SU1739855A3 - Способ получени полипептида, обладающего активностью фактора некроза опухоли человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к способу получени  полипептида со свойствами человеческого фактора некроза опухо- ли (ФНО). Способ получени  ФИО предполагает культивирование штаммов бактерий Escherichia coli, трансформированных рекомбинантными плазмидными ДНК рНТТ 26, или pHTR91, или PHTS115, или PHTS37, или рНТКРЗ, или рНТКШ, кодирующими ФНО в LB бу льоне, модифицированной М-9 среде или TG среде,выдел ют продукт, а потом очищают его путем нанесени  на колонку с ДЕАЕ-сефарозой с обессоливанием, ультрафильтрацией, изоэлектрофокуси- рующим гель-электрофорезом с после- -дующей ультрафильтрацией и гель- фильтрацией на колонке с Био-гелем.

Description

-

Ё

Изобретение относитс  к способу получени  полипептида со свойствами человеческого фактора некроза опухоли , который может быть использован в качестве противоопухолевых агентов, так как обладает селективной цито- токсической активностью по отношению к опухолевым клеткам и регрессирует, опухоли у животных.

Пример 1,

1. Получение и-РНК ФИО из человеческих альвеол рных макрофагов,

Человеческие альвеол рные макрофаги собирают бронхоальвеол рным промыванием с помощью фасфатно-солевого буфера. Альвеол рные макрофаги, 6,3 I07 клеток, суспендируют в среде RPM1-1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и высевают в чашки Петри (диаметром 8 см) при концентрации клеток на чашку. Их предварительно культивируют при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа Через 1 ч культивировани  эндотоксин (липополисаха- рид, полученный из E,coli), TPA (фор- бол-1-миристат-13-ацетат) и цикло- ; гексимид ( ингибитор синтеза белка) добавл ют до концентраций соответст-. венно 10 мкг/мл, 10 нг/ мл и 1 мкг/мп После этого культивирование продолжают 4,0 - 4,5 ч (общее врем  5,0 - 5,4 ч). Культуральную среду удал ют и макрофаги лизируют и гомогеннаи- -, руют в 5 М гуанидилтиоцианатном растворе , содержащем 0,6% N-лауроилсарко- зината натри  и 6 мМ нитрата натри л

VJ Ы О 00 СЯ (Л

OJ

Гомогенат центрифугируют в градиенте хлористого цези , содержащем 0,1 М ЭДТА. Осадок раствор ют в небольшом I количестве 7 М раствора, мочевины, содержащего 0,35 М NaCl 20 мм трис- НС1 (рН 7,4) и 20 мм ЭДТА, и осаждают этанолом. Получают 159 мкг общей РНК.

Фракцию общей РНК раствор ют в .1 мл 10 мМ трис-HCl (рИ 7,4) буфера, содержащего 1 мМ ЭДТА (ТЭ-раствор), и npoi-ревают при 65°С в течение 5 мино Добавл ют раствор хлористого натри  до концентрации 0,5 М и раствор нанос т на колонку с олиго(дТ)- целлюлозой, предварительно уравно- вешенной ТЭ-раствором, содержащим 0,5 М хлористый натрий. Поли(А)-и-РНК элюйруют из колонки с помощью ТЭ- раствора и получают 8 мкг РНК«

Поли(А)-и-РНК раствор ют в концентрации 1,9 нг/мл в дистиллированной воде и раствор инъецируют в ооци- ты Xenopus laevis в дозе приблизи- - тельно 50 мл на ооцит. Дес ть ооци- тов инкубируют в 100 мкл среды Barth при в течение 24 ч. Ооциты гомогенизируют и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин. Сус- пернатант подвергают анализу на ФНО- активность определением цитотоксичес- кой активности ho отношению к клеткам L-929 мыши.

Дл  этого образец (0,1 мл) серийно разбавл ют указанной ниже средой и в каждую лунку 96-луночного планшета прибавл ют 0,1 мл суспензии клеток L-929 (5х10 клеток/мл), содержащей актиномицин D (2 мкг/мл). Используют4 минимальную питательную среду Eagle, содержащую 1% эмбриональной бычьей сыворотки. Пластинку инкубируют при 38,5°С в течение 18 ч во влажной атмосфере , содержащей 5% углекислого газа.

Определение числа жизнеспособных клеток L-929 м оценку биологической активности провод т следующим образом . После инкубировани  прибавл ют 20 мкл 25%-ного глутаральдегида дл  фиксировани  жизнеспособных клеток, затем промывают и сушат. После этого дл  окрашивани  фиксированных клеток прибавл ют 0,1 мл 0,05%-ного раствора метиленового голубого. Избыток мети- ленового голубого отмывают и пластинки сушат. Метиленовый голубой, св завшийс  с фиксированными клетками,

10

9855

элюйруют 200 мкл 0,36 н„НС1 и измер ют его поглощение при 665 нм.

Поглощение пропорционально числу жизнеспособных клеток. Концентраци  требуема  дл  умерщвлени  50% клеток L-M, приравниваетс  к 1 ед активности/мл о Цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-M, определенную в указанных выше услови х, выражают как единицы (LM) дл  того, чтобы отличать от цитоксической активности по отношению к мышиным клеткам L-929 - клеткам-мишен м.

Супернатант, полученньй выше, обладает цитотоксической активностью 6,6 ед. (Ь-929)/мл. Это указывает на то, что образец поли(А)-и-РНК содержит и-РНК ФИО.

2. Синтез к-ДНК.

Комплементарную ДНК синтезируют с использованием полученной в разделе 1 поли(А)-и-РНК в качестве матрицы .

15

20

0

5

0

5

0

5

6 мкг поли(А)-и-РНК раствор ют в 40 мкл буфера 50 мМ трис-HCl (рН 8,3), содержащего 10 мМ MgCl2, 10 мМ ди- тиотреитола, 4 мМ пирофосфата натри , 1,25 мМ каждого из трех дезоксирибо- нуклеотидтрифосфатов дГТФ, дАТФ и дТТФ, 0,5 мМ дЦТФ, 167 нМ альфа-з2Р- дЦТФ (удельна  радиоактивность 3000 Ки/ммоль), 4 мкг олиго(дТ)1г„(4 и 120 ед. обратной транскриптазы, полученной из вируса птичьего миело- бластоза (ВПМ), и инкубируют при 43 С в течение 30 мин. После этого реакцию останавливают прибавлением ЭДТА„ Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол/хлороформ (1:1) и к водной фазе прибавл ют ацетат аммони  до концентрации 2,5 М. Гибрид к-ДНК-и-РНК выдел ют из водной фазы осаждением этанолом. Осадок гидрида к-ДНК-и-РНК раствор ют в 100 мкл 20 мМ буфера трис-HCl (рН 7,5), содержащего 5 мМ MgClfc, 10 мМ сульфата аммони , 100 мМ хлористого кали , 0,15 мМ бетаникоти- намидадениндинуклеотида, 5 мкг бычьеч- го сывороточного альбумина, 0,04 мМ каждого из четырех дезоксирибонуклео- тидтрифосфатов дГТФ, дАТФ, дТТФ и дЦТФ, 0,9 ед. рибонуклеазы НЕ.со11, 23 ед. ДНК-полимеразы 11, и кубируют при 12°С в течение 60 мин, а затем еще в течение 60 мин при.22°С дл  синтеза к-ДНК, Реакцию останавливают прибавлением ЭДТА, экстрагируют

«

смесью фенол/хлороформ и выдел ют осаждением этанолом

3.Получение к-ДНК с олиго (дЦ)- окончанием.

к-ДНК, полученную выше, раствор ют в 100 мМ буферного раствора какодила- та натри  (рИ 7,2), содержащего 2 мМ СаС12, 0,2 мМ дитиотреитола, 0,1 мМ альфа- 2Р-дЦТФ (удельна  радиоактивность 3 Ки/ммоль), 10 ед. терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин.

