулы-„М- ;нНснг Нк.NHо351СН2 )бМН(0 40-Н2С-ССН3где I 0,92-0.94; k - 0,06-0,08,с диаметром набухших гранул 50-12545цикл очистки 8-аргинин или окситоцинаТ а бл и цХарактеристика исходных и очищенных продуктовТавлиц« 2Чистоту (8-аргининЗ вазолр ссина исследовали в системе н-проланол - вода - анниак 6:1:3, окситоцин - в системн-бутанол - уксусна кислота - вода trliS (верхн фаза), про вление хлор-толидиноеыи реактивом В-Аргинин eajonpecCHH - аазолрессорное действие, окситочин - действие на гпадхуа мускулатуру натки крмси
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904844581A SU1747456A1 (ru) | 1990-06-29 | 1990-06-29 | Способ очистки синтетических [8-аргинин]вазопрессина или окситоцина |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904844581A SU1747456A1 (ru) | 1990-06-29 | 1990-06-29 | Способ очистки синтетических [8-аргинин]вазопрессина или окситоцина |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1747456A1 true SU1747456A1 (ru) | 1992-07-15 |
Family
ID=21523892
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU904844581A SU1747456A1 (ru) | 1990-06-29 | 1990-06-29 | Способ очистки синтетических [8-аргинин]вазопрессина или окситоцина |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1747456A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2581019C1 (ru) * | 2015-03-26 | 2016-04-10 | Индивидуальный предприниматель Михайлов Олег Ростиславович | Способ очистки десмопрессина (варианты) |
-
1990
- 1990-06-29 SU SU904844581A patent/SU1747456A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Папсуевич О. С.,Чипенс Г. И. и др. Ней- рогипофизарные гормоны. - Рига: Зинатне, 1986. с. 16-34. Шредер Э. Любке К. Пептиды. - М.: Мир, 1969. т. II, с. 76-77. Donald Jamashira. Partition chromatography of Oxltocin on Sephadex. - Nature, 1.964. 2JЈj, N: 4914, p. 76-77. Папсуевич О. С. и др. Синтез окситоци- на,-Хими природных соединений, 1988, № 3, с. 433-439. Manning M. The purification of slntetlc oxitocin and analogs by gel-filtration on Sephadex. - J. Chromatogr. 1968, 3.8, № 3, p. 396-398. Патент US № 3728290. кл. 260-2.5. опублик. 1978. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2581019C1 (ru) * | 2015-03-26 | 2016-04-10 | Индивидуальный предприниматель Михайлов Олег Ростиславович | Способ очистки десмопрессина (варианты) |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3266311B2 (ja) | 新規ポリペプチドおよびこれを用いる抗hiv剤 | |
Nestor Jr et al. | Synthesis and biological activity of some very hydrophobic superagonist analogs of luteinizing hormone-releasing hormone | |
KR100352541B1 (ko) | 노나-및데카펩타이드와,이를포함하는후천성면역결핍증치료용약제학적조성물 | |
CH639361A5 (de) | Peptide, verfahren zu deren herstellung und pharmazeutische praeparate, welche diese als wirkstoff enthalten. | |
SE437993B (sv) | Sett att framstella en polypeptid med luliberin-agonist-egenskaper | |
JPH0219397A (ja) | アルギニンバソプレシン拮抗剤の新規線形誘導体類 | |
DE3782010T2 (de) | Vom calcitonin-gen abgeleitete peptidderivate. | |
US5674850A (en) | High purity desmopressin produced in large single batches | |
US4071622A (en) | Treatment of a mammary or DMBA inducible tumor | |
EP0502198B1 (en) | Novel polypeptide and anti-hiv drug prepared therefrom | |
SU1747456A1 (ru) | Способ очистки синтетических [8-аргинин]вазопрессина или окситоцина | |
CA1101843A (en) | Cyclic hexapeptides useful for increasing feed efficiency | |
US5723504A (en) | Amadori reaction compounds and products, process for their manufacture, and their use as cytokine inducers | |
JPH03118393A (ja) | ペプチド又はプソイドペプチド構造の低分子量化合物の精製方法 | |
EP0138616A2 (en) | Nona- and dodecapeptides for augmenting natural killer cell activity, processes for making them and pharmaceutical compositions comprising them | |
JPH0288595A (ja) | 免疫刺激性ペプチド、その製法、及び該ペプチドを含有する薬剤組成物 | |
EP0446582A1 (en) | Method for producing of recombinant human cysteineless gamma-interferon free of methionine at n-terminal | |
EP0700928A1 (de) | Nukleinsäuren-bindende Oligomere für Therapie und Diagnostik | |
JPS60161999A (ja) | ペプチド | |
US4455303A (en) | Renin inhibitors | |
Bodanszky et al. | Two diastereoisomeric α, β-diaminobutyric acids from amphomycin | |
Narita et al. | The Estimation of the. BETA.-Sheet-Structure Stability of Protected Peptides in Organic Solvents. | |
GB2125408A (en) | Luteinizing and follicle-stimulating hormones releasing factor analogs | |
DE3605908A1 (de) | Verfahren zum reinigen von interferon | |
EP0327334A2 (en) | Phospholipase A2-inhibiting peptides |