SU1717632A1 - Штамм гриба РеNIсILLIUм caNeSceNS - продуцент @ -галактозидазы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к получению нового продуцента фермента а -галактозидазы. Цель изобретени  - вы вление штамма продуцента а -галактозидазы, обладающего более высокой активностью. Изобретение позвол ет получить а-галактозидазу в количестве 4-7 ед./мл культуральной жидкости. Из глубинной культуры предлагаемого продуцента выделенный ферментный препарат может быть применен в сахарной промышленности и медицине. 2 табл.

Description

Изобретение относитс  к ферментной промышленности, в частности к получению нового штамма, продуцента фермента о;-галактозидазы .

а -Гэлактозидаза используетс  широко, в пищевой и микробиологической отрасл х промышленности, аналитической биохимии , при вы снении строени  различных ут- леводосодержэщих биополимеров и низкомолекул рных соединений, содержащих концевые  -D-галактозидные группировки , а также в медицине при лечении - наследственных энзимопатий - болезни Фабри, св занной с недостатком в организме человека лизосомальной а -галактозидазы и гематологии при изучении группоспецифических веществ крови.

Предлагаемый штамм Pehicilllum canescens ВКПМ F-417-продуцент а -галактозидазы получают путем облучени  ультрафиолетовыми лучами в дозе 400 Дж/м конидии исходного штамма Penicillium canescens Sopp. 20171 и обладает указанными свойствами.

Морфологические признаки.

Штамм атоксичен, быстрорастущий, характеризуетс  умеренным спороношением. Образование конидии начинаетс  на два дн  позже, чем в исходной культуре.

Конидиеноецы длиной 400-500 мкм и с диаметром 2,8-3 мкм отход т от войлочного мицели , оболочка четко-шероховата . Кисточки двухъ русные, растопыренные, состо т из веточе к (метуль), несущих мутовки -

Os

ы

го

лид, метули около (10-15)х(.5) мкм, сте- рйгмы (7-8)х2,8 мкм.

Культуральные признаки.

Штамм хорошо растет на искусственных средах (сусло-агаре, кэртофельно-глю- козном агаре, картофельном агаре) и синтетических агаризованных средах (средах Чапека, Сабу-ро, Ролена-Тома, агаризо- вэнной среде с лактозой).

На агаризоеанной среде Чапека, сусло- агаре, агаризованной среде с лактозой колонии пушистые, состо щие из плотного базального войлочного и рыхлого сплетени  воздушного мицели  со слабо выраженной радиальнобороздчатостью, умереннымспо- роношением; с растущим краем до 2-3 мм ширины; колонии бледно-голубовато-серого цвета, затем сероватого цвета и потом при старении колонии приобретают дымчато-сероватый оттенок.

Линейный рост колонии на агаризованных средах по дн м: на сусло-агаровой среде - 5-й день - 45-50 мм, 10-й день - 60-70 мм; на среде Чапека - 5-й день - 25 мм, 10-й день - 35-40 мм; на агаризованной с лактозой - 5-й день - 30 мм, 10-й день - 50-60 мм.

На отруб х штамм растет хорошо.

Отношение к углеродному питанию: мутант хорошо усваивает моносахариды - глюкозу, галактозу, арабинозу; сахароспирч ты - сорбит, маннит; из дисахаридов - лактозу , сахарозу, мальтозу, а также крахмал и инулин..

Отношение к азотному питанию: усваи- вает нитратный азот, лучше аммонийный. Из органических источников азота ассимилирует пептон, мочевину, кукурузный экстракт , дрожжевой автолизат.

Отношение к кислороду: облигатный аэроб.

Отношение к температуре: мезофил, оптимальна  температура дл  роста и биосинтетической активности 27-28°С.

Отношение к кислотности питательной среды: растет в широких пределах рН 2,0- 9,5.

Дл  размножени  штамма примен ют модифицированную среду Чапека с раффинозой следующего состава, %: раффиноза 3,0; МЩМОз 0,2; КНаРОл 0,1; MgS04 0.05; KCI 0,05; кукурузный экстракт 0,05; агар 2; исходное рН 5,8-6,0.

Питательной средой дл  ферментации служит среда следующего состава, %: сое- ва  мука 3,0; Мз2НРО4 12Н2О t,5; (NH2S04 0,2; KCI 0,05; MgSQ 0.015: исходное рН 4,1-4,2.

Проверкой, проведенной в течение четырех лет, установлено, что при хранении и

пересевах уровень ферментативной активности Penicillium canescens AMT-85 не снижаетс ,

Использование предлагаемого штамма дает возможность при организации производства а -галактозидазы в СССР получить культуру гриба с повышенной в 5-6 раз активностью . ТермостэбильнЪсть штамма 50- 55°С, кислотоустойчивость - рН 2,0-8,0.

Кроме высокоактивной а-галактозидазы предлагаемый продуцент образует богатую белком биомассу (до 35% от веса сухой биомассы).

П р и м е р 1. Штамм PenicMlium canescens AMT-85 поддерживали на агаризованной среде с раффинозой, %: раффиноза 3,0; NH-iNOs 0,2; КН2Р04 0.1; КС 0,1; МдЗОз 0,05; кукурузный экстракт 0,05; агар 2; исходное рН среды 6,0.

Глубинное культивирование гриба проводили на жидкой питательной среде следующего состава, %: соева  мука 3,0; N32HP04 12Н20 1,5; ( 0,2; KCI 0,05; MgS04 0,015; исходное рН 4,2.

Культивирование проводили в колбах емкостью 750 мл на термостатированной качалке, делающей 220 об/мин (уровень аэрации 1,4 т Оз/лфч) при 30°С в течение 72ч.

Объем питательной среды в колбах составл л 100 мл. Засев питательной среды производили 2%-ной суспензией конидий поверхностной культуры гриба, выращенной в пробирках на скошенном лактозном агаре в течение 12 дней при 28°С.

Биомассу отдел ли фильтрованием и в фильтрате определ ли активность а-галактозидазы , использу  в качестве субстрата паранитрофенил- а -D-галактопирано- зид. Реакционную смесь, состо щую из 0,1 мл 5 мМ субстрата, 0,2 мл фосфатно-цитратно- го буфера (рН 4,2) и 0,1 мл раствора фермента (культуральной жидкости), инкубировали при 37°С в течение 10 мин, а затем добавл ли 2 мл 1 М N32CO3 дл  прекращени  реакции . Освободившийс  п-нитрофенол определ ли при 410 нм.

Стабильность уровн  активности фермента , продуцируемого Penicillium canescens AMT-85, дана в табл. 1.

Зависимость активности а-галактозидазы от примен емой среды дана в табл. 2.

Активность биосинтезирующего штамма а-галактозидэзы равна 5-6,5 ед./мл.

Активность а -галактозидазы определ ли и по гидролизу мелибиозы.

Активность а -галактозидазы в экстракте , определ емом по.гидролизу мели- биозы. составл ет 90-100 ед. на 1 г сухой культуры.

Предлагаемый штамм дает возможность получить ксиланазу с активностью 3- 3.5ед./мл.

Предлагаемый фермент может быть применен в пищевой промышленности и медицине.

Штамм Penicilllum canescens AMT-85 - продуцент а-галактозидазы депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов Института ВНИИгенетика под коллекционным номером ВКПМ-Р-417.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм гриба Penicilllum canescens ВКПМ F-477-продуцент а-галактозидазы.

   Таблица 1

   Таблица 2