SU1655986A1 - Способ выделени эндонуклеазы рестрикции Ара 1 - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеаз рестрикции с высокой степенью очистки, свободных от примесных нуклеаз. Целью изобретени   вл етс  повышение чистоты и увеличение выхода целевого продукта. Дл  выделени  рестриктазы Ара 1 используетс  фракционирование клеточного гомогената в двухфазной системе полиэтиленгликоль - декстран в присутствии хлористого натри . Дальнейша  очисткаферментаосуществл етс  хроматографией на фосфоцеллюлозе и на гидроксилапатите. Способ позвол ет получать 420000 ед.акт/г биомассы высокоочищенного препарата фермента, свободного от примеси неспецифических нуклеаз и фос- фатаз, выход по активности составл ет 51 %, удельна  активность препарата 150000 ед/мг. 5 табл. Ё

Description

Изобретение относитс  к микробиологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеаз рестрикции с высокой степенью очистки, свободных от примесных нуклеаз.

РестриктазаАра 1  вл етс  уникальной, не имеет изошизомеров и, следовательно, не может быть заменена какой-либо ре- стриктазой из другого источника.

Целью изобретени   вл етс  повышение чистоты и увеличение выхода целевого продукта.

Способ заключаетс  в том, что дл  выделени  рестриктазы Ара 1 используетс  фракционирование клеточного гомогената в двухфазной системе 7-%ный полиэтиленгликоль (ПЭГ), 2%-ный декстран в присутствии определенной (0,6 М) концентрации хлористого натри , а дальнейша  очистка фермента осуществл етс  хроматографией на фосфоцеллюлозе Р-11 с элюцией градиентом (0,15 - 1) М хлористого кали  в буфере и хроматографией на гидроксилапатите (ГАП) с элюцией градиентом (0,01.- 0,6) М концентрации калийфосфатного буфера рН 7,4. Использование в процессе хроматографии на фосфоцеллюлозе Р-11 и гидроксилапатите буфера, содержащего определенную (0,1 мМ) концентрацию ЭДТА, ведет к большей стабильности фермента и повышению выхода целевого продукта.

Дл  фракционировани  клеточного гомогената в двухфазной системе ПЭГ - декстран оптимальна  концентраци  NaCI

ON СЛ СП

ю

00

Os

равна 0,55 - 0,65 М (табл. 1), а ПЭГ и декстра- на - 7 и 2% соответственно (табл.2),

Как видно из табл.2, двухфазна  система 7%-ный полиэтиленгликоль - 2 %-ный де- кстран  вл етс  оптимальной. Двухфазна  система 4%-ный ПЭГ - 7%-ный декстран по составу фаз соответствует двухфазной системе 7%-ный ПЭГ - 2%-ный декстран, но при этом увеличиваетс  объем нижней фазы , что вызывает методические трудности при разделении фаз.

Подбор концентрации ЭДТА в элюиру- ющих хроматографических буферах позвол ет увеличить выход рестриктазы Ара 1 (табл.3).

Из табл.3 видно, что использование оптимальной (0,10 - 0,15 мМ) концентрации ЭДТА значительно увеличивает выход целевого продукта.

В табл.4 представлена зависимость выхода эндонуклеазы рекстрикции Ара 1 от концентрации ЭДТА в хроматографических буферах при выделении по известному способу и согласно изобретению.

Объем градиента на начальных этапах очистки (хроматографи  на фосфоцеллюло- зе) составл ет 5-10 объемов хроматографи- ческой колонки. При более тонкой очистке (стади  доочистки фермента на гидроксила- патите) объем градиента увеличивают до 15 - 30 объемов колонки. Объемы колонок рассчитывают в зависимости от емкости сорбента и количества наносимого материала. Начальна  концентраци  соли в градиенте определ етс  концентрацией соли в буфере . Конечна  концентраци  соли определ етс  экспериментальным путем. Использование крутых градиентов сказываетс  на эффективности разделени , а применение пологих градиентов приводит к разбавлению фермента, что иллюстрируетс  данными, представленными в табл.5.

Оптимальными концентраци ми градиентов при хроматографической очистке целевого продукта  вл ютс  при хроматографии на фосфоцеллюлозе 0,15 - 1,0 М КС1, и на гидроксилапатите - 0,1 - 0,6 М калийфосфата.

Способ позвол ет получить препарат рестриктазы с высоким выходом (табл.4) и очищенный от примесей экзонуклеаз и фос- фатаэ, тогда как препараты фермента, выделенные по известному способу, содержат примесные экзонуклеазы.

