SU1641884A1 - Strain of cultured animal cells of mus musculus l employed for the production of a hybridome - Google Patents

Strain of cultured animal cells of mus musculus l employed for the production of a hybridome Download PDF

Info

Publication number
SU1641884A1
SU1641884A1 SU884618802A SU4618802A SU1641884A1 SU 1641884 A1 SU1641884 A1 SU 1641884A1 SU 884618802 A SU884618802 A SU 884618802A SU 4618802 A SU4618802 A SU 4618802A SU 1641884 A1 SU1641884 A1 SU 1641884A1
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
strain
cells
hybridomas
yield
animal cells
Prior art date
Application number
SU884618802A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Елена Владимировна Березкина
Татьяна Николаевна Игнатова
Зоя Владимировна Ковалева
Original Assignee
Институт Цитологии Ан Ссср
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Институт Цитологии Ан Ссср filed Critical Институт Цитологии Ан Ссср
Priority to SU884618802A priority Critical patent/SU1641884A1/en
Application granted granted Critical
Publication of SU1641884A1 publication Critical patent/SU1641884A1/en

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относитс  к гибри- домной технологии и может быть использовано при получении гибридом. Цель изобретени  - получение штамма опухолевых клеток-партнеров со сниженной зависимостью от макрофагаль- ного фидера, повышенной скоростью пролиферации и выходом гибридом. Штамм получают из клеток Sp 2/0 путем селекции на резистентность к бромистому этицию (ЕВ) в концентрации 5 мкг/мл. Штамм культивируют в среде ДМЕМ с 10% сыворотки эмбриона коровы, 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натри , 2 мМ глютами- на, меркаптоэтанола и 40 ед/мл гентамицина. Птамм отличаетс  от исходного по влением по крайней мере двух хромосомных маркеров, устойчивостью к ЕВ, а также к 0,5 мкг/мл колхицина, и 0,074 мкг/мл актиномицина Д. Гибридомы, полученные при гибридизации лимфоцитов мышей с клетками за вл емого штамма, растут без добавлени  макрофагов и выход продуцентов антител вдвое выше, чем при использовании линии-прототипа Sp 2/0 Ag 14, Штамм депонирован под № ВСКК(П)309Д. О $The invention relates to a hybrid technology and can be used in preparing hybridomas. The purpose of the invention is to obtain a strain of partner tumor cells with a reduced dependence on the macrophage feeder, an increased proliferation rate and hybridoma yield. The strain is obtained from Sp 2/0 cells by selection for resistance to bromide etiation (EB) at a concentration of 5 μg / ml. The strain is cultured in a DMEM medium with 10% bovine fetal serum, 1 mM of essential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 2 mM glutamine, mercaptoethanol, and 40 U / ml gentamicin. Ptamm differs from the original in the presence of at least two chromosomal markers, resistant to EB, as well as to 0.5 µg / ml of colchicine, and 0.074 µg / ml of actinomycin D. Hybridomas obtained by hybridizing mouse lymphocytes with the claimed strain, grow without the addition of macrophages and the yield of antibody producers is twice as high as when using the prototype line Sp 2/0 Ag 14, the strain is deposited under the number VSCK (P) 309D. About $

Description

Изобретение относитс  к гибридом- ной технологии и может быть использовано при получении гибридом.The invention relates to hybridoma technology and can be used in preparing hybridomas.

Цель изобретени  - получение штамма опухолевых клеток-партнеров со сниженной зависимостью от макрофа- гального фидера, повышенной скоростью пролиферации и выходом гибридом.The purpose of the invention is to obtain a strain of partner tumor cells with a reduced dependence on the macrophage feeder, an increased proliferation rate and the yield of hybridomas.

Штамм Sp EBR-5 получают следующим образом.Strain Sp EBR-5 was prepared as follows.

