SU1636445A1 - Способ выращивани мицелиальных организмов - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, медицинской и микробиологи- ческой промышленности. Цель изобретени  - повышение выхода биомассы мицелиальных организмов. Процесс выращивани  Panus tigrinus 8/18, Panus tig- rinus 144, Streptomyces tumemacerans BK№-502 осуществл ют в услови х гидродинамического расслоени  культуральной жидкости и локализации мицели  внутри объема кулвтуральной среды в придонном слое. Перемешивание культуральной жидкости провод т посредством колебаний гидростатического столба всего ее рабочего объема с амплитудой колебани  1-3 мм. Аэрацию осуществл ют через насыщение кислородом воздуха придонного сло . В процессе культивировани  отработанную культу- ральную среду, образующуюс  над слоем мицели , замещают свежей питательной средой. 1 ил (Л

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической , медицинской и пищевой промышленности.

Цель изобретени  - повышение выхода биомассы.

На чертеже представлена установка дл  осуществлени  способа.

Способ заключаетс  в том, что процесс выращивани  мицелиальных организмов осуществл ют в услови х гидродинамического расслоени  культураль- ной жидкости и локализации сло  мицели  внутри объема культуральной среды .

Установка содержит йерментер 1, крышку 2, перемешивающий узел 3 с пробкой 4 и штуцером 5, подключенным к генератору 6 пневмоимпульсов, штуцер 7 дл  ввода инокул та, штуцер 8 дл  отвода воздуха из Аерментера, штуцер 9 дл  отвода культуральной среды, штуцер 10 дл  ввода в Ьермен тер свежей питательной среды, насос 11, теплообменную рубашку 12, бу-4 тыли 13 и 14 дл  питательной среды и дл  сбора культуральной среды, бактериальные фильтры 15 и 16 и технологическую сеть трубопроводов 17. Перемешивающий узел 3 (устройство

со о

4

4

сл

дл  перемешивани  и насыщени  пита-.- тельной среды кислородом воздуха) содержит кусок силиконовой трубки диаметром 10„мм, которую размещают в , металлической трубе с боковым отводом Силиконовую трубку с одной стороны снабжают лепестковым клапаном, а затем герметично скрепл ют с торцами металлического корпуса накидными гай-JQ ками со штуцерами. На металлический корпус одевают эластичную пробку, с помощью которой устройство вертикально закрепл ют в крышке емкости , Ферментера АНКУМ-2 таким образом, $ чтобы штуцер находилс  на рассто нии 5-10 мм от дна этой емкости.

Установку стерилизуют в автоклаве в режиме 1 атм в течение 1 ч. Из бутыли 13 в ферментер 1 с помощью насо- 20 са 1 1 закачивают заданное количество питательной среды. Через штуцер 7 ввод т посевной мицелий и включают генератор 6, пневмоимпульсы которого воздействуют на силиконовую трубку 25 перемешивающего узла 3, заставл   ее вибрировать с заданной частотой генератора 6. При поступлении пневмо- импульсов в перемешивающий узел 3 силиконова  трубка деформируетс  0 с заданной частотой, вследствие чего образуетс  пульсирующий турбулентный газожидкостной поток, который активно насыщает слой питательной среды. оздух в Ферментер поступает через - бактериальный фильтр 15, установленный на бутыли 13 с питательной средой отводитс  из --ферментера в атмосферу через бактериальный фильтр 16, установленный на бутыли 14 дл  слива отаботанной жидкости. Заполнение полости перемешивающего узла питательной средой и воздухом и возврат образованг ной газожидкостной смеси в ферментер араллельно с насыщением питательной .с среды кислородом воздуха и перемешианием придонного объема питательной среды вызывают колебани  всего объема ультуральной жидкости с амплитудой 1-3 мм и частотой, заданной генератоом , и обеспечивают пассивное (ламиарное ) -перемешивание культуральной идкости в приповерхностном объеме Ьерментера.

При амплитуде колебаний гидроста1 тического столба культуральной жид ости 41 мм происходит обрастание мицелием стенки ферментера, а при амплитуде 3 мм увеличиваютс  энерге35

40

„ 55

0 5 0 с

5

0

5

тические затраты на проведение процесса . Частота колебаний гидростати- ческого столба культуральной:жидкости выбираетс , исход  из возможностей технологического оборудовани ,

В процессе перемешивани  в момент внесени  в питательную среду посевного материала осуществл етс  его равномерное распределение по всему объему культуральной жидкости. В/.процессе культивировани  происходит рис- слоение культхральной жидкости на слой, содержащий биомассу, и жидкую фазу (кулвтуральную среду), Плотна  биомасса растущего мицели  при пассивном (ламинарном) перемешивании, вызываемом колебани ми гидростатического столба культуральной жидкости, преп тствует образованию пены и зарастанию стенок ферментера.