Реакцию останавливают прибавлением ЭДТА, к-ДНК экстрагируют смесь фенол/ /хлороформ и осаждают этанолом. к-ДНК, оканчивающуюс  олиго(дЦ), раствор ют в 10 мМ буфере трис-НС1 (рИ 7,4), содержащем 1 мМ ЭДТА и 100 мМ хлористого натри , до концентрации к-ДНК, оканчивающейс  олиго(дЦ) равной 2 мкг/мл.

4.Получение ДНК pBR322, оканчивающейс  олиго(дГ).

10 мкг ДНК pBR322 раствор ют в 100 мкл 20 мМ буфера трис-HCl (рН 7,4), содержащего 10 мМ хлористого магни , 50 мМ сульфата аммони , 10 мкг бычьего сывороточного альбумина , и прибавл ют 15 ед рестрик- ционной эндонуклеазы Pstl. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 1 ч, экстрагируют смесью фенол/хлороформ и выдел ют ДНК из водной фазы осаждением этанолом. Полученную ДНК раствор ют в 200 мкл такого же буферного раствора, который был использован дл  присоединени  к окончанию к-ДНК (за исключением того, что он содержит 80 едо терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и Н-дГТФ вместо

Р-дЦТФ), и инкубируют при 37°С в течение 20 мин, осуществл   присоединение приблизительно 10 - 15 остатков дезоксигуаниловой кислоты (дГ) к 3 -окончанию. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол/хлороформ и ДНК pBR3-22, оканчивающуюс  олиго (дГ), выдел ют из водной фазы осаждением этанолом. Результирующую ДНК pBR322 с присоединенными окончани ми раствор ют в том же буфере, которьй был использован дл  растворени  олиго(дЦ) концевой к-ДНК таким образом, чтобы результирующа  концентраци  ДНК pBR322 с присоединенными окончани ми была равна 20 мкг/мл.

5. Конструирование рекомбинатных ллазмид.

0

120 мкл раствора олиго (дЦ)-конце-1 вой к-ДНК смешивают с равным объемом раствора олиго(дГ)-концевой ДНК pBR322, инкубируют при 65°С в течение 5 мин и при 57°С в течение 120 мин дл  достижени  ренатурации. 6. Отбор организмов-хоз ев о Полученными ллазмидами трансформируют клетки штамма E.coli X 1776, культивируют при 37°С в 20 мл L-бульо- на (состав: 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого натри  и 1г глюкозы на 1 л, рН 7,2), содержащего 100 мкг/мл диаминопимели- новой кислоты и 40 мкг/мл тимидина, до тех пор, пока мутность, измер ема  при 600 нм, не достигнет 0,5. Клетки собирают центрифугированием при 4 С, промывают 10 мл 10 мМ буфера трис-HCl (рН 7,3), содержащего 50 мМ хлористого кальци . Клетки снова суспендируют в 2 мл того же буферного раствора и инкубируют при 0°С в течение 5 мин. К 0,2 мл 5 суспензии прибавл ют О,1 мл раствора рекомбинантных плазмид, полученного выше , инкубируют при 0°С в течение

5

0

0

5

0

0

5

15 мин, выдерживают при 42°С в течение 2 мин, добавл ют €,5 мл L-бульона с добавками и культивируют при встр хивании в течение 1 ч. Отбирают аликвоту культуры, нанос т на пластинку агара с L-бульном, содержащим добавки и тетрациклин в концентрации 15 мкг/мл, и культивируют при 37°С в течение 12ч. Набор к-ДНК получают отбором трансформированных клеток, устойчивых к тетрациклину.

7. Кодирование к-ДНК человеческого ФИО.

Трансформированные клетки, включающие в себ  рекомбинантные плазми- ды, содержащие к-ДНК, кодирующую по- липептид человеческого ФНО, отбирают гибридизационным анализом,

к-ДНК, кодирующую кроличий ФНО, выдел ют из рекомбинантной плазмиды pRTNF802 (как показано в справочном примере 7), расщепл ют эндонуклеазой Ava I или На« II, фрагменты ДНК выдел ют осаждением этанолом и электрофорезом в полиакриламидном геле.

Фрагмент ДНК (299 п„о), соответствующий основани м от 285 до 583, получают расщеплением эндонуклеазой Ava I (Av.a I-фрагмент)

Другой фрагмент ДНК (88 п.о-), соответствующий основани м от 33 до 120, получают расщеплением эндонуклеазой Нае II (Нае II-фрагмент). Ava I-фрагмент и Нае II-фрагмент мет т радиоактивной меткой Р„ Эти меченые фрагменты ДНК используют в качестве пробы дл  проверки набора к-ДНК и отбора трансформированных клеток, имеющих плазмиду, содержащую к-ДНК, кодирующую полипептид человеческого ФИО.

С использованием 2Т-меченого Ava I-фрагмента в качестве пробы при rtepBOM отборе из 20000 клоновг и отбирают 43 клона. Эти 43 выбранных клона подвергают второму отбору с использованием 32Р-меченого Нае II- фрагмента и отбирают 6 клонов, имеющих сильные гибридизационные сигналы на оба фрагмента к-ДНК ФИО кролика.

8.Экспресси  .

ДНК выдел ют из 6 клонов, отобранных в разделе 7, а именно плазмиды pIITNFl, pHTNF4, pHTNFS, pHTNFU, pHTNF22 и pHTNF260 Каждую из рекомби- натных плазмид ввод т в клетки E.coli НВ101, культивируют в 50 мл LB-бульо- на (составг 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г хлористого натри  на 1 л, рН 7,5) до тех пор, пока мутность культуры, измер ема  при 600 нм, не достигнет 0,8 После этого собирают приблизительно (3-5) хЮ10 клеток, суспендируют в 50 мМ буфера трис-HCl (рН 8,0), содержащего 0,15 лнзоцима и 30 мМ NaCl. После инкубации в течение 30 мин в .. лед ной воде клетки подвергают лизису шестикратным замораживанием-размора- живанием. Клеточные остатки удал ют центрифугированием и получают просветленный лиэат. Лизат, полученный из каждого трансформированного организма , подвергают анализу на цитотокси- ческую активность по отношению к . клеткам L-929.

Лизат, полученный из трансформированного организма, содержащего плазмиду pHTNF13, имеет цитотоксичес- кую активность 186,1 ед. (Ь-929)/мл.

9.Определение последовательности оснований в клонированной к-ДНК.

Рекомбинантную плазмиду pHTNF13 выдел ют так, как описано выше,, Плаз- мидную ДНК расщепл ют с помощью эн- донуклеаэы Pst I, клонируют к-ДНК , После этог фрагмент клонированной к-ДНК расщепл ют различными рестрик- ционными эндонуклеазами и последовательности оснований результирующих 16

o

5

0

5

фрагментов определ ют по методике Maxac-Gilberc.

Участок, кодирующий полипоптид человеческого ФИО, определен на основе гемологичности к последовательности оснований, кодирующей кроличий ФИО,

ДНК, кодирующа  полипептид человеческого ФИО, кодирует его полипептид-предшественник , состо щий из 233 аминокислотных остатков. Полный полипептид человеческого ФИО представл ет собой полипептид, соответствующий 155 аминокислотным остаткам от С-конца его предшественника, который кодируетс  последовательностью оснований от } 235 до № 699. Последний кодон, кодирующий полипептид человеческого ФИО, представл ет собой кодон TGA.

10. Иммунологические свойства полипептида человеческого ФИО.

Иммунологическую перекрестную реакционную способность полипептида человеческого ФИО лизата определ ют с помощью антитела против кроличьего г плазменного ФИО следующим образом.