Клетки исходной линии Sp 2/0 Ag 14 обрабатывают бромистым этидием (ЕВ) в конечной концентрации 50 мкг/мл в течение 24 ч..ЕВ добавл ют в среду культивировани  следующего состава:Cells of the original Sp 2/0 Ag 14 line are treated with ethidium bromide (EB) at a final concentration of 50 µg / ml for 24 hours. EB is added to the culture medium of the following composition:

ДНЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки, 1 мМ заменимых аминокислот , 1 мМ пирувата натри , 2 мМ глю- тамина, меркаптоэтанола и 40 ед/мл гентамицина при 37°С. Затем клетки отмывают от ЕВ и культивируют в течение 48 ч. После этого клетки высевают на 24-луночные платы в концентрации 100 тыс. клеток на лунку и культивируют в стандартных услови х с разными дозами ЕВ. В лунках с ЕВ в концентрации 1 мкг/мл по вл ютс  единичные клоны. Один из них выделен и подвергс  многошаговой селекции в течение 60 дней с повыше-DAILY with the addition of 10% fetal serum, 1 mM of essential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 2 mM glutamine, mercapto ethanol, and 40 units / ml gentamicin at 37 ° C. The cells are then washed from the EB and cultured for 48 hours. Thereafter, the cells are seeded on 24-well plates at a concentration of 100 thousand cells per well and cultured under standard conditions with different doses of EB. In the EB wells at a concentration of 1 µg / ml, single clones appear. One of them is isolated and subjected to multistep selection within 60 days with an increase in

00 00 Јь00 00

10ten

1515

2020

2525

нием дозы ЕВ до 5 мкг/мп. В результате получен штамм клеток EBR-5, обладающий снижением зависимости полученных на основе этой линии гибридом от присутстви  макрофагов, повышенной скоростью пролиферации полученных гибридом, а также повышенным выходом гибридом-продуцентов моНАТ. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) Р 309 Д и характеризуетс  следующими признаками.a dose of EB up to 5 μg / mp. As a result, the strain of EBR-5 cells was obtained, which has a decrease in the dependence of hybridomas obtained on the basis of this line on the presence of macrophages, an increased proliferation rate of the resulting hybridomas, as well as an increased yield of the mono-producing monohybridomas. The strain is deposited under a VSKK number (P) P 309 D and is characterized by the following features.

Морфологи . Культура состоит из клеток одного типа округлой формы. Культура имеет суспензионный тип роста.Morphology. Culture consists of cells of the same type of round shape. Culture has suspension type of growth.

В клетках линии Sp ER R-5 по сравнению с клетками линии Sp 2/0 Ag 14 по вл етс  5 новых хромосомных маркеров (Myj-M p. Два из них (Myj-M встречаютс  в подавл ющем числе клеток (92 и 88% клеток соответственно) и представл ют собой субметацентри- ческие хромосомы, возникшие в результате робертсоновских транслокаций: tr Мэд(:2), tr М40ПЗ:3). Три других метацентрика (M4,-M,,j) встречаютс  редко - в 8, 12, 16% клеток. М4, - ицентрическа  хромосома, возникша  в результате транслокации хромосомы 4 на хромосому 9 - tr (4:9) (4 А - Е.:9 А) - F.) М4Ј- телоцентрик tr (14:), происхождение телоцентри- ческой хромосомы Мц не сно. Полученные данные позвол ют считать, что клетки Sp EBR-5 характеризуютс  нали- 5 чием специфических маркеров, позвол ющих отличать эту линию от исходной клеточной линии Sp 2/0 Ag 14.In the Sp ER R-5 cells, compared with the Sp 2/0 Ag 14 cells, 5 new chromosomal markers appear (Myj-M p. Two of them (Myj-M are found in the overwhelming number of cells (92 and 88% cells, respectively) and represent submetacentric chromosomes resulting from Robertsonian translocations: tr Mad (: 2), tr М40ПЗ: 3). Three other metacentrics (M4, -M, j) are rarely found at 8, 12 , 16% of cells. M4, is a centric chromosome resulting from the translocation of chromosome 4 to chromosome 9 - tr (4: 9) (4 A - E.: 9 A) - F.) M4Ј is the telocentric tr (14 :), the origin is telocentric oh chromosome mts not clear. The data obtained suggests that Sp EBR-5 cells are characterized by the presence of specific markers that distinguish this line from the original Sp 2/0 Ag 14 cell line.

Штамм клеток Sp EBR-5 при введении внутрибрюшинно мышам линии Balb/c по 10б клеток на мышь в 0,5 мл Хэнкса через 10 дней развиваетс  в виде опухоли асцитного типа.The Sp strain of EBR-5 cells when administered intraperitoneally to Balb / c mice of 10b cells per mouse in 0.5 ml of Hanks develops in the form of an ascites tumor after 10 days.

