SU1636773A1 - Способ определени пироксидазной активности биологических объектов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способамбиохимического анализа и может быть использовано для определения пероксидазной активности в биологическихобразцах и в иммунофермент- ном анализе. Цель изобретения - повышениечувствительности способа. К исследуемой пробе добавляют буферныйраствор, перекись водорода и в качестве хромогена смесь гваякола и п-аминодиэтиланилина при концентрациикаждого компонента 0,25-0,75 мм. Пробу инкубируют, измеряя прирост оптической плотности во времени. Способпозволяет повысить чувствительностьопределения пероксидазной активностив 5,6 раз. 2 табл.

Description

Изобретение относитс  к способам биохимического анализа и может быть использовано дл  определени  пероксидазной активности в биологических образцах и в иммуноферментном анализе .

Цель изобретени  - повышение чувствительности способа.

Способ осуществл етс  следующим образом.

К исследуемой пробе добавл ют буферный раствор, перекись водорода и в качестве хромогена смесь гва кола и n-аминодиэтиланилина при концентрации каждого компонента 0,25-0,75 мМ. Пробу инкубируют, измер   прирост оптической плотности во времени.

Пример 1. Анализ пероксидаз- ной активности экстракта хрена.

500 мг измельченного на терке хрена гомогенизируют в ступке, растира  с равным объемом битого стекла с дробным прибавлением 5 мл 5 мМ фосфатного буфера, рН 7,0. Полученную смесь центрифугируют при 5 тыс.об/мин в течение 5 мин, Супернатант разбавл ют в 10 раз. Дл  анализа в 1 см - кювету внос т 0,2 мл 1 М фосфатного буфера, рН 7,0, по 0,2 мл 5мМ гва кола и 5 мМ п-аминодиэтиланилина, 0,2 мл разведенного экстракта хрена. Объем довод т водой до 3,8 мл и реакцию начинают прибавлением 0,2 мл 2 мМ Н202. Через 30 с измер ют прирост оптической плотности раствора при 670 нм за 1 мин на приборе ФЭК КФК-2МП (в кинетическом режиме ) при комнатной температуре. Расчет ведут по формуле

д АР/мин К-п

05

со

о

-sj

00

v

n

V

где Д D/MJIH - прирост оптической плотнстсти за 1 мин , К - калибровочный коэффициент (т.е. количество мкмоль HjgO в 4 мл пробы, соответствующее оптической плотности 1)| разведение перед внесением пробы в реакционную смесь, объем вносимой пробы, мл.

В конкретном случае ДБ/мин 0,26 К 0,35} n 10; V 0,2. Тогда А 4,56 мкмоль/минмл 0,0456 мкмоль /мин мг влажной массы хрена.

Пример 2. Анализ пероксидаз ной активности очищенного препарата пероксидазы хрена (RZ 2,7).

Раствор фермента в воде разбавл ют до концентрации 0,25-4мкг/мл и анализ осуществл ют по примеру 1.

Исходна  концентраци  фермента 0,5 мг/мл, разбавление 250, объем вносимой пробы фермента 0,2 мл. ADg7()/MHH 0,195. Тогда А 85 мкмол /мин-мл 170 мкмоль/мин мг

В предыдущих примерах активность определ лась в кинетическом режиме, т.е„ пр мым измерением прироста оптической плотности за 1 мин. Если соответствующие приборы отсутствуют, в серийных опытах активность перокси дазы можно измер ть в режиме определени  абсолютной величины оптической плотности растворов (против контрол  предварительно инкубиру  пробы в фиксированное врем  (5 - 30 мин) при комнатной температуре по формуле, мкмоль/мин-мл:,

А

АР-П-К V-t

где t - врем  инкубации, мин. Остальные параметры аналогичны примеру 1.

Пример 3. Анализ следов гемоглобина по его пероксидальной активности .

Непосредственно перед опытом смешивают 0,2 мл 1 М ацетатного буфера, рН 5,3, 0,2 т 5 мМ гва кола, 0,2 мл 5 мМ п-аминодиэтиланилина, 0,2 мл разведенной исследуемой пробы (4- 40 мкг гемоглобина). Объем проб довод т до 2,8 мл водой и реакцию начи

5

0

нают прибавлением 0,2 мл 20 мМ П„0„. После инкубации проб при комнатной температуре реакцию останавливают прибавлением 1 мл 0,125 М Na2HPO. и пробы фотометрируют при 670 нм (ФЭК КФК-2МЩ 1 см) или 650 нм (СФ-26, 1 см) против контрол  (без гемоглобина). Расчет ведут по калибровочному графику, построенному по раствору гемоглобина с известным содержанием этого гемового белка.

Допустимые граничные значени  концентраций хромогенов приведены в табл.1 о Услови : 50 мМ фосфатный буфер , рН 7,0. Концентраци  пероксидазы хрена (Реанол, RZ 0,6) 0,5 мкг/мл, перекиси водорода 0,1 мМ. ФЭК КФК-2МП; 670 нм, 1 см.

Таблиц

1

Как видно кз табл.1, максимальный положительный эффект предлагаемого способа достигаетс  при концентрации хромогенов 0,25-0, 75 мК При концентрации больше 0,75 мМ чувствительность анализа не растет, однако увеличиваетс  оптическа  плотность контрол .

Чувствительность анализа увеличиваетс  в 5,6 раза.

Сравнение чувствительности определени  пероксидазы хрена по предлагаемому и известному методам (хромоген - гва кол) дано в табл.2.

Услови : 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,0. Концентраци  хромогенов 0,25 мМ. перекиси водорода 0,t мМ, фотоэлектроколориметр ФЭК (2МП, 1 см. Температура 20еС. Пероксидаза хрена (Реанол, RZ 0,6).

0,005 0,124 0,251 0,372 0,492 0,834

О

0,022 0,045 0,066 0,087 0,198

Способ определени  пероксидазной активности биологических объектов

путем добавлени  к исследуемой пробе буферного раствора, перекиси водорода и хромогена и инкубации с измерением прироста оптической плотности во времени, отличающийс  тем, что, с целью повышени  чувствительности способа, в качестве хромогена используют смесь гва кола и п-аминодиэтиланилина при

концентрации каждого компонента 0,25-0,75 ммоль.

Claims (2)

1. Таблица
2. 2 Формула изобретения

   Конечная концентрация пероксидазы, мкг/мл

   Λΐ>67ο / мин (Гваяколп-аминодиэтиланилин) ф Г) 44о/мин [ (гваякол)И

   0,25

   0,5

   0,75

   0,005

   0,124

   0,251

   0,372

   0,492

   0,834 . 0

   0,022

   0,045

   0,066

   0,087

   0,198

   Способ определения пероксидазной активности биологических объектов 5 путем добавления к йсследуемой пробе буферного раствора, перекиси водорода и хромогена и инкубации с измерением прироста оптической плот10 ности во времени, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве хромогена используют смесь гваякола и п-аминодиэтиланилинй при 15 концентрации каждого компонента 0,25-0,75 ммоль.

   Составитель Н.Гуляева Редактор Л.Гратилло Техред С.Мигунова Корректор М.Самборская^-