Лизат смешивают с равным объемом разбавленного в 100 раз очищенного антитела против кроличьего плазменного ФИО, полученного в справочном примере . После инкубировани  при 37ЯЗ в течение 2 ч цитотоксическую активность реакционной смеси измер ют по методике, описанной выше, с использованием клеток L-929 в качестве кле- 5 ток-мишеней. Кроличий плазменный ФНО, полученный в справочном примере, предварительно разбавл ют фосфатным солевым буфером и разбавленный раствор используют в качестве контрольного ® образца ФНО. Цитотоксическа  активность полипептида человеческого ФНО не нейтрализуетс  антителом,

П р и м е р 2, Получение полипепг тида человеческого ФНО в Escherichia

5 coll.

1. Экспресси  под контролем промотора с ас о

к-ДНК выдел ют из рекомбинантной

0 плазмиды pHTHF13 так , как указано в примере 1, расщепл ют с помощью эн- донуклеаэы. Eco RI дл  отщеплени  части некодирующего участка ниже участка, кодирующего ФНО. Результи5 рующий фрагмент ДНК (приблизительно 1,1 к.д.о.) ввод т в больший фрагмент ДНК плазмиды pBR322 по Pst I и Eco RI и конструируют рекомбинант- ную плазмиду, включающую в себ  к-ДНК

0

ФИО и ген устойчивости к тетрациклину (плазмида рНТ113).

Экспрессивна  плазмида рВТТ26 кодирует полный полипептид человеческого ФИО.

к-ДНК, выделенную из рНТ113, расщепл ют эндонуклеазами Ava I и Hind III и фрагмент ДНК размером 578 ., включающий большую часть участка, кодирующего полный полипептид человеческого ФИО (называемый ЧФНО-фраг- мент), выдел ют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Фрагмент ДНК, содержащий промотор tac, выдел ют из плазмиды pDR 540/P-L растворением в 2 мл 0,10 мМ буфера трис-HCl (рН 7,5), содержащего 50 мМ NaCl, 6 мМ MgClg и 6 мМ 2-меркапто- этанола, и расщеплением эндонуклеазами EcoRI и Bam H1 при 37 С в течение 60 мин После добавлени  хлористого натри  до результирующей концентрации О,3 М отщепленные фрагменты ДНК осаждают этанолом Фрагмент ДНК, содержащий промотор пае, выдел ют электрофорезом в полиакриламидном геле с выходом 8,3 мкг.

Фрагмент промотора tac св зывают с химически синтезированным олигодез- оксирибонуклеотидным адаптером, представленными следующей формулой:

5 -GATCCATGTCATCTTCTCGAACC

3 -GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT

Этот адаптер включает инициирующий кодон АТС и последовательность оснований , соответствующую 5 -концевой части последовательности оснований, кодирующей полный полипептид человеческого ФИО, и имеет Bam HI- и Ava.I- когезивные концы. Результирующий фрагмент ДИК называют сас-промотор- адапторным фрагментом.

Отдельно больший фрагмент ДНК (размером 4,3 т.п.о.), включающий ген устойчивости к ампициллину (фрагмент рВК322-Амп) вырезают из плазмиды pBR322 расщеплением эндонуклеазами Hind III и Ecu RI, и выдел ют гель- электрофорезом в 0,7%-ном агарозе с низкотемпературным разм гчением,

1 мкг ЧФНО-фрагмента и 6 мкг фрагмента рВК322-Амп раствор ют в 66 мМ буфере трис-UCl (рН 7,6), содержащем 6,6 мМ хлористого магни , инкубируют при 55 С в течение 10 мин, прибавл ют АТФ и дитиотреитол соответственно до концентрации 1 и 10 мМ и 168 ед. Т ДНК-лигазы и смесь инкуби10

«5

0

5

0

5

0

5

0

руют при 22°С в течение 120 мий, Результирующий фрагмент ДНК выдел ют экстракцией фенолом. Получают приблизительно 4 мкг ДНК. Фрагмент ДНК (0,8 мкг) св зывают с сас-промотор- адапторным фрагментом (0,3 мкг) в тех же услови х, как описано выше, за исключением того, что используют 63 ед. Т ДНК-лигазы. Реакционную смесь разбавл ют в 6 раз дистиллированной водой и смешивают с равным объемом суспензии клеток Eocoli IM103, обработанных кальцием. Смесь последовательно инкубируют в лед ной воде в течение 20 мин, при 42 С в течение 1 мин и при комнатной температуре в течение 10 мин, прибавл ют бульон LB, встр хивают при 37 С в течение 60 мин. Аликвоту результирующей клеточной суспензии нанос т на LB-ara- ровые пластинки, содержащие ампициллин в концентрации 25 мкг/мл, и культивируют в течение ночи при 37 С. Отбирают колонии, устойчивые к ампициллину .

Один из трансформированных организмов , способный вырабатывать полипептид человеческого ФНО, называют 1М103/рНТТ26.

Обработанные кальцием клетки E.coli IM103 получают следующим образом Клетки E.coli IM103 высевают в LB бульон и культивируют при 37°С в течение ночи. 1 мл результирующей культуры высевают в 100 мл LB-бульона и дополнительно культивируют при 37 С до тех пор, пока мутность культуры, определ ема  при 650 нм, не достигнет 0,6. После инкубации в течение 30 мин в лед ной воде клетки собирают центрифугированием и суспендируют в 50 мл 50 мМ раствора хлористого кальци , выдерживают при 0°С в течение 60 мин, собирают центрифугированием и снова суспендируют в 10 мл 50 мМ раствора хлористого кальци , содержащего 20% глицерина. Эту суспензию используют в качестве обработанной кальцием суспензии клеток E.coli IM103. Трансформированный организм Ш103/рНТТ26 культивируют в течение ночи в бульоне LB при 37°С. Культуру (0,5 мл) высевают в 5 мл свежего бульона LB, культивируют при 37°С в течение 1 ч, прибавл ют изопропил- бета-В-тиогалактозид до концентрации 1 мМ и культивирование продолжают еще в течение 4 ч. Клетки собирают

11- 17

и суспендируют в 1 мл 50 мК буфера трис-HCl (рН 8,0), содержащего 0,1% лизоцима и 30 мМ NaCl, и оставл ют сто ть при 0°С в течение 30 мин, После этого шесть раз повтор ют замораживание в смеси сухой лед/этанол и размораживание при 37°С, клеточные остатки удал ют центрифугированием и получают просветленный лизат.

Лизат имеет цитотоксическую активность , равную 99000 ед„ (L-929)/ /мл, котора  не нейтрализуетс  антителом против кроличьего ФНО„ Это подтверждает тот факт, что полипептид человеческого ФИО иммунологичес- ки не пересекаетс  с кроличьим ФИО.

2. Экспресси  под контролем промотора сгр.

Рекомбинантную плазмиду рНТ113 гид- ролизуют эндонуклеазами Ava I и Sal I дл  расщеплени  на 3 фрагмента (размерами 0,8, 1,3 - 2,6 к.п.о.) Фрагмент 1,3 к.п.о.-ДНК, включающий в себ  большую часть участка, кодирующего полный полипептид человеческого ФНО и часть гена устойчивости к тетрациклину , .выдел ют -(обозначают Ava I- Sal I-фрагмент). Ava I- Sal I-фраг- мент св зывают со следующим химически синтезированным олигодезокеирибонук- леотидным адаптером. Этот адаптер

обозначают как адаптер I:

5 -CGATATGTCATCTTCTCGAACC

3 -TATACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT

Результирующий фрагмент ДНК обоз- начают как ЧФНО-адапторный фрагменте

Отдельно фрагмент ДНК (35-п.о.), включающий в себ  часть участка промотора trp, отрезают от плазмиды pDR720/P-L расщеплением эндонуклеаза- ми Eco RI и Нра I, и фрагмент ДНК св зывают с химически синтезированным адаптером, имеющим следующую формулу:

5 -AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTA

3 -TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCAT

Св занный фрагмент ДНК обозначают как фрагмент промотора сгр.

