SU1710576A1

SU1710576A1 - Strain of hybridous cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to the human insulin

Info

Publication number: SU1710576A1
Application number: SU904810181A
Authority: SU
Inventors: Юрий Викторович Ионов; Виталий Львович Юрин
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Priority date: 1990-04-03
Filing date: 1990-04-03
Publication date: 1992-02-07

Abstract

Изобретение относитс к биотеХйог» логии и касаетс получени моноКлог :нальных антител к инсулину человека спомощью нового штамма гибридом. Цель изобретени " получение штамма гибри- домы - продуцента моноклональных анти~ тел с более высоким средством к инсулину. Ытамм Е6Е5 получают гибридизацией иммунных клеток лимфоузлов мы;1Ш BALB/C с клетками миеломы РЗ-ХбЗ- . Ag8.653. Штамм Е6Е5 хранитс в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР "ОД номером ВСКК(П) Д39Д. Клетки штамма Е6Е5 растут на среде RPMI 1640 или DMEM с 10% амбриональной тел чьей сыворотки. Концентраци антител, продуцируемых штаммом ЕбЕ5, составл ет в культуральной жидкости 30 мкг/мл, в асцитной жидкости 12 мг/мл. Аффинность антител составл ет 7,5*10'' л/моль.г 1(лThis invention relates to biotography and relates to the production of monoclogging: human antibodies to human insulin using a new hybridoma strain. The purpose of the invention is to obtain a hybrid strain — a producer of monoclonal anti bodies with a higher insulin agent. Y6am E6E5 is obtained by hybridization of lymph node immune cells; 1S BALB / C with myeloma RZ-XbZ-A. Ag8.653. The E6E5 strain is stored in Specialized collection of transplantable somatic cells of vertebrates of the Institute of Cytology of the Academy of Sciences of the USSR "OD number VSKK (P) D39D. Cells of strain E6E5 grow on RPMI 1640 medium or DMEM with 10% ambrional bovine serum. The concentration of antibodies produced by the EbE5 strain is 30 µg / ml in the culture fluid and 12 mg / ml in ascites fluid. The affinity of antibodies is 7.5 * 10 "l / mol g 1 (l

Description

Изобретение относитс к бибтехнб- логии и касаетс получени - монрклональных антител к инсулину человека с помощью нового штамма гибридом.The invention relates to bibtechnology and relates to the production of - monrlonal antibodies to human insulin using a new hybrid strain.

Цель изобретени - получение шта)м ма гибридных культивируемых клеток мы пш MUS muscuius, позвол нмдего получать моноклональные антитела fc более высрКИМ сродством к инсулину человека.The purpose of the invention is to obtain the head of hybrid cultured cells in our MUS muscuius, which allows us to obtain fc monoclonal antibodies with more vigorous affinity for human insulin.

Новым штамм гибридных культивир уе мых Клеток MUS musculus Е6Ё5 продуцирует моноклональные антитела Е6Е5 к инсулину человека с констан той св зывани 7,5 Ю л/моль. Конг центраци антител,продуцируемых штаммом MUS musculus ЕбЕ5, составл ет 30 мкг/мл в культуральной жидкости и 12 мг/мл, в асцитной жидкости.A new strain of hybrid cultured cells of MUS musculus E6E5 produces monoclonal antibodies to human insulin E6E5 with a binding constant of 7.5 Y l / mol. The concentration of antibodies produced by the strain of MUS musculus EbE5 is 30 µg / ml in culture fluid and 12 mg / ml in ascites fluid.

Штамм получают следуюищм образом.Strain get the next way.

