SU1697008A1 - Способ определени адгезии лейкоцитов - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к клинической иммунологии, а также дл  диагностики специфической сенсибилизации лейкоцитов у обследуемых лиц. Целью изобретени   вл етс  повышение точности способа. Способ осуществл ют путем инкубировани  цельной крови с 0,9-1,1%-ным раствором желатины на среде 199 в течение 10-15 мин с последующим выделением лейкоцитов Полученную суспензию лейкоцитов из над- осадка осаждают и внос т в лунки планшета в концентрации 1-1,5 млн/мл  дросодержа- щих клеток в среде 199, затем клетки инкубируют 1,5-2 ч при рН 7,0-7,2 с после,- ющей промывкой и дозированием. Определение адгезии провод т по активности миелопероксидазы в прилипших клетках. Дл  этого в лунки планшета дополнительно внос т смесь ортофенилендиамина и перекиси водорода в соотношении (98-102) 1, после чего снимают показатель оптической плотности, пропорционально соответствующий количеству прилипших клеток. Способ  вл етс  значительно более точным. Положительный эффект способа дает возможность значительно повысить точность метода и сократить врем  его выполнени .

Description

Изобретение относитс  к клинической иммунологии и может быть использовано при диагностике специфической сенсибилизации лейкоцитов у обследуемых лиц.

Целью изобретени   вл етс  повышение точности определени  адгезии лейкоцитов крови.

Способ осуществл ют следующим образом .

Лейкоцитарную взвесь из цельной гепа- ринизированной крови получают путем осаждени  эритроцитов 0,9-1,1 %-ной желатиной на среде 199 Выдерживают смесь 10-15 мин при 37°С Отбирают надосадок. Суспензию, наход щуюс  в надосадочной жидкости, отмывают в режиме 200 g в течение 10 мин и 0 05-0 15 мл клеточной взвеси

на среде 199 в концентрации 1-1,5 млн/мл помещают в лунки плоскодонных пластин дл  иммунологических реакций. Пластины предварительно обрабатывают средой 199 в течение 30 мин

Планшеты инкубируют в течение 1,5-2 ч при 37°С в присутствии 5% С02, или буферного раствора (ХЕПЕС) дл  создани  рН 7,0- 7,2. По окончании инкубации содержимое лунок трижды промывают средой 199 и последний раз бесцветным физиологическим раствором (рН 7-7,2) дл  удалени  остатков красител .

Количество прилипших клеток определ ют путем тестировани  активности фермента МП, содержащегос  в азурофильных гранулах этих клеток. С этой целью в лунки

О

ю VJ о о

00

добавл ют 0,1-0,15 мл Н20, выдерживают в течение 15-20 мин. Фермент высвобождаетс  в жидкую среду, вследствие осмотического лизиса клеток. Добавл ют субстратную смесь, состо щую из 0,04%-го раствора ортофенилендиаммна и 0,02%-го раствора Н202, при их соотношении (102:1)-(98:1) (ОРД на фосфат-цитратном буфере рН 5,0). По истечении 5-10 мин реакци  останавливаетс  добавлением 1 N bteSCM, оптическую плотность реакционной смеси снимают в многоканальном спектрофотометре Multiskan Plus. Результаты оптической плотности, соответствующие активности исследуемой МП в прилипших клетках, перевод т в ус.ед. активности фермента перок- сидазы хрена (удельна  активность 350-500 ед/мг).

Дл  построени  стандартной калибровочной кривой используетс  приготовленный раствор перексидазы хрена с известной концентрацией этого фермента и активность этого фермента тестируетс  в той же реакционной системе. Стандартную кривую стро т, откладыва  по оси абсцисс весовые количества пероксидэзы хрена, а по оси ординат соответствующую им оптическую плотность.

Объектом исследовани  служит гепари- низированна  кровь, полученна  из вены в количестве 10 мл. Далее полученную кровь дел т на 10 порций по 1 мл и провод т 10 параллельных исследований. С целью разделени  клеток белой крови от эритроцитов кровь смешивают с 0,9%-ным раствором желатина на питательной среде 199 в соотношении 1:2. Инкубируют в течение 10 мин при 37°С. По истечении инкубации образовавшийс  верхний слой, состо щий преимущественно из лейкоцитов, отсасывают и отмывают от желатина при 1000 об/мин в течение 10 мин.

После отмывани  к клеткам добавл ют 1 мл среды 199 или сбалансированного солевого раствора. Провод т счет клеток в краске следующего состава, %: тритон-Х- 1000,2; эозин 0,1; азур 11 водорастворимый 0,015; НаО до 100 (разведение клеточной суспензии 1:10).

Дифференцированный счет провод т в камере Гор ева с учетом формы  дра, что позвол ет вывести процент полинуклеар- ных и мононуклеарных клеток, нар ду с абсолютным количеством лейкоцитов и нейтрофилов.

В лунки плоскодонных планшет дл  иммунологических реакций внос т 0,1 мл исследуемой клеточной взвеси с концентрацией 1-106 нейтрофилов/мл. Далее планшеты инкубируют в течение 1,5 ч при 37иС в присутствии 5% СОа. По окончании инкубации содержимое лунок трижды промывают средой 199 и последний раз бесцветным

физиологическим раствором рН 7,0 дл  уда- лени  остатков красител . Затем в лунки добавл ют 0,f мл Н20, выдерживают в течение 20 мин и далее внос т в лунки 0,1 мл смеси , 0,04% ортофенилендиамина на фосфат-цитратном буфере рН 5,0 и 0,02% раствора Н202 при их соотношении соответственно равном (в 10,2 мл ОРД внос т 0,1 мл 0,02% На02). Через 5 мин реакци  останавливаетс  добавлением 0,1 мл 1 N H2S04. Оптическую плотность реакционной смеси снимают в спектрофотометре Multlshan Plus.

Сравнительный анализ предлагаемого и известного способов приведен в таблице.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ определени  адгезии лейкоцитов , включающий их выделение и последующее определение количества прилипших к

   поверхности пластика клеток, отличающийс  тем, что, с целью повышени  точности способа, суспензию лейкоцитов внос т в лунки планшета в концентрации 1-1,5 млн/мл лейкоцитов, инкубируют 1,5-2

   ч при рН 7.0-7,2 с последующей промывкой и лизированием, а адгезию определ ют по активности миелопероксидазы в прилипших клетках, при этом в лунки дополнительно внос т смесь 0,04% раствора

   ортофенилендиамина и 0,02% раствора перекиси водорода в соотношении соответственно равном (98:102): 1, после чего снимают показатель оптической плотности, пропорционально соответствующий количеству

   прилипших клеток.