Йлазмиду pBR322 расщепл ют нуклеазами Eco RI и Sal I, выдел ют больший фрагмент ДНК (размером 3,7 т.п.о.). Последовательным св зыванием этих трех фрагментов ДНК, фрагмента ЧФНО-адаптора, фрагмента промотора сгр и большего фрагмента-pBR322 :. конструируют экспрессивную плаэмиду pHTR91. Экспрессивную плазмиду ввод т в клетки E.coli HB101 способом, описанным в разделе 1, и один из

o

855

5

0

5

0

12

трансформированных организмов называют HB101/pHTR91o

Трансформированный организм HB101/pHTR91 культивируют в течение ночи при 37 С в модифицированной среде М-9 (состав: 0,7% NazHPO, 12% HfcO, 0,3% , 0,05% NaCl,

В

ч

5

0

C

0,1% , 2 мг/мл витамина 0,45% казаминовой кислоты, 1 мМ MgS04, 0,1 мМ СаС12 и 0,5% глюкозы)., Культуру (0,05 мл) высевают в 5 мл той же среды и культивируют при 37°С в течение 1 ч, прибавл ют 3-бета- индолакриловую кислоту до концентрации 20 мкг/мл, культивируют в течение 4 ч. Клетки собирают, обрабатывают по методике, описанной в разделе 1 , и получают просветленньй лизат,

Лизат имеет цитотоксическую активность 1,01х10б ед. (Ь-929)/мл„

3. Экспресси  под контролем промотора phos о

Фрагмент Ava I- Sal I, полученный в разделе 2, св зывают с химически синтезированным олигодезоксирибонук- леотидным адаптером, имеющим следующую последовательность:

5 -GATCCATGTCATCTTCTCGAACC

3 -GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT

Св занный фрагмент ДНК расщепл ют эндонуклеазой Bam HI и получают фрагмент ДНК, имеющий на обоих окончани х когезивные концы Bam HI (фрагмент ЧФНО-ТетУ. Bam HI).

Отдельно в плазмиду pSN5182, содержащую ген phos, расщепл ют эндонуклеазами Нра I и Eco RI и получают фрагмент ДНК (размером 4 т.п.о.), включающий участок промотора phos и последовательность Shine-Daigarпо, последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид, N-концевую часть фосфатсв эывающего белка, а также ген устойчивости к тетрациклину.

Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент Нра I - Eco RI0 Фрагмент Нра I - Eco RI св зывают с химически синтезированным олигодезоксирибонук- леотидом-св зывателем, имеющим следующую последовательность:

5J-CCCGGATCCGGG

3 -GGGCCTAGGCCC

После этого св занный фрагмент ДНК расщепл ют рестрикционной эндонуклеазой Bam HI. Результирующий фрагмент ДНК (приблизительно 3,6 т. ПоО.), имеющий когезивные концы

13

Вага III в обоих окончани х, обозначают как phos - Bam Ш.Тет.

и

Фрагмент ЧФНО-Тет . Bam HI св зывают с фрагментом промотор phos - Ваш Ш.Тет и конструируют экспрессивную плазмиду дл  получени  полипептида человеческого ФИО, св занног со св зывающим фосфат белком, котору называют pHTS115. Экспрессивную плазмиду ввод т в Eocoli HB101 по описанной методике.

Один из трансформированных организмов (НВ101/pHTSI15) культивируют в 5 мл среды TG (состав: 120 мМ буфер трис-HCl (рН 7,4), 0,2% глюкозы, 80 мМ NaCl, 20 мМ КС1, 20 мМ , 3 мМ , 1 мМ MgClfc, 0,2 мМ СаС1г 200 мМ FeClj, 20 мг/л лейцина, 20 мг/л пролина и 10 мг/л витамина В{), в которой присутствует . в концентрации 0,64 мМ, при 37°С в течение 20 ч при в стр хивании„ Клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 2 мл среды TG, содержащей . в концентрации 0,064 мМ, культивируют при в течение 6 ч, центрифугируют и промывают 1 мл 10 м буфера трис-HCl (рН 7,2), содержащего 30 мМ NaCl. После этого их снова суспендируют в 0,2 мл 33 мМ буфер трис-HCl (рН 7,2) и смешивают с равным объемом 33 мМ буфера трис-HCl (рН 7,2), содержащего 0,1 мМ ЭДТА и 40% сахарозы, инкубируют при 37°С в течение 10 мин, клетки собирают, сно ва суспендируют в 0,4 мл охлажденног 0,5 мМ раствора MgCl и оставл ют сто ть в лед ной воде в течение 10 мин при периодическом встр хивании . Клеточные остатки удал ют центрифугированием и получают просветленный экстракт (далее обозначаетс  как периплазмический экстракт).

Периплазмический экстракт имеет цитотоксическую активность 1,34МО5 ед. (Ь-929)/мл.

Мол.м. полипептида, имеющего цитотоксическую активность, определенна  электрофорезом в полиакриламидном геле (12,5%) с додецилсульфатом натри , равна 19000 дальтон, и это свиде

тельствует о том, что полипептид получаетс  в вид« соединенного белка.

4. Экспресси  под контролем промотора phos.

Рекомбинантную плазмидную ДНК PHTNF13 расщепл ют эндонуклеазой Pst I дл  вырезывани  фрагмента ДНК (приб 35

398551

лизительно 1,2 т.п.о,), включающего ДНК человеческого ФИО. Фрагмент ДНК ДНК человеческого ФИО. Фрагмент ДНК рас5 щепл ют эндонуклеазой ВЬе I и полу- чают фрагмент ДНК (приблизительно 0,9 т.ПоО. (далее обозначаетс  как фрагмент Bbe I - Pst I) 6 мкг фрагмента Bbe I - Psc I раствор ют в

10 80 мкл 20 мМ буфера трис-ИС1 (рН

8,0), содержащего 12 мМ CaCl, 12 мМ MgCl2, 0,2 М NaCl, 1 мМ ЭДТА и 0,02 ед. экзонуклеазы Bal 31, инкубируют при 300°С в течение 30 мин дл  от15 щеплени  приблизительно 50 - 150 пар оснований с каждого конца фрагмента

ДНК. Затем концы фрагмента снова наращивают инкубированием при 37 С в

течение 60 мин с 10 ед. ДНК-полиме- разы I EoColi (большой фрагмент) в присутствии каждого из четырех дез- оксирибонуклеотидтрифосфатов дГТФ, дАТФ, дЦТФ и дТТФ, вз лых в концентрации 0,1 мМ, и 50 Mkr/мл бычьего

сывороточного альбумина о Полученный фрагмент ДНК расщепл ют эндонуклеа- RI и результирующий фрагмент ДНК (приблизительно 750 п.о„), имею- - щий тупой конец и Eco RI - липкий конец, выдел ют (обозначают как Bal 31-Есо RI-фрагмент).

Bal 31-Есо RI-фрагмент св зывают с фрагментом Нра I-Eco RI (приблизительно 4 т.п.о о), полученным из pSN 5182 так, как описано в разделе 3, и конструируют плазмиду, содержащую участок промотора phos, последовательность Shine - Dalgano, последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид и N-концевую часть фосфат- св зывающего белка, последовательность ДНК, кодирующую полный полипептид человеческого ФИО и часть его полипептида-предшественника о

Плазмиду называют pHTS 37 и ввод т ее в E.coli HB101 с получением трансформанта HB101/pHTS 37. Трансформированный организм HB101/pHTS 37 культивируют и периплазмический экстракт получают в услови х, описанных в разделе 3,

Полученный периплазмический экстракт имеет цитотоксическую активность , равную 4, ед. (L-929)/ /мл.