Мышей линии BALB/C иммунизируют инсулином человека в полном адьюванте Фройнда в , подушечки задних,лапок |(по 50 мкг на мьш1ь). Чистота инсулина проверена электрофоретически и составл ет 98%. На 13-й день мышей иммунизируют в подушечки задних лапок тем же Количеством инсулина в неполном адьюванте Фройнда. На Т6-и день мышей забивают , достают подколенные лимфоузлы :и клетки лимфоузлов сливают с клетками шеломы РЗ.Х63. Ag 8.653 с помощью по лиэтиленгликол ПЭГ 2000 (Merck). Соотношение клеток лимфоузлов и клеток миеломы составл ет 5:1. После сли ни клетки рассевают в лунки 96 чеечного планшета Nund в количестве 100 тыс. клеток на лунку, в которые предварительно высевают перитрнеальные макрофаги мыши по 5000 клеток на лунку. Селекцию гибридом ведут в среде ГАТ /RPMI 1640/ содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин/. Отбор растущих культур клеток, секретирующих ангтитела нужной специвиачности провод т с помощью -радиоиммунологического анализа : в лунки полихлорвинилового планшета, покрытые антителами против иммуноглобулинов мыши, внос т культу ральные жидкости растущих культур клеток, инкубируют 2 ч при комнатной температуре, лунки npoMMBaiOT 1и инку-; бируют с 125 меченьм инсулином. Лунки нарезают и просчитывают в гамма счетчике. Гибридому, секретирующую аититела к инсулину, дважды клонируют t методом ЛИМ11 тирующих разведений, т.е. клетки рассеивают в лунках 9б-йчеечных планшетов из расчета 1 клетка на лунку в ростовой среде (RPMI 1640 с 10% эмбриональной тел чьей сыворотки, j4 мМ L-тлютамина, 1% пирувата натри , 50 ЕД/мл пенициллина и 25 мкг/мп стрептомицина). Выросшие клоны тестируют на секрецию антител. Дол клонов сохран ющих продукгщю антител заданной специфичности, составл ет 100%. Штамм обозначают Mus musculus. Штамм; Б6Е5 хранитс и Специализированно коллекции перевиваемых соматических kneTOK позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 439 Д и характеризуетс следующими признаками . Культуральные свойства. Среда дл культивировани - .RPMJ 1640 или DMEM.C 10% эмбриональной тел чьей сыворотки, 4 мМ L-глютамина, 1% пирувата натри , 50 ЕД/мл пенициллина и 25 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивируют при З7с в атмосфере, содержащей 5% СО Дл выращивани штаммов можно использовать стекл нную и. пластиковую культуральную посуду. Характер роста - стационарна суспензи lacTOTa пассировани сут.Кратность ассева 1:3-1:4. При введении мьшгам IALB/C, предварительно обработанных , фистаном, по 1 млн. клеток, асцит об азуетс через 10-15 дней. Стабильна продукци наблюдаетс в течение 7 пас сажей на мышах. Титр антител в культуральной жидкости составл ет 1:256, в асцитической - 1:500000. 17 6 ; .7 Продуктивность, ; Концентраци антител, продуцируеMiDc штаммом Е6Е5, составл ет в культуралЁНой зЬадкости 30 мкг/мп, в а ;цитной жидкости 12 мг/мл. Стабильность продуцировани антител сохран етс на прот жении 20 пассажей в культуре и 7 пассажей на ткивотных, если гибридрна перевиваетс . Контаминаци . Бактерий и гриб в культурах не обнаружены при длительном наблюдений Н посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не вы влено при окрадшвании красител ми на ДНК и тимидиноврм пррмечивании культуральной среды. Консерваци клеток. Клетки штаммов замораживают после 2 Н 3 клонировани на 10 и 15 пассажах в культуре и после роста в виде асцитнрй рпухрли в мышах. Крирза11Ц тна среда 50% ррстрврй среды, 40% эмбрирнальной тел чьей сыврротки и 10% диметидсульфркеида . Режим замрраживани : клетки в кри- озащитной среде помещают на сутки в хрлрдильник 1фи -70, после чего перенос т в ЖИДКИЙ азот. Выживаемость клеток прсле размрраживани составл ет 50%. . ,;,. . .,: ;;. . V . / . ,-. Прлез п.1й продукт. Моноклональные антитела IgGI класса . Специфичность - инсулин человека, проннсулйн человека. Ыетрд оценки сохране1ш специфичности: кроличьи и антитела против, иммуноглобулинов мыши сорбируют на-поверхности лунок гибко- го планшета, в лунки внос т супернатанты клеток ЕбЕ5, затем планшет отмывают , и в лунки внос т 125/ инсулин, планшет вновь отмьшают, лунки вырезают и просчитывают в гамма-счетчике. Аффинность антител составл ет 7,5 X 1 о л/моль. Испрльзрвание штамма Е6Е5 дл получени антител к инсулину. П р и мер 1. Получение антител Е6Е5 с прмрщью штамма гибридом ЕбЕ5. Дл получени мрнрклональных антител Е6Е5 клетки штамма гибридрм ЕбЕ5 вьфащивают в пластикрвых флаконах на среде дл культивировани : RPMI 1640 (или DMEM) с 10% эмбриональной тел чьей сывррртки, 4 мМ L-глютaминaJ 1% пирувата натри , 50 ЕД/мп пенициллина , и 25 мкг/мл стрептоь инина. КРНцентраци клеток в среде не должна /мл. Когда число кле- превышать 05 млн,Mice of the BALB / C line are immunized with human insulin in Freund's complete