SU1655990A1

SU1655990A1 - Способ количественного определени активности каталазы

Info

Publication number: SU1655990A1
Application number: SU894666439A
Authority: SU
Inventors: Александр Александрович Токмаков; Ольга Евгеньевна Благова
Original assignee: Ленинградский государственный университет
Priority date: 1989-03-24
Filing date: 1989-03-24
Publication date: 1991-06-15

Abstract

Изобретение относитс к медицине и биохимии и может быть широко использовано в клинической медицине и диагностике дл тестировани функциональной активности фагоцитов периферической крови человека при определении иммунного статуса организма. Целью изобретени вл етс повышение чувствительности способа. Дл определени активности каталазы используют пероксидгенерирующую систему, состо щую из глюкозы и глюкозооксидазы, и пе- роксидрегистрирующуюсистему, состо щую из люминола и пероксидазы. Образующиес в ходе пероксидазной реакции кванты света регистрируют при помощи лю- минометра или сцинтилл ционного счетчика . В присутствии каталазы снижаетс стационарна концентраци пероксида, причем снижение пропорционально активности каталазы. Чувствительность способа 0,42 - 0,65 ед.активности в пробе. 4 фиг. Ё

Description

Изобретение относитс к медицине и биохимии, в частности может быть широко использовано в клинической медицине и диагностике дл тестировани функциональной активности фагоцитов периферической крови человека при определении иммунного статуса организма,

Целью изобретени вл етс повышение чувствительности способа.

Способ заключаетс в том, что инкубацию каталазы осуществл ют с ферментативной пероксидгенерирующей системой, котора содержит глюкозу в количестве 3 - 40 мкг, в пероксидгенерирующую систему (глюкозооксидазную систему - ГОС) добавл ют в качестве индикаторного вещества люминол в насыщающей концентрации 5 М, определ ют величины хемилюминесценции эталонных проб, по которым стро т калибровочную

кривую зависимости величины хемилюминесценции от активности каталазы в эталонных пробах, после чего измер ют хемилюминесценцию искомой пробы и по калибровочной кривой эталонных проб определ ют активность каталазы. Способ заключаетс виспользовании пероксидгенерирующей ферментативной системы ГОС и в регистрации люминолзависи- мой хемилюминесценции, уменьшение значений которой характеризует разложение перекиси водорода каталазой. В используемой биферментной системе происход т следующие реакции: 1) перок- сидгенерирующа система (глюкозоокси- дазна система) в присутствии люминола: глюкоза + Н202 ++02 глюкозооксидаза глюконат + Н202

2) H2U2 + люминол пероксидаза ами- нофталат + Н20 + Na.

О

ел ел ю ю о

NH20

Отношение

InC

близко к 1, что сви

Образующиес в ходе реакции кванты света регистрируютс при помощи люмино- метра или сцинтилл ционного счетчика.

Люминол (5-амино-2,3-дигидрофтала- зиндион) при окислении пероксидом в водных основных растворах дает ркую хемилюминесценцию. Структурна формула люминола приведена ниже;

О

f JN

NH2 0 , i.

люминол диазохинон аминофталат (конечный продукт реакции )

Показано, что в процессе его окислени образуютс такие продукты, как диазохинон и 3-аминофталева кислота. Последн вл етс конечным продуктом окислени . По-видимому, 3-аминофталат вл етс эмиттером света.

При добавлении к пероксидгенерирую- щей системе с люминолом каталазы эффективна концентраци (N202) снижаетс в результате ферментной реакции: 3) НзОа каталаза НаОа + 02.

Это вызывает снижение квантового выхода в реакции (2) и, следовательно, уменьшение величины хемилюминесценции.

Таким образом, уменьшение величины хемилюминесценции системы 1.+2. при добавлении каталазы за определенный интервал времени соответствует количеству перекиси водорода, разложенного катала- зой за данный интервал времени.

На фиг.1 представлены кривые кинетики хемилюминесценции пероксидгенериру ющей системы с люминолом в отсутствие и в присутствие каталазы представлены. Во всех случа х инкубационна смесь содержит 0,5 мл раствора ГОС, 40 мкг глюкозы. Конечный объем проб 0,6 мл. Крива 1 соответствует кинетике хемилюминесценции в отсутствие каталазы, а кривые 2 - 6 - в присутствии каталазы соответственно с активность ю 3,9; 3,9x2; 3,9x4; 3,9x8, 3,9x16 ед.активности фермента.

На фиг.2 представлена крива зависимости величины максимальной интенсивности хемилюминесценции от концентрации каталазы в пробе.

In макс

/-

детельствует в пользу первого пор дка ка- талэзной реакции.