Экстракт подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле (12,5%) с додецилсульфатом натри . Электрофорез провод т при 35 В в течение 12 ч с

использованием трис-глицинового(рН 8,3) буфера, содержащего 0,1% доде- цильсульфата натри  Белок окрашиваю Кумасси бриллиантовым голубым. Две полосы белка, не наблюдавшиес  в экстракте E.coli HB101, наблюдаютс  в положени х, соответствующих 22000 и 16500 дальтон. Гель нарезают на кусочки шириной 2 мм и каждый кусочек гел  инкубируют в минимальной J питательной среде Eagle, содержащей 1% зародышевой бычьей сыворотки, при 4°С в течение ночи, дл  элюиро- вани  белка из гел . Элюат используют дл  определени  цитотоксической активности по отношению к мышиным клеткам L-929. В результате устанавливают , что сильна  цитотоксическа  активность наблюдаетс  в элюате, соответствующем белку с мол,Мо 16500 дальтон.

Исход  из структуры экспрессивной плазмиды pHTS 37 делают вывод о том, что полипептид человеческого ФИО, полученный в трансформированном организме , представл ет собой слитый белок, включающий часть фосфатсв - эывающего белка и полипептид человеческого ФИО с частью его предшественника . Теоретическа  мол.м. слитого белка рассчитана-и равна приблизительно 23000 дальтоно С другой стороны , мол.м. полного полипептида человеческого ФИО равна 17097 дальтон. Это исследование свидетельствует о том, что получаемый слитый белок может быть превращен в полньй полипептид человеческого ФИО в клетке-хоз и не путем ограниченного гидролиза, возможно по специфическому участку (Arg-Ser), соедин ющему полный полипептид человеческого ФИО с частью ег предшественника„

Если Периплазмический экстракт инкубировать с 5 мкг/мл трипсина при 37°С в течение 1 ч и реакционную смесь подвергнуть электрофорезу на полиакриламидном геле с додецилсуль- фатом натри  в описанных выше услови х , то наблюдаетс  белкова  полоса соответствующа  мол.м. около 2200 дальтон, котора  может представл ть собой слитый белок, исчезающий при расщепл ющем действии трипсина.

ПримерЗ. Получение модифи- цированного полипептида человеческого ФИО.

0

5

5

O

5

37°С

5

Плазмиду pHTRD 4, содержащую ДНК, кодирующую полипептид, получающийс  В результате отщеплени  четырех аминокислот из N-окончани  полного поли- пепогида человеческого ФИО, конструируют таким же образом, как и экспрессивную плазмиду pHTR 91 в примере 2 (2), за исключением того, что исполь- Q зуют следующий синтетический адаптер:

5 -CGATATCACC

З1 -TATACTGGGGCT

Плазмиду pHTRD4 ввод т в E«coli НВ101, трансформированный организм 5 культивируют в течение ночи при

в модифицированной среде М-9, высевают в 5 мл той же среды, культивируют при 37°С в течение 1 ч, прибавл ют 3-бета-индолакриловую кислоту до 0 концентрации 20 мкг/мл и культивирование продолжают в течение ночи. Клетки собирают центрифугированием, обрабатывают по методике, описанной в примере 2 (1), и получают просветленный лизат.

Лизат имеет цитотоксическую активность 1,. (Ь-929)/мл.

П р и м е р 4 оПолучение полипептида-предшественника человеческого ФИО в Escherichia coli.

Плазмиду рНТКРЗ, содержащую к-ДНК, кодирующую полипептид-предшественник человеческого ФИО, конструируют следующим образом. к-ДНК выдел ют из ре- комбинантной плазмиды рНТ113 расщеплением эндонуклеазами Pst I и Hind III. Фрагмент к-ДНК затем дополнительно частично расщепл ют эндонук- . леазой Hgi AI с получением фрагмента ft ДНК (приблизительно 820 п.о.), включающего последовательность оснований, кодирующую большую часть полипептида-предшественника . Результирующий фрагмент ДНК св зывают с химически синтезированным олигодезоксирибонук- леотидным фрагментом, имеющим следующую формулу

5 -CGATATGAGCA

З -ТАТАС

Св занный фрагмент ДНК называют фрагментом Рге-ФНО.

Отдельно фрагмент ДНК, содержащий часть .участка промотора сгр, вырезают из плазмиды р№720 расщеплением эндонуклеазой Eco RI и Нра I, и фрагмент ДНК св зывают со следующим химически синтезированным адаптером: 5 -AACTAGTACGCAAGTTCACGT.AAAAAGGGT.AAT 3 -TTGATCATGGGTTCAAGTGCATTTTTCCCATTAGC

Результирующий фрагмент ДНК св зывают с фрагментом Pre-ФНО и св зан- , ный фрагмент ДНК сшивают с фрагментом ДНК (приблизительно 4,3 т„п„о,), имеющим ген устойчивости к ампициллину плазмиды pBR322.

Плазмиду рНТКРЗ конструируют по описанной методике, ввод т вЕ,со11 НВ101, культивируют в течение ночи при 37°С в модифицированной среде М-9. Культуру (0,05 мл) высевают в 5 мл той же среды, культивируют при 37°С в течение 1 ч, прибавл ют 3-бе- та-индолакриловую кислоту до концентрации 20 мкг/мл и культивирование продолжают в течение ночи Клетки собирают центрифугированием, обрабатывают по методике, описанной в примере 2 (1) и получают просветленный лизат.

Лизат имеет цитотоксическую активность , равную 1, ед„ (L-929)/ мл.

П р и м е р 5. Получение и очистка полипептида человеческого ФНО„

1.Получение„

Клетки E.coli HB101/pHT 91, полученные в примере 2 (2), используют дл ,получени  полипептида человечес- jcoro ФНО с Дл  этого культивируют их в течение ночи при 37°С в бульоне LB, содержащем тетрациклин в концентрации 12,5 мкг/мл, высевают в 10 объемов модифицированной среды М-9, использованной в примере 2 (2), и культивируют при 37°С в течение 1 ч« После прибавлени  3-бета-индолакриловой кислоты до концентрации 20 мкг/мл культивирование продолжают в течение 4 ч. Клетки собирают, обрабатывают и получают просветленный лизат. Лизат используют дл  очистки полипептида человеческого ФИО

2.Очистка полипептида человечес1- кого ФИО.

В колонку ( см), набитую DEAE- Sepharose CL-6B (Pharmacia), предварительно уравновешенную 20 мМ буфером трис-HCl (рН 7,8), ввод т 1030 мл ли- зата. Колонку промывают 3 л того же буфера, а затем элюируют линейным градиентом NaCl от 0 до 0,3 М в том жег буфере со скоростью потока 133 мл/ч. Элюат фракционируют по фракци м 10 мл. Фракции, обладающие цитотоксической активностью, собирают и объедин ют.

Выделение цитотоксической активности на этой стадии составл ет 53%, а удельна  активность повышаетс  с приблизительно в 9 раз.

Соединенные активные фракции обессоливают и концентрируют до 1/10

объема ультрафильтрацией с использованием мембраны.