Получение рекстриктазы Ара 1 из Acetobacter pasteurlanus.

П р и м е р 1. Дл  получени  рестриктазы Ара 1 используют штамм Acetobacter Pasteurlanus BK-440, полученный из Центрального Музе  промышленных микроорганизмов института ВНИИ генетика.

Все операции по выделению и очистке фермента провод т при +4°С. Активность

рестриктазы тестируют методом гидролиза ДНК фага А с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом на пластинах с 1 %-ным агарозным гелем. Дл  увеличени  разрешающей способности

электрофореза в агарозном геле используют метод, основанный на периодическом изменении пол рности напр жени , подаваемого на электроды электрофоретической камеры (пульсирующий форез). Дл  разделени  Ара 1 рестриктов ДНК фага А и на- тивной ДНК фаза А используетс  пульсирующее поле с периодом 1, 2 с в пр мом и 0,6 с в обратном направлени х. Реакционна  смесь дл  гидролиза содержит 10

ММ трис-HCI рТН 7,9; 6 мМ MgCl2, 6 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 1 мкг ДНК фага Аи 1 мкл фермента. Реакцию провод т при 37°С 10 мин. Электрофорез провод т в 0,06 М трис-ацетатном буфере, рН 7,9, 2 мМ ЭДТА в течение 5 ч при напр жении 100 В Окрашенные этидий-бромидом (1 мкг/мл) гели просматривают в УФ-свете

За единицу активности принимают количество фермента, которое в оптимальных

услови х за 1 ч полностью расщепл ет 1 мкг ДНК фага А . 2 г биомассы Acetobacter pasteurianus суспендируют в 4 мл буфера экстракции, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7,5; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1 мМ

ЭДТА и 0,1 %-ный тритон Х-100, обрабатывают ультразвуком на Дезинтеграторе при частоте 20 кГц и амплитуде 17 мкм по 30 с 5 раз с интервалом 30с дл  охлаждени  смеси .

К 6 мл клеточного гомогенатэ приливают 6 мл смеси 21 % ПЭГ - декстран, 2,7 мл 4 М натри  хлористого и 3,3 мл деионизован- ной воды (конечна  концентраци  ингредиентов - 7%-ный ПЭГ, 2%-ный декстран,

0,6 М NaCI). Смесь перемешивают 15 мин, выдерживают 30 мин в лед ной бане и центрифугируют на центрифуге Bekman С 2 - 21 при 8000 об/мин 1 ч.

Верхнюю фазу сливают и диалиэуют

против 1 л буфера В, содержащего 10 мМ калий фосфат рН 7,4; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1 мМ ЭДТА; 10%-ный глицерин. Диализ провод т со смекой буфера (три раза) в течение 6 ч.

Отдиализованную фракцию со скоростью 15 мл/ч нанос т на колонку 1,5x30 см с фосфоцеллюлозой Р-11. Колонку промывают 50 мл 0,15 М кали  хлористого в буфере . Далее дл  элюции используют линейный

градиент концентрации кали  хлористого 0,15 - 1,0 М в буфере В объемом 200 мл. Фракции, элюируемые при 0,35 - 0,45 М KCI и содержащие основную часть активности, объедин ют.

Ферментный раствор без диализа со скоростью 3 мл/ч нанос т на колонку 0,9x4 см с гидроксилапатитом. Элюцию провод т линейным градиентом концентрации кали  фосфорнокислого рН 7,4 от 0,01 до 0,6 М, содержащего 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0, мМ ЭДТА и 10%-ный глицерин. Общий овьем градиента 50 мл. Фракции, элюируемые при 0,22 - 0,28 М соли, содержащие активность рестриктазы Ара 1, объедин ют и ди- ализуют против буфера В, содержащего 50%-ный глицерин. Выход рестриктазы Ара 1 составил 420000 ед.акт./г биомассы. В препарате рестриктазы отсутствуют примеси неспецифических эндонуклеаз (сохране- ниеспецифическойкартины

рестрикции при инкубации 1 мкг ДНК фага А с 30 ед. акт. фермента в течение 17ч при 37°С и примеси экзонуклеаз и фосфатаз (фрагменты ДНК, полученные гид- релизом 1 мкг ДНК фага АЗО ед.акт.фермента в течение 1 ч при 37°С сшиваютс  с ДНК-лигазой и повторно гидролизуютс  ре- стриктазой). Концентрированные препараты хран т без снижени  активности год и более при минус 20°С.

П р и м е р 2. Эндонуклеазу рестрикции Ара 1 выдел ют из 2 г клеток аналогично примеру 1, но к клеточному гомогенату приливают 2,5 мл 4М NaCI (до конечной концен- трации 0,55 М) и 3,5 мл деионизованной воды. Выход препарата составил 385000 ед.акт./r биомассы.

Примеси неспецифических эндонуклеаз , экзонуклеаз и фосфатаз в препарате не обнаруживаютс .

ПримерЗ. Эндонуклеазу рестрикции Ара 1 выдел ют из 2 г биомассы аналогично примеру 1, однако к клеточному гомогенату приливают 2,9 мл 4 М NaCI (до конечной концентрации 0,65 М) и 3,1 мл деионизованной воды. Выход препарата составил 400000 ед.акт./r биомассы.

Примеси неспецифических эндонуклеаз , экзонуклеаз из фосфатаз в препарате не обнаруживаютс .

П р и м е р 4. Эндонуклеазу рестрикции Ара 1 выдел ют из 2 г клеток аналогично примеру 1, однако буфер В содержит 0,15 мМ ЭДТА Выход препарата составил 370000 ед.акт./r биомассы.

Примеси неспецифических эндонуклеаз , экзонуклеаз и фосфатаз в препарате не обнаруживаютс .

Таким образом, выход рекстриктазы Ара 1 составл ет 420000 ед.акт. с 1 г биомассы . В препарате рестриктазы отсутствуют примеси неспецифических эндонуклеаз (сохранение специфической картины рестрикции при инкубации 1 мкг ДНК фага Я с 30 ед. акт. фермента в течение 17ч при 37°С) и примеси эндонуклеаз и фосфатаз (фрагменты ДНК, полученные гидролизом 1 мкг ДНК фага 30 ед.акт. фермента в течение 1 ч при 37°С сшиваютс  ДНК-лигазой и повторно гидролизуютс  рекстриктазой).

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ выделени  эндонуклеазы рестрикции Ара 1, включающий разрушение биомассы ультразвуком, фракционирование лизата и хроматографическую очистку, отличающийс  тем, что, с целью повышени  чистоты и увеличени  выхода целевого продукта, фракционирование лизата осуществл ют в двухфазной системе, содержащей 7% полиэтиленгликол  и 2% декстрана в присутствии 0,55 - 0,65 М NaCI, хроматографическую очистку фермента провод т последовательно методом ионообменной хроматографии на фосфоцеллю- лозе Р-11 в градиенте KCI 0,15 - 1,0 М и методом адсорбционной хроматографии на гидроксилапатите в градиенте фосфорнокислого кали  0,01 - 0,6 М с использованием в элюирующих хроматографических буферах 0,10 - 0,15 мМ ЭДТА.

   716559868

   Т а б л и и   I

   Фракцнониропание клеточнсн о гомогената п днухфачкой системе 7% ПЭГ-2% дек стран при ра-эличмых концет раци х NaCl

   Обнаруживаютс  следовые количества

   ракционирование клетчксп о гомогемпта при различных концентраци х полиэтиленгликол  ч декстраи . в ирису rcinmi 0,6 М NaCl

   Таблица 4 Вьщеление Ара 1 из 2 г биомассы

   168

   150

   84

   42

   100

   89

   Клеточный экстракт

   Биогель А-0,5 см

   164

   151

   18,5 7,4

   7,2

   14

   1

   4,3

   ДЭАЭ - 90 целлюлоза (0,1 мМ ЭДТА)

   ФосАо- 77

   целлючоза

   Р-11

   (0,1 мМ

   ЭДТА)

   Таблица 2

   100

   ПЭГ- 164 декстран

   56 100

   2

   6

   92

   55

   Фпсфо- целлю- лоза Р-11

   ГАП

   (0,1 мМ ЭДТА)

   145

   84

   68 88

   150 51

   150

   47

   О

   Стади  очистки

   Градиент

   соли, М0,15-1,5 0,15-1,0 0,15-0,60,01-1,0. 0,01-0,60,01-0,4

   Наличие

   примесных

   нуклеаз++ ++ Обнаруживаютс  следовые количества

   Вли ние изменени  концентрации градиентов на эффективность хроматографической очистки

   Хроматографи  на фосфоцеллюлоэе Р-П

   Хроматографи  на гидроксилапа- тите