Жизнеспособность клеток поддерживаетс  путем пересевов на свежую питательную среду ДНЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки, 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натри , 2 мМ глютамина, 5-10 мМ меркаптоэтанола, 40 ед/мл гектамици- на с добавлением ЕВ в концентрации 50 мкг/мл. Метод сн ти  клеток - пипетирование, кратность рассева 1:4, посевна  доза 5-Ю4 кл/мл, насыщающа  плотность 5-10 кл/мл. Врем  уддоени  попул ции 24 ч.Cell viability is maintained by subcultures on fresh nutrient medium DNEM supplemented with 10% fetal serum, 1 mM essential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 2 mM glutamine, 5-10 mM mercaptoethanol, 40 U / ml hectamycin with addition of EB at a concentration of 50 mcg / ml The method of removing the cells is by pipetting, the multiplicity of sowing is 1: 4, the seeding dose of 5-U4 cells / ml, saturating the density of 5-10 cells / ml. A population of 24 hours

Услови  культивировани  - на флаконах Каррел  при 37°С или в пласти30Cultivation conditions — in Carrel bottles at 37 ° C or in plastic

4040

4545

5050

5555

00

5five

00

5five

5 five

00

00

5five

00

5five

ковых флаконах в СО.-термостате при и 5-7% С0г.covials in CO. thermostat at 5-7% C0g.

Клетки штамма Sp EBR-5 способны расти при 1% сыворотки со временем удвоени  попул ции 32 ч, насыщающей плотностью 1-2-Ю5 кл/мл.Sp Sp EBR-5 cells are able to grow at 1% serum with a population doubling time of 32 h, saturating with a density of 1-2-U5 cells / ml.

Криоконсервирование. Клетки замораживают в эмбриональной сыворотке с добавлением 10% ДМЗО в концентрации 10б кл/мл, режим замораживани : 1°С/мин до -196°С. Клетки хран т в жидком азоте. Режим оттаивани : вод на  бан  +40°С в течение 1 мин. Жизнеспособность клеток после криокон- сервировани  70% при окраске трипа- новым синим. Клетки после отогрева перенос т из 1 ампулы в свежую среду на 1 флакон Каррел .Cryoconservation Cells are frozen in fetal serum with the addition of 10% DMZO at a concentration of 10 cells / ml, freezing mode: 1 ° C / min to -196 ° C. Cells are stored in liquid nitrogen. Mode of thawing: water in the ban + 40 ° C for 1 min. Cell viability after cryopreservation is 70% when stained with trypan blue. After warming up, the cells are transferred from 1 ampoule to fresh medium per 1 bottle of Carrel.

Штамм Sp EBR-5 сохран ет неизменными свои биологические характеристики на прот жении 60-кратного пассировани  в присутствии ЕВ в концентрации 5 мкг/мл, а также рекультивировани  после размораживани  за период времени более 1 года.Strain Sp EBR-5 maintains its biological characteristics unchanged during 60-fold passaging in the presence of EB at a concentration of 5 µg / ml, as well as recultivation after thawing over a period of more than 1 year.

Клетки штамма Sp EBR-5 устойчивы кроме ЕВ еще и к колхицину (0,5 мкг/мл) и к актиномицину D (0,074 мкг/мл) в отличие от клеток исходного штамма Sp 2/0 Ag 14.Sp cells of the EBR-5 strain are resistant besides EB to colchicine (0.5 µg / ml) and to actinomycin D (0.074 µg / ml) in contrast to cells of the original Sp 2/0 Ag 14 strain.

Использование клеток штамма Sp EBR-5 в качестве клеток-партйеров при гибридизации с лимфоцитами мышей , иммунизированных эритроцитами коровы, иллюстрируетс  следующим примером .The use of Sp EBR-5 cells as part-cells when hybridized with lymphocytes of mice immunized with bovine erythrocytes is illustrated by the following example.