0 Концентрат подвергают препаративному изоэлектрофокусирующему гель- электрофорезу. Аликвоту концентрата нанос т на пластинку ит полиакрил- амидного гел  (0, см) с гра5 диентом рН от 5,6 до 6,1, созданным с помощью 1 тМ obiline (1KB) Электрофорез провод т при напр жении 2400 В в течение 16 ч при 15°С. Гель нарезают на куски шириной 10 мм и

0 , белок элюируют с помощью 20 мМ буфера трис-HCl (рН 7,8). Описанную операцию повтор ют. Элюаты, имеющие цитотоксическую активность, объедин ют и концентрируют с помощью ультрафильтрациио Концентрат нанос т на колонку (0,7«25 см) с BiO-Gel Р-6(В10- RAD) и обессоливают. Результирующий обессоленньй образец  вл етс  однородным с точки зрени  электрофоре-

0 тического анализа в полиакриламид- ном геле с додецилсульфатом натри  и его используют в качестве очищенного полипептида человеческого ФИО дл  проведени  анализа,

5 Примерб. Способ получени  лиофилизованного полипептида человеческого ФНО.

Раствор очищенного полипептида человеческого ФНО, полученный по

0 примеру 5, используют дл  получени  лиофилизованного полипептида человеческого ФНО.

10 мл раствора очищенного поли- е пептида человеческого ФНО, имеющего цитотоксическую активность 2, ед. (LM), смешивают с 0,1 объема 8% NaCl, содержащего 10% человеческого сывороточного альбумина и 20% D-ман- 0 нита. После доведени  рН раствора до 6,8 раствор стерилизуют фильтрованием через мембрану (размер пор 0,2 мкм)о По 5 мл стерильного раствора помещают в стекл нные сосуды и лиофильно высушивают Каждый сосуд содержит по 10 ед. (LM) очищенного полипептида человеческого ФНО.

Пример (справочный). Получение к-ДНК кроличьего ФНОо

19

1, Получение и-РНК ФИО из кроличьих альвеол рных макрофагов

Кроликам (вес приблизительно 2,5 кг) внутривенно ввод т мертвые сухие клетки Propionibacterium acnes в дозе 100 мг на кролика. Через 8 дней кроликов забивают. Легкие несколько раз промывают фосфатным солевым буфером через трубку, введенную в трахею животного, и собирают альвеол рные макрофаги. От 12 кроликов получают приблизительно 3x10 альвеол рных макрофагов.

Альвеол рные макрофаги суспендируют в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и высевают в чашки Петри (диаметром 8 см) с плотностью клеток на чашку. Их предварительно культивируют при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода,, После предварительного культивировани , проведенного в течение 1 ч, эндотоксин (липополисахарид, полученный из E.coli), TPA (форбол-12-ми- ристат- 13-ацетат) и циклогексимид (ингибитор синтеза белка) прибавл ют до концентрации соответственно 10 мкг/мл, Ю нг/мл и 1 мкг/мл. Культивирование продолжают еще в течение 4,0 - 4,5 ч (общее врем  культивировани  5,0 - 5,5 ч), культуральную среду удал ют отсасыванием, макрофаги , адгезированные к чашкам, лизи- руют и гомогенизируют в 5 М раствора гуанидилцианата, содержащем 0,6% N- лауроилсакрозината натри  и 6 мМ цитрата натри . Гомогенизат выливают в 5,7 М раствор хлорида цези , содержащий 0,1 М ЭДТА, и центрифугируют в течение 20 ч при 26500 об/мин с использованием ультрацентрифугио Осадо раствор ют в небольшом количестве 7 раствора мочевины, содержащего 0,35 NaCl, 20 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 20 м ЭДТА, и выдел ют осаждением этанолом От 12 кроликов получают 5,2 мг общей РНК

Фракцию общей РНК раствор ют в 2 мл раствора ТЭ, использованного в примере 1 (1), и раствор нагревают при 65 С в течение 5 ыин. Добавл ют раствор NaCl до результирующей концентрации 0,5 М, нанос т на колонку с олиго(дТ)-целлюлозой, предварительно уравновешенной ТЭ-раствором, содержащим 0,5 М NaCl. Поли(А)-и-РНК эчюируют с колонки ТЭ-раствором с

10

20

выходом 314 мкг. 200 мкг результирующей поли(А)-и-РНК подвергают электрофорезу в 1%-ном агарозном геле в присутствии 6 М мочевины (рН 4) и фракционируют на 7 фракций в соответствии с молекул рными размерами Поли(А)-и-РНК выдел ют из каждого фракционированного гел , расплавл   его при 70°С в течение 10 мин, с

30

последующей экстракцией фенолом и хлороформом и осаждением этанолом, Содержание и-РНК кроличьего ФИО в поли(А)-и-РНК, выделенной из каждой

., фракции, определ ют и-РНК-трансл - ционным анализом с использованием ооцитов Xenopus laevis

Более высокую концентрацию и-РНК кроличьего ФИО выдел ют из фракции,

20 соответствующей молекул рному размеру 1,6 - 2,7 т.п.о. (сокращенно называют обогащенной и-РНК кроличьего ФИО).

Фракцию, обогащенную и-РНК кроли25 чьего ФИО, полученную таким образом, используют в последующих экспериментах .

2. Синтез к-ДНК. к-ДНК синтезируют в следующих услови х. 4 мкг фракции, обогащенной и-РНК кроличьего ФИО, раствор ют в 10 мкл 50 мМ буфера трис-HCl (рН 8,3), содержащего 10 мМ MgClz, 70 мМ КС1, 1 мМ дитиотреитол, 0,5 мМ каждого из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов

35 дТТФ, дЦТФ, ДТФ и дГТФ ХдСТФ мет т

, удельна  активность 4, распадов в минуту на 1 нмоль), 3 мкг олиго(дТ)2.,)8 , 80 ед обратной транскриптазы, полученной из вируса птичьего миелобластола, и инкубируют при 43°С в течение 50 мин. После этого реакцию останавливают прибавлением ЭДТАо Результирующий гибрид к-ДНК-и-РНК экстрагируют смесью фенол/хлороформ (1:1) и выдел ют из водной фазы осаждением этанолом. Матрицу и-РНК удал ют обработкой щелочью при 65 - 70°С. Синтетическую к-ДНК вьщел ют осаждением этанолом

Осадок ДНК раствор ют в 40 мкл 0,1 М буфера Нерез (рН 6,9), содержащего каждый из четырех дезоксири- бонуклеотидтрифосфатов дАТФ, дТТФ, дГТФ и дЦТФ в концентрации 0, 5 мМ, 70 мМ КС1, 5 мМ. MgCl2, 1,5 мМ 2-мер- каптоэтанол и 8 ед, E.coli ДНК-поли- меразы I (большой фрагмент), инкубируют при 15°С в течение 20 ч дл 

4S

50

55

синтеза к-ДНК. Реакцию останавливают прибавлением додецилсульфата натри . к-ДНК экстрагируют смесью фенол/хло-. реформ и выдел ют осаждением этанолом .

Результирующую к-ДНК раствор ют в 100 мкл 50 мМ раствора ацетата натри  (рН 4,5), содержащего 1 мМ ZnSO, 200 мМ NaCl, 0,5% глицерина и 0,5 ед„ 1Q нуклеазы S1, и инкубируют при 37 С в течение 20 мин дл  расщеплени  структуры. Реакцию останавливают прибавлением ЭДТА. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол/хлороформ, ., а затем диэтиловым эфиром „ к-ДНК выдел ют осаждением этанолом,

3. Получение олиго(дЦ)-концевой к-ДНК.

Полученную выше к-ДНК раствор ют 20 в 100 мкл буфера 130 мМ какодилат натри  - 30 мМ трис-HCl (рН 6,8), содержащего 1 мМ CoClz, 0,1 мМ ди- тиотреитол, 0,2 мкг поли(А), 0,1 мМ Н-дЦТФ (удельна  активность 5400 25 распадов в минуту на 1 пмоль) и 10 ед. концевой дезоксинуклеотидилтранс- еразы, инкубируют при 37°С в течение 20 мин дл  присоединени  концов оли- го(дЦ) к 3 -концам к-ДНК„

Реакцию останавливают добавлением ЭДТА. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол/хлороформ и диэтиловым эфиром. Олиго(дЦ)-концевую к-ДНК выел ют осаждением этанолом,, Олиго- (дЦ)-концевую к-ДНК раствор ют в 35 10 мМ буфере трис-HCl (рН-7,4), соержащем 1 мМ ЭДТА и 100 мМ NaCl, таким образом, чтобы концентраци  олиго(дЦ)-концевой к-ДНК была равна 0,2 мкг/мл.