20

25

30

35

40

45

50

55

Данна крива построена на основе кривых фиг.1, т.е. при концентрации глюкозы в системе, равной 40 мкг. Средний участок кривой 2 соответствует значени м активности каталазы 0,78x4 0,78x70 ед. ферментативной активности (т.е. диапазон измер емых активностей каталазы около 1 пор дка). Причем возможность определе- чни предельно низкой активности фермента достигаетс использованием в пероксидге- нерирующей системе глюкозы в количестве 3 мкг, в то врем как стандартна система ГОС содержит 40 мкг, Крива зависимости величины хемилюминесценции (%) от активности каталазы, вносимой в пробу (фиг.З), построена при концентрации глюкозы в системе 3 мкг/пробу. Активность каталазы 0,42 - 0,65 ед. активности дает снижение величины хемилюминесценции на 10%, что Явл етс достоверным изменением и может служить нижней границей оценки чувствительности данного метода. Использование глюкозы в концентрации ниже 3 мкг на пробу невозможно дл данного метода, так как дл построени калибровочной кривой зависимости хемилюминесценции от активности каталазы необходим диапазон изменений интенсивности (величины) хемилюминесценции как минимум на 1 пор док, а именно, использование 3 мкг глюкозы в пробе позвол ет получить уровень хемилюминесценции , превышающий фоновый на пор док.

С другой стороны, концентраци глюкозы 40 мкг на пробу вл етс верхним предельным значением, позвол ющим сохранить высокую чувствительность метода , так как при повышении концентрации глюкозы 40 мкг возрастает интенсивность хемилюминесценции и активность каталазы , способна заингибировать реакцию и снизить хемилюминесценцию, возрастает до значений не менее 2 - 3 ед. активности.

На фиг.4 представлена крива зависимости интенсивности хемилюминесценции от концентрации люминола в инкубационной среде.

Реакци протекает в услови х насыщени по люминолу, что следует из графика зависимости интенсивности люминесценции от концентрации люминола в инкубационной среде (концентраци глюкозы в пероксидгенерируюцей системе неизменна - 40 мкг ). Квантовый выход реакции достигает максимума при концентрации люминола 2 - 5x10 М и остаетс неизменным при дальнейшем ее увеличении. Таким образом , рабочей концентрацией выбрана 5.10 5 М Использование более высоких концентраций люминола не приводит к.улучше

нию условий протекани реакции, однако сопровождаетс повышенным расходом дефицитного компонента инкубационной среды .

П р и м е р. В качестве эталонной используют катадазу фирмы Sen/a N 26900 из печени быка с удельной активностью 39000 ед./мг, Суспензию фермента в воде, насыщенной тимолом, 20 мг/мл предварительно разбавл ют в 1000 раз(I ,78ед. активности). В качестве искомой используют каталззу фирмы Реахим из печени крупного рогатого скота марки Б с предполагаемой удельной активностью 41650 ед./мг.

Глюкозооксидазную систему ГОС составл ют по Ллойду. Проба содержит 3 или 40 мкг глюкозы. Концентраци люминола - насыщающа 5 10 М. Конечный объем пробы 0,6 мл. Катэлазу внос т в объеме 100 мкл. Конечное объемное соотношение компонентов в смеси - проба: ферментативна система: индикаторное вещество - 0,5:1 0:0,05.

Во всех случа х инкубационна смесь содержит 0,5 мл раствора ГОС. Инкубационную смесь, содержащую все компоненты, включа каталазу, пред инкубируют в темноте в течение 1,5 мин, чтобы исключить эндогенный пероксид. Реакцию инициируют добавлением глюкозы. Измер ют хемилю- минесценцию эталонных проб в течение 10 - 12 мин на жидкостном сцинтилл ционном счетчике БЕТА-Г, термостатированном при 37°С, и получают кинетические кривые хемилюминесценции дл эталонных проб. На основе полученных кривых кинетики изменени величины хемилюминесценции эталонных проб в отсутствие и в присутствие каталазы (фиг.1) стро т калибровочную кривую зависимости максимальной величины (интенсивности) хемилюминесценции от активности каталазы в пробе (фиг 2,3)

Затем, аналогичным образом получают кинетические кривые хемилюминесценции

дл искомой пробы, в двух разведени х

Каталазу Реахим с предполагаемой активностью 41650 ед./мг развод т до получени предполагаемых концентраций 80 и 160 ед., а именно каталазу развод т до получени расчетной концентрации 40 ед/мг и далее берут по 2 и 4 мкл.

По графику калибровки оказал ось. что внесение в пробу 2 мкл суспензии ката азы с искомой активностью дает максимальную

величину хемилюмивесценции на пределе чувствительности, что соответствует 2,7 ед активности, а 4 мкл соответствует 5,5 ед активности, т.е. активность катайазы Реахим упала в 30 раз по сравнению с маркировочными данными, т.е. удельна

2,Тед активность искомого препарата х

ед./мг вместо маркировочных 41650 ед./мг.

Claims

Формула изоб р в тени Способ количественного определени активности катэлазы, включающим инкуба цию анализируемого образца в присутствии

пероксидгенерирующей системы, состо щей из глюкозоохсидазы и углеводного субстрата , и пероксид регистрирующей системы, состо щей из пероксидззы и субстрата пероксидазы, отличающийс

тем, что, с целью повышени чувствительности способа, в качестве углеводногъ субстрата глюкоэооксидазы используют глюкозу в количестве 3-40 мкг, а в качестве субстрата пероксидазы - люминол в концентрам 5 М.

Out SOlO U G U

02L

B li

: и Ј

001

ooi

00Ј

001

QJ. ХНПЫ/иЫК

066S99I

W1,5

Фи&З

Ц1макс В

5- ц..

3

ч17 -6 -5 -4 -J ,

фиг. 4

2,0 М,ед.

Ч1