Периодически в процессе роста по мере исчерпани , субстрата культураль- ную жидкость, образующуюс  вне сло  мицели , сливают в бутыль 14, а в йерментер заливают новую порцию исходной питательной среды из бутыли 13. В результате весь объем ферментера может быть заполнен биомассой.

Дл  реализации способа может быть использовано любое ферментационное оборудование, обеспечивающее насыщение жидкости газом и позвол ющее осуществить колебание объема культуральной жидкости с амплитудой Т-3 мм, например аппараты, перемешивающие устройства , в которых устанавливают вблизи дна БИОР-01 и БИОР-025. При этом Ферментационна  емкость должна быть снабжена устройством дл  колебани  гидростатического столба жидкости от воздействи  пневматического ; или гидравлического приводов.

Дл  иллюстрации работы способа используют либо ферментационную емкость от аппарата АНКУМ-2, в котором вместо традиционного перемешивающего узла используют устройство дл  перемешивани  и газонасыщени  питательной среды, либо колбы Бунэена, снабженные аналогичным устройством.

Пример 1. Гриб Panus tigri- nus 8/18 смывают с кос ка 10- мл сте- рильной водопроводной воды, внос т в ферментер, сконструированный из колбы Вунзена, куда предварительно загружают 400 мл питательной среды следующего состава, г/л глицерин 25,0; пеп

тон 5,0;.соева  мука 2,5; КШз 2,0; СаС1«, б/в 0,5; MgSO 7HU0 OJ1.

Дл  осуществлени  аэрации культу- ральной жидкости с придонного объем ферментера с частотой 3 Гц отбирают 50 мл питательной среды, которую перемешивают с воздухом в турбулентном потоке и возвращают в придонный объем ферментера. Соотношение объема перемешивающего узла к диаметру ферментера выбирают из расчета колебани  гидростатического столба рабочей жидкости с амплитудой 3 мм. Объе культуральной жидоксти перемешивающего узла составл ет 50 мл, а диаметр колбы Бунзена 80 мм, что приводит к изменению гидростатического столба рабочей жидкости в ферментере с амплитудой 3 мм. Выращивание мицели  провод т при te24°C. Через 3 ч после инокулировани  гриб равномерно распредел етс  по всему объему среды. Через 6 ч начинает формироватс  рыхлый верхний слой, но часть миц ли  еще распредел етс  по всему объему среды. Через 12 ч после посева весь мицелий гриба занимает верхний елой культуральной жидкости, а в придонном слое активного перемешивани  питательной среды имеютс  отдельные вкгйочени  биомассы. Через 14 ч после посева весь растущий мицелий флотирует в приповерхностный объем колбы, а под ним находитс  прозрачна  с  рко- желтой окраской культуральна  среда, не содержаща  основного субстрата. Культуральную среду через каждые последующие 10 ч сливают в бутыль, а в ферментер загружают исходную питательную среду до уровн  рабочего объ

ема

Через 71 ч выращивани  нижн   поверхность мицелиальной массы находитс  на высоте 15-20 мм от дна ферментера , что вызывает турбулизацию мице- лиального сло  и затрудн ет перезагрузку питательной средой, в св зи с чем процесс останавливают.

Концентраци  биомассы к концу процесса составл ет лМЗ, г/л, что в л/2,6 раза больше, чем в известном способе , где концентраци  биомассы составл ет 5 г/л. Плотность локализованного сло  биомассы составл ет 18,4 г/л

II

( , где В - количество биомассы

В

Ґ

в граммах по сухому весу; - объем сло  мицели  в культуральной жидкос

ти, л; Р - плотность биомассы, г/л),

0

5 вают через

0

5

Микроскопическ.ий контроль показыва- ., ет в пробах отсутствие мицели  с по- врежденными гифами, что свидетельствует об активном физиологическом состо нии биомассы.

Пример2. Емкость от ферментера АНКУМ2, оборудованную перемешивающим узлом, подключают к бутыли с питательной средой и бутыли дл  сбора культуральной среды. В «Ьерментер заливают 700 мл питательной среды состава , указанного в примере 1, ги вно5 с т 5 мл грибной суспензии P.tigri-1 v tius 8/18, выращенной по примеру 1. Культивируют при амплитуде гидростатического столба культуральной жидкости 1 мм. Через 10 ч культивировани  мицелий собираетс  в приповерхностном объеме ферментера. Через 20, 44 и 58 ч роста в Лерментере производ т замену культуральной среды на свежую питательную среду. Процесс останавли . . 92 ч. В объеме 700 сма

грибной мицелий занимает объем 400 см 157 об.%), что составл ет 10,8592 г (с.в.) биомасы гриба. Концентраци  биомассы составл ет 15,6 г/л, что в 3,1 раза больше, чем в известном способе. Плотность локализованного сло  биомассы составл ет 27,2 г/л. Микроскопический контроль подтверждает отсутствие мицели  с повреждении-4 ми гифами в препаратах биомассы.