. 4. Получение олиго(дГ)-концевой ДНК плазмиды pBR322.

pBR322 (10 мкг) раствор ют в 100 мкл 20 мМ буфера трис-HCl (рН 7,4), содержащего 10 мМ , 50 мм (Ш. и мкг бычьего сывороточного альбумина, и прибавл ют 15 ед0 эндонуклеазы Pst I. Смесь инкубируют при 37°€ в течение 1 ч, экстрагируют смесью фенол/хлороформ. ДНК выдел ют из водной фазы осаждением этанолом , раствор ют в 200 мкл того же буфера, который используют дл  присоединени  к концам к-ДНК (за исключением того, что он содержит 80 ед. 55 концевой дезоксинуклеотидилтрансфе- разы Н-дГГФ вместо Н-дИТФ), и инкубируют пои 37 С в течение 20 мин дл  при30

45

SO

1Q ,

0 5

5 0

5

0

5

O

соединени  к концу приблизительно 10 - 15 остатков дГ. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол/хлороформ и оли- го (ДГ)-концевую днк плазмиды pBR322 выдел ют из водной фазы осаждением этанолом . Результирующую концевую плазмидную ДИК раствор ют в том же буфере, который использовалс  дл  растворени  олиго(дЦ)-концевой к-ДНК таким образом , чтобы концентраци  концевой плазмидной ДНК была равна 2 мкг/мл.

5. Конструирование рекомбинантной плазмиды.

50 мкл раствора олиго(дЦ)-концевой к-ДНК смешивают с 50 мкл раствора олиго(дГ)-концевой ДНК pBR322 и смесь последовательно инкубируют при в течение 10 мин, при 57°С в те65°С

чение 120 мин, при 45°С в течение 60 мин, при 35°С в течение 60 мин и при комнатной температуре в течение 60 мин дл  достижени  св зывани .

6. Отбор трансформированных организмов .

Штамм E.coli X 1776 трансформируют полученной выше рекомбинантной плаз- мид-ой. Дл  этого E.coli k 1776 культивируют при 37°С в 20 мл бульона L, содержащего 100 мкг/мл диаминопимели-- новой кислоты и 40 мкг/мл тимидина, до тех пор, пока мутность, измер ема  при 600 нм, не достигнет 0,5. Клетки собирают центрифугированием при 0°С и промывают 10 мМ буфером трис-HCl (рН 7,3), содержащим 50 мМ CaCl. Клетки снова суспендируют в 2 мл того же буфера и инкубируют при

0С в течение 5 мин. К 0,2 мл сус- пензии прибавл ют 0,1 мл полученного выше раствора рекомбинантной плазмиды, оставл ют сто ть при 0°С на 15 мин и затем выдерживают в течение 2 мин при 42 С После этого прибавл ют 0,5 мл использованного выше бульона LB с добавками и культивируют в течение

1ч. Отбирают аликвоту культуры, на- . нос т ее на пластинку агара с содержащим добавки бульоном LB, содержащую 15 мкг/мл тетрациклина, и культивируют при 37°С в течение приблизительно 12ч. Отбирают трансформированные организмы, устойчивые к тетрациклину , которые используют в качестве набора к-ДНК.

7. Гибридизационный анализ. Анализ с помощью гибридизации колоний провод т с использованием 2Р- 1 меченой пробы к-ДНК, котора  имеет

плазмиду, содержащую к-ДНК, кодирующую кроличий ФНО о Пробы 2 Р-меченой к-ДНК синтезируют по методике, описанной в разделе 2 с использованием и-РНК, полученной из индуктивных альвеол рных макрофагов по методике, описанной в разделе 1, за исключением тоги, что используют 2Р-дЦТФ с высокой удельной радиоактивностью. Отбирают колонии трансформированных организмов . Из 20000 колоний выбирают 50„

Затем 20 из выбранных 50 колоний подвергают .гибридизационно рет- рансл ционному анализу. Ппазмидную ДНК экстрагируют из каждого трансформированного организма и фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах после термической денатурациио К фильтру прибавл ют полученную в разделе 1 фракцию поли(А), содержащую кроличий ФИО, и инкубируют при 50°С в течение 3 ч дл  достижени  гидриди- зации Прогибридизовавшуюс  и-РНК выдел ют и ввод т в ооциты дл  определени  того, представл ет ли собой выделенна  РНК и-РНК кроличьего ФНО. В результате этого обнаруживают три колонии, имеющие плазмиды, содержащие к-ДНК, сильно гибридизуемую с.и- РНК кроличьего ФНО. Фрагменты к-ДНК получают из плазмиды, содержащей к-ДНК наибольшего размера (около 750 п,о.), расщеплением с помощью рест- рикционной эндонуклеазы Dde I и используют в качестве пробы дл  дальнейшего отбора Эти фрагменты ДНК мет т 32Р. Отбирают колонии трансформированных организмов, имеющих плазмиды , содержащие к-ДНК, сильно гибридизуемую мечеными пробами В этом испытании положительный результат дают 98 из 60000 колоний. Выдел ют ре комбинантную плазмидную ДНК и к-ДНК вырезают расщеплением эндонуклеазой Pst Io Из размеры определ ют электрофорезом в п олиакриламидном геле Отбирают 17 колоний трансформированных организмов, содержащих вставки к-ДНК размером не менее 1 Из трансформированного организма, содержащего к-ДНК наибольшего размера (трансформированный организм № X 1776/ /pRTNF 802; плазмида № pRTNF 802), выдел ют клонированную к-ДНК и определ ют ее последовательность оснований о

8. Определение последовательности оснований клонированной к-ДНК„

0

5

0

Трансформированный организм X 1776/pRTNF 802 культивируют в бульоне LB, содержащем диаминопимели- новую кислоту и тимидин. Клетки обрабатывают ДНК, расщепл ют эндонуклеазой Pst I, очищают и получают клонированную к-ДНКо Фрагмент клонированной к-ДНК расщепл ют-затем различными эндонуклеазами и определ ют последовательности оснований фрагментов,

Последовательность оснований с 277-го по 738-е основание  вл етс  участком, кодирующим полный кроличий ФНО. Основани  с 34-го по 276-е  вл ютс  последовательностью оснований , кодирующих полипептид, необходимый дл  образовани  предшественника кроличьего ФНО.

ПримерЗ (справочный)„ Выделение и очистка кроличьего ФИО

Кроликам (вес тела 2,5 - 3,0 кг) внутривенной инъекцией ввод т по 50 мг умерщвленных сухих клеток Pro5 pionibacterium acnes. Спуст  8 дней кроликам внутривенной инъекцией ввод т по 100 мкг эндотоксина. Через 2 ч у каждого кролгка забирают кровь сердечной пункцией. Кровь смешивают со 100 ед. гепарина натри  на 100 мл, клетки крови и нерастворимые соединени  удал юто От 400 кроликов получают 24 л плазмы.

К 24 л плазмы прибавл ют ЭДТА (24 г) и 240 г цеолита, смесь пере5 мешивают в течение 1 ч, фильтруют через три фильтра с размерами пор 3, 1 и 0,2 мкм.