adjuvant, hind pads, legs | (50 µg per each 1). Insulin purity is electrophoretically tested and is 98%. On the 13th day, mice are immunized in the pads of the hind legs with the same amount of insulin in incomplete Freund's adjuvant. On T6, the mice are slaughtered, and the popliteal lymph nodes are pulled out: and the lymph node cells are fused with the RZ.H63 shelom cells. Ag 8.653 using polyethylene glycol PEG 2000 (Merck). The ratio of lymph node cells to myeloma cells is 5: 1. After fusion, cells are seeded into wells of a 96-well Nund cell tablet in an amount of 100 thousand cells per well, into which mouse peritheral macrophages are pre-seeded at 5000 cells per well. Selection of hybridomas are carried out in the medium GAT / RPMI 1640 / containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine /. Selection of growing cultures of cells secreting the necessary specificity of the antibody is carried out using α-radioimmunoassay: the wells of a PVC tablet coated with antibodies against mouse immunoglobulins are added to the culture fluids of growing cell cultures, incubated for 2 hours at room temperature, wells of npoMMBaiOT 1 and incubated; It is bathed with 125 insulin. The wells are cut and calculated in the gamma counter. Hybridoma secreting vitamins to insulin is cloned twice by LIM limiting dilutions, i.e. cells are scattered in wells of 9b-well plates at the rate of 1 cell per well in growth medium (RPMI 1640 with 10% fetal calf serum, j4 mM L-tlutamine, 1% pyruvate sodium, 50 U / ml penicillin and 25 µg streptomycin ). Grown clones are tested for antibody secretion. The amount of clones of preserving antibodies of a given specificity is 100%. Strain denoted Mus musculus. Strain; B6E5 is also stored in the Specialized Collection of Intertwined Somatic Vertebral KneTOK of the Institute of Cytology of the Academy of Sciences of the USSR under the number VSKK (P) 439 D and is characterized by the following features. Cultural properties. The culture medium is .RPMJ 1640 or DMEM.C 10% fetal calf serum, 4 mM L-glutamine, 1% pyruvate sodium, 50 U / ml penicillin and 25 µg / ml streptomycin. Cells are cultured at 3-7C in an atmosphere containing 5% CO. Glass and can be used for growing strains. plastic culture dish. The growth pattern is a stationary suspension of lacTOTa for passage of days. The range of 1: 3-1: 4. With the administration of IALB / C, pretreated, with fistan, 1 million cells each, ascites becomes relieved after 10-15 days. Stable production is observed for 7 weeks of soot in mice. The antibody titer in the culture fluid is 1: 256, and in ascites, 1: 500000. 17 6; .7 Productivity,; The concentration of antibodies produced by MiDc strain E6E5 is 30 µg / mp in culture, and a citric fluid 12 mg / ml. Stability of antibody production is maintained for 20 passages in culture and 7 passages per weaver if the hybrid is intertwined. Contamination Bacteria and fungi in cultures were not detected with prolonged observations of H crops on nutrient media. Infection with mycoplasma was not detected when the dyes were stained with DNA and thymidine preparation of the culture medium. Cell preservation. The strain cells are frozen after 2 H 3 cloning at 10 and 15 passages in culture and after growing as ascites in mice. The crystalline medium is 50% of the medium, 40% of the embryonic calvine and 10% of dimetied sulfrkeid. Frozen mode: the cells in a cryoprotective medium are placed for 24 hours in hrlfiln1fi-70, after which they are transferred to LIQUID nitrogen. Cell survival after defrosting is 50%. . ,,, . .:: ;;. . V. /. , -. The first product has come through. Monoclonal antibodies of IgGI class. The specificity is human insulin, person's insulin. An assessment of preservation of specificity: rabbit and antibodies against, mouse immunoglobulins adsorb on the surface of the wells of the flexible plate, supernatants of EbE5 cells are added to the wells, then the plate is washed, 125 / insulin is added to the wells, the tablet is removed again, the wells are cut out and calculate in the gamma counter. The affinity of the antibodies is 7.5 x 1 o L / mol. Use of strain E6E5 to produce antibodies to insulin. PRI and measures 1. Obtaining antibodies E6E5 with the use of strain hybrid EbE5. To obtain E6E5 mrnclonal antibodies, the cells of the EbE5 hybrid strain are infused into plastic bottles on culture medium: RPMI 1640 (or DMEM) with 10% fetal cell serum, 4 mM L-glutamine J 1% pyruvate sodium, 50 EDA, 50 EDA, 0 EDA, 4% pyramidal sodium, 50 EDA, 4% pyramidal sodium, 50 EDA, and µg / ml strepto inina. CRN concentration of cells in the medium should not / ml. When the number of glue- exceed 05 million,