ПримерЗ. В ферментер емкостью 600 мл внос т 200 мл питательной среды и 10 мл суспензии гриба Panus tigrinus 144, выращенного в колбе. Состав среды и услови  культивировани  как в примере 1. Культи- вирумт при амплитуде колебаний гидростатического столба культуральной жидкости 1 мм,

После Нормировани  плотного верхнего сло  мицели  на прот жении ферментации по мере исчерпани  основного субстрата три раза в сутки сливают культуральную среду, замен   ее порQ цией питательной среды, поддержива  посто нным рабочий объем ферментера. Через 6 сут процесс останавливают, так как визуально грибной мицелий занимает почти весь объем ферментера. Из 200 см рабочего объема мицелий занимает см (70 об.%). Этот объем сырого мицели  содержит 9,6251 г абсолютно сухой биомассы. Концентраци  биомассы составл ет

5

0

71636445

48,1 г/л, что в 9,6 раза больше, чем в известном способе. Плотность локализованного сло  биомассы составл ет г/л. Микроскопический контроль показывает в пробах, отбираемых во врем  замени среды, отсутствие мицели  с поврежденными гифами,

П р и м е р 4. Актиномицет Strep - tomyces tumemacerans ВКМ-502, синте- JQ зирующий метаболиты с инсектицидными свойствами, выращивают1 в колбах на среде состава г/л: лактоэа 2,0; соева  мука,-15,0; дрожжевой эктракт5,0; ( рН 7,0-7,2, в течение 4 js на .качалке {200 об./мин), По- 1 лученный посевной материал внос т в Ферментационную среду состава, г/л: крахмал 15,0; глюкоза 1,5; соева  мука 20,0; сухие дрожжи 5,0; NaCl 20 2,5; СаСОэ 3,0; СоСЦ , 0,05; рН 7,2, в ферментер с рабочим объе- мом 1 л и провод т выращивание клеток в течение 5 сут как описано в примере 1. Амплитуда колебаний гидро- 25 статического столба культуральной жидкости составл ет 1 мм. В конце первых суток на поверхности фазового раздела и по периметру царги (прор с

с ч 9 б

в к п б э

зрачна  стенка Ферментера) образуют- зр и аэрацию, осуществл емую в ее лос  заметные невооруженным глазом скоплени  мицелиальной биомассы,котог рые к концу 2 сут образуют рыхлый слой биомассы толщиной 8-10 мм, перекальной зоне, отличающий- с   тем, что, с целью повышени  вы хода биомассы, перемешивание осуществл ют воздействием колебаний с

8

мвшивани  в ферментере наблюдаетс  расслоение мицелиального сло  биомассы , который увеличиваетс  в 2 раза и имеет толщину 30 мм.

Через 96 ч процесс останавливают. К этому моменту плотный слой биомассы в ферментере имеет толщину 67 мм, что составл ет 50% его рабочего объема Концентраци  биомассы составл ет 9,5 г/л сухого вещества, что в Р Л1,4 раза больше, чем при выращивании известным методом. Плотность сло  биомассы составл ет 19 г/ «

Claims (1)

1. Таким образом, предлагаемый способ выращивани  мицелиальных организмов позвол ет повысить выход биомассы в культуральной жидкостное 3-ГО раз по сравнению с известным способом, упростить процесс -выделени  экзомета- болитов, а также увеличивает произво- де тельность аппарата при снижении энергозатрат, Формула изобретени 

   Способ выращивани  мицелиальных организмов, предусматривающий перемешивание культуральной жидкости, помещенной в замкнутый объем ферментера,

   и аэрацию, осуществл емую в ее локальной зоне, отличающий- с   тем, что, с целью повышени  выхода биомассы, перемешивание осуществл ют воздействием колебаний с

   крывающий всю поверхность культураль- ,, амплитудой 1-3 мм имеющегос  объема

   ной жидкости в ферментере. Под слоем биомассы находитс  прозрачна  отработанна  среда, не содержаща  основно- го субстрата.

   После замены питательной среды, Q восстановлени  режима аэрации и пере-

   культуральной жидкости с получением сло  биомассы и жидкой фазы, в качестве локальной зоны дл  аэрации используют придонный слой, а жидкую фазу, | свободную от биомассы,периодически за , мешают свежей питательной средой.

   культуральной жидкости с получением сло  биомассы и жидкой фазы, в качестве локальной зоны дл  аэрации используют придонный слой, а жидкую фазу, | свободную от биомассы,периодически за- , мешают свежей питательной средой.

   Составитель В. Соина Редактор Н. Яцола Техред Л.Олийнык Корректор М.Самборска 

   Заказ 796

   Тираж 379

   ВНИИПИ Государственного комитета по изобретени м и открыти м при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5

   Подписное