К 24 л фильтрата прибавл ют 12 л 0,04 М буфера трис-HCl (рН 7,8), на0 нос т на колонку ( см) с DEAE- Sepharose, уравновешенную 0,04 М буфером трис-HCl (рН 7,8), содержащим 0,1 М NaCl, После этого колонку промывают 75 л буфера трис-HCl 8рН 7,8),,

5 7,8), содержащего 0,1 М NaCl, и затем 50 л 0,04 М буфера трис-HCl (рН 7,8), содержащего 0,15 М NaCl, после чего элюируют 0,04 М буфером трис-HCl (рН 7,2), содержащим 0,18 М NaCb

0 -Элюат фракционируют на фракции по 8 л и собирают фракции, обладающие цито- токсической активностью. Активные фракции объедин ют и разбавл ют равным объемом 0,04 М буфера тр ис-НС1

5 (рН 7,8)4 Разбавленный раствор нанос т на колонку ( см) с DEAE-Sep- harose. Колонку промывают 1 л 0,04 М буфера трис-HCl (рН 7,8) содержащего 0,1 М Nad, элюируют 5 л 0, буфера трис-HCl (рН 7,2), содержащег О,Ш М NaCl, фракционируют на фракци по 250 мл и фракции, обладающие цито токсической активностью, собирают и объедин ют.

Активную фракцию нагревают при 60°С в течение 30 мин и быстро охлаждают до 4° С. Холодный раствор концентрируют ультрафильтрацией„

Результирующий концентрат нанос т на колонку (5x80 см) с Sephaeryes-20 уравновешенную 0,005 М фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,1 М NaCl, и элюируют тем же буфером, Элюат фракционируют на фракции по 40 мл и активные фракции собирают, объедин ют и концентрируют ультрафильтрацией .

Концентрат нанос т на колонку с Zn -хедатной сефарозой. Колонку (1, см) наполн ют хелатной сефарозой (смола с фиксированной имино- диуксусной кислотой), промывают 120 мл раствора хлорида цинку (1 мг/ /мл) и уравновешивают 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим О,I M NaCl. После этого в колонку ввод т концентрат, полученный на предыдущей стадии, элюируют тем же буфером Собирают фракции, не адсорбирующиес  на колонке о Цитотоксичес- ка  активность почти полностью выдел етс  в этих фракци хо

Активные фракции, полученные на предыдущей стадии, концентрируют и нанос т на колонку (1,5x90 см), уравновешенную 0,005 М фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,15 М NaCl, . элюируют тем же буфером и собирают активные фракции. Этот образец представл ет собой очищенный кроличий плазменный ФИО

Полученный таким образом очищенный кроличий плазменный ФИО используют в примерах 3 и 4.

П р и М е р 9 (справочный). Определение N-концевой и С-концевой аминокислотных последовательностей кроличьего плазменного ФНО„

Очищенный кроличий плазменный ФИО, полученный в примере 2, используют дл  определени  N-концевой и С-концевой аминокислотных последовательностей . N-концевую аминокислотную последовательность определ ют разложением по способу Эдмана. Результирующие фенилтиогидантоинамино5

кислоты идентифицируют жидкостной хроматографией высокого давлени .

С-концевую аминокислотную после- е довательность определ ют ферментативным способом с использованием карбоксипептидаз„ Очищенный кроличий плазменный ФИО расщепл ют карбоксипептидаз ами А и Y при мол рном соотQ ношении фермента и субстрата, равном соответственно 1:25 и 1:1000. Свободные аминокислоты, выдел ющиес  из С-окончани  кроличьего плазменного ФИО в результате двойного отщеплени ,

5 идентифицируют с помощью аминокислотного микроанализатора.

Установлено, что N-концевые и С- концевые аминокислотные последовав тельности кроличьего плазменного ФИО

0  вл ютс  следующими:

N-окончание - Ser-Ala-Ser-Arg-Ala о о

С-окончание - . , „ „Val-Tyr-Phe-Gl y-TIe-TIe- Ala-Leu.

Пример 10 (справочньй). Получение антитела против кроличьего плазменного ФИО.

Раствор ФИО, содержащий 1, едо (L-929) очищенного кроличьего плазменного ФИО, полученного в приг- мере 2, эмульгируют с равным объемом полного стимул тора Фрейнда и эмульсию ввод т подкожной инъекцией в спину морских свинок в нескольких местах Животных иммунизуют таким же 5 способом через 1,3 и 6 нед. Кроме того, через 6 нед такое же количество очищенного кроличьего плазменного ФИО ввод т внутрибрюшинной инъекцией вместе с гелем гидроокиси алюмини . Цельную кровь отбирают сердечной пункцией через 9 нед после первой иммунизации , центрифугируют и получают антисыворотку, содержащую антитела против кроличьего плазменного ФИО,

Антисыворотку пропускают через колонку, снабженную сывороточными белковыми компонентами нормальных кроликов . Провод  операцию три раза, получают очищенные антитела, специфические по отношению к кроличьему плазменному ФИО о Иммуноэлектрофорез и методики двойной диффузии через гель подтверждают, что это антитело образует одну полосу осадка с очищен- 5 ным кроличьим плазменным ФИО.

Этот раствор антитела, разбавленный приблизительно в 60000 раз, обладает способностью нейтрализовать 50%

0

0

5

0

27173985528

Claims (1)

1. от 500 ед. (L-929) цитотоксической Формула изобретени  активности кроличьего плазменного

   ФИО, а разбавленный в 1000 раз может Способ получени  полипептида, об- полностью нейтрализовать 50 ед„ (LM) падающего активностью фактора некро- цитотоксической активности кроличье- . 5 за опухоли человека, характеризую- го плазменного ФНО„щегос  формулой А или В, или

   Мег-х-В В, где А представл ет собой:

   I

   Thr Pro Ser Asp Lys Pro ValAla His Val

   Val Ala Asn Pro Gin Ala GluGly Gin Leu

   Gin Trp Leu Asn Arg Arg AlaAsn Ala Leu

   Leu Ala Asn Gly Val Glu LeuArg Asp Asn

   Gin Leu Val Val Pro Ser GluGly Leu Tyr

   Leu He Tyr Ser Gin Val LeuPhe Lys Gly

   ч

   Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr lie Ser Arg lie Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala He Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro He Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu

   Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu He Asn Arg Pro Asp Tyr .Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly He He Ala

   Lcu. „ fcaЈP

   7 $- Scr-Scr-Scr-Arg« «te J

   7.

   )fcscr Thr Glu Ser Met He Arg Asp Val Glu ,

   Leu Ala Glu Glu Ala Lou Pro Lys Lys Thr

   Gly Gly Pro Gin Gly Ser Arg Arg Cys. Leu Phe Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu He Val. Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys Leu Leu . His Phe Gly Val He Gly Pro Gin Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Sec Leu He Ser Pro Leu Ala Gin Ala Val Arg ... tic,

   заключающийс  в том, что культивируют штамм бактерий Escherichia coli 1М103/рНТТ26 .или EoColi HB101/pHTR91 или Е„соН HB101/pHTS11 5 или E,coli HB101/pHTS37 или E.coli HB101/pHTRP3 или E.coli HBl01/pHTRD4 в LB бульоне, модифицированной М-9 среде или TG среде при 37°С, получают клеточный лизат, центрифугируют его, очищают путем нанесени  лизата на колонку с ДЕАЕ-сефарозой, уравновешенную трис-HCl буфером с рН 7,8 с после

   дующей элюцией линейным градиентом NaCl от 0 до 0,3 М, обессоливанием

   .активных фракций, Концентрированием ультрафильтрацией, иэоэлектрофокуси- рующим гель-электрофорезом в буфере с градиентом рН 5,6 - 6,1, элюирова- нием полипептида с помощью трис-HCl при рН 7,8, объединением элюатов и концентрированием с помощью ультра , фильтрации и гель-фильтрации на колонке с Био-гелем0