Claims

water water. A series of five-fold dilutions of the test samples is prepared in 45 0.2 M pH 8.0 buffer solution containing 0.1% gelatin. Analyzed samples in a volume of 50 μl are added at 2-temperature. After incubation, the containing culture fluid, the contents of the wells are removed, the wells are washed and i each add 50 μl of a solution of rabbit antibody conjugate with horseradish peroxidase to mouse immunoglobulins, _g · 10 previously diluted with buffer; .

a solution of 1000 times. Plates were incubated for another 2 hours, washed and the wells Pipette 100 ul of substrate ^4, a buffer strength solution containing o-phenylene • diayin (0.4 mg / ml) and 0.0003% -s' hydrogen peroxide. Tablets incubate! 15-20 minutes and add 50 μl of 2.5 M sulfuric acid to the wells to stop the reaction. The plates are scanned with a microplate reader at a wavelength of 492 nm. The concentration of antibodies in the analyzed samples is determined by the calibration curve, which is obtained * Simultaneously with the test. For

25, the construction of the calibration curve of the PROCEDURE is carried out in the same way, but instead of the analyzed samples, dilutions of standard preparations of purified E6E5 antibodies in the well-known

E6E5 in the culture fluid of strain E6E5 is 30 μg / ml, in ascites fluid 12 mg / ml. The binding constant of antibodies E6E5 adsorbed onto the solid phase is measured.

Thus, the proposed strain allows to obtain monoclonal antibodies to human insulin with a binding constant 3 times higher than the analysis and incubated for 2 hours at room with the known strain.

Strain of hybrid cultured animal cells Mus musculus L, HSCC (Π)

439 bodies

D - producer of monoclonal anti-human insulin. ‘