Пример. Клетки штамма Sp EBR-5 культивируют на флаконах Каррел  в течение 48 ч. Посевна  доза на флакон 10 клеток/мл. Состав культуральной среды: среды ДНЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки , 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натри , 2 мМ глютамина , 510 мМ меркаптоэтанола, 40 ед/мл гентамицина, 5 мкг/мл ЕВ.Example. Sp-EBR-5 cells were cultured in Carrel vials for 48 hours. Seed dose per vial of 10 cells / ml. The composition of the culture medium: the environment of the DNEM with the addition of 10% fetal serum, 1 mm of replaceable amino acids, 1 mm of sodium pyruvate, 2 mm of glutamine, 510 mm of mercaptoethanol, 40 units / ml of gentamicin, 5 μg / ml of EB.

Дл  контрол  клетки линии миеломы Sp 2/0 Ag 14 культивируют на флаконах Каррел  в течение 48 ч. Посевна  доза на флакон была 10 клеток/мл. Состав культуральной среды: среда ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки, 1 мМ неосновных аминокислот , 1 мМ пирувата натри , 2 мМ глютамина , меркаптоэтанола, 40 ед/мл гентамицина. Клетки обеих исследуемых миелом.гибридиэовали со спленоцитами, выделенными из селе51For control, Sp 2/0 Ag 14 myeloma cells were cultured in Carrel vials for 48 hours. The seeding dose per vial was 10 cells / ml. The composition of the culture medium: medium DMEM with the addition of 10% fetal serum, 1 mM non-essential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 2 mM glutamine, mercapto ethanol, 40 units / ml gentamicin. The cells of both myelomas investigated. Hybridized with splenocytes isolated from the village51

зенки иммунизированных мышей (анти- геном дл  иммунизации  вл ютс  эритроциты крови крупного рогатого скота ) . Гибридизацию провод т посредством обработки клеток PEG. Далее клетки высевали на 96-луночные планшеты . Через 24 ч после обработки PEG добавл ли селективную среду. В случае использовани  клеток линии Sp 2/0 Ag 14 примен ют стандартную среду ГАТ, а в случае использовани  клеток Sp EBR-5 - среду ГАТ с добавлением 1 мкг/мл ЕВ. Когда гибридные клоны достигают плотности 103 - 1, клеток на лунку (плотность определ ют визуально), провод т тестирование на наличие AT постановкой реакции гемолиза. За эффективность образовани  гибридом - продуцентов- монокловальных антител (монАТ) принимают долю (%) гибридом, продуцирующих монАТ от общего числа образовавшихс  гибридных клонов.Zenka immunized mice (the antigen for immunization is the red blood cells of cattle). Hybridization is carried out by treating the cells with PEG. Next, cells were seeded onto 96 well plates. 24 hours after treatment with PEG, selective medium was added. In the case of using Sp 2/0 Ag 14 cells, the standard GAT medium is used, and in the case of Sp EBR-5 cells, GAT medium supplemented with 1 µg / ml EB is used. When hybrid clones reach a density of 103-1 cells per well (density is determined visually), testing for the presence of AT is performed by setting the hemolysis reaction. The efficiency of the formation of hybridomas - producers of monoclonal antibodies (monAT) is taken by the proportion (%) of hybridomas producing monAT from the total number of hybrid clones formed.

4646

Выход гибридом-продуцентов монАТ, полученных на основе линии Sp 2/0 Ag 14, составл ет 4,83% от общегоThe yield of the monat producers, derived from the Sp 2/0 Ag 14 line, is 4.83% of the total

количества образовавшихс  гибридом, а выход гибридом-продуцентов, полученных на клетках штамма Sp EBR-5, составл ет в случае культивировани  гибридом на макрофагах - 11,76%,the numbers of hybridomas formed, and the yield of hybridomas produced on cells of the Sp strain EBR-5 is 11.76% in the case of hybridoma cultivation on macrophages,

без макрофагов - 10,14%.without macrophages - 10,14%.

Таким образом, эффективность образовани  гибридом-продуцентов монАТ на основе клеток штамма Sp EBR-5 в 2 раза выше, чем на основе клетокThus, the efficiency of the formation of monAT producing hybridomas based on Sp EBR-5 cells is 2 times higher than that based

линии Sp 2/0 Ag 14. Кроме того, гибрид омы, полученные на основе клеток штамма Sp EBR-5, пролиферируют на ранних этапах развити  с более высокой скоростью и растут в отсутствииSp 2/0 Ag 14 lines. In addition, hybrid ohms, obtained on the basis of Sp EBR-5 strain cells, proliferate in the early stages of development at a higher rate and grow in the absence of

макрофагов с момента образовани .macrophages since formation.

Claims (1)

Формула изобретений 1Лтамм культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) № 309 D, используемый дл  получени  гибридомы.Claims 1Lthamm of cultured animal cells Mus musculus L. VSKK (P) No. 309 D, used to obtain hybridoma. Редактор Т.ЛазоренкоEditor T. Lazorenko Составитель Г.ИгнатьеваCompiled by G.Ignatieva Техред М.Дидык Корректор М.ДемчикTehred M.Didyk Proofreader M.Demchik Заказ 1126Order 1126 Тираж 376Circulation 376 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретени м и открыти м при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5VNIIPI State Committee for Inventions and Discoveries at the State Committee on Science and Technology of the USSR 113035, Moscow, Zh-35, Raushsk nab. 4/5 ПодписноеSubscription
SU884618802A 1988-12-12 1988-12-12 Strain of cultured animal cells of mus musculus l employed for the production of a hybridome SU1641884A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU884618802A SU1641884A1 (en) 1988-12-12 1988-12-12 Strain of cultured animal cells of mus musculus l employed for the production of a hybridome

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU884618802A SU1641884A1 (en) 1988-12-12 1988-12-12 Strain of cultured animal cells of mus musculus l employed for the production of a hybridome

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1641884A1 true SU1641884A1 (en) 1991-04-15

Family

ID=21414522

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU884618802A SU1641884A1 (en) 1988-12-12 1988-12-12 Strain of cultured animal cells of mus musculus l employed for the production of a hybridome

Country Status (1)

Country Link
SU (1) SU1641884A1 (en)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nature (London), 1978, v. 276, p.p. 269-270. I *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chang et al. Production of monoclonal antibodies in serum free medium
US7070960B2 (en) Method of increasing product expression through solute stress
EP0014519A2 (en) Cell lines, process for preparing them and process for producing antibodies
JPS61128886A (en) Human cell hybrid cell line and its production
Hengartner et al. Fusion of in vitro immunized lymphoid cells with X63Ag8
Siraganian et al. [2] Methods of enhancing the frequency of antigen-specific hybridomas
EP0114670B1 (en) Novel cell lines for use in the preparation of hybridoma cells
US4407945A (en) Constitutive production of interleukin 2 by a T cell hybridoma
De Blas et al. Estimation of the number of monoclonal hybridomas in a cell fusion experiment. Effect of post-fusion cell dilution on hybridoma survival
JPS595121A (en) Monoclonal antibody
SU1641884A1 (en) Strain of cultured animal cells of mus musculus l employed for the production of a hybridome
Astaldi et al. Increase of hybridoma formation by human lymphocytes after stimulation in vitro; effect of antigen, endothelial cells, and PWM.
US4473642A (en) Constitutive production of interleukin 2 by a T cell hybridoma
Buxbaum et al. Analysis of Thy-1 variants of murine lymphoma cells
EP0077571A2 (en) Process for producing a lymphokine
JP3043023B2 (en) Hybridoma
SU1495374A1 (en) Strain of cultivable mus musculus cells as producer of growth-stimulating hybrid factors
SU1595902A1 (en) Strain of mus musculus l hybrid cultivable cells for producing monoclonal antibodies to atigen cd38
Bartal et al. Current methodologies in hybridoma formation
SU1514770A1 (en) Strain of cultivable hybrid cells of mus musculus as producer of monoclonal antibodies against factor v of erythrocytes of cattle
SU1640157A1 (en) Strain of hybridous cultivating mammalian cells, mus musculus l, used for preparation of monoclonal antibodies for dna-dependent rna-polymerase of bacteriophage t7
SU1710576A1 (en) Strain of hybridous cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to the human insulin
SU1497214A1 (en) Strain of hybrid cultivated cells of animals mus musculus - producer of monoclonal antibodies to ca2+/mg2- dependent on endonuclease of nucleus of manъs spleen lymphocytes
SU1640158A1 (en) Strain of hybridous cultivating mammalian cells, mus musculus l, tsed for preparation of monoclonal antibodies for dna-dependent rna-polymerase of bacteriophaga t7
SU1389284A1 (en) Strain of hybrid cultivable mus musculus cells for producing monoclonal antibodies to differentiating antigen of human b